Способ получения сухого пробиотического препарата "бацелл"

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления бактериальных препаратов для профилактики болезней животных. Способ предусматривает раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625, и Rhuminococcus albus Kr. Выращенные маточные культуры В. subtilis ВКПМ В-8130 и L. acidophilus Scav. ВКПМ В-4625 и R. albus Kr смешивают в соотношении 1:1, засевают этой смесью автоклавированный подсолнечниковый шрот, при следующем соотношении компонентов, мас.%: автоклавированный подсолнечниковый шрот 45-55, маточная культура Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625, Rhuminococcus albus Kr - 20-30, маточная культура Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 20-30. Инкубируют полученную смесь при 30-45°С в течение 4-8 дней с получением в полувлажном препарате не менее 1·10⁸ клеток/г препарата, причем смешивают полученный препарат с подсолнечниковым шротом в соотношении 1:10 - 1:12 с получением препарата с остаточной влажностью 8-10%. Изобретение обеспечивает повышение эффективности получения сухого пробиотического препарата, снижение материальных затрат при его производстве, упрощение технологии получения и использования дешевого сырья при изготовлении препарата, за счет исключения из технологической схемы стадии высушивания и получение препарата с более высоким титром. 3 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления бактериальных препаратов для профилактики болезней животных.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммами энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus falcium ВГНКИ-27 в течение 12-15 ч, затем нативную культуральную жидкость охлаждают до температуры 15-20°С и концентрируют в 10-15 раз, полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°С. При этом концентрированно нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрацией на плоских мембранах или сепарированием в полупериодическом режиме работы (см. патент РФ №2065305, кл. А 61 К 35/74, бюл. №23, опубл. 08.20.1996 г.).

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, необходимость использования гидролизата казеина значительно удорожает препарат. Во-вторых, использование в качестве метода концентрирования ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрации на плоских мембранах делает данный метод дорогостоящим и требующим больших капиталовложений и высокой подготовки персонала. Также использование криогенной техники обезвоживания значительно усложняет технологический процесс. Кроме того, использование в качестве смешанной пробиотической культуры только двух видов бактерий делает эту смешанную популяцию неустойчивой, что снижает эффективность ее применения.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата путем смешивания с защитной средой с последующим контактно-сорбционным обезвоживанием целевого продукта сорбентом, охлажденным до минус 8-10°С, например, окисью алюминия с остаточной влажностью менее 1% при массовом соотношении 1:10 - 1:12 соответственно, а досушивание осуществляют в течение 18-20 ч при температуре 0-5°С в замкнутом объеме (Патент РФ №2067114, Кл. 6 С 12 N 1/20, А 61 К 35/74, С 12 N 1/04. Бюл. №27. 27.09.96).

Однако в известном способе используется в качестве основы для пробиотического препарата монокультура бифидобактерий или стрептококков, что не может обеспечить получения пробиотической добавки с высокой эффективностью, так как у монокультур низкая резистентность к патогенным микроорганизмам, населяющим желудочно-кишечный тракт, и они не способны оказывать длительное терапевтическое или лечебное действие. Кроме того, использование в качестве сорбента окиси алюминия удорожает получаемый продукт, а кроме того, он является инертным веществом и выступает только в качестве балласта и только засоряет желудочно-кишечный тракт. Следует отметить, что пробиотический препарат, полученный по указанному способу, получится дорогостоящим для применения в животноводстве и птицеводстве за счет использования таких дорогостоящих технологических приемов, как контактно-сорбционное обезвоживание, использование низких температур.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения препарата для кормления цыплят, предусматривающий выращивание консорциума пробиотических культур Lactobacillus acidophilus 1-33 и Rhuminococcus albus 1-33 на питательной среде, содержащей подсолнечниковый или соевый шрот и водопроводную воду при температуре 36-38°С в течение суток, после чего полученную производственную бактериальную культуру, состоящую из смеси обозначенных маточных культур, смешивают с подсолнечным или соевым шротом в соотношении от 1:1 до 1:2 и высушивают полученную смесь, пропуская сухой воздух при температуре 40-60°С до остаточной влажности 7-7,2%, высушенный препарат измельчают (Патент РФ №2171037, А 23 К 1/165, 27.07.2001, Бюл. №21. 27.07.2001 - прототип).

Однако в известном способе используется в качестве компонентов всего два штамма, что делает данную композицию неустойчивой при заселении ею желудочно-кишечного тракта, а значит и низкой эффективностью препарата. Предлагаемая авторами данного способа стадия высушивания негативно скажется на физиологическом состоянии подвергнутых термообработки микроорганизмов, а кроме того, приводит к удорожанию препарата за счет использования энергоносителя. Вызывает сомнение, что использования в питательной среде как равноценных таких субстратов, как соевый и подсолнечниковый шрот, позволит получить стандартизированый препарат, так как их химический состав различен. Следует отметить, что такой препарат не может обладать комплексным действием: пробиотическим, антимикробным, иммуномодулирующим и располагать целлюлозолитической активностью.

Известные способы не позволяют экономически эффективно получать сухой пробиотический препарат высокого качества, сочетающего противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки и при использовании дешевого сырья с минимальными затратами и по упрощенной технологии производства, основанной на использовании трех культур пробиотических микроорганизмов и без использования стадии термического высушивания.

Техническим решением задачи является расширение ассортимента пробиотических препаратов, снижение материальных затрат за счет использования дешевого сырья и упрощения технологии изготовления препарата за счет исключения из технологической схемы стадии высушивания и получения препарата с более высоким титром, повышения эффективности применения препарата за счет дополнительного использования штамма Bacillus subtilis.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения сухого пробиотического препарата включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus acidophilus и Rhuminococcus albus до заданного достижения титра каждого микроорганизма, смешивание полученной маточной культуры с подсолнечниковым шротом в заданном соотношении, причем в качестве микроорганизмов дополнительно используют Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, из Lactobacillus acidophilus используют Lactobacillus acidophilus Suav. ВКПМ В-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus KR, при этом выращенные маточные культуры смешивают в соотношении 1:1, засевают ею автоклавированный подсолнечниковый шрот, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

автоклавированный подсолнечниковый шрот	45-55
маточная культура Lactobacillus acidophilus Suav. ВКПМ
4625, Rhuminococcus albus Kr	20-30
маточная культура Bacillus subtilis ВКПМ В-8130	20-30

инкубируют полученную смесь при 30-45°С в течение 4-8 дней с получением в полувлажном препарате не менее 1·10⁸ клеток/г препарата, причем смешивают полученный препарат с подсолнечниковым шротом в соотношении 1:10 - 1:12 с получением препарата с остаточной влажностью 8-10%.

Заявленный способ получения пробиотического препарата отличается от прототипа составом микроорганизмов (штаммами микроорганизмов Lactobacillus acidophilus и Rhuminococcus albus, а также дополнительным вводом Bacillus subtilis), иными технологическими режимами и упрощением технологической схемы получения препарата.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию "новизна".

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение поставленной задачи и не выявлены при изучении патентной и научно-технической литературы в данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию "изобретательский уровень".

Производственным названием пробиотического препарата, полученного по указанному способу, является слово, образованное от слов бацилла и субстрата ассимилирующего включенными в состав препарата микроорганизмами целлюлоза - "Бацелл".

В сухом пробиотическом препарате с производственным названием "Бацелл" используются 3 штамма микроорганизмов: Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625, Rhuminococcus albus Kr и Bacillus subtilis ВКПМ В-8130. Все штаммы являются непатогенными и не требуют специальных мер предосторожности при работе с ними.

Штамм Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625 задепонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИ Генетика, г. Москва) под номером В-4625 и является неотипом вида и чаще всего используется для синтеза молочной кислоты.

Штамм Rhuminococcus albus Kr выделен из слепой кишки кролика Ушаковой Н.А. в 2000 году. Культурально-биохимические свойства: сферические кокки диаметром 0,8-1,0 мкм. Одиночные в парах и короткие цепочки. Грамположительные. Неподвижные. Глубинные колонии чечевицеобразные. Строгие анаэробы. Целлюлозу расщепляют. Каталазоотрицательные. Нитрат не восстанавливают, аммиак из аминокислот не образуют. Хемоорганотрофы со сложными пищевыми потребностями. Растут при температуре 25-40°С, оптимальное значение рН 6,5.

Применяется для биоконверсии клетчатки растительных субстратов. Непатогенен для лабораторных животных. Для данного штамма функции коллекции-депозитария выполняет коллекция микроорганизмов института экологии и эволюции им. Северцева (РАН, г. Москва).

Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 задепонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИ Генетика, г. Москва) под номером В-8130 и выделен в 1998 году Ушаковой Н.А. из слепой кишки глухаря. Культурально-биохимические свойства: факультативно-анаэробные спорообразующие палочки, прямые или слегка изогнутые 0,3-0,5×3,0-7,0 мкм, иногда могут образовывать нити или цепочки. Грамположительные. Каталазоположительные. Спора овальная и субтермальная. Колонии на агаровой среде слегка округлые или с волнистым краем. Могут быть волнистыми, палевого цвета. При развитии на глюкозе образуют пленку, среду подкисляют без образования газа. Растут на сахарозе, лактозе, мальтозе, маните, разжижают желатин, гидролизуют эскулин. Разрушают пектин и полисахариды растительных тканей. Образуют эндоглюканазу. Растут при температуре 45-55°С.

Применяется для биоконверсии клетчатки растительных субстратов. Непатогенен для лабораторных животных.

Пример конкретного осуществления способа получения сухого пробиотического препарата осуществлялся в условиях ФГУ "Краснодарский биоцентр" г. Краснодар.

Выращивание бактериальных культур Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625 и Rhuminococcus albus Kr осуществляют на жидкой питательной среде в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра без встряхивания в течение 6 суток при температуре 37°С на среде следующего состава:

рубцовая жидкость	50 мл
целлобиоза	7,5 г
мясопептонный бульон	5,0 г
хлористый натрий	1,0 г
сульфат натрия	1,0 г
фосфат калия однозамещенный	1,0 г
сульфат аммония	2,0 г
мел	2,0 г

до получения титра бактериальных клеток не менее 2·10⁸ клеток/мл среды.

Одновременно культивируют Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 на жидкой питательной среде в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра на качалке в течение 2 суток при температуре 37°С на глюкозопептонной среде следующего состава (г/л):

глюкоза	20 г
пептон	4 г
дрожжевой экстракт	1,5 г
сульфат магния	0,5 г
фосфат аммония двузамещенный	1,5 г
рН	7,2-7,4

до получения титра бактериальных клеток не менее 1·10⁸ клеток/мл среды.

Полученные таким образом жидкие маточные культуры объединяются в соотношении 1:1. И смесь в стерильных условиях высевается в полипропиленовые пакеты, содержащие автоклавированный подсолнечниковый шрот массой 2 кг. В дальнейшем пакеты инкубируют при температуре 37°С в течение 6 дней с получением титра клеток в полувлажном препарате не менее 1·10⁹ клеток/г препарата. Полученный полувлажный, препарат смешивают с нестерильным подсолнечниковым шротом в соотношении 1:10 с получением титра клеток не менее 1·10⁸ клеток/г препарата и его конечной влажностью 8-10%.

Для оценки эффективности хранения предлагаемого препарата "Бацелл" провели эксперимент, результаты которого представлены в таблице 1.

Таблица 1
Содержание микроорганизмов в предлагаемом препарате "Бацелл" в процессе хранения
Препарат	Время хранения, мес
0	2	4	6	8	10	12
Предлагаемый препарат	5·108	3·108	2·108	1·108	8·107	6·107	1·107

Как видно из таблицы, полученный препарат хранится в течение 6 месяцев без значительного изменения титра клеток.

Предлагаемый пробиотический препарат "Бацелл" является более дешевым по сравнению аналогами, так как в ценах 2003 года коммерческая стоимость 1 кг предлагаемого препарата 20 руб., а стоимость близкого по составу сухого препарата "Целлобактерин" составила 120 руб. Удешевление предлагаемого препарата в 6 раз достигается использованием дешевых питательных сред и отсутствием операции по его высушиванию, при этом концентрация микроорганизмов одинакова.

Для оценки эффективности применения сухого пробиотического препарата "Бацелл" провели производственные испытания на цыплятах-бройлерах в условиях птицефабрики "Кубань", г. Усть-Лабинска (Краснодарский край). Схема опыта представлена в таблице 2, а некоторые результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Таблица 2
Схема опыта на цыплятах-бройлерах
Группы	Количество голов в группе	Характеристика кормления
контрольная	22939	Основные кормовые смеси, составленные по нормам ВНИТИП из кормов собственного производства с добавлением витаминно-минерального премикса по периодам выращивания 1-28 и 29-49 дней
опытная	25660	Основные кормовые смеси, составленные по нормам ВНИТИП из кормов
		собственного производства с добавлением витаминно-минерального премикса по периодам выращивания 1-28 и 29-49 дней + предлагаемый пробиотический препарат "Бацелл" из расчета 2 кг на 1 тонну комбикорма или 0,2% по массе кормосмеси

Как видно из результатов производственных испытаний, в условиях птицефабрики предлагаемый пробиотический препарат "Бацелл" способствовал увеличению интенсивности роста цыплят, снижению затрат кормов на 1 кг прироста, повышению сохранности, а кроме этого, значительному улучшению мясных качеств цыплят-бройлеров. Экономические результаты опыта оказались значительно лучше в опытной группе с применением "Бацелла", где стоимость кормов, затраченных на 1 кг прироста, оказалась на 20,7% ниже (2,26 рубля), чем в контроле.

Таблица 3
Результаты производственных испытаний предлагаемого сухого пробиотического препарата на цыплятах-бройлерах
Группы	Живая масса 1 головы, г	Среднесуточный прирост, г	Затраты корма на 1 кг прироста, г	Сохранность, %
на начало опыта	на конец опыта
контрольная	40	1457	28,9	2,64	94,7
опытная	41	1585	31,5	2,50	96,3

Для получения сухого пробиотического препарата смешивают между собой маточные культуры микроорганизмов с пробиотическими свойствами, относящиеся к Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625, Rhuminococcus albus Kr и Bacillus subtilis ВКПМ В-8130. Данная совокупность микроорганизмов оптимально подобрана для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных. Так штамм Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625 обеспечивает создание нормального кислотного равновесия в ЖКТ за счет выделения молочной кислоты, которая также обладает дополнительно антимикробными свойствами.

Введение в предлагаемый препарат штамма Rhuminococcus albus Kr, выделенный из слепой кишки кролика, позволяет обеспечить лучшее переваривание компонентов корма с высоким содержанием клетчатки за счет наличия у данного штамма высокой целлюлозолитической активности, Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, обладая высокой антимикробной активностью, позволяет в короткие сроки избавиться от патогенных микроорганизмов, находящихся в ЖКТ, при том что нормальная микрофлора кишечника данным штаммом не угнетается. Выращивание микроорганизмов осуществляется в условиях глубинной культуры, что связано с необходимостью получения однородной по возрасту и активности популяции, чего невозможно достичь при использовании поверхностного культивирования. Кроме того, скорость роста глубинной культуры значительно быстрее, а ее получение менее трудоемко в сравнении с альтернативой. Культивирование осуществляют до получения титра каждой культурой не менее 1·10⁸ клеток/мл суспензии. Получение суспензии с титром менее 1·10⁸ клеток/мл не может обеспечить высокой эффективности заявляемых свойств препарата. Титр более 1·10⁸ клеток/мл требует увеличения сроков культивирования и введения дополнительных веществ в питательную среду, что потребует увеличения стоимости препарата. Поэтому оптимальным титром суспензии в прелагаемом препарате является 1·10⁸ клеток/мл. Выращенные суспензии смешивают с автоклавированным шротом. Если массовая доля подсолнечникового шрота будет менее 45%, то этого количества будет недостаточно для поддержания нужного титра препарата, так как он используется и как сорбент, и как источник питательных веществ. Если содержание шрота будет более 55%, это приведет к снижению влажности субстрата и степени размножения микроорганизмов, а значит снизится титр действующей основы и качество препарата снизится. Оптимальное значение содержания подсолнечникового шрота должно составлять 50%. Если доля суспензии микроорганизмов видов Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625, Rhuminococcus albus Kr будет менее 20%, то уровень лактопродуцирующей и целлюлозолитической активности препарата снизится, а значит и качество препарата будет плохим. Если доля суспензии микроорганизмов видов Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625, Rhuminococcus albus Kr будет более 30%, то общая влажность препарата повысится и он станет нетехнологичен. Поэтому оптимальной долей ввода указанной суспензии микроорганизмов является 25%. Если доля суспензии микроорганизмов вида Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 будет менее 20%, то уровень антимикробной активности препарата снизится, а значит и качество препарата будет плохим. Если доля суспензии микроорганизмов вида Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 будет более 30%, то общая влажность препарата повысится и он станет нетехнологичен. Поэтому оптимальной долей ввода Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 является 25%.

Полученную смесь инкубируют при постоянной температуре. Если температура будет менее 30°С, то развитие микроорганизмов будет снижено или рост культуры будет отсутствовать полностью. Если температура будет более 45°С, то происходит гибель микроорганизмов. Поэтому оптимальной температурой культивирования является температура, равная 37°С. Культивирование осуществляют в течение нескольких дней. Если выращивание культуры будет менее 4 суток, то не будет достигнут нужный титр микроорганизмов и это снизит качество препарата. Если выращивание культуры будет более 8 суток, то питательных веществ субстрата не хватит и микроорганизмы начнут гибнуть, кроме того, качество сорбента ухудшится за счет большого разрушения клетчатки и технологические свойства влажного препарата не обеспечат равномерность смешивания с сухим шротом. Оптимальным временем культивирования является 6 суток. Смешивание осуществляют с сорбентом, в качестве которого используют подсолнечниковый шрот. Если температура сорбента будет менее 0°С, то происходит перерасход теплоносителей, так как понижение температуры до такого уровня требует специальных установок. Если температура сорбента будет более 30°С, то поддержание такой температуры сорбента потребует дополнительного перерасхода теплоносителей, что скажется на стоимости предлагаемого препарата. Оптимальной температурой сорбента является температура 15°С.

Для уменьшения влажности препарата необходимо ввести сорбент, в качестве которого используется подсолнечниковый шрот. Если влажность сорбента будет менее 10%, то для получения такой начальной влажности необходима дополнительная сушка подсолнечникового шрота, что приведет к увеличению расхода теплоносителей и удорожанию предлагаемого препарата. Если влажность сорбента будет более 12%, то такой сорбент плохо хранится и его качество снижается за счет повышения общей обсемененности патогенными микроорганизмами. Оптимальной влажностью подсолнечникового шрота является влажность 11%. Сорбент смешивается с влажным препаратом. Если соотношение влажного препарата и сорбента будет менее чем 1:10, то качество препарата снизится, так как нельзя получить при таком разбавлении требуемый титр препарата 1·10⁸ кл/г. Если соотношение влажного препарата и сорбента будет более чем 1:12, то качество препарата снизится, так как повысится влажность препарата, и сроки хранения уменьшатся, а также будет происходить рост посторонней микрофлоры. Оптимальным соотношением влажного препарата и сорбента является соотношение 1:11.

Заявленный способ позволяет получить сухую пробиотическую добавку с низкой стоимостью за счет использования дешевого сырья, упрощения технологии получения добавки и повышения ее эффективности за счет использования смешанной культуры, адаптированной к используемому для нее сорбенту, введение предлагаемой добавки в растительные рационы с повышенным содержанием клетчатки позволяет получить высокую продуктивность сельскохозяйственных животных и птицы.

Способ получения сухого пробиотического препарата, предусматривающий приготовление маточной культуры совместным выращиванием в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus acidophilus и Rhuminococcus albus до заданного достижения титра каждого микроорганизма, смешивание полученной маточной культуры с подсолнечниковым шротом, отличающийся тем, что дополнительно для приготовления маточной культуры используют Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, из Lactobacillus acidophilus используют Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus Кг, при этом маточную культуру Lactobacillus acidophilus Scav. ВКПМ В-4625 и Rhuminococcus albus Kr и маточную культуру Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 смешивают в соотношении 1:1, засевают ею автоклавированный подсолнечниковый шрот при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Автоклавированный подсолнечниковый шрот	45-55
Маточная культура Lactobacillus acidophilus
ВКПМ В-4625, Rhuminococcus albus Kr	20-30
Маточная культура Bacillus subtilis ВКПМ В-8130	20-30

инкубируют полученную смесь при 30-45°С в течение 4-8 дней с получением в полувлажном препарате не менее 1·10⁸ клеток/г препарата, причем смешивают полученный препарат с подсолнечниковым шротом в соотношении 1:10-1:12 с получением препарата с остаточной влажностью 8-10%.