Способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии у детей и подростков

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быь использовано для прогнозирования диабетической периферической нейропатии (ДПНП) у детей и подростков, страдающих сахарным диабетом I типа. Сущность изобретения состоит в том, что в периферической крови серологическим методом исследуют мозговой нейротрофический фактор (BDNF) и при его величине больше 9000 пг/мл диагностируют субклиническую стадию ДПНП. Техническим результатом является разработка высокочувствительного и точного способа прогнозирования возникновения диабетической периферической нейропатии.

 

Сахарный диабет (СД) I типа - инсулинозависимый сахарный диабет - является одной из актуальных медико-социальных проблем. Около 20 миллионов человек страдают этим заболеванием и более 5% от общего числа больных составляют дети и подростки. В России ежегодно регистрируются от 4 до 10 новых случаев СД I типа на 100 тысяч детского населения, рост заболеваемости неуклонно увеличивается в среднем на 5% (Э.П.Касаткина, 1999).Характерный для детей сахарный диабет I типа развивается в результате деструкции бета-клеток поджелудочной железы и характеризуется абсолютной инсулиновой недостаточностью, острым возникновением тяжелых симптомов, склонностью к кетозу и необходимостью вводить экзогенный инсулин для поддержания жизни больного.

Особая значимость проблемы СД I типа определяется угрозой ранней инвалидизации молодых пациентов и снижением общей продолжительности жизни в связи с развитием тяжелых микрососудистых осложнений. До недавнего времени считалось, что микрососудистые осложнения у детей и подростков являются редкостью. Исследованиями последних лет установлено, что одним из частых и наименее изученных в детском возрасте осложнений является диабетическая периферическая нейропатия, поражающая от 20 до 85% больных (Э.П.Касаткина, 1996). Распространенность ДПНП возрастает по мере увеличения длительности заболевания. Так частота ДПНП при впервые выявленном СД I составляет около 1-2% и 50-70% при длительности СД I типа свыше 15 лет (М.Б.Анциферов, 1998). Большие расхождения в распространенности ДПНП объясняются отсутствием единых диагностических критериев и отличиями в методах выявления ДПНП.

Трудности диагностики ДПНП в детском возрасте объясняются также и тем, что у детей преобладает субклиническая стадия нейропатии, субъективные ощущения появляются чаще в подростковом возрасте, после более или менее продолжительного периода существования сахарного диабета. В связи с этим прогнозирование и ранняя доклиническая диагностика ДПНП у детей является чрезвычайно актуальными.

В настоящее время диагностика субклинической стадии ДПНП основывается на исследовании чувствительных и электродиагностических тестов (И.В.Гурьева, Е.Ю.Комелягина, И.В.Кузина. Диабетическая периферическая сенсомоторная нейропатия. Патогенез, клиника, диагностика. М., 2000, Центр «Диабетическая стопа» Международной программы «Диабет».)

Оценка болевой чувствительности может быть исследована при помощи тупой иглы, одноразовой зубочистки или специальных приборов, позволяющих стандартизировать укол: неврологической ручки (Neuropen) или зубчатого колеса(Pin-wheel). Болевая чувствительность считается не нарушенной, если пациент чувствует боль на всей поверхности исследования. Порогом нарушения болевой чувствительности считается уровень, с которого пациент начинает ощущать боль от укола (С.В.Котов, А.П.Калинин, И.Г.Рудакова. Диабетическая нейропатия. М.: Медицина, 2000). Однако данная методика, как правило, вызывает негативную реакцию у ребенка, чувство беспокойства и дискомфорта.

Порог тактильной чувствительности оценивается при помощи волокон хлопковой ваты и 10 г (5,07 Semmes-Weinstein) монофиламента. Тактильная чувствительность считается не нарушенной, если пациент ощущает прикосновение на всем протяжении (Т.В.Мохорт, Д.И.Ромейко. Диабетическая полинейропатия (патогенез, клиника, диагностика, лечение). Минск: Научно-исследовательский клинический институт радиационной медицины и эндокринологии, 2000). Несовершенство данной методики заключается в том, что достоверность обследования зависит от условий проведения (в спокойном и расслабленном состоянии) и эмоционального настроя ребенка.

Температурную чувствительность оценивают при помощи предметов с различной температурой (теплопроводностью): металлической и резиновой частями неврологического молоточка (площадь прикосновения должна быть одинаковой) или специальным прибором - термическим наконечником (Thip-term). Температурная чувствительность считается нормальной, если пациент ощущает разницу температур во всех исследуемых точках (Е.Ю.Комелягина. Алгоритм выявления пациентов из группы риска развития синдрома диабетической стопы. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. М.,1998). В связи с тем что прибор быстро принимает температуру тела, диагностическая ценность данной методики невелика.

Вибрационную чувствительность оценивают при помощи градуированного неврологического камертона (tuning fork), вибрирующего с частотой 128 Гц, или биотензиометра. Значение на шкале камертона в момент, когда пациент перестает ощущать вибрацию, считается порогом вибрационной чувствительности на уровне исследования. Вибрационная чувствительность считается не нарушенной, если значение шкалы камертона, при котором пациент перестает ощущать вибрацию, соответствует 7 УЕ и выше. Вибрационная чувствительность считается сниженной умеренно, если значения шкалы камертона, при которых пациент перестает ощущать вибрацию, соответствует 5 или 6 УЕ. Вибрационная чувствительность считается сниженной значительно, если показания шкалы камертона, при которых пациент перестает ощущать вибрацию, ниже 4 УЕ (Dyck P.J. Detection, characterization and staging of polyneuropathy: assessed in diabetics. Muscle Nerve, 1988; 11: 21-32). Данная методика также несовершенна, так как на результаты исследования значительное влияние оказывает состояние кожных покровов (трофические изменения, отечность), невозможность четкой оценки ребенком поставленной перед ним задачи.

С помощью электродиагностических тестов - электромиографии (ЭМГ) - при субклинической стадии ДПНП можно выявить снижение проводимости нервного импульса чувствительных и двигательных периферических нервов; снижение амплитуды нервно-мышечных индуцированных потенциалов. Однако данные изменения неспецифичны и могут отмечаться при другой нервно-мышечной патологии. Кроме того, применение ЭМГ ограничено из-за возраста ребенка (исследование проводится детям старше 7 лет), трудоемкости и высокой стоимости исследования.

В качестве прототипа нами использована шкала Нейропатического Дисфункционального счета (НДС), используемая для определения степени тяжести периферической полинейропатии и включающая суммарную количественную оценку тактильной, температурной, болевой, вибрационной чувствительности и нарушений сухожильных рефлексов (Young M.J., Boulton A.J.М., Macleod A.F., Williams D.R.R., Sonsken P.H.A multicentre study of the prevalence of diabetic peripheral neuropathy in the United Kingdom hospital clinic population. Diabetologia, 1993; 36: 150-154). Шкала НДС разработана M.J. Young в 1986 году и рекомендована издательской группой Neurodiab при Европейской ассоциации по Изучению Диабета. Для каждого вида нарушения чувствительности рассчитывается средняя величина по формуле: (х1+х2):2, где х1- и х2- цифровое значение (в баллах) нарушения чувствительности на левой и правой нижних конечностях. Сумма средних значений каждого вида чувствительности и каждого из периферических рефлексов (на каждой конечности) и составляет значение шкалы НДС. При значении НДС 0-4 балла - у пациента отсутствуют начальные признаки ДПНП, при 5-13 баллах - имеется умеренно выраженная ДПНП, а при 14 баллах и более имеется выраженная ДПНП.

Учитывая, что дети и подростки не всегда могут четко ответить на поставленные вопросы, отдифференцировать эффект от проводимого воздействия; а также тот факт, что информативность методики во многом зависит от возраста ребенка и эмоционального статуса, диагностическая значимость шкалы НДС для диагностики субклинической стадии и прогнозирования ДПНП в педиатрической практике невелика и носит субъективный характер.

Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.

Задачей изобретения является разработка более точного, высокочувствительного метода прогнозирования ДПНП у детей и подростков.

Поставленная задача решается тем, что у пациентов серологическим методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют уровень мозгового нейротрофического фактора - brain derived neurotrophic factor (BDNF) в сыворотке крови и при концентрации выше 9000 пг/мл прогнозироуют ДПНП.

Выбор BDNF как маркера субклинической стадии ДПНП не случаен. BDNF - член семейства нейротрофинов, который играет роль в пролиферации нейронов, дифференцировке и защите их на всех стадиях развития. (Barde et al, 1982). По данным литературы эндогенным источником BDNF могут быть шванновские клетки, фибробласты. Экспериментальными работами (Jian-Yi Zhang, Xue- Gang Luo et al. «Endogenous BDNF is required for myelination and regeneration of injured sciatic nerve in rodents» European Journal of Neu-roscience. Vol., pp.4171-4180, 2000) доказано, что BDNF необходим для регенерации и ремиелинизации периферических нервов после повреждения. Нашими исследованиями установлено, что повышение уровня BDNF у детей и подростков, страдающих сахарным диабетом I типа, выше 9000 пк/мл в крови свидетельствует о субклинической стадии ДПНП и позволяет прогнозировать ДПНП.

Предлагаемый способ не зависит от возраста, эмоционального настроя ребенка, исключает наличие субъективизма. Способ позволит врачу по сывороточному уровню BDNF у детей и подростков, страдающих сахарным диабетом I типа, оценить возможность развития субклинической стадии ДПНП, прогнозировать ее течение, своевременно назначить адекватную терапию. Это будет способствовать уменьшению риска развития поздних сосудистых осложнений диабета и улучшению состояния здоровья и качества жизни детей и подростков.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами.

Пример 1.

Ребенок Дима К., 15 лет, наблюдается в детском эндокринном отделении РНИИАП в течение 3 лет по поводу сахарного диабета I типа. Течение заболевания тяжелое лабильное, отмечаются частые гипогликемические состояния, обусловленные физической нагрузкой. Гликозилированный гемоглобин - 12,2% свидетельствует о декомпенсации СД I. Жалоб ребенок не предъявляет. При обследовании неврологического статуса отмечалось незначительное снижение коленных и ахилловых рефлексов с обеих сторон, снижение вибрационной чувствительности до 6 баллов на первом пальце стопы обеих ног при нормальных параметрах остальных видов чувствительности (тактильной, температурной, болевой). Шкала НДС составила 2 балла, что расценивается как вариант нормы. На тыльной поверхности стоп и медиальной поверхности голеностопных суставов участки пигментации. При проведении ЭМГ исследования выявлены спонтанная активность в покое на икроножных мышцах голени, снижение электрической активности на икроножной и передней большеберцовой мышцах с обеих сторон, резко выраженная полифазия на длинном разгибателе пальцев стопы обеих ног, урежение частотных характеристик обследуемых групп мышц.

У пациента взяли 1 мл венозной крови, центрифугировали 5 минут при 1500 об/минуту. Полученную сыворотку развели 1:20 дилюентом, для этого 10 мл сыворотки соединили со 190 мл дилюента. 50 мл полученной разведенной сыворотки использовали для определения мозгового нейротрофического фактора в микротиражных лунках планшет от набора для определения BDNF серологическим методом. Из пакета со стрипами достали необходимое количество стрипов, учитывая, что при каждом проведении анализа используется б калибраторов с разными концентрацией BDNF. Пакет с оставшимися стрипами и вложенным в него мешочком силикагеля снова плотно закрыли. Стрипы вставили в рамку-держатель, промаркировав с одной стороны. В каждую лунку внесли по 100 мкл инкубационного реагента. Добавили по 50 мкл исследуемого разведенного образца сыворотки или раствора калибратора. Перемешали, встряхивая содержимое лунки на шейкере ±1000 об/мин или пепитируя несколько раз многоканальным дозатором. Накрыли планшет липкой лентой и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Не промывая планшет, добавили в каждую лунку по 100 мкл раствора конъюгата. Накрыли планшет липкой лентой и инкубировали 60 минут при комнатной температуре. В конце времени инкубации подготовили раствор субстрата. Промыли все лунки планшета 3 раза. В каждую лунку добавили по 200 мкл раствора субстрата, инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте. Для остановки реакции в каждую лунку добавили 50 мкл 2NH₂SO₄ (в той же последовательности и с той же скоростью, как вносили раствор субстрата). Перемешали содержание лунок осторожным постукиванием микропланшета по рамке-держателю. Результаты подсчитывали на фотометре (Labsystem Multiscan plus, Финляндия) в течение 15 минут. В компьютерное обеспечение прибора вводили значения концентрации BDNF в стандартных образцах и, таким образом, при считывании ОП 450 всех проб сразу получали значения искомых концентраций BDNF в исследуемых разведенных образцах. Полученные значения концентраций умножали на фактор разведения 20.

Уровень BDNF в сыворотке у данного ребенка составил 9135 пк/мл. Дальнейшее клиническое наблюдение в динамике, при повторном плановом поступлении через 10 месяцев, выявило 2 балла по шкале НДС, отрицательную динамику по данным ЭМГ исследования преимущественно со стороны длинного разгибателя пальцев стопы обеих ног. На участке пигментации на тыльной поверхности левой стопы появление более выраженных трофических изменений, расцениваемых как липоидный некробиоз.

Таким образом, из данного примера следует, что повышение уровня BDNF выше 9000 пк/мл, свидетельствует о субклинической стадии ДПНП, позволяет прогнозировать ДПНП и требует проведения превентивной патогенетической терапии.

Пример 2.

Ребенок Вероника К., 12 лет, наблюдается в отделении в течение 3 лет с диагнозом сахарный диабет I типа. Течение заболевания тяжелое лабильное, девочка не соблюдает диету. Гликозилированный гемоглобин - 11,2%, что свидетельствует о декомпенсации СД I. Жалоб не предъявляет. Шкала НДС составила 2 балла за счет снижения вибрационной до 6 баллов и температурной (1 балл) чувствительности в дистальных отделах нижних конечностей. Данные ЭМГ исследования: электрофизиологическая характеристика электрической активности исследуемых мышц аксонального типа, частотные характеристики и электрическая активность мышц в пределах физиологических сдвигов. Уровень BDNF - 9000 пк/мл.

Через 6 месяцев при плановом поступлении не выявлено отрицательной динамики при клиническом и функциональном обследовании, что позволяет исключить субклиническую стадию ДПНП.

Пример 3.

Ребенок Владимир Р., 12 лет, наблюдается в детском эндокринном отделении РНИИАП в течение 4 лет по поводу сахарного диабета I типа, тяжелое лабильное течение. Гликозилированный гемоглобин - 12,1% свидетельствует о декомпенсации СД1. Жалоб нет. Суммарная оценка всех видов чувствительности по шкале НДС составила 3 балла, что соответствовало норме. Данные ЭМГ: электрофизиологическая характеристика электрической активности обследуемых мышц аксонального типа. Изменения на ЭМГ длинного разгибателя пальцев стопы справа и слева и слева легкой степени выраженности (незначительное урежение частотных характеристик), что укладывается в параметры физиологических сдвигов. При исследовании более проксимальных отделов мышц нижних конечностей (переднебольшеберцовых и икроножных справа и слева) патологических сдвигов также не выявлено.

Уровень BDNF в сыворотке крови ребенка составил 9580 пк/мл.

Через 6 месяцев при плановом поступлении выявлена отрицательная динамика: 6 баллов по шкале НДС, отрицательная динамика по данным ЭМГ исследования, преимущественно со стороны длинного разгибателя пальцев стопы обеих ног.

Таким образом, из данного примера следует, что повышение уровня BDNF выше 9000 пк/мл позволяет прогнозировать ДПНП, свидетельствует о субклинической стадии ДПНП и требует проведения превентивной патогенетической терапии.

Предлагаемым методом было обследовано 80 детей, страдающих сахарным диабетом I типа с различной длительностью заболевания, наблюдающихся в детском эндокринном отделении РНИИАП. Уровень BDNF превышал 9000 пк/мл у 77 детей, что позволило прогнозировать ДПНП. У значительной части этих детей были выявлены патологические изменения на ЭМГ, преимущественно с вовлечением наиболее дистальных отделов нижних конечностей. Шкала НДС составила от 0 до 6 баллов. У 3 детей уровень BDNF был ниже 9000 пк/мл, и в данной группе не было выявлено клинико-функциональных признаков поражения периферической нервной системы.

Таким образом, исследование уровня BDNF в крови у пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, показало, что точность заявляемого способа 96,3%.

Исходя из вышеизложенного, заявляемый способ прогнозирования ДПНП у детей и подростков по сравнению с существующими имеет следующие преимущества:

1. Способ относится к методам экспресс-диагностики (время выполнения - 4 часа).

2. Предлагаемый способ обладает высокой точностью.

3. Способ позволяет прогнозировать ДПНП у детей и подростков.

Способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии у детей и подростков может широко использоваться в эндокринологии, диабетологии.

Способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии (ДПНП) у детей и подростков, отличающийся тем, что в периферической крови серологическим методом исследуют мозговой нейротрофический фактор (BDNF) и при его величине больше 9000 пг/мл диагностируют субклиническую стадию ДПНП.