Способ приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для клинических и эпидемиологических исследований. Способ предусматривает смешивание, г/л: панкреатического гидролизата рыбной муки 22,0-27,0, натрия хлорида - 4,0-6,0, агара - 14,5-15,5, сорбита - 9,0-11,0 и дистиллированной воды - до 1 л. После нагревания и расплавления агара устанавливают рН 7,2+0,2 и в полученную среду добавляют 18-22 мл индикатора, состоящего из, г/л: кислого фуксина - 4,5-5,5, бромтимолового синего 3,5-4,5, гидроксида натрия (1%-ный раствор) - 150-170,0 мл и дистиллированная вода - до 1 л. При этом кислый фуксин предварительно растворяют в 1%-ном растворе гидроксида натрия и к полученному раствору добавляют бромтимоловый синий и дистиллированную воду. Изобретение обеспечивает повышение четкости изменения цвета колоний на дифференциальной среде, сокращение срока инкубации и более длительное хранение готовой для употребления среды.

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для клинических и эпидемиологических исследований.

Известен способ приготовления питательней среды (Среды бактериологические для клинических и эпидемиологических исследований. Каталог. М., 2001. - С.54), которая готовится по следующей схеме: смешиваются панкреатический гидролизат казеина, панкреатический гидролизат мясной муки, желчная соль, натрий хлористый, сорбит, нейтральный красный, фиолетовый красный, агар, полученная смесь добавляется в дистиллированную воду, кипятится 2-3 мин до расплавления, фильтруется, охлаждается до температуры 45-50°С и разливается в чашки Петри. Среда используется в течение 24-48 ч после приготовления.

Также известен способ приготовления питательной среды (Энтеробактерии: Руководство для врачей / Авт. И.В.Голубева, В.А.Килессо, Б.С.Киселева и др.; Под ред. В.И.Покровского. - М., Медицина, 1985. - С.265 - прототип), включающий смешивание панкреатического гидролизата рыбного сырья, натрия хлорида, агара, сорбита, индикатора, растворение их в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипячения, розлив на порции. Среда используется в день приготовления.

Известные способы приготовления питательных сред имеют ряд недостатков:

1) они являются сложными и для их приготовления необходимы дорогостоящие и дефицитные компоненты;

2) полученные среды чувствительны к свету и теплу и сами по себе могут изменять свой цвет, в результате чего в одинаково красный цвет окрашиваются как сорбитположительные, так и сорбитотрицательные колонии эшерихий, что ставит диагностику Е. coli 0157 недостоверной;

3) ввиду цветовой нестабильности готовые среды рекомендуется использовать в день приготовления;

4) бактерии со слабой ферментативной активностью могут ошибочно быть учтены как сорбит(-), т.к. для этих вариантов требуется более продолжительная инкубация, в процессе которой изменяется цвет самой среды.

Техническим решением задачи является обеспечение доступности, упрощение приготовления среды, повышение четкости изменения цвета колоний на дифференциальной среде, сокращение срока инкубации и более длительный срок хранения готовой для употребления среды.

Поставленная задача достигается тем, что в способе приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157, включающем смешивание панкреатического гидролизата рыбного сырья, натрия хлорида, агара, сорбита, индикатора, растворение их в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипячения, розлив на порции, в качестве панкреатического гидролизата рыбного сырья используют панкреатический гидролизат кильки при следующем соотношении компонентов, г/л:

панкреатический гидролизат кильки	22,0-27,0
натрия хлорид	4,0-6,0
агар	14,5-15,5
сорбит	9,0-11,0
дистиллированная вода	остальное

после нагревания и расплавления агара устанавливают рН 7,0-7,4, а индикатор, состоящий из кислого фуксина, бромтимолового синего, 1%-ного раствора гидроксида натрия и дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов, г/л:

кислый фуксин	4,5-5,5
бромтимоловый синий	3,5-4,5
1%-ный раствор гидроксида натрия	150,0-170,0 мл
дистиллированная вода	остальное

добавляют в полученную среду в количестве 18-22 мл, при этом предварительно кислый фуксин растворяют в 1 %-ном растворе гидроксида натрия и к полученному раствору добавляют бромтимоловый синий и дистиллированную воду.

Новизна заявленного предложения состоит в том, что разработан способ приготовления дифференциально-диагностической среды. Полученная данным способом среда стабильна при воздействии солнечного или электрического света, обладает четким дифференцирующим свойством, позволяющим достоверно различать сорбит(-) и сорбит(+) бактерии. Вследствие чего полученная среда может использоваться для первичной дифференциации Е.coli 0157 от других серотипов кишечной палочки, поскольку в 70-80% случаев является сорбит(-).

Способ приготовления питательной среды для выявления E.coli 0157 осуществляется следующим образом.

Первоначально сухие ингредиенты среды разводят в воде и доводят до кипения, фильтруют, после чего устанавливается рН 7,0-7,4, вводится индикатор, затем готовая среда разливается по флаконам и автоклавируется при 0,5 атм в течение 20 мин. Расплавленную и охлажденную до 45-50°С среду разливают в чашки Петри. Готовая среда имеет оливково-зеленый цвет, прозрачная на просвете. На данной среде штаммы кишечной палочки расщепляющие сорбит уже через 15-18 ч после посева, образуют непрозрачные желтого или оранжевого цвета колонии с изменением цвета среды вокруг колоний из оливково-зеленого в желто-оранжевую. Сорбит(-) E.coli (0157) к тому же сроку образует непрозрачные зеленовато-голубые колонии на фоне неизмененной, оливково-зеленого цвета среды.

Пример конкретного осуществления способа приготовления питательной среды для выявления E.coli 0157

25 г Панкреатического гидролизата кильки, 5 г натрия хлорида, 13,5 г агара, 10 г сорбита перемешивают, добавляют до 1000 мл дистиллированной воды и нагревают до кипения и расплавления агара. После чего полученную массу фильтруют, контролируют рН (7,0-7,4) и добавляют 20 мл предварительно приготовленного индикатора. Затем масса разливается по колбам или флаконам и автоклавируется при 0,5 атм в течение 20 мин.

Индикатор готовится по прописи: 0,5 г кислого фуксина растворяется в 16 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия, к полученному раствору добавляют 84 мл дистиллированной воды и 0,4 г бромтимолового синего.

Количественные значения ввода в среду сорбита, кислого фуксина и бромтимолового синего подобраны экспериментально. При вводе сорбита в количестве 0,5-0,7% - реакция нечеткая (слабо отличаются сорбит(+) колонии от сорбит(-), не происходит изменения окраски среды вокруг колоний). При применении кислого фуксина меньше 0,5% - все колонии Е.coli бледные и не отличаются друг от друга, а в случае увеличения свыше 0,5% - все колонии, напротив, приобретают окраску от светло-красного до интенсивно-красного цвета. При введении бромтимолового синего ниже 0,4% - среда имеет слегка зеленоватую окраску и не меняет своего цвета в процессе роста на ней колоний, поэтому разницы между Е.coli, усваивающими и не усваивающими сорбит, практически установить не удается. В случае добавления бромтимолового синего больше 0,4% - среда приобретает очень темный сине-зеленый цвет, колонии Е.coli, выросшие в данных условиях, трудно различаются.

Готовая для употребления среда может храниться без изменения своих свойств в течение 7 дней, в то время как среды, приготовленные по известным способам, - 1-2 дня, т.к. при более длительном хранении самопроизвольно меняют свой цвет.

Удовлетворительного результата добиваемся за счет оптимизации ввода в базовую питательную среду необходимого объема углевода (сорбита) и объема индикаторов, не влияющих на рост бактерий, но позволяющих дифференцировать выросшие колонии Е.coli по заданному признаку. Цвет полученной среды - оливково-зеленый. При положительной реакции (утилизация сорбита) - колонии окрашиваются в цвет в диапазоне от желтого до оранжевого (в зависимости от биохимической активности штамма), при этом среда вокруг них также желтеет. При отрицательной реакции, когда сорбит не ферментируется (E.coli 0157), - колонии окрашиваются в зеленовато-голубой цвет, среда вокруг них не изменяется, т.е. остается оливково-зеленого цвета. Кроме того, цветовую дифференциацию сорбит(+) от сорбит(-) кишечных палочек, осуществляемую предлагаемым способом, можно осуществлять уже спустя 15-18 ч после посева материала, в то время как известными способами только через 24-26 ч и даже более.

Способ приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157, включающий смешивание панкреатического гидролизата рыбного сырья, натрия хлорида, агара, сорбита, индикатора, растворение их в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипячения, розлив на порции, отличающийся тем, что в качестве панкреатического гидролизата рыбного сырья используют панкреатический гидролизат кильки при следующем соотношении компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат кильки	22,0-27,0
Натрия хлорид	4,0-6,0
Агар	14,5-15,5
Сорбит	9,0-11,0
Дистиллированная вода	Остальное

после нагревания и расплавления агара устанавливают рН 7,0-7,4, а индикатор, состоящий из кислого фуксина, бромтимолового синего, 1%-ного раствора гидроксида натрия и дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов, г/л:

Кислый фуксин	4,5-5,5
Бромтимоловый синий	3,5-4,5
1%-ный раствор гидроксида натрия	150,0-170,0 мл
Дистиллированная вода	Остальное

добавляют в полученную среду в количестве 18-22 мл, при этом предварительно кислый фуксин растворяют в 1%-ном растворе гидроксида натрия и к полученному раствору добавляют бромтимоловый синий и дистиллированную воду.