Цереброзид-цереброзидсульфатсодержащий липидный комплекс и способ его получения

Группа изобретений относится к медицине, биотехнологии, косметологии и может быть использована в технологии получения липидных комплексов, в частности цереброзид-цереброзидсульфатсодержащих, которые могут быть применены при производстве различных форм лекарственных препаратов и косметических средств. Цереброзид-цереброзидсульфатсодержащий липидный комплекс содержит, мас.%: холестерин, триглицериды и ганглиозиды - 6,0-14,7, цереброзид - 25,0-57,0, фосфатидилэтаноламин - 7,2-24,1, фосфатидилхолин и сфингомиелины - 8,8-29,2, цереброзидсульфат - 7,0-21,0. Способ получения цереброзид-цереброзидсульфатсодержащего липидного комплекса включает гомогенизацию спинного или головного мозга животных в охлажденном ацетоне, фильтрацию, перемешивании до гомогенного состояния, фильтрацией, повторную обработку отфильтрованного осадка ацетоном из расчета 1,0-1,5 объемов ацетона на 1 обрабатываемого сырья, одно- или двухстадийную экстракцию отфильтрованного осадка этанолом, сначала при 20-30°С, а затем, при наличии второй стадии, при 40-70°С и последующей кристаллизацией и/или перекристаллизацией из этанола и/или промывкой холодным ацетоном. Способ обеспечивает получение липидного комплекса с повышенной биологической активностью. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, косметологии и непосредственно к способам получения липидов из природного сырья, в частности цереброзидсодержащих липидных комплексов, применяемых в медицине и косметологии.

Цереброзиды - группа липидов, которых по своему строению относят как к гликолипидам, так и к сфинголипидам, поскольку они в своей структуре содержат и сахар, и сфингозин (ненасыщенный аминоспирт). Из опубликованных материалов известно, что сфинголипиды содержатся в мембранах растительных и животных клеток. Особенно богата ими нервная ткань и, в частности, мозг (Shapiro et al, "Stadies of Sphingolipids, YII, Synthesis and Configuration of Natural Sphingomielins" J. Am. Chem. Soc., V.84, P.1047-1050, 1962). Цереброзиды также содержатся в мембранах нервных клеток. К группе цереброзидов относится и цереброзидсульфат, обнаруженный в спинном и головном мозге млекопитающих, а также в незначительных количествах в почках и сетчатках глаза (F.F.Farooqu, /1982/ Adv. LipidRes. V.18, Р.626-631).

Как видно их вышеуказанного, сырьем для цереброзидов может быть выбрана растительная или животная ткань. Растительная ткань, в частности экстракт листьев растения Гинго Билоба, используется, например, в известном способе для получения экстракта данного растения, содержащего 30-40 мас.% гликолипидов (моногалактодиглицеридов и дигалактодиглицеридов) и 3-10 мас.% галактоцереброзида (ЕР 0731708, А 61 К 35/78, 2001). Животная ткань, преимущественно нервная ткань спинного и головного мозга животных, применяется и для получения других представителей класса цереброзидов, например нервона по способу, описанному в заявке на патент, основанному также на экстрактивном извлечения целевого продукта из исходного сырья - головного мозга свиней (RU 94012010 A1, А 61 К 35/30, 1996). Данный способ многостадиен и включает экстракцию животного сырья 2-3 объемами ацетона при 30-40°С в течение 10-12 часов, отделение экстракта и фильтрацию, осаждение охлажденного фильтрата 4-5 объемами этилового спирта при 6-10°С в течение 2-4 часов, экстракцию фильтрата 2-4 объемами серного эфира при 20-25°С в течение 4-6 часов, вакуумную отгонку растворителя, растворение остатка в пиридине при 50-60°С и выделение целевого продукта при охлаждении раствора при 0-2°С. Получаемый данным способом продукт подвергают дополнительной очистке промыванием его ацетоном при рН 3-4, растворением в метиловом спирте и перекристаллизацией из смеси равных объемов хлороформа и ацетона.

Экстракционный метод положен и в основу другого известного способа обработки головного мозга животных, но уже крупного рогатого скота /RU 2192265, А 61 К 35/30, 2002/. Данным способом получается не конкретный продукт, а липидный комплекс, включающий и цереброзиды. Данный способ включает стадию гомогенизации ткани мозга в охлажденном ацетоне, фильтрацию, суспендирование осадка в ацетоне, повторную фильтрацию, экстракцию осадка смесью хлороформа с этанолом и последующее осаждение фосфолипидов охлажденным ацетоном. Получаемый данным способом комплекс содержит, мас.%: холестерина - 16,6, цереброзидов - 16,6, фосфатидилэтаноламина - 16,6, фосфатидилхолина - 8,3, сфингомиелина - 8,3, фосфатидилсерина - 6,25, фосфатидилинозита - 6,25. Комплекс, получаемый данным способом, как сказано в описании, может быть использован для получения липосомных форм лекарственных препаратов. К недостаткам данного способа можно отнести длительность его осуществления (около 20 часов), использование значительных количеств ацетона, что делает процесс пожаро- и экологически опасным. Кроме того, продукт содержит сложную смесь глицеролипидов и сфинголипидов, но не содержит биологически активный цереброзид-сульфат, являющийся эффективным биологически активным веществом. Кроме того, присутствующие в известном составе глицерофосфолипиды содержат много ненасыщенных жирных кислот, которые делают смесь легко окисляемой, что ограничивает его применение в ряде прогрессивных областей медицины.

Для расширения ассортимента биологически активных липидных средств и повышения их эффективности создан новый биологически активный комплекс, получаемый из головного или спинного мозга свиньи, содержащий, мас.%: холестерин, триглицериды, ганглиозиды 6,0,-14,7, цереброзид 25,0-57,0, фосфатидилэтаноламин 7,2,-24,1, фосфатидилхолин и сфингомиелин 8,8-29,2, цереброзидсульфат 7,0-21,0.

Объектом изобретения также является новый способ получения цереброзид-цереброзидсульфатсодержащего липидного комплекса из головного или спинного мозга свиньи, который включает: обработку исходного сырья 1-1,5 объемами охлажденного ацетона из расчета на 1 массовую часть исходного сырья при перемешивании до образования гомогенного состояния, фильтрацию и обработку отфильтрованного осадка охлажденным ацетоном при тех же условиях, затем экстракцию этанолом при 20-30°С при использовании 2-4-х объемов этанола на 1 массовую часть отфильтрованного осадка и кристаллизацию из этанола. Способ может дополнительно включать повторную экстракцию этанолом отфильтрованного осадка сначала при 40-70°С при использовании также 2-4-х объемов этанола на 1 массовую часть отфильтрованного осадка. Перемешивание в охлажденном ацетоне проводится предпочтительно со скоростью 2000-3000 об/мин. Дополнительно получаемый кристаллический продукт подвергают перекристаллизации из этанола или промывают холодным ацетоном.

Существенной особенностью нового комплекса сложного состава является присутствие в нем наряду с цереброзидом и цереброзидсульфата, что повышает его эффективность как биологически активного средства по сравнению с известными аналогичными комплексами. Состав получаемого комплекса находится в прямой зависимости от способа его получения.

Выбор в качестве исходного сырья тканей головного или спинного мозга свиньи обоснован повышенным содержанием в них цереброзидов, а также содержанием в них биологически активного цереброзидсульфата, не обнаруженного в тканях других животных Важным признаком способа являются условия проведения гомогенизации сырья с применением экспериментально подобранных количеств охлажденного ацетона, что обеспечивает сначала максимальное обезвоживание сырья, а затем после фильтрации осадка и его повторной обработки охлажденным ацетоном - максимальное экстракционное отделение нейтральных липидов и холестерина.

Данный процесс в новом способе для гомогенизации необходимо проводить при перемешивании. Предпочтительной является скорость перемешивания, составляющая 2000-3000 об/мин, что позволяет значительно повысить эффективность процесса и сократить продолжительность этого этапа до 10 минут. Существенным признаком нового способа является применение в качестве экстрагента этанола в экспериментально подобранном количестве, составляющем 2-4 объема на 1 массовую часть отфильтрованного осадка. Благодаря комплексному использованию всех признаков нового способа удается получать продукт с повышенной биологической активностью, характеризуемый высоким содержанием цереброзида и цереброзидсульфата. Кроме того, новый способ экологически приемлем и технологически безопасен, поскольку в нем в качестве экстрагента используется экологически безопасный этанол, и, кроме того, используемый для гомогенизации ацетон применяется в малых количествах. Используемые в процессе чистые органические растворители подвергаются регенерации и рециклизации, что подчеркивает экономичность процесса и его экологическую безопасность. Особым достоинством способа является высокое содержание в комплексе основных компонентов: 25-57 мас.% цереброзида и 7-21 мас.% цереброзидсульфата.

Ниже изобретение иллюстрируется примерами 1-4.

Пример 1.

500 г свежезамороженного головного мозга свиньи размораживают, заливают ацетоном, имеющим температуру минус 20°С, в количестве 750 мл, что составляет 1,5 объема по отношению к исходному влажному сырью, гомогенизируют при перемешивании со скоростью 3000 об/мин, в течение 10 мин и отфильтровывают под вакуумом. После этого отфильтрованный осадок повторно заливают ацетоном, имеющим температуру минус 20°С в том же количестве /750 мл/ и гомогенизируют осадок перемешиванием в течение 20 мин и отфильтровывают под вакуумом. Ацетон сливают и утилизируют, а к отфильтрованным 125 г осадка приливают 500 мл этанола, что составляет 4 объема по отношению к осадку, и экстрагируют в течение 3 часов при температуре 30°С. Полученный спиртовой экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при +18°С в течение 24 часов до образования белого кристаллического осадка, который отфильтровывают. Получают 3 г кристаллического белого вещества, содержащего следующие компоненты, мас.%:, цереброзида - 25, цереброзидсульфата - 7,0, 29,2 - смеси фосфатидилхолина и сфингомиелина - 29,2, смеси холестерина, триглицеридов и ганглиозидов - 14,7, фосфатидилэтаноламина - 24,3.

Пример 2.

500 г свежезамороженного головного мозга свиньи размораживают и двукратно гомогенизируют в 500 мл ацетона при температуре минус 15°С аналогично примеру 1. Затем 100 г полученного осадка о мозговой ткани дважды подвергают экстракции спиртом. При этом первую экстракцию осуществляют при температуре 25°C, для чего к осадку добавляют 300 мл этанола, что составляет 3 объема по отношению к осадку, взятому для спиртовой экстракции, и перемешивают в течение двух часов. После экстракции спиртовой экстракт отделяют от отфильтрованного осадка и утилизируют, а отфильтрованный осадок снова смешивают с 200 мл этанола, что составляет 2 объема по отношению к осадку, полученному после последней ацетоновой гомогенизации. Экстракцию проводят при температуре 60°С в течение 2 часов, после чего отделяют спиртовой экстракт от оставшейся твердой массы методом фильтрации. Конечный спиртовой экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при температуре 20°С в течение 24 часов до образования кристаллического осадка, который отделяют от маточника фильтрацией. Получают 2 г кристаллического белого вещества, содержащего следующие компоненты, мас.%: цереброзида - 37, цереброзидсульфата - 9,0, смеси холестерина, триглицеридов, танглиозидов - 6,9, фосфатидилэтаноламина - 24,1, смеси сфингомиелина и фосфатидилхолина - 23.

Пример 3.

500 г свежезамороженного головного мозга свиньи размораживают и подвергают двухстадийной гомогенизации ацетоном по способу, описанному в примере 1. 100 г полученного осадка мозговой ткани подвергают двухстадийной экстракции этанолом аналогично примеру 2. Отделяют спиртовой экстракт от твердого остатка методом фильтрации. Экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при температуре 20°С в течение 24 часов до образования кристаллического белого осадка. Кристаллический осадок отфильтровывают от маточника и подвергают перекристаллизации из этилового спирта. К полученным 2 г кристаллического вещества добавляют 50 г этанола и перемешивают при температуре 40°С в течение 1 часа. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и сушат под вакуумом. Получают 1,5 г кристаллического вещества, содержащего следующие компоненты, мас.%: цереброзида - 57, цереброзидсульфата - 21, смеси холестерина, тригликозидов и танглиозидов - 6,0, фосфатидилэтаноламина - 7,2, смеси фосфатидилхолина и сфингомиелина - 8,8.

Пример 4.

500 г свежезамороженного спинного мозга свиньи размораживают и подвергают двухстадийной гомогенизации ацетоном, затем фильтрации аналогично способу, описанному в примере 1. Затем 100 г осадка мозговой ткани подвергают одностадийной экстракции этанолом по способу, описанному также в примере 1. Затем отделяют спиртовой экстракт от твердого остатка мозговой ткани методом фильтрации. Экстракт направляют на стадию кристаллизации, которую осуществляют при 20°С в течение 24 часов до получения кристаллического осадка. Кристаллический осадок отделяют от маточника и проводят перекристаллизацию из ацетона. К 2 г кристаллического вещества добавляют 30 г ацетона при температуре минус 20°С и перемешивают в течение 1 часа. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и сушат под вакуумом. Получают 1,6 г вещества, следующего состава, мас.%: цереброзида - 46, цереброзидсульфата - 15, холестерина, триглицеридов и ганглиозидов - 7,5, фосфатидилэтаноламина - 22,5, фосфатидилхолина и сфингомиелина - 9,0.

1. Цереброзид-цереброзидсульфатсодержащий липидный комплекс, получаемый из головного или спинного мозга свиньи, характеризуемый содержанием холестерина, триглицеридов, ганглиозидов, цереброзида, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, сфингомиелина, цереброзидсульфата в следующем весовом соотношении, мас.%:

Холестерин, триглицериды ганглиозиды	6,0-14,7
Цереброзид	25,0-57,0
Фосфатидилэтаноламин	7,2-24,1
Фосфатидилхолин, сфингомиелин	8,8-29,2
Цереброзидсульфат	7,0-21,0

2. Способ получения цереброзид-цереброзидсульфатсодержащего липидного комплекса, характеризующийся тем, что исходное сырье - ткань головного или спинного мозга свиньи обрабатывают при перемешивании охлажденным ацетоном из расчета 1,0-1,5 объемного количества ацетона на 1 мас.ч. исходного сырья до образования гомогенной массы, которую затем отфильтровывают и отфильтрованный осадок обрабатывают при перемешивании до гомогенного состояния охлажденным ацетоном из расчета 1-1,5 объемного количества ацетона на 1 мас.ч. отфильтрованного осадка, после чего гомогенную смесь повторно фильтруют, отфильтрованный осадок подвергают экстракции 2-4 объемами этанола на 1 мас.ч. отфильтрованного осадка при 20-30°С и выделяют целевой продукт кристаллизацией из этанола.

3. Способ по п.2, характеризующийся тем, что осадок, отфильтрованный после первой стадии экстракции, дополнительно экстрагируют этанолом при температуре 40-70°С.

4. Способ по п.2, характеризующийся тем, что выделенный после кристаллизации из этанола целевой продукт дополнительно промывают холодным ацетоном.

5. Способ по п.2, характеризующийся тем, что выделенный целевой продукт дополнительно подвергают перекристаллизацией из этанола.

6. Способ по п.2, характеризующийся тем, что сырье при обработке ацетоном перемешивают со скоростью 2000-3000 об/мин.