Способ получения гидролизата из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства и использованию их при изготовлении питательных сред для культивирования спирохет. Способ состоит в том, что гидролизуемый субстрат измельчают на гомогенизаторе 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Экспозиция ультразвукового облучения 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц. По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступают к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. Надосадочную жидкость разливают по флаконам, закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120°С. Способ позволяет достичь полного ферментативного гидролиза, что обеспечивает высокий рост и развитие спирохет.

 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства (обрезки, подмор, личинки трутней) и использованию их при изготовлении питательных сред для культивирования спирохет, и может быть использовано при промышленном приготовлении бактериальных вакцин.

Известен способ получения гидролизата белков крови ферментативного сухого (ГБК-С) для питательных сред тканевых культур клеток из отходов сывороточного производства, включающий измельчение 300 кг сгустков крови, соединение полученной массы с 480 л сыворотки при температуре 90°С и выдержку в течение 30 мин, охлаждение до 50°С, установление рН 7,5±0,1 путем добавления 20%-ного раствора гидроокиси натрия, 1,5% хлороформа, добавление 200 л ферментного препарата и осуществление гидролиза в течение 48-60 ч при 40-42°С, постоянно осуществляя коррекцию рН среды в пределах указанного значения. Гидролиз завершен, если через 48-60 ч в нем отсутствует нерасщепленный белок, а накопление аминного азота достигает не менее 600 мг% (см. Временное наставление по применению гидролизата, белков крови ферментативного сухого (ГБК-С) для питательных сред тканевых культур клеток, утвержденного зам. начальника Главного управления ветеринарии МСХ СССР 30.08.91 г.).

Недостатком данного способа и питательной среды (ПС) является то, что в качестве сырья использовались отходы только сывороточного производства в виде цельной крови и ее сгустков от крупного рогатого скота. Гидролиз сырья осуществлялся без предварительной химической обработки аммиаков, в результате чего не достигалось полного гидролиза, причем применялась только поджелудочная железа свиньи.

Известен способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда для культивирования клеток эукариотов, включающая обработку белоксодержащего сырья, разведенного водой, медицинским панкреатином или нативной поджелудочной железой свиньи в щелочной зоне рН 7,6-7,8 в присутствии хлороформа при 37-38°С в течение 6-7 суток, прогревание при 90°С в течение 5-10 мин, последующее осаждение высокомолекулярных соединений, фильтрование целевого продукта, при этом фермент растворяют в воде в соотношении 1:25 и перед осаждением высокомолекулярных соединений проводят обработку гидролизата 20-22%-ным раствором хлористого кальция. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов включает аминокислотную основу, комплекс витаминов, раствор Хенкса и сыворотку крови крупного рогатого скота, при этом в качестве аминокислотной основы используют ферментативный гидролизат обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов, %:

Ферментативный гидролизат
обезжиренной мозговой ткани
крупного рогатого скота	0,15-0,20
Комплекс витаминов	0,0001-0,00012
Сыворотка крови
крупного рогатого скота	5-10
Раствор Хенкса	остальное

(см. патент РФ № 2020153, кл. с 12 N 5/00, с 12 Р 21/06).

Недостатком данного способа и питательной среды является высокая стоимость получения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ получения гидролизата, предусматривающий обработку белковосодержащего сырья ферментативным гидролизом нативной поджелудочной железой в щелочной зоне в присутствии хлороформа с добавлением 20%-ного раствора гидроокиси натрия, отделение от нерастворимых примесей, инактивирование фермента, нейтрализация до рН 7,0-7,2, сушку целевого продукта, при этом в качестве белоксодержащего сырья используют отходы вакцинно-сывороточного и инкубаторного производства в виде глобулинов, или куриных эмбрионов, или сгустков крови, или фибрина, перед ферментативным гидролизом сырье измельчают, смешивают с деминерализованной водой и проводят аммиачный гидролиз 26%-ным водным раствором аммиака в течение 2 ч при 120°С, а ферментативный гидролиз ведут нативной поджелудочной железой крупного рогатого скота до содержания аминного азота 500-700 мг% при следующем соотношении химических соединений, мас.%:

Пептон	1-2
Хлорид натрия	1,0-1,2
Аммонийные соли, а также, мг%:
общий азот	1100-1400
аминный азот	200-220
триптофан	80-200

В способе деминерализованную воду смешивают в соотношении 1,5:1,0 для глобулинов, 5:1 для куриных эмбрионов и фибрина, 1,0:1,6 для сгустков крови.

В способе аммиачный гидролизат охлаждают до 45°С, рН доводят до 7 раствором соляной кислоты, а ферментативный гидролиз проводят нативной поджелудочной железой крупного рогатого скота из расчета 200-256 г/л и для глобулинов, и для сгустков крови, 83,3-166,6 г/л для куриных эмбрионов и фибрина при 42-43°С в течение 6-7 суток для глобулинов, 6 суток для куриных эмбрионов и фибрина, 4-5 суток для сгустков крови, при этом конечное накопление в целевом продукте аминного азота составляет не менее 500-700 мг% (см. пат. РФ № 2103345, кл. С 12 N 1/00, опубл. 27.01.98 г.)

Недостатком данного способа является высокая стоимость и сложность получения гидролизата. Задачей предлагаемого способа получения гидролизата является достижение полного гидролиза и снижение себестоимости продукта. Поставленная задача достигается с помощью способа. Способ получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет, предусматривающий обработку белоксодержащего сырья ферментативным гидролизом нативной поджелудочной железой, измельчение, отделение от растворимых примесей, нейтрализацию до рН 7,0-7,2, автоклавирование при 120°С в течение 1 ч, при этом в качестве белоксодержащего сырья используют продукты пчелиного производства (обрезки, подмор, личинки трутней), при этом сырье измельчают на гомогенизаторе при 3 тыс. об/мин, затем его разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5, полученную суспензию обрабатывают ультразвуком мощностью 400 Вт, причем экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А и частоте 35 кГц, по окончании ультразвукового облучения суспензию нейтрализуют раствором соляной кислоты или двууглекислым натрием с последующим гидролизом, центрифугирование при 3 тыс. оборотов в течение 5 мин.

Сущность способа получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет

Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор, личинки трутней) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Воздействие ультразвуком производят в стеклянных химических стаканах, которые опускают в водяную баню с плавающим льдом; аппарат включают и опускают экспоненциальный излучатель так, чтобы он касался поверхности жидкости. Экспозиция ультразвукового облучения 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц.

По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступают к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды.

Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. Надосадочную жидкость разливают по флаконам, закупоривают и автоклавируют в течении 1 ч при температуре 120°С.

После приготовления среды проверяют на стерильность в чашках Петри в термостате при 37°С - 1 сутки.

Примеры конкретного выполнения способа получения гидролизатов из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет

Пример 1. Культивирование спирохет проводят на мясопеченочном бульоне с добавлением ферментов поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды, для ферментативного гидролиза. Затем пробы закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120 С°.

В опыт для культивирования спирохет берутся три курицы. Две заражают штаммом СТС по 0,5 мл внутримышечно, третья служит контролем. Когда у опытных кур развиваются яркие клинические признаки заболевания (апатия, лихорадка, параличи ног и парезы крыльев), а в мазках крови обнаружены спирохеты, тогда в стерильных условиях берется кровь из-под крыльцовой вены. В боксе делают посевы в пробирки с мясопеченочным бульоном, в среду добавляют 0,1 мл инвазированной крови от больных спирохетозом кур. Культивирование проводят в термостате при температуре 37°С в аэробных условиях.

При наблюдении за средой с внесенной кровью больных спирохетозом кур устанавливают. В мясопеченочной среде в стационарных аэробных условиях на 9 день выделяют культуры спирохет в незначительных количествах (до 7 в одном поле зрения), с характерной морфологией и ограниченным ростом.

Пример 2. Приготовление среды осуществляют по вышеописанному примеру 1. В качестве стимулятора роста для спирохет добавляют продукты пчелиного производства: подмор, обрезки, личинки трутней. Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор, личинки трутней) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем полученное сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию подвергают обработке на УЗДН-1. Воздействие ультразвуком производят в стеклянных химических стаканах, которые опускают в водяную баню с плавающим льдом; аппарат включают и опускают экспоненциальный излучатель так, чтобы он касался поверхности жидкости. Экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц. По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты или с помощью гидрооксида натрия, это необходимо для успешного роста спирохет в данной среде. Затем добавляют поджелудочную железу КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Пробы закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120°С. Для подавления микрофлоры добавляют рифампицин (антибиотик) из расчета 30 мг/л среды.

В результате культивирования спирохет на мясопеченочной среде с добавлением стимулирующих веществ получают интенсивный рост и развитие спирохет в стационарных аэробных условиях на 7 день с характерной морфологией и без роста патогенной микрофлоры.

Пример 3. Приготовление среды осуществляют по вышеописанному примеру 2. После добавления в мясопеченочный бульон измельченных продуктов пчелиного производства и фермента поджелудочной железы они находятся во взвешенном состоянии, что затрудняет дальнейшую работу при изготовлении питательной среды, и успешный рост спирохет, т.к. все активные вещества переходят в бульон и плохо используются микроорганизмами. Поэтому для работы мы используем центрифугирование.

Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость разливают по флаконам и закупоривают, затем автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120°С.

Применение центрифугирования и осаждение взвесей в дальнейшем помогает работать быстро и без осложнений.

Пример 4. Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор, личинки трутней) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 3 тыс. оборотах. Затем полученное сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Воздействие ультразвуком производят в стеклянных химических стаканах, которые опускают в водяную баню с плавающим льдом; аппарат включают и опускают экспоненциальный излучатель так, чтобы он касался поверхности жидкости. Экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц. По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуют рН-метром до рН 7,0-7,2 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступают к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Нейтрализованный гидролизат центрифугируют на центрифуге WE 6 при 3 тыс. оборотах 5 мин. Надосадочную жидкость разливают по флаконам, закупоривают и автоклавируют в течение 1 ч при температуре 120 С°.

После приготовления среды проверяют на стерильность в чашках Петри в термостате при 37°С 1 сутки.

Пример 5. Гидролизуемый субстрат измельчают (обрезки, подмор) на гомогенизаторе MPW 309 1 мин при 4 тыс. оборотах. Затем полученное сырье разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:10. Подготовленную суспензию обрабатывают на УЗДН-1 с максимальной мощностью 400 Вт. Экспозицию ультразвукового облучения увеличиваем до 10 мин при токе 0,7 А, частоте 35 кГц.

По окончании ультразвукового дробления на УЗДН полученную массу нейтрализуем рН-метром до рН 7,2-7,5 раствором соляной кислоты и с помощью двууглекислого натрия и приступаем к ферментативному гидролизу с применением фермента поджелудочной железы КРС из расчета 300 г на 1 л среды. Нейтрализованный гидролизат центрифугируем на центрифуге WE 6 при 4 тыс. оборотах 5 мин. Пробы закупориваем и автоклавируем в течение 1 ч при температуре 120°С.

Культивирование спирохет проводят по примеру 2. При этом отмечают, что разведение продуктов пчелиного производства мясопеченочным бульоном в соотношении (1:10) и повышение рН до 7,2-7,5, не оказывает никакого влияния на развитие спирохет, а наоборот, оказывает губительное действие на их рост и развитие.

Таким образом, полученный гидролизат из продуктов пчелиного производства является универсальным, обеспечивающим высокий рост и развитие спирохет, обеспечивает предприятиям биологической промышленности значительное повышение производительности труда при небольших затратах на приготовлении гидролизатов.

Способ получения гидролизата из продуктов пчелиного производства для культивирования спирохет, предусматривающий обработку белоксодержащего сырья ферментативным гидролизом нативной поджелудочной железой, измельчение, отделение от нерастворимых примесей, нейтрализацию до рН 7,0-7,2, автоклавирование при 120°С в течение 1 ч, отличающийся тем, что в качестве белоксодержащего сырья используют продукты пчелиного производства: обрезки, подмор, при этом сырье измельчают на гомогенизаторе при 3 тыс. об/мин, затем его разводят мясопеченочным бульоном в соотношении 1:5, полученную суспензию обрабатывают ультразвуком мощностью 400 Вт, причем экспозиция ультразвукового облучения составляет 2-3 мин при токе 0,7 А и частоте 35 кГц, после ферментативного гидролиза проводят центрифугирование при 3 тыс. оборотов в течение 5 мин.