Штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота для изготовления вакцинных и диагностических препаратов

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным наименованием «ПГ/К-2002»-ДЕП. Штамм имеет высокую инфекционную, антигенную и иммуногенную эффективность и может быть использован для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. 1 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для изготовления средств специфической профилактики и диагностики парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота (КРС).

ПГ-3 (транспортная лихорадка КРС, параинфлюэнца-3) - остро протекающая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания, но наиболее характерной является латентная форма парагриппозной инфекции. Часто осложняет течение других болезней, в сочетании с пастереллами обуславливает тяжелые формы респираторных инфекций у телят ПГ-3 распространен повсеместно, практически во всех странах мира. Указанная инфекция возникает у КРС в виде моноинфекции, смешанных инфекций, которые наносят значительный экономический ущерб из-за гибели и выбраковки животных, снижения продуктивности и нарушения функции воспроизводства.

Для специфической профилактики ПГ-3 применяют живые и инактивированные вакцины (1). Живые вакцины против ПГ-3 используют как монопрепараты или в составе ассоциированных вакцин, а инактивированные не нашли широкого применения из-за их низкой иммуногенности.

В связи с этим актуальной остается проблема новых штаммов вируса ПГ-3, сохраняющих свои нативные биологические свойства и после инактивации, для производства высокочувствительных и специфичных средств диагностики и высокоиммуногенных, безвредных средств профилактики заболевания.

Известен аттенуированный штамм УК-АТИ-739 вируса ПГ-3, используемый для изготовления живой вакцины против ПГ-3 (2). Его недостатком является низкая иммуногенная активность и нестабильность при инактивации.

Известен штамм paramyxovirus "ПТК-45/86" вируса ПГ-3 КРС, используемый для изготовления ассоциированной вирусвакцины против ИРТ, ПГ-3 и вирусной диареи КРС (3). Его недостатком является низкая иммуногенная активность и высокая реактогенность для телят 1-3-месячного возраста.

Известен аттенуированный штамм 1-а ВА 77 №14 вируса ПГ-3, используемый для изготовления вирусвакцины против ПГ-3 КРС (4). Недостатки данного штамма состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности и нестабильности при инактивации.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм " ВГНКИ-4" вируса ПГ-3, (прототип) используемый для изготовления инактивированной вакцины против парагриппа-3 крупного рогатого скота (5). Недостатками данного штамма являются его низкая биологическая, иммуногенная активность и нестабильность при инактивации.

Целью настоящего изобретения являлось получение нового производственного вируса ПГ-3, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление эффективных диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных по протективному антигену эпизоотическому вирусу, циркулирующему на территориии Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении производственного штамма вируса ПГ-3, обладающего высокой биологической, антигенной активностью и стабильностью при инактивации и пригодного для изготовления средств диагностики и специфической профилактики заболевания.

Указанный технический результат достигнут получением штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3. Штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма ПГ/К-2002 выделен из легких 1-2-месячных телят с респираторной патологией во время вспышки заболевания в комплексе "Славянское" Орловской области в 1999 году.

Вакцинный штамм получен во ВНИИВВиМ путем культивирования в перевиваемых культурах клеток MDBK и ПС.

Полученный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 23.08.2003 г. под регистрационным наименованием ПГ/К-2002 ДЕП.

По сравнению с прототипом штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 обладает белее высокой биологической, антигенной и иммуногеннной активностью в нативном виде.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ПГ-3 КРС. Штамм ПГ/К-2002 обеспечивает проведение серологической диагностики ПГ-3 и производство эффективных живых и инактивированных вакцин, создающих защиту восприимчивых животных от указанного возбудителя заболевания.

Штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 характеризуется следующими признаками и свойствами (Табл.1):

Таблица 1

Маркерные характеристики штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3
№ п/пНаименование свойствХарактеристика свойств
123
1Морфологические признаки (свойства)Штамм обладает морфологическими признаками, характерными для семейства парамиксовирусов. Размер от 150 до 250 нм. Вирион состоит из оболочки и внутреннего компонента,
123
который представлен рибонуклеопротеидной спиралью. Коэффициент седиментации - 1000 S в градиенте сахарозы. Вирус ПГ-3 штамм ПГ/К-2002 имеет 7 структурных белков:
1. Фосфопротеины (р, мол.м. 83 кД);
2. ГА-нейроминидазный гликопротеин (HN мол. м. 69 к.Д);
3. Главный нуклеокапсидный протеин (Np, мол.м. 66 к.Д);
4. Гликопротеин (F, мол.м. 55 кД);
5. Матричный белок(М. мол.м. 38 кД);
6. Белок L-полимераза (мол.м. 180 кД);
7. Клеточный активный белок А (мол.м. 43 кД)
2Адаптационные свойства и контагиозностьВирус репродуцируется в культуре перевиваемой линии клеток почки сайги (ПС) при оптимальной температуре (37±0,5°С), значений рН-7,0-7,4 до уровня титров инфекционности 8,0-8,5 lg ТЦД50/мл. Штамм не контагиозен для КРС.
3Патогенные свойстваВирус после аттенуации не проявляет патогенность для лабораторных и восприимчивых животных при внутримышечном и подкожном способах введения.
4Свойства полезного вещества, продуцируемые вирусом (антигенные свойства)Вирус вызывает образование вируснейтрализующих протективных и гемагглютинирующих антител. Штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, коровы, мыши, овцы, козы, человека, белой мыши. После инактивации индуцирует иммунитет у КРС против эпизоотических вариантов возбудителя ПГ-3, циркулирующих в настоящее время на территории Российской Федерации.
5Терморезистентность (Т-56 признак)Полностью утрачивает инфекционную и ГА-активность в течение 90 минут.

123
6ИнгибиторочувствительностьПод воздействием хлороформа, эфира и других растворителей полностью утрачивает инфекционную активность. Вирус инакивируют растворы формальдегида, сернокислой меди, теотропина, димер этиленимина.
7Стабильность генетических и иммунобиологических признаковСтабильность генетических и иммунобиологических признаков сохранялись при его пассировании в культуре клеток чувствительных к вирусу ПГ-3 в течение не менее 18 пассажей (срок наблюдения).
8Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусамиНе контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.
9Биотехнологические характеристикиШтамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, и по перечисленным признакам соответствует полевым изолятам. Штамм ПГ/К-2002 предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живых и инактивированных вакцин против ПГ-3 КРС. Этот вирус размножается в культурах ПЭК, ПТ, ВНК-21, ПС, MDBK и накапливается в титрах 5,0-8,5 lg ТЦД50/мл.
10Сохраняемость и условия храненияШтамм ПГ/К-2002 стабилизируют обезжиренным молоком или другими стабилизаторами и хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С. Вирус освежают пасссированием в культуре клеток ПС один раз в 3 года.
11Оригинальность и патентоспособностьШтамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 по показателям инфекционности, антигенности и иммуногенности является оригинальным, в таксономическом отношении, новым ранее неизвестным вариантом вируса ПГ-3.

Примеры, поясняющие сущность предлагаемого изобретения.

Пример 1.

Для получения инактивированной вакцины против ПГ-3 КРС из штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 используют перевиваемую монослойную культуру клеток ПС, к которой адаптирован предложенный штамм вируса ПГ-3. В качестве поддерживающей используют среду Игла MEM без сыворотки с добавлением антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 1:100-1:1000 (доза инфицирования - 0,1-0,01 ТЦД50/клетку). Культивирование вируса ведут при температуре 36-37°С в течение 48-96 часов до разрушения монослоя на 80-90%. После этого вируссодержащую суспензию сливают в емкость и отбирают пробы для контроля стерильности и биологической активности вируссодержащего материала. Для составления серии вакцины используют только стерильные вируссодержащие жидкости, прошедшие контроль на МПА, МПБ и тиогликолевой среде. Одновременно берут пробы (2-3 мл) для определения инфекционного титра вируса (в каждой емкости) перед инактивацией вирусного сырья. Инфекционную активность определяют по общепринятой методике. Титр вируссодержащего сырья должен быть не ниже 7,5-8,0 lg ТЦД50/см3. В полученный вируссодержащий материал вносят в качестве инактиванта теотропин в конечной концентрации 0,1% (дробно), для коррекции рН до величины не выше 7,3±1,0 вносят двухзамещенный фосфорнокислый калий, содержимое сосудов тщательно перемешивают и выдерживают при 36-37°С в течение 6-7 суток периодически перемешивая.

Приготовленный таким образом полуфабрикат вакцины проверяют на стерильность и полноту инактивации. Проверку на отсутствие контаминации проводят по ГОСТу 28085-89, полноту инактивации вируса проверяют путем 3-кратного пассирования в культуре клеток ПС.

Для нейтрализации теотропина после окончания процесса инактивации в антигенсодержащую суспензию добавляют раствор тиосульфата натрия из расчета 80% к объему использованного теотропина.

Сорбирование полученного антигена осуществляют 6%-ным гелем гидроокиси алюминия (ГОА) из расчета 200 см3 на 1000 см3 антигенсодержащего материала. После седиментации ГОА в течение ночи к полученному адсорбенту добавляют 10%-ный раствор сапонина из расчета 10,0 см3 на 1000 см3 суспензии полуфабриката.

Полученная таким образом вакцина представляет собой суспензию розового цвета. При хранении выпадает рыхлый осадок, легко разбивающийся после встряхивания. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают контролю на стерильность по ГОСТу 28085-89. Безвредность вакцины проверяют на 10 мышах. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на антигенную активность на кроликах.

Полученная ГОА-сапониновая инактивированная вакцина против ПГ-3 имеет оптимальный количественный состав (%):

Авирулентный штамм ПГ-3/К-2002 вируса
ПГ-3 КРС78,0
ГОА (6%-ный раствор)20,0
Теотропин (10%-ный раствор)1,0
Сапонин (10%-ный раствор)1,0

Полученная вакцина предназначена для применения в неблагополучных по ПГ-3 КРС хозяйствах и угрожаемых зонах для профилактики этого заболевания. Вакцинации подлежат клинически здоровые животные. Телят вакцинируют в 1-6 месячном возрасте. Вакцину вводят подкожно в области средней трети шеи двукратно с интервалом 14-28 дней в объеме 2,0 см3. Иммунитет формируется через 2 недели с начала вакцинации, после повторной вакцинации иммунитет сохраняется не менее 12 месяцев (срок наблюдения).

Пример 2.

Проведены испытания предлагаемой инактивированной культуральной вакцины против ПГ-3, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей (%):

Теотропин (10%-ный раствор)1,0
Гель ГОА (6%-ный раствор)20,0
Сапонин (1%-ный раствор)1,0
Авирулентный антигенный материал из штамма ПГ/К-2002
вируса ПГ-3 с инфекционной
активностью 7,5-8,0 lg ТЦД50/см378,0

Эффективность инактивированной вакцины против ПГ-3 КРС, содержащей вирус ПГ-3 (шт. ПГ/К-2002), приготовленной так, как описано в примере 1, испытана на телятах 1-3 месячного возраста в ЗАО "Славянское" Орловской области. Вакцину применяли так, как описано в примере 1. Наблюдение за привитыми телятами показали, что испытуемая вакцина является безвредным препаратом, позволяющим ликвидировать респираторные болезни молодняка КРС и снизить до минимума его гибель.

Пример 3.

Проведены испытания предлагаемой инактивированной культуральной вакцины против ПГ-3, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей (%);

Теотропин1,0
Гель ГОА (6%-ный водный раствор)20,0
Сапонин (10%-ный раствор)1,0
Авирулентный антигенный материал из штамма ПГ/К-2002
вируса ПГ-3 с инфекционной
активностью 7,5-8,0 lg ТЦД50/см378,0

Эффективность инактивированной вакцины против ПГ-3 КРС, содержащей вирус ПГ-3 (штамм ПГ/К-2002), изготовленной так, как описано в примере 1, испытана на телятах на комплексе "Мценский" Орловской области.

Вакцину применяли так, как описано в примере 1. Наблюдения за привитыми телятами показали, что испытуемая вакцина является безвредным препаратом, позволяющим ликвидировать респираторные болезни молодняка КРС и снизить до минимума гибель животных.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении предлагаемого изобретения при следующей совокупности условий:

- инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно, в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в формуле изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов;

- штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью как в нативном виде, так и после инактивации и пригоден для изготовления вакцинных и диагностических препаратов как из живого так и из инактивированного вируса.

Литература

1. Инфекционные болезни животных. Справочник. Под. ред. Д.Ф.Осидзе, - М.: Агропромиздат, 1987, 19-99.

2. Пат. ФРГ №2323847, А 61 К 39/02, 1976.

3. Пат РФ №2111011, А 61 К 39/295, А 61 К 39/15? 39/265, 20.05.98 г.

4. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998, 242-251.

5. Пат. РФ №2182494. А 61 К 39/155, 20.05.2002 г.

Штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, сем. Paramixoviridae, род Parainfluenza, подтип Parainfluenza virus3, коллекция ВГНКИ N «ПГ/К-2002»-ДЕП, для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к применению штамма Lactobacillus salivarius UCC 118 для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности и профилактики рака.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству бактериальных препаратов. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано для культуральной диагностики трихомоноза. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности. .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а точнее к производству диагностикумов и вакцинных препаратов против вируса "аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита кур (АДВГГ)", и может быть использовано как для изготовления диагностикумов и вакцин, так и для экспериментального изучения болезни.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к производству биопрепарата. .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к области генной инженерии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .
Наверх