Способ получения кальция фруктозодифосфата

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения кальция фруктозодифосфата. Кальция фруктозодифосфат используют для приготовления лекарственных препаратов для лечения и профилактики сахарного диабета, нарушения сердечно-сосудистой и нервной системы, отравлений токсическими веществами. Предложенный способ получения кальция фруктозодифосфата включает трансформацию дрожжами Saccharomyces carlsbergensis при 34-36°С в присутствии одновременно толуола, пропанола и изопропанола в количестве 0,4-0,5% каждого. Целевой продукт выделяли из супернатанта при температуре 85°С в присутствии хлористого кальция в течение 15-20 мин с последующей промывкой этиловым спиртом и сушкой. Выход основного продукта (по фосфору органическому) на субстрат увеличен на 30%, способ обеспечивает стабильность процесса трансформации, повышение производительности и качества продукта.

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства кальция фруктозодифосфата (Са-ФДФ).

Кальция фруктозодифосфат - смесь кальциевых солей фосфорных эфиров моносахаридов с преобладающим количеством монокальциевой соли фруктозо-1,6 дифосфорной кислоты. Кальция фруктозодифосфат содержит как действующее начало органически связанный фосфор и кальций. Кальция фруктозодифосфат используют для приготовления лекарственных препаратов для лечения и профилактики сахарного диабета, нарушений сердечно-сосудистой и нервной системы, отравлений токсическими веществами, в частности для создания антиалкогольного препарата "Фруктогликол-комплекс" - биологически активной пищевой добавки, таблеток "Феррокаль" пролонгированного действия (общеукрепляющее и антианемическое средство) и ветеринарного препарата "Пуриветин", обладающего иммуностимулирующим действием.

Описано получение фруктозо-1-6-дифосфата путем биологической трансформации с использованием иммобилизированных клеток [1, 2].

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ получения гексозофосфата с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae 6-11 генераций и толуола в качестве агента, повышающего проницаемость клеток [3, 4].

Согласно этому способу ферментацию проводили при 37°С в присутствии толуола в течение 3 часов.

В состав инкубационной смеси входили толуол, двузамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий и сахароза в следующем соотношении 2,4:2:6:10, а дрожжевая культура вносилась в питательную смесь в количестве 0,4 объема на 1 объем питательной среды. По окончании фосфорилирования дрожжевой белок осаждали путем коагуляции в кислой среде (рН 5,0-5,2) при температуре 85-90°С и отделяли фильтрацией, затем пропускали через уголь марки ОУ-Б в кислой среде при рН 5,8-6,2. Полученный раствор, содержащий гексозофосфаты, стерилизовали и использовали для экспериментального изучения в виде 6%-ного стерильного раствора.

Оптимальный выход основного продукта (по фосфору органическому) - 8,26 г на 100 г сахарозы.

Однако указанный способ касался получения препарата гексозофосфат и характеризовался невысокой производительностью, кроме того, в процессе культивирования добавлялось очень большое количество толуола.

В предлагаемом изобретении в качестве продуцента использовали дрожжи Saccharomyces carlsbergensis 776 (2-10 генерации).

Способ получения Са-ФДФ осуществляли следующим образом: дрожжи помещали в фосфатный буфер (рН-7,0), содержащий сахарный песок, а в качестве веществ, повышающих проницаемость клеточной стенки дрожжей, использовали смесь толуола, н-пропанола и изопропанола.

Процесс проводили в течение 2-2,5 часов при температуре 35°С. По окончании трансформации дрожжи отделяли центрифугированием, а в супернатант добавляли хлористый кальций при температуре 85°С. Полученный осадок отделяли, промывали этанолом и сушили при 50°С.

Получали 0,55 кг Са-ФДФ с содержанием органического фосфора 10-12% на сухую массу.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1

Процесс трансформации осуществляли в аппарате вместимостью 15 л, снабженном мешалкой. На 5 кг отстоявшихся дрожжей Saccharomyces carlsbergensis 776 4 генерации готовили 2,5 л фосфатного буфера (0,3 кг 82% фосфорной кислоты нейтрализовали до рН 7,0 25% едким натром). В полученную смесь, содержащую дрожжи и фосфатный буфер, вносили 560 г сахарного песка. Общий объем смеси 8 л. Процесс проводили при 35°С в течение 2,0-2,5 часов в присутствии 0,5% толуола, 0,5% н-пропанола и 0,5% изопропанола.

По окончании трансформации дрожжи отделяли на сепараторе. Супернатант нагревали на водяной бане до 85°С, добавляли 300 г безводного хлористого кальция и выдерживали при этой температуре 15-20 мин. Осадок отделяли, промывали 2 л этанола 96% и сушили при 50°С. Получили 0,55 кг кальция фруктозодифосфат с содержанием органического фосфора 11%. Выход основного продукта (по фосфору органическому) составлял 10,8 г на 100 г сахарного песка.

Пример 2

Условия трансформации и выделения те же, что в примере 1, за исключением количества поверхностно-активных веществ.

В смесь дрожжей, буфера и сахарного песка добавляли по 0,3% толуола, н-пропанола и изопропанола. Трансформация проходила не полностью, продукт был некачественный, содержание органического фосфора 5-6%.

Пример 3

Условия трансформации и выделения те же, что в примере 1, за исключением количества поверхностно-активных веществ. В смесь дрожжей, буфера и сахарного песка добавляли по 0,7% толуола, н-пропанола и изопропанола. Образование продукта не наблюдали в связи с лизисом дрожжевых клеток.

Источники информации

1. Патент Италии C 12N №3709718, 1986.

2. Патент Италии С 12Р №8711056, 1987.

3. Баскович Г.А. Получение препарата гексозофосфат, его состав и свойства. Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук, Л., 1973.

4. Михайлова Л.Г., Баскович Г.А. Получение препарата гексозофосфатов из дрожжей. Прикладная биохимия и микробиология, 1969, 6, 738-739.

Способ получения кальция фруктозодифосфата, предусматривающий культивирование дрожжей Saccharomyces carlgbergensis в фосфатосодержащей среде с сахарозой при содержании ее в количестве 7,5-8,0%, в присутствии толуола, пропанола и изопропанола в количестве 0,4-0,5% каждого при 34-36°С с последующим отделением дрожжей и выделением целевого продукта в виде вышеуказанной кальциевой соли при термообработке при 80-85°С в течение 15-20 мин с последующей промывкой этиловым спиртом и сушкой.