Способ приготовления пробиотика

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления биологически активных добавок и продуктов функционального питания на основе живых бактерий. Способ предусматривает внесение штаммов лактобактерий L. fermentum 39 и L. plantarum 8 PA 3 в питательную среду, совместное их культивирование на питательной среде, содержащей разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока, раффинозу, дрожжевой автолизат, агар-агар. Культивирование ведут в два этапа. На первом этапе разведенные в питательной среде штаммы соединяют в соотношении 1:1, культивируют 24 ч при 37°С. На втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000. Продолжают культивирование в течение 24 ч при той же температуре. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность бактерий, их антагонистическую активность и выход биомассы. 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к лечебно-пищевой биотехнологии и может быть использовано для приготовления биологически активных добавок и продуктов функционального питания на основе живых бактерий.

Широко известны препараты, направленные на восстановление нормального биоценоза кишечника, в частности эубиотики - бактерийные препараты из живых микроорганизмов - представителей облигатной микрофлоры кишечника, это колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол и т.п. сухие препараты (см. книгу под ред. В.А.Княжева. Дисбактериозы. Теория и практика. Нижний Новгород, 1999, с.70-73).

При всех положительных качествах этих препаратов: длительный срок хранения, простота транспортировки и употребления и так далее, имеется ряд недостатков - во первых, за счет процесса лиофильной сушки клетки микроорганизмов находятся в глубоком анабиозе, для перехода их в активное физиологическое состояние требуется 8-10 часов (процесс пищеварения у детей - 4-6 часов), к тому же после процесса лиофилизации клетки теряют специфические рецепторы (адгезины), с помощью которых они закрепляются на слизистых, в итоге время их пребывания в кишечнике снижается, таким образом, уменьшается терапевтический эффект. Также в процессе сушки разрушается большая часть метаболитов (в частности, жирные кислоты), которые содержат дополнительные лечебные факторы.

Известно, что для улучшения качества препаратов, в частности усвояемости и терапевтического эффекта, готовят закваски из бифидо- и лактобактерий, которые вносят в молоко, см., например, способ приготовления пробиотика на основе живых бифидо- и лактобактерий по патенту РФ №2060673, А 23 С 9/12, С 12 N 1/20, 1996 г.

Недостаток этого способа состоит в том, что основой пробиотика является цельное молоко, в которое вносится закваска. РН конечного продукта 4,4-4,8, а концентрация живых бактерий всего 10⁸.

В качестве прототипа принят способ приготовления закваски для получения кисломолочного лактобактерина (см. методические рекомендации «Применение молочного лактобактерина в лечении заболеваний, протекающих на фоне дисбактериоза кишечника». Горький, 1980 год, с.7).

Способ включает приготовление молочно-дрожжевой среды, содержащей гидролизат обрата молока (гидролизат обезжиренного молока) + 5% дрожжевого автолизата и + 0,2% глюкозы (углевода). Используют штаммы лактобактерий Lb fermenti 90-TC-4 или Lb plantamm 8-PA-3, которые засевают в молочно-дрожжевую среду из расчета 200-300 млрд на 10 л среды и инкубируют 20-22 часа.

Закваска имеет вид мутной жидкости грязно-желтого цвета с кислым вкусом. В 1 мл закваски содержится не менее 10⁶-10⁸ живых бактерий, значит, в конечном продукте их меньше.

Продукт обладает довольно высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микробам.

Недостатком известного способа является довольно короткий срок годности закваски (1-2 суток). Закваска используется только в составе кисломолочного продукта.

Эти недостатки устраняются предлагаемым решением.

Решаемая задача - совершенствование способа приготовления пробиотика (лечебно-профилактического препарата) на основе живых штаммов микроорганизмов с повышенным сроком годности (до 60 суток).

Технический результат - повышение жизнеспособности бактерий, их антагонистической активности и выхода биомассы.

Этот результат достигается тем, что в способе приготовления пробиотика на основе живых штаммов лактобактерий с использованием молочно-дрожжевой питательной среды (МДС), включающей гидролизат обезжиренного молока, дрожжевой автолизат, углевод в качестве источника энергии, путем культивирования в ней штаммов-продуцентов при температуре 37^±1°С, расфасовку препарата, питательная среда дополнительно содержит агар-агар, разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока с содержанием аминного азота 130-200 мг %, в качестве углевода используют раффинозу, причем совместное культивирование штаммов лактобактерий L. plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39 ведут в два этапа: на первом этапе разведенные в среде штаммы соединяют в соотношении 1:1 и культивируют 24^±1 ч, на втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000 и продолжают культивирование в течение 24^±1 ч при той же температуре.

Таким образом, предложен оптимальный комплекс, позволяющий получить препарат из живых бактерий с более длительным сроком хранения.

Совместное культивирование штаммов синергистов L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39 позволило ускорить процесс наращивания биомассы и увеличить ее выход.

Также при совместном культивировании этих штаммов синергистов повысился их уровень анатагонистической активности по отношению к широко распространенному виду грибов рода кандида C.albicans. Этот вид этиологически значим в 60-80% случаев заболеваний грибковой этиологии. Известно, что антагонистические свойства лактобацилл обусловлены их способностью к продуцированию бактериоцинов или бактериоциноподобных субстанций. Штаммы L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39, L.fermentum 90-TC-4 являются продуцентами бактериоцинов. L.plantarum 8 PA 3 устойчив к бактериоцинам, как к своим, так и к бактериоцинам, вырабатываемым L.fermentum 39, L.fermentum 90-TC-4. L.fennentum 39 обладает устойчивостью к действию собственных бактериоцинов, a L.fermentum 90-ТС-4 проявляет чувствительность к действию собственных бактериоцинов. А штаммы лактобацилл, устойчивые к собственным бактериоцинам, создают селективные преимущества, как для собственного роста, так и для штаммов резистентных к действию их бактериоцидов. Таким образом, штаммы L.plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39 могут культивироваться совместно с высоким уровнем выхода биомассы в отличии от L.fermentum 90-ТС-4.

Другая причина выбора штамма L.fementum 39 - его высокая адгезивная активность (бактериосорбция ) к муцину и фибронектину, которые являются рецепторами для адгезинов лактобацилл на эукариотических клетках, что имеет важное значение в обеспечении колонизации лактобациллами желудочно-кишечного тракта.

Использование в качестве основы МДС разведенного очищенной водой гидролизата обезжиренного молока увеличивает интенсивность снабжения клеток лактобацилл (которые являются микроаэрофилами) водородом и кислородом, гидроокись натрия удовлетворяет потребность клетки в неорганических элементах, агар-агар позволяет увеличить вязкость среды, что позволяет лактобациллам расти равномерно по всей толще среды (на жидких средах придонный рост), то есть равномерно потреблять факторы роста и питательные вещества по всему объему, а замена углевода глюкозы на раффинозу (фруктоолигосахарид), кроме удовлетворения потребности клетки в углеводе, способствует селективной стимуляции роста и активизации метаболизма полезных представителей кишечной микрофлоры (в частности, лактобацилл).

Способ осуществляют следующим образом. Готовят среду МДС по следующей схеме: кипятят обезжиренное молоко в течение 2-3 минут, охлаждают до 45°С, устанавливают рН 20% раствором едкого натра, добавляют панкреатин, перемешивают, добавляют хлороформ, ставят в термостат, первый час постоянно перемешивают, затем фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают аминный азот, разводят очищенный водой 2:1, из части готовят раствор агар-агара, в оставшуюся часть добавляют дрожжевой автолизат из прессованных дрожжей, разведенных водой, настоянных в термостате, затем проавтоклавированных и профильтрованных, и раффинозу, все перемешивают и стерилизуют.

Культивирование штаммов-продуцентов L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39 проводят при температуре 37^±1°C совместно в два этапа, на первом этапе разведенные в МДС штаммы соединяют в соотношении 1:1 и культивируют 24^±1 часа, на втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей МДС в соотношении 1:1000 и продолжают культивировать еще 24^±1 часа при той же температуре. В конечный препарат идет вторая генерация штаммов, далее по окончании культивирования биомасса расфасовывается по 5 мл с учетом суточной дозы пробиотика. Эксперименты показывают, что этот режим является оптимальным для достижения результата.

Пример осуществления способа.

На первом этапе готовят впрок цельный гидролизат обезжиренного молока и дрожжевой автолизат.

Цельный гидролизат обезжиренного молока готовят следующим образом: кипятят обезжиренное молоко (I-II категории) в течение 2-3 минут, охлаждают до 45^±1°C, добавляют панкреатин из расчета 1 г/л, предварительно разведенный в небольшом количестве нагретой до 44^±1°С воды, размешивают, ставят в термостат и выдерживают при температуре 40^±1°С, постоянно перемешивают в течение 4-х часов с коррекцией активной кислотности, далее добавляют 1-2% хлороформа, закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат. В течение первых часов обезжиренное молоко несколько раз перемешивают, (пробку после встряхивания прокалывают для удаления паров хлороформа). Через 4 часа доводят рН до 4,3^±0,1 ЕД 30% раствором уксусной кислоты, кипятят, помешивая, 15 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Готовый гидролизат должен содержать 200-300 мг/% аминного азота. Хранят гидролизат впрок под хлороформом (1% к объему) при температуре 4^±1°С.

Дрожжевой автолизат готовят следующим образом: 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1л воды и помещают в термостат при температуре 56^±1°С на 72^±2 часа. После этого полученную суспензию обрабатывают в автоклаве при температуре 115^±1°С в течение 15^±1 минут. Автолизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр, промывая осадок таким количеством воды, чтобы общее количество фильтрата составило 4,0^±0,1 л (хранят впрок в холодной камере при температуре 4^±1°С).

Из полученного основного сырья готовят следующую рецептуру питательной среды (МДС):

Гидролизат обезжиренного молока 0,633 л	658,32 г	63,27%
Вода очищенная	0,32 л	320 г	30,75%
Дрожжевой автолизат	0,05 л	51,5 г	4,95%
Агар-агар	0,75 г	0,75 г	0,07%
Раффиноза	10,0 Г	10,0 г	0,96%
Итого:		1040,57 г	100%

NaOH 20% раствор от 0,00005 до 0,001 л для установления рН 7,1-7,2 ЕД. Режим стерилизации питательной среды: 20 минут при 0,5 атм.

Порядок приготовления.

Для приготовления МДС разводят цельный гидролизат (аминный азот 200-300 мг %) очищенной водой из расчета на 0,633 л цельного гидролизата 0,32 л очищенной воды, то есть 2:1 (аминный азот 130-200 мг %).

Далее берут 100 мл разведенного гидролизата, добавляют 0,75 г агара-агара и нагревают на водяной бане до полного растворения агара.

К оставшейся части разведенного гидролизата 0,853 л добавляют дрожжевой автолизат 0,05 л и 10,0 г раффинозы, перемешивают, добавляют разведенный агар, перемешивают, доводят рН до 7,1 ЕД 20% раствором гидроокиси натрия, перемешивают, разливают в нужные объемы и стерилизуют 20 минут при 0,5 атм.

В качестве штаммов-продуцентов используют L.plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39, имеющие высокую антагонистическую активность по отношении к C.albicans.

Культивирование штаммов-продуцентов производят по следующему способу.

I генерация - сухой штамм L.plantarum 8 РА 3 разводят 0,007 л МДС, растворяют в течение 10 минут, встряхивая, при комнатной температуре, так же готовят штамм L.fermentum 39. Далее их вместе сливают в соотношении 1:1 в 0,3 л МДС и культивируют 24 часа при температуре 37^±1°С.

II генерация. По 0,001 л I генерации добавляют в 1 л свежей среды МДС (т.е. из 0,314 л I генерации получается 314 л II генерации) и культивируют 24 часа при температуре 37^±1°С.

По окончании культивирования биомассы осуществляют расфасовку готового к употреблению препарата во флаконы по 5 мл, герметично закрывают резиновой пробкой и алюминиевым колпачком. Хранится препарат при температуре +6^±2°С до 60 суток с сохранением живых микробных клеток в 1 мл жидкого препарата 10⁹-10¹¹ КОЕ/мл.

Препарат может быть получен реакторным методом.

Результаты испытаний полученного по описанному примеру препарата приведены в таблицах 1,2 и на графиках фиг.1,2.

В табл.1 показана жизнеспособность бактерий в препарате, полученном по известному способу (прототип) и предлагаемому. Видно, что количество живых микробных клеток сохраняется с увеличением времени хранения.

В табл.2 приведена антагонистическая активность штаммов лактобацилл, их комплекса и прототипа по отношению к грибам C.albicans.

На графиках фиг.1,2 приведены соответственно динамика роста лактобацилл при раздельном и совместном культивировании (она активнее при совместном культивировании - по количеству КОЕ/мл) и по изменению показателя оптической плотности среды - она выше при совместном культивировании штаммов L.plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39).

Препарат может использоваться перорально в 1 или 2 приема по 1 флакону в день перед едой с водой, молоком, кефиром, киселем, компотом, творогом, йогуртом и др. с температурой не выше 30°С.

Показания к применению: все заболевания этиологическим фактором, которых является C.albicans (бактериологически подтвержденная), все гастроэнтерологические заболевания, применение антибиотиков при любой патологии, аллергические заболевания, гинекологические заболевания (молочница) и беременным при подготовке к родам.

Возможно местное применение препарата в качестве вагинальных тампонов (2,5 мл на тампон 2 раза в сутки на 2 часа) или для обработки полости рта и десен (3-4 раза в сутки между приемами пищи по 1-2,5 мл на тампон).

Клиническая апробация пробиотика, приготовленного по способу, представленному в заявке, была проведена в следующих лечебно-профилактических учреждениях города Нижнего Новгорода: Городская детская клиническая больница №27, Детская поликлиника № 49 Приокского Райздравотдела, Сормовский межрайонный кожно-венерологический диспансер.

Указанные результаты полностью подтвердились.

Полученный предлагаемым способом препарат условно назван LL-комплекс.

Таблица 1
Количество живых лактобацилл КОЕ/мл (LL-комплекс) на различных модификациях среды МДС.
Наименование среды Время Хранения в сутках	МДС (классическая) По прототипу	МДС по предлагаемому способу
	Количество живых микробных клеток лактобацилл в 1 мл препарата в КОЕ\мл
1	1012	1012
10	1010	1012
20	109	1012
30	109	1012
40	109	1011
50	108	1011
60	107	1011
70	107	1010

Исследовали антагонистическую активность L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39 LL-комплекса и закваски для получения кисломолочного лактобактерина (по прототипу) по отношению к штаммам C.albicans (41 штамм), выделенных из различных биотопов организма человека (зев, мокрота, кишечник, репродуктивный тракт и др.).

Таблица 2
Антагонистическая активность штаммов лактобацилл, их комплекса по отношению к грибам C.albicans
Исследуемый штамм	Отсутствие антагонистической активности (%)	Низкая степень антагонистической активности (%)	Высокая степень антагон-истической активности (%)
L.plantarum 8 РА 3	8,8	47,2	44
L.fermentum 39	5,8	50	44,2
LL-комплекс предлагаемый способ.	0	29,4	70,6
Закваска для получения кисломолочного лактобактерина (по прототипу)	8,8	47,2	44

Способ приготовления пробиотика на основе живых штаммов лактобактерий с использованием молочно-дрожжевой питательной среды, включающей гидролизат обезжиренного молока, дрожжевой автолизат и углевод, путем культивирования лактобактерий при температуре (37±1)°С, расфасовку препарата, отличающийся тем, что питательная среда дополнительно содержит агар-агар, разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока с содержанием аминного азота 130-200 мг %, в качестве углевода используют раффинозу, причем совместное культивирование штаммов лактобактерий L. fermentum 39 и L.plantarum 8 PA 3 ведут в два этапа: на первом этапе разведенные в среде штаммы соединяют в соотношении 1:1 и культивируют (24±1) ч, на втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000 и продолжают культивирование в течение (24±1) ч при той же температуре.