Способ получения l-аминокислот методом ферментации смеси глюкозы и пентоз
Владельцы патента RU 2273666:
Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. L-аминокислоты получают культивированием бактерии рода Escherichia - продуцента L-аминокислот в питательной среде, содержащей смесь глюкозы и пентоз. Полученную и накопленную L-аминокислоту выделяют из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 11 з.п. ф-лы, 6 табл.
Область техники
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот методом ферментации пентоз, более конкретно способу получения L-аминокислот методом ферментации смеси арабинозы и/или ксилозы вместе с глюкозой в качестве источника углерода. Дешевый источник углерода, содержащий смесь гексоз и пентоз в гемицеллюлозных фракциях, полученных из биомассы целлюлозы, может быть использован для коммерческой продукции L-аминокислот, например L-изолейцина, L-гистидина, L-треонина и L-триптофана.
Уровень техники
Промышленным способом L-аминокислоты традиционно получают методом ферментации с использованием штаммов различных микроорганизмов. Питательные среды для ферментации должны содержать достаточное количество источников углерода и азота.
В качестве источников углерода традиционно используют различные углеводы, такие как гексозы, пентозы, триозы; различные органические кислоты и спирты. К гексозам относятся глюкоза, фруктоза, манноза, сорбоза, галактоза и другие подобные соединения. К пентозам относятся арабиноза, ксилоза, рибоза и другие подобные соединения. Но указанные выше углеводы, а также другие традиционные источники углерода, используемые в промышленности, такие как меласса, зерновые, тростниковый сахар, крахмал и его гидролизат, являются достаточно дорогими, и поэтому снижение стоимости продуцируемых L-аминокислот желательно.
Биомасса целлюлозы является подходящим сырьем для продукции L-аминокислот ввиду как ее широкой доступности, так и меньшей стоимости, чем углеводы, зерновые, тростниковый сахар и другие источники углерода. Типичное содержание целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина в биомассе следующее: 40-60% целлюлозы, 20-40% гемицеллюлозы, 10-25% лигнина и около 10% других компонентов. Целлюлозная фракция состоит из полимера гексозы - глюкозы. Гемицеллюлозная фракция содержит, в основном, пентозы, включая ксилозу и арабинозу. Состав различных сырьевых биомасс показан в Таблице 1 (http://www.ott.doe.gov/unerstanding_biomass.html).
| Таблица 1 | ||||
| Материал | Сахара с шестью атомами углерода | Сахара с пятью атомами углерода | Лигнин | Зола |
| Твердая древесина | 39-50% | 18-28% | 15-28% | 0.3-1.0% |
| Мягкая древесина | 41-57% | 8-12% | 24-27% | 0.1-0.4% |
Более детальная информация о составе более 150 образцов биомассы приведена в «Базе данных состава и свойств сырьевых биомасс» ("Biomass Feedstock Composition and Property Database", http://www.ott.doe.gov/biofuels/progs/search 1.cgi).
Ожидается, что процесс эффективной промышленной конверсии биомассы целлюлозы в сырье, годное к использованию в ферментации (обычно смесь углеводов), будет разработан в ближайшем будущем. Поэтому использование возобновляемых источников энергии, таких как целлюлозы и гемицеллюлозы, для продукции полезных соединений увеличится, как ожидается, в ближайшем будущем (Aristidou A., Pentila.M., Curr. Opin. Biotechnol, 2000, Apr., 11:2, 187-198). Но в большинстве опубликованных статей и патентов (или патентных заявок) описано использование биомассы целлюлозы биокатализаторами (бактериями и дрожжами) для производства этанола, который, как ожидается, будет альтернативным автомобильным топливом. В указанных процессах ферментация биомассы целлюлозы происходит с использованием различных модифицированных штаммов Zymomonas mobilis (Deanda К. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996 Dec., 62:12, 4465-70; Mohagheghi A. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98-100:885-98; Lawford H.G., Rousseau J.D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002, 98-100:429-48; заявки РСТ WO 95/28476, WO 98/50524), модифицированных штаммов Escherichia coli (Dien B.S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2000, 84-86:181-96; Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56:1-2, 120-5; US patent 5000000). Ксилитол может быть получен методом ферментации ксилозы из гемицеллюлозных сахаров с использованием Candida tropicalis (Walthers Т. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93:423-35). 1,2-пропандиол может быть получен методом ферментации арабинозы, фруктозы, галактозы, глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, ксилозы и их смесей с использованием рекомбинантных штаммов Escherichia coli (патент США 6303352). Также было показано, что 3-дегидрошикимовая кислота может быть получена методом ферментации смеси глюкозы, ксилозы и арабинозы с использованием штаммов Escherichia coli, при этом в случае использования в качестве источника углерода смеси глюкозы, ксилозы и арабинозы были получены большие выходы 3-дегидрошикимовой кислоты, чем при использовании только ксилозы или глюкозы (Kai Li and J.W.Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 876-883).
Известно, что Escherichia coli могут утилизировать пентозы, такие как L-арабиноза и D-ксилоза. Транспорт L-арабинозы в клетку осуществляется двумя индуцируемыми системами: низко-аффинной пермеазой (Km около 0.1 мМ), кодируемой геном araE и системой с высокой аффинностью (Кm 1-3 мкМ), кодируемой опероном araFG. Ген araF кодирует периплазматический связывающий белок (306 аминокислотных остатков) с функцией хемотактического рецептора, а локус araG кодирует внутри мембранный белок. Метаболизм сахара осуществляется набором ферментов, кодируемых опероном araBAD: изомеразой (кодируемой геном araA), которая обратимо превращает альдозу в L-рибулозу; киназой (кодируемой геном araB), которая фосфорилирует кетозу в рибулоза-5-фосфат; и L-рибулоза-5-фосфат-4-эпимеразой (кодируемой геном araD), катализирующей образование D-ксилоза-5-фосфата (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
Большинство штаммов Е.coli способны расти на D-ксилозе, но штамм К-12 должен содержать определенную мутацию, чтобы расти на этом соединении. Утилизация этой пентозы происходит через индуцируемый и репрессируемый катаболитами путь, включающий транспорт через цитоплазматическую мембрану с помощью двух индуцируемых пермеаз (неактивных в случае D-рибозы и D-арабинозы), изомеризацию D-ксилулозы и АТФ-зависимого фосфорилирования пентулозы с выходом D-ксилулоза-5-фосфата. Высокоаффинная (Km 0.3-3 мкМ) система транспорта включает периплазматический связывающий белок (37000 Да) и, вероятно, функционирует с использованием высокоэнергетических соединений. Система с низкой аффинностью (Km около 170 мкМ) работает с использованием энергии переноса протона. Эта система транспорта D-ксилозы в симпорте с протоном кодируется геном xylE. Основным кластером генов, определяющим утилизацию D-ксилозы, является xylAB(RT). Ген xylA кодирует изомеразу (54000 Да), а ген xylB кодирует киназу (52000 Да). Оперон содержит две точки транскрипции, одна из которых расположена перед открытой рамкой считывания гена xylB. Поскольку пермеаза с низкой аффинностью кодируется несвязанным геном xylE, локус xylT, вероятно, кодирует систему транспорта с высокой аффинностью и поэтому должна содержать, по крайней мере, два гена (один для периплазматического белка, другой для интегрального мембранного белка) (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
Введение перечисленных выше генов, кодирующих L-арабинозоизомеразу, L-рибулокиназу, L-рибулоза-5-фосфат-4-эпимеразу, ксилозоизомеразу и ксилулокиназу в дополнение к трансальдолазе и транскетолазе позволяет получить микроорганизмы, такие как Zymomonas mobilis, способные метаболизировать арабинозу и ксилозу в этанол (заявки РСТ WO/9528476, WO 98/50524). Напротив, гены, кодирующие алкогольгедирогеназу (ADH) и пируватдекарбоксилазу (PDH), выделенные из Zymomonas, полезны для продукции этанола штаммами Escherichia coli (Dien B.S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2000, 84-86:181-96; US patent 5000000).
Но к настоящему моменту нет сообщений, описывающих процесс получения L-аминокислот методом ферментации смеси глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислот из смеси гексозы, такой как глюкоза, и пентоз, таких как ксилоза и арабиноза, путем выращивания микроорганизма - продуцента L-аминокислоты в питательной среде, содержащей смесь указанных сахаров. В качестве источника углерода в питательной среде может быть использовано сырье для ферментации, полученное из биомассы целлюлозы. Используемые микроорганизмы способны к росту на указанном сырье для ферментации и способны с высокой эффективностью продуцировать L-аминокислоты с использованием сырья для ферментации, содержащего в качестве источника углерода ксилозу и арабинозу вместе с глюкозой.
Авторы настоящего изобретения установили, что известные штаммы - продуценты L-аминокислот - способны эффективно утилизировать пентозы вместе с глюкозой и продуцировать L-аминокислоты в количестве, сравнимом с количеством, полученном при ферментации только глюкозы. Примерами штаммов - продуцентов L-аминокислот - являются такие штаммы Escherichia coli.
Другими словами, в настоящем изобретении описано использование рекомбинантных штаммов простых микроорганизмов для получения L-аминокислот из неиспользуемых источников биомассы, таких как целлюлоза и гемицеллюлоза, составляющих основную часть древесины и несъедобных частей растений.
Таким образом было совершено настоящее изобретение.
Настоящее изобретение включает в себя следующее:
1. Способ получения L-аминокислот, включающий стадии выращивания бактерии-продуцента L-аминокислоты в питательной среде и выделения полученной и накопленной L-аминокислоты из культуральной жидкости, в котором питательная среда содержит смесь глюкозы и пентоз.
2. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором пентозами являются арабиноза и ксилоза.
3. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором смесь сахаров является сырьем для ферментации, полученным из биомассы целлюлозы.
4. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором бактерией-продуцентом L-аминокислоты является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia.
5. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором бактерия-продуцент L-аминокислоты модифицирована с целью повышения степени утилизации пентоз.
6. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором получаемой L-аминокислотой является L-изолейцин.
7. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-изолейцина.
8. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором получаемой L-аминокислотой является L-гистидин.
9. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-гистидина.
10. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором получаемой L-аминокислотой является L-треонин.
11. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-треонина.
12. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором получаемой L-аминокислотой является L-триптофан.
13. Способ в соответствии с описанным выше способом, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-триптофана.
К способу получения L-аминокислот согласно настоящему изобретению относится способ получения L-изолейцина методом ферментации глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также к способу получения L-аминокислот согласно настоящему изобретению относится способ получения L-гистидина методом ферментации глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также к способу получения L-аминокислот согласно настоящему изобретению относится способ получения L-треонина методом ферментации глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также к способу получения L-аминокислот согласно настоящему изобретению относится способ получения L-триптофана методом ферментации глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Подобная смесь глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза, используемая в качестве сырья для ферментации, может быть получена из неиспользуемых источников растительной биомассы.
Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.
Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты», использованный здесь, также означает бактерию, обладающую способностью к продукции и накоплению L-аминокислоты в питательной среде в количестве большем, чем родительский штамм или штамм дикого типа, и, предпочтительно, означает, что бактерия обладает способностью к продукции и накоплению в питательной среде не менее 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее 1 г/л целевой L-аминокислоты. К L-аминокислотам относятся L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-цистеин, L-глутаминовая кислота, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).
Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, - продуцентов L-аминокислот описаны ниже.
Бактерии-продуценты L-изолейцина
В качестве бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-изолейцина, могут быть упомянуты следующие штаммы: штамм Е.coli AJ12919 (выложенная заявка Японии №8-47397); штаммы Е.coli VL1892 и КХ141 (ВКПМ В-4781) (патент США 5658766); штаммы Е. coli H-9146 (FERM ВР-5055) и Е.coli Н-9156 (FERM ВР-5056) (патент США 5695972); штаммы Е.coli H-8670 (FERM ВР-4051) и Н-8683 (FERM ВР-4052) (патент США 5460958); штамм Е.coli FERM ВР-3757 (патент США 5474918) и подобные им. Штамм ВКПМ В-3996, в котором амплифицирован оперон ilv, (штамм TDV5) также является предпочтительным примером бактерии-продуцента L-изолейцина (Hashiguchi К. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63(4), 672-9).
Бактерии-продуценты L-гистидина
В качестве бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-гистидина, могут быть упомянуты следующие штаммы: штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В-12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им.
Бактерии-продуценты L-треонина
В качестве бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-треонина, могут быть упомянуты следующие штаммы: штамм Е.coli TDH6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР1149911А) и подобные им.
Бактерии-продуценты L-триптофана
В качестве бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-триптофана, могут быть упомянуты следующие штаммы: штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по триптофанил-тРНК синтетазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, не чувствительный к ингибированию серином по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), дефицитные по ферменту триптофаназе (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором увеличена способность к продукции фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 97/08333, патент США 6319696) и подобные им.
Указанные выше штаммы-продуценты L-аминокислот в дальнейшем могут быть модифицированы с целью повышения степени ассимиляции (утилизации) пентоз и глюкозы или с целью повышения способности к биосинтезу L-аминокислот с помощью широкого спектра методов, хорошо известных специалисту в данной области.
Степень повышения утилизации пентоз может быть повышена амплификацией генов, принимающих участие в ассимиляции пентоз, таких как гены araFG и araBAD для арабинозы, и гены xylE и xylAB(RT) для ксилозы, или получением мутаций в системе ассимиляции глюкозы (PTS и non-PTS), таких как мутация pstG (Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, Jul. 56:1-2, 120-5).
Способность к биосинтезу бактерий-продуцентов L-аминокислот может быть в дальнейшем улучшена путем увеличения экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-аминокислот. Примерами таких генов являются гены оперона ilvGMEDA, предпочтительно ген ilvA, кодирующий треониндеаминазу с повышенной устойчивостью к ингибированию L-изолейцином (патент США 5998178), для бактерий-продуцентов L-изолейцина. Также примерами таких генов являются гены гистидинового оперона, предпочтительно ген hisG, кодирующий АТФ-фосфорибозилтрансферазу, в которой чувствительность к ингибированию L-гистидином утрачена (патенты РФ 2003677 и 2119536), для бактерий-продуцентов L-гистидина. Также примерами таких генов являются гены треонинового оперона, предпочтительно ген, кодирующий аспартаткиназа-гомосериндегидрогеназу, в которой чувствительность к ингибированию L-треонином утрачена (патентная заявка Японии 1-29559), для бактерий-продуцентов L-треонина. Также примерами таких генов являются гены оперона trpEDCBA, предпочтительно ген trpE, кодирующий антранилатсинтазу с утраченной чувствительностью к L-триптофану по типу обратной связи; ген serA с утраченной чувствительностью к L-серину по типу обратной связи, для бактерий-продуцентов L-триптофана. Также способность к продукции L-триптофана может быть улучшена путем создания бактерии, дефицитной в активности ферментов, утилизирующих L-триптофан, предпочтительно триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS, или триптофаназы, кодируемой мутантным геном aroP.
К способу согласно настоящему изобретению относится способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии-продуцента L-аминокислоты в питательной среде с целью продукции и накопления указанной L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости, при этом питательная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-изолейцина, включающий стадии выращивания бактерии-продуцента L-изолейцина в питательной среде с целью продукции и накопления L-изолейцина в питательной среде, и выделения L-изолейцина из культуральной жидкости, при этом питательная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-гистидина, включающий стадии выращивания бактерии-продуцента L-гистидина в питательной среде с целью продукции и накопления L-гистидина в питательной среде, и выделения L-гистидина из культуральной жидкости, при этом питательная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии-продуцента L-треонина в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде, и выделения L-треонина из культуральной жидкости, при этом питательная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-триптофана, включающий стадии выращивания бактерии-продуцента L-триптофана в питательной среде с целью продукции и накопления L-триптофана в питательной среде, и выделения L-триптофана из культуральной жидкости, при этом питательная среда содержит смесь глюкозы и пентоз.
Смесь пентоз, таких как ксилоза и арабиноза, вместе с гексозами, такой как глюкоза, может быть получена из неиспользуемых источников биомассы. Глюкоза, ксилоза, арабиноза и другие углеводороды могут быть высвобождены из растительной биомассы в результате обработки паром и/или с помощью гидролиза концентрированной кислотой, разбавленной кислотой, гидролиза с использованием ферментов, таких как целлюлаза, щелочной обработки. В случае, когда субстратом является целлюлозный материал, целлюлоза может быть гидролизована до сахаров как раздельно, так и одновременно с ее ферментацией в L-аминокислоты. Поскольку гемицеллюлоза обычно гидролизуется легче, чем целлюлоза, желательно прегидролизовать целлюлозный материал, выделить пентозы, а затем гидролизовать целлюлозу путем обработки паром, кислотой, щелочью, целлюлазой или их комбинацией, с получением глюкозы.
В настоящем исследовании была использована смесь с различными соотношениями глюкозы, ксилозы и арабинозы в качестве приближения к составу сырьевой смеси глюкозы и пентоз, которая может быть получена из растительных гидролизатов. Содержание в смеси каждой из пентоз варьировалось в пределах от 12% до 50% от общего содержания углеводов (см. Примеры).
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста.
К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, сахароза, арабиноза, ксилоза, а также другие пентозы и гексозы, которые способны утилизироваться бактерией-продуцентом L-аминокислоты. Глюкоза, ксилоза, арабиноза и другие углеводы могут быть частью сырьевой смеси сахаров, полученной из биомассы целлюлозы.
К пентозам, подходящим для ферментации в настоящем изобретении, относятся ксилоза и арабиноза, но круг пентоз не ограничивается только ими.
В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения. Некоторые питательные добавки могут быть, при необходимости, добавлены в питательную среду. Например, если микроорганизму для роста необходим треонин (ауксотрофия по треонину), соответствующее количество треонина может быть добавлено в питательную среду для выращивания.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 42°С, предпочтительно от 30 до 38°С. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.
Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение более детально описано ниже со ссылкой на примеры.
Пример 1. Получение L-изолейцина с использованием бактерии-продуцента L-изолейцина методом ферментации смеси глюкозы и пентоз.
В качестве штамма для продукции L-изолейцина методом ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli TDV5 - продуцент L-изолейцина. Штамм Е.coli TDV5 является производным штамма TDH6/pVIC40 (ВКПМ В-3996), в котором дополнительно амплифицирован оперон ilv (плазмида pMWD5) (Hashiguchi К. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63(4), 672-9).
Для получения посевной культуры штамм выращивали при 37°С в течение 7 часов в среде LB, а затем добавляли в среду для ферментации в соотношении 1/20 (v/v). 2 мл посевной культуры переносили в пробирки 20×200 мм со средой для ферментации, содержащей смесь различных сахаров, и выращивали при 37°С в течение 72 часов на роторной мешалке. После процедуры выращивания накопленное в среде количество L-изолейцина определяли методом ТСХ. Для этого использовали пластины для ТСХ 10×15 см, покрытые слоем силикагеля Сорбфил (0.11 мм) без флуоресцентного красителя (АО Сорбполимер, Краснодар, Россия). Хроматографию пластин проводили в подвижной фазе пропан-2-ол:этилацетат:водный аммоний (25%):вода = 80:80:25:50 (v/v). В качестве визуализирующего агента использовали раствор нингидрина (2%) в ацетоне, Результаты (данные по крайней мере трех независимых экспериментов) представлены в Таблице 2.
| Состав среды для ферментации (г/л): | |
| Углеводы | 40.0 |
| (NH4)2SO4 | 18.0 |
| К2HPO4 | 2.0 |
| MgSO4×7H2O | 1.0 |
| Тиамин HCl | 0.02 |
| СаСО3 | 25.0 |
Сахара и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО3 стерилизовали при 180°С в течение 2 часов. Значение рН соответствовало 7.0.
| Таблица 2. | ||||
| Углеводы | OD540 | L-изолейцин,г/л | ||
| D-глюкоза | L-арабиноза | D-ксилоза | ||
| 6% | - | - | 16.0±2.3 | 15.0±0.6 |
| - | 6% | - | 10.6±1.3 | 5.2±0.3 |
| - | - | 6% | 11.1±0.4 | 8.4±0.5 |
| 3% | 3% | - | 11.9±2.0 | 9.5±2.8 |
| 3% | - | 3% | 14.1±0.3 | 12.8±1.9 |
| 3% | 1.5% | 1.5% | 12.8±1.5 | 11.8±1.8 |
| 1.5% | 3% | 1.5% | 12.7±1.2 | 10.4±2.3 |
| 1.5% | 1.5% | 3% | 14.1±1.1 | 11.8±0.5 |
Как видно из Таблицы 2, штамм Е.coli TDV5 - продуцент L-изолейцина - способен эффективно утилизировать пентозы в смеси с глюкозой и продуцировать L-изолейцин в количестве, сравнимом с количеством L-изолейцина, получающемся при ферментации с использованием только глюкозы.
Пример 2. Получение L-гистидина с использованием бактерии-продуцента L-гистидина методом ферментации смеси глюкозы и пентоз.
В качестве штамма для продукции L-гистидина методом ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli 80 - продуцент L-гистидина. Штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270) подробно описан в патенте РФ 2119536.
Для получения посевной культуры штамм выращивали на роторной мешалке (250 об/мин) при 27°С в течение 6 часов в пробирках объемом 40 мл, содержащих 2 мл L-бульона с 3% глюкозой. Затем в среду для ферментации добавляли 2 мл (5%) посевного материала. Ферментацию проводили на роторной мешалке (250 об/мин) при 27°С в течение 65 часов в пробирках объемом 40 мл, содержащих 2 мл среды для ферментации.
После процедуры выращивания накопленное в среде количество L-гистидина определяли методом бумажной хроматографии. Состав подвижной фазы следующий: бутанол:ацетат:вода = 4:1:1 (v/v). В качестве визуализирующего агента использовали раствор нингидрина (0.5%). Результаты приведены в Таблице 3.
| Состав среды для ферментации (г/л): | |
| Углеводы | 100.0 |
| Mameno-TN | 0.2 |
| L-треонин | 0.8 |
| (NH4)2SO4 | 25.0 |
| К2HPO4 | 2.0 |
| MgSO4×7H2O | 1.0 |
| FeSO4×7H2O | 0.01 |
| MnSO4×5H2O | 0.01 |
| Тиамин HCl | 0.001 |
| Бетаин | 2.0 |
| СаСО3 | 6.0 |
Сахара, L-треонин и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО3 стерилизовали при 110°С в течение 30 мин. Значение рН 6.0 установили с помощью КОН перед стерилизацией.
| Таблица 3. | ||||
| Углеводы | OD450 | L-гистидин, г/л | ||
| D-глюкоза | L-арабиноза | D-ксилоза | ||
| 10% | - | - | 33.8 | 13.0 |
| - | 10% | - | 30.5 | 14.2 |
| - | - | 10% | Отсутствие роста | - |
| 5% | 5% | - | 29.0 | 13.6 |
| 5% | - | 5% | 32.6 | 7.8 |
| 5% | 2.5% | 2.5% | 28.9 | 10.2 |
| 5% | 1.25% | 3.75% | 28.0 | 6.6 |
| 5% | 3.75% | 1.25% | 29.0 | 13.9 |
| 2.5% | 3.75% | 3.75% | 25.7 | 9.0 |
Как видно из Таблицы 3, штамм Е.coli 80 - продуцент L-гистидина способен эффективно утилизировать пентозы в смеси с глюкозой и продуцировать L-гистидин в количестве, сравнимом с количеством L-гистидина, получающемся при ферментации с использованием только глюкозы.
Пример 3. Получение L-треонина с использованием бактерии-продуцента L-треонина методом ферментации смеси глюкозы и пентоз.
В качестве штамма для продукции L-треонина методом ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli TDH6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) - продуцент L-треонина. Штамм Е.coli TDH6/pVIC40 подробно описан в патенте США 5175107.
Для получения посевной культуры штамм выращивали на роторной мешалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках объемом 40 мл (⊘ 18 мм), содержащих 2 мл L-бульона с 4% глюкозой. Затем в среду для ферментации добавляли 2 мл (5%) посевного материала. Ферментацию проводили на роторной мешалке (250 об/мин) при 32°С в течение 24 часов в пробирках объемом 40 мл, содержащих 2 мл среды для ферментации.
После процедуры выращивания накопленное в среде количество L-треонина определяли методом ТСХ. Хроматографию пластин, покрытых слоем силикагеля Сорбфил (АО Сорбполимер, Краснодар, Россия), проводили в подвижной фазе пропан-2-ол:ацетон:вода:водный аммоний (25%) = 25:25:7:6 (v/v). В качестве визуализирующего агента использовали раствор нингидрина (2%) в ацетоне. Результаты (данные по крайней мере 3 независимых экспериментов) приведены в Таблице 4.
| Состав среды для ферментации (г/л): | |
| Углеводы | 40.0 |
| (NH4)2SO4 | 10.0 |
| К2HPO4 | 1.0 |
| MgSO4×7H2O | 0.4 |
| FeSO4×7H2O | 0.02 |
| MnSO4×5H2O | 0.02 |
| Тиамин HCl | 0.0002 |
| Дрожжевой экстракт | 1.0 |
| СаСО3 | 20.0 |
Сахара и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО3 стерилизовали при 180°С в течение 2 часов. Значение рН соответствовало 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.
| Таблица 4. | ||||
| Углеводы | OD450 | L-треонин, г/л | ||
| D-глюкоза | L-арабиноза | D-ксилоза | ||
| 4% | - | - | 13.8±0.5 | 14.1±1.0 |
| - | 4% | - | 15.8±0.2 | 14.9±0.4 |
| - | - | 4% | 13.1±0.1 | 16.6±0.1 |
| 2% | 2% | - | 13.7±0.2 | 15.9±0.3 |
| 2% | - | 2% | 14.2±0.5 | 14.5±1.1 |
| 2% | 1% | 1% | 13.3±0.4 | 15.8±0.6 |
| 1% | 2% | 1% | 14.6±0.3 | 16.6±0.8 |
| 1% | 1% | 2% | 15.6±0.7 | 12.4±1.9 |
Как видно из Таблицы 4, штамм Е.coli TDH6/pVIC40 - продуцент L-треонина способен эффективно утилизировать пентозы в смеси с глюкозой и продуцировать L-треонин в количестве, сравнимом с количеством L-треонина, получающемся при ферментации с использованием только глюкозы.
Пример 4. Получение L-триптофана с использованием бактерии-продуцента L-триптофана методом ферментации смеси глюкозы и пентоз.
В качестве штамма для продукции L-триптофана методом ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli SV164(pGH5) - продуцент L-триптофана. Штамм Е.coli SV164(pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 и Европейском патенте 0662143.
Для получения посевной культуры штамм выращивали на роторной мешалке (250 об/мин) при 37°С в течение 18 часов в пробирках объемом 40 мл (0 18 мм), содержащих 3 мл L-бульона с 4% глюкозой и 20 мг/мл тетрациклина (маркер для плазмиды pGH5). Затем к 3 мл среды для ферментации, содержащей тетрациклин (20 мг/мл), в пробирках 20×200 мл добавляли 0.3 мл полученного посевного материала и выращивали при 37°С в течение 48 часов на роторной мешалке (250 об/мин).
Состав среды для ферментации приведен в Таблице 5.
| Таблица 5. | ||
| Секция | Компонент | Конечная концентрация, г/л |
| А | КН2PO4 | 1.5 |
| NaCl | 0.5 | |
| (NH4)2SO4 | 1.5 | |
| L-метионин | 0.05 | |
| L-фенилаланин | 0.1 | |
| L-тирозин | 0.1 | |
| Mameno (общий азот) | 0,07 | |
| В | Глюкоза | 40.0 |
| MgSO4×7Н2О | 0.3 | |
| С | CaCl2 | 0.011 |
| D | FeSO4×7H2O | 0.075 |
| Цитрат натрия | 1.0 | |
| Е | Na2MoO4×2H2O | 0.00015 |
| Н3ВО3 | 0.0025 | |
| CoCl2×6Н2O | 0.00007 | |
| CuSO4×5H2O | 0.00025 | |
| MnCl2×4Н2O | 0.0016 | |
| ZnSO4×7H2O | 0.0003 | |
| F | Тиамин HCl | 0.005 |
| G | СаСО3 | 30.0 |
| Н | Пиридоксин | 0.03 |
Секция А имела рН 7.1, установленный с помощью NH4OH. Каждую секцию стерилизовали раздельно.
После процедуры выращивания накопленное в среде количество L-триптофана определяли методом ТСХ. Для этого использовали пластины для ТСХ 10×15 см, покрытые слоем силикагеля Сорбфил (0.11 мм) без флуоресцентного красителя (АО Сорбполимер, Краснодар, Россия). Хроматографию пластин проводили в подвижной фазе пропан-2-ол: этилацетат:водный аммоний (25%):вода = 40:40:7:16 (v/v). В качестве визуализирующего агента использовали раствор нингидрина (2%) в ацетоне. Результаты (данные по крайней мере трех независимых экспериментов) представлены в Таблице 6.
| Таблица 6. | ||||
| Углеводы | OD560 | L-триптофан,г/л | ||
| D-глюкоза | L-арабиноза | D-ксилоза | ||
| 4% | - | - | 10.5±0.1 | 4.7±0.2 |
| - | 4% | - | 1.6±0.1 | Следовые |
| количества | ||||
| - | - | 4% | 0.7±0.1 | Следовые |
| количества | ||||
| 2% | 2% | - | 9.1±1.0 | 5.2±0.1 |
| 2% | - | 2% | 9.1±0.2 | 3.8±0.1 |
| - | 2% | 2% | 6.2±1.1 | 0.9±0.1 |
| 1.33% | 1.33% | 1.33% | 9.2±0.3 | 4.4±0.1 |
| 0.4% | 1.8% | 1.8% | 3.6±0.2 | 3.8±0.1 |
Как видно из Таблицы 6, штамм Е.coli SV164(pGH5) - продуцент L-триптофана способен эффективно утилизировать пентозы в смеси с глюкозой и продуцировать L-триптофан в количестве, сравнимом с количеством L-триптофана, получающемся при ферментации с использованием только глюкозы.
1. Способ получения L-аминокислот, включающий стадии выращивания бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, - продуцента L-аминокислоты в питательной среде - и выделения полученной и накопленной L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающийся тем, что питательная среда содержит смесь глюкозы и пентоз.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пентозами являются арабиноза и ксилоза.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что смесь сахаров является сырьем для ферментации, полученным из биомассы целлюлозы.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактерия - продуцент L-аминокислоты - модифицирована с целью повышения степени утилизации пентоз.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-изолейцин.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанная бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-изолейцина.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-гистидин.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанная бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-гистидина.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-треонин.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-треонина.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-триптофан.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза L-триптофана.
