Антитела, специфически реагирующие с прионным протеином prp или его фрагментом, и их применение
Владельцы патента RU 2281510:
Общество с ограниченной ответственностью "БиоХарт" (RU)
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к разработке диагностических реагентов для тестирования прионного протеина в ткани мозга млекопитающих методом ИФА и касается антител, специфически реагирующих с прионным протеином PrP или его фрагментом. Изобретение включает поликлональные антитела, полученные к синтетическим пептидам, включающим аминокислотные последовательности бычьего прионного белка 143-168, 101-134 и 211-241, их конъюгаты с пероксидазой хрена и полученные на их основе диагностические реагенты, позволяющие определять прионный протеин в тканях мозга млекопитающих. Преимущество изобретения заключается в разработке реагентов для проведения ИФА, позволяющих определять прионный протеин в ткани мозга с высокой специфичностью, 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается антител, специфически реагирующих с прионным протеином PrP или его фрагментом, и их применение. Прионные болезни человека и животных относятся к группе медленных инфекций, проявляются в дегенеративных изменениях центральной нервной системы и завершаются летальным исходом. Одним из таких заболеваний является губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота [ГЭ]. Попадание в организм человека продуктов питания либо лекарственных препаратов, полученных из тканей больных животных, может вызвать прионное заболевание - новый вариант болезни Крейцфельда-Якоба. Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии, или прионные болезни - это неизлечимые нейродегенеративные заболевания, поражающие человека и некоторые виды млекопитающих. В настоящее время известно четыре болезни человека - болезнь Крейцфельда-Якоба, куру, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, фатальная семейная инсомния и шесть болезней животных - скрепи овец и коз, ГЭ крупного рогатого скота ("бешенство коров"), трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь оленей и лосей, ГЭ кошек и ГЭ экзотических копытных [1]. Инфекционный агент этой группы заболеваний представляет собой изоформу нормального белка млекопитающих, являясь нерастворимым и протеазоустойчивым гликопротеином, полученным в результате посттрансляционной модификации нормального гликопротеина млекопитающих. Механизм патогенеза этой группы заболеваний заключается в превращениях нормального протеина PrP при его контакте с патогенной изоформой прионного протеина овец или крупного рогатого скота PrP-Sc с последующим его накоплением в нервной ткани. Ввиду высокой межвидовой гомологии прионного белка разработка методов выявления его патогенной формы позволяет диагностировать прионные заболевания всей вышеуказанной группы [2]. Для разработки чувствительных методов исследования и диагностики прионных болезней необходимы антитела, специфичные к различным участкам приона. Проблема получения антител к прионному белку связана с его низкой иммуногенностью. Для ее разрешения разрабатывают различные подходы, среди которых наиболее перспективным считается иммунизация синтетическими пептидными фрагментами приона.
В настоящее время методы диагностики прионных заболеваний основаны на применении иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных антител, полученных к различным участкам прионного белка. Так, известны моноклональные антитела, полученные к синтетическому пептиду 146-159 бычьего прионного белка, конъюгированному с KLH (гемоцианин улитки) и использованному в качестве иммуногена [3]. Эти моноклональные антитела связывают консервативный эпитоп-Ile-His-Phe-Gli-PrP-Sc скрепи овец. Далее использование комбинации двух моноклональных антител к вышеуказанному синтетическому пептиду и к пептиду 225-241, которые связывают дополнительный консервативный эпитоп-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-PrP-Sc, позволило повысить чувствительность и специфичность определения патогенной формы прионного протеина методом ИФА, а также расширить его применение для диагностики прионных болезней жвачных домашних животных, кошек, норок, человека и нечеловекообразных приматов [4]. Известен способ обнаружения прионного протеина для диагностики ГЭ посредством ИФА и иммуногистохимического метода с использованием одного моноклонального антитела, взаимодействующего с консервативным эпитопом 150-153 бычьего PrP или пары двух вышеуказанных моноклональных антител, включающий прижизненный метод предклинического определения прионного протеина в лимфоидной ткани и посмертного определения с предварительной обработкой ткани муравьиной кислотой, перевариванием трипсином или воздействием автоклавирования для активирования патогенной формы протеина [5]. Наиболее близким аналогом является источник информации, касающийся получения антител против синтетических фрагментов бычьего прионного белка, используемых для диагностики ГЭ крупного рогатого скота [6]. Для получения поликлональных сывороток авторы использовали 7 синтетических пептидов, полученных твердофазным методом на n-алкоксибензильном полимере. Для получения противопептидных сывороток кроликов иммунизировали трехкратно синтетическими пептидами или их конъюгатами с KLH. Первую иммунизацию проводили в дозе 500 мкг на одно животное в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), вторую иммунизацию осуществляли в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) в той же дозе и третью иммунизацию проводили в дозе 50 мкг пептида в НАФ. Наиболее иммунологически активными пептидами оказались пептиды с последовательностями аминокислот 106-134 бычьего PrP, которые далее использовались в иммуногистологическом методе определения прионного белка в срезах парафиновых блоков коров больных ГЭ. В указанной работе выявлены пептиды, позволившие получить сыворотки, связывающиеся с препаратами мозга крупного рогатого скота, больного ГЭ, и не взаимодействующие с препаратами мозга здоровых животных. Однако предложенный метод тестирования прионсодержащих протеинов не является количественным, а сыворотки, используемые для него имеют сравнительно низкую специфичность. В связи с изложенным, технический результат предложенного изобретения заключается в разработке получения высокоспецифичных поликлональных антител к нескольким консервативным эпитопам прионного протеина с целью создания диагностикумов для определения прионного протеина в ткани мозга млекопитающих методом ИФА.
Сущность изобретения заключается в следующем: один аспект изобретения заключается в поликлональном антителе, специфически связывающемся с прионным протеином PrP или его фрагментом, включающим аминокислотные последовательности, выбранные из группы:
а) пептид или его иммунологически активный фрагмент, имеющий аминокислотную последовательность:
SEQ ID NO:1
б) пептид, включающий аминокислотную последовательность:
143-168 SEQ ID NO:1
в) пептид, включающий аминокислотную последовательность:
101-134 SEQ ID NO:1
г) пептид, включающий аминокислотную последовательность:
211-241 SEQ ID NO:1
при этом антитело представляет собой очищенный иммуноглобулин IgG с содержанием белка не менее 95% и содержанием изотипа IgG1 не менее 70%. Оптимальным вариантом является антитело, где пептид 143-168 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:
SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRY
Дополнительным вариантом является антитело, где пептид 101-134 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:
WGQLGTHWNKPSKPKTNMKKKHVAGAAAAGAVVG
Еще одним аспектом изобретения является антитело, где пептид 211-241 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:
ETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGA
Изобретение также включает способ получения поликлонального антитела путем иммунизации кроликов синтетическими пептидами, выбранными из группы, включающей: аминокислотную последовательность: 143-168 SEQ ID NO:1, 101-134 SEQ ID NO:1 и 211-241 SEQ ID NO:1, при этом первичная иммунизация включает 1 мг белка на одного кролика, смешанного с ПАФ с последующими 4-мя иммунизациями пептидами в дозе 1 мг, смешанными с НАФ, получение сыворотки и ее очистку на аффинном сорбенте, представляющем собой агарозу с иммобилизованным пептидом с получением очищенных антител. Изобретение также включает конъюгат для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), представляющий собой антитело, полученное по вышеупомянутому способу, конъюгированное с пероксидазой хрена со степенью модификации 1.3 моль пероксидазы хрена на 1 моль IgG1 кролика.
Оптимальным конъюгатом является конъюгат, где антитело специфически связывается с пептидом 101-134 SEQ ID NO:1
Дополнительно конъюгат включает антитело, которое специфически связываеся с пептидом 211-241 SEQ ID NO:1
Диагностический реагент для определения прионного протеина PrP или его фрагментов методом ИФА, представляет собой раствор конъюгата для проведения ИФА в 50% глицерине в 0.1 М фосфатном буфере рН 7.4, содержащем БСА, при следующем содержании компонентов, мг/мл:
| Конъюгат для проведения ИФА | 1 |
| БСА | 5 |
Изобретение также включает применение диагностического реагента для определения прионного протеина PrP посредством прямого и "сэндвич-метода" ИФА.
Дополнительно изобретение включает применение диагностического реагента для определения прионного протеина PrP в ткани млекопитающего. Оптимальным аспектом изобретения является применение диагностического реагента для определения патогенной формы прионного протеина PrP. Изобретение также включает набор для определения прионного протеина PrP в ткани мозга млекопитающих, включающий: диагностический реагент, аффиноочищенное антитело, вспомогательные вещества и инструкцию по применению. Набор для "сэндвич-метода" ИФА включает пару: антитело, специфически связывающееся с пептидом 143-168 SEQ ID NO:1, и конъюгат второго антитела, полученного против пептида 211-241 SEQ ID NO: 1.
В состав набора также входят вспомогательные вещества: лизирующий буфер, денатурирующий буфер, ингибирующий реагент, реагент для разведения протеиназы К, протеиназа К, буфер для разведения проб, промывающий буфер, пероксидазный субстратный буфер, ТМБ, останавливающий реагент.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Синтез пептидов и иммунизация животных.
Для получения сывороток используют следующие пептиды PrP: 143-168, 101-134 и 211-241. Такой выбор пептидов обусловлен тем, что пептид 143-168 содержит консервативный участок прионного протеина 150-153, при этом ранее отмечалось, что моноклональные антитела, взаимодействующие с этим участком, успешно использовались для выявления PrP-Sc-протеина и диагностики ГЭ [3-5]. Пептид 143-168 включает участок, образующий β-складчатую структуру, и пептид 101-134 содержит большую часть третьего α-спирального участка. Такой выбор пептидов обусловлен тем, что необходимо получить сыворотки с высоким титром антител для дальнейшего выделения чистых антител и создания диагностикумов для ИФА. При этом пептиды 101-134 и 211-241 содержат на 5 и на 3 аминокислоты больше по сравнению с пептидами, опубликованными в наиболее близком аналоге.
Пептиды получают твердофазным методом на n-алкоксибензоильном полимере. Защитные группы боковых функциональных групп аминокислотных остатков выбирают с расчетом на конечное деблокирование TFA [трифторуксусная кислота]. Для защиты боковых функций Thr, Tyr, Ser используют But-группу, для Asp, Glu-OBut-rpynny, для Lys-Boc-, для His-Trt. В качестве временной Nα -защиты служит Fmoc-группа. Для наращивания полипептидной цепи на полимере применяют TBTU (тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-N,N,N,N-тетраметилмочевины) метод, используя пятикратный избыток аминокислоты. Отщепление синтезированных пептидов от полимера с одновременным деблокированием осуществляют смесью TFA с добавками, предотвращающими протекание побочных реакций. После деблокирования пептиды обессоливают гель-фильтрацией и очищают с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход конечных продуктов после очистки составляет от 11 до 41% в расчете на С-концевую аминокислоту. Индивидуальность полученных соединений подтверждена данными аминокислотного анализа, масс-спектрометрии и обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Получение иммунных сывороток. Иммунизацию кроликов производят вышеуказанными пептидами, параллельно по 2 кролика на пептид. Первичное введение антигена животным осуществляют в форме эмульсии в ПАФ. Последующие 4-кратные введения антигена осуществляют в НАФ согласно стандартной схеме иммунизации. В течение всего курса иммунизации (2,5 месяца) осуществляют контрольные заборы образцов крови для проведения ИФА-тестов. Выход кроличьей антисыворотки: около 20 мл от каждого забора крови у животного.
Стандартная схема иммунизации животных представлена в таблице 1.
| Таблица 1. Схема иммунизации кроликов. | ||||||
| Животное | Кролик | № | Способ иммунизации: подкожные инъекции вдоль хребта | |||
| Дата | Этап | Количество забираемой крови | Антиген | Адъювант | ||
| начало | контрольный забор крови | 5 мл | масса | объем | объем | |
| первая иммунизация | 1 мг | 1 мл | полный адъювант Фрейнда | 1 мл | ||
| через 6 недель после начала | вторая иммунизация | 1 мг | 1 мл | неполный адъювант Фрейнда | 1 мл | |
| через 8 недель после начала | третья иммунизация | 1 мг | 1 мл | неполный адъювант Фрейнда | 1 мл | |
| через 9 недель после начала | контрольный забор крови | 40 мл | ||||
| через 10 недель после начала | четвертая иммунизация | 1 мг | 1 мл | неполный адъювант Фрейнда | 1 мл | |
| через 11 недель после начала | контрольный забор крови | 40 мл | ||||
| анализ антисыворотки |
Первичный этап получения сыворотки включает в себя обработку сгустка, центрифугирование антисыворотки и ее анализ методом ИФА с применением пептида, которым иммунизированы животные (смотри далее). Характеристика полученных сывороток представлена в таблице 2.
| Таблица 2 Разведения противопептидных антител поликлональных сывороток. | |
| Пептид | Разведения сыворотки |
| 143-168 | 1:100000 |
| 101-134 | 1:150000 |
| 106-134 (известный) | 1:64000 |
| 211-241 | 1:250000 |
| 214-240 (известный) | 1:120000 |
Пример 2. Очистка сывороток.
Приготовление аффинного сорбента. К 5 мл свежеприготовленной CNBr-активированной агарозы добавляют 5-6 мг пептида в 5 мл боратно-солевого буфера (0.1 М NaCl, 0.05 М Na-борат, рН 8.0), инкубируют в течение 2-х часов при непрерывном перемешивании на ротаторе. Концентрацию лиганда определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Реакцию останавливают добавлением 0.2 М этаноламина, рН 8.0, инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Промывают сорбент на фильтре 100 мл дистиллированной воды, 20 мл элюирующего буфера (0.1 М NaCl, 0.1 М Na-ацетат, рН 2.5) и 50 мл рабочего (0.15 М NaCl, 0.01 М Na-фосфат, рН 7.5) буфера. Содержание лиганда на сорбенте составляет 0.9-1.0 мг/мл. Сорбенты хранят в боратном буфере в присутствии 3 мМ азида натрия при температуре 4°С.
Очистка сыворотки и условия хроматографирования.
1. Наносят 20 мл антисыворотки на сорбент с иммобилизованным пептидом.
2. Собирают проскок фракциями по 5 мл - не менее 5-и фракций.
3. Промывают 10 объемами (от объема колонки) рабочего буфера (0.15 M NaCl, 0.01 М Na-фосфат, рН 7.5).
4. Элюируют сорбированный материал 5-ю объемами элюирующего буфера (0.1 М NaCl, 0.1 М Na-ацетат, рН 2.5).
5. Доводят рН элюатов сухим тетраборатом натрия до рН 7.2 - 7.5.
6. Измеряют оптическую плотность при 260, 280 и 310 нм во всех фракциях элюата.
Полученные антитела представляют собой иммуноглобулин кролика IgG с содержанием не менее 95% от общего количества белка и содержанием IgGl не менее 70%. Раствор аффиноочищенных антител разводят до содержания 1 мг/мл в 0.15 М растворе хлористого натрия, содержащем 0.01 М фосфата натрия рН 7.4. В таблице 3 представлены концентрации очищенных антител.
За конечную концентрацию противопептидных антител принимают такую концентрацию антител, при которой в ИФА развивается окрашивание не менее 0.1 оптической плотности при 450 нм, превышающее фоновый уровень более чем в два раза.
| Таблица 3. Конечная и рабочая концентрация афиноочищенных антител при тестировании против пептидов в ИФА. | ||
| Пептид | Конечная концентрация антител, мкг/мл | Рабочая концентрация антител, мкг/мл |
| 143-168 | 0.008 | 0.1 |
| 101-134 | 0.01 | 0.2 |
| 211-241 | 0.002 | 0.1 |
Далее осуществляют конъюгацию пероксидазы хрена с аффиноочищенными антителами кролика методом периодатного окисления [7], при степени модификации, составляющей 1.3 моль пероксидазы хрена на 1 моль IgG кролика.
Диагностический реагент для определения прионного протеина PrP приготавливают растворением конъюгата в концентрации 1 мг/мл раствора, содержащего 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 50% глицерина в 0.1М фосфате натрия, рН 7.4. Диагностический реагент хранят при температуре -20°С в течение 2-х лет.
Пример 3. Процедура определения приона в образце мозга методом ИФА.
Подготовка проб. Вносят 1.5 мл лизирующего буфера в пробирку. Вставляют фильтр в пробирку до щелчка и помещают 200±20 мг ткани блуждающего нерва мозга коровы (овцы) на фильтр. Далее ткань гомогенизируют при помощи пестика легкими полувращательными движениями. После удаления из пробирки держателя с фильтром надосадочную жидкость декантируют и просушивают пробирку в течение нескольких секунд на фильтровальной бумаге. Отделяют осадок от надосадочной жидкости центрифугированием, просушивают, обрабатывают протеиназой К и реакцию останавливают PMSF (фенилметансульфонидфторид). Затем добавляют денатурирующий буфер и инкубируют 10 мин при 100°С.
Пример 4. Сравнение конъюгатов пероксидазы хрена с аффиноочищенными антителами кролика методом прямого ИФА.
Конъюгаты сравнивают, оценивая их специфичность к приону в образце мозга, приготовленом, как описано в примере 3, обработанным и не обработанным протеиназой К. Образец мозга, не обработанный протеиназой К, считают условно патогенным, так как, как указывалось ранее, патогенная форма приона в отличие от непатогенной устойчива к действию протеиназы [2].
На 96-луночную планшету в качестве антигена наносят образец мозга, обработанный протеиназой К, образец мозга, не обработанный протеиназой К, положительный и отрицательный контроли. В качестве положительного контроля применяют рекомбинантный прион в концентрации 2,5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена в лунки добавляют конъюгаты пероксидазы хрена с аффиноочищенными антителами кролика к пептидам: 143-168, 101-134, 211-241. Затем инкубируют 1 час и в каждую лунку добавляют пероксидазный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). После развития в лунках с положительным контролем голубого окрашивания реакцию останавливают 10% H2SO4 и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм. Значения оптической плотности представлены в таблице 4.
Критерием выбора конъюгата для определения приона в образце мозга методом прямого ИФА является специфичность, рассчитываемая по формуле:
Специфичность=OD (образец)/OD (образец+протеиназа),
где OD (образец) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, не обработанным протеиназой К (сигнал);
OD (образец+протеиназа) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, обработанным протеиназой К (шум).
То есть специфичность характеризуется отношением значений оптической плотности в лунках с образцом мозга, не обработанным протеиназой К, и образцом мозга, обработанным протеиназой К. Чем больше это отношение, тем специфичнее конъюгат к приону в образце мозга.
Значения оптической плотности в лунках с положительным контролем были максимальными, в лунках с отрицательным контролем минимальными, что подтверждает корректность проведенных экспериментов.
На основании полученных результатов для определения приона в образце мозга прямым ИФА наиболее специфичным оказался конъюгат антител к пептиду 101-134. При использовании этого конъюгата отношение оптических плотностей в лунках с образцом, не обработанным протеиназой и образцом, обработанным протеиназой, было наибольшим.
| Таблица 4 Сравнение специфичности конъюгатов | |||
| Антиген | Значения оптической плотности OD450 нм | ||
| конъюгат 143-168 | конъюгат 101-134 | конъюгат 211-241 | |
| положительный контроль | 1100 | 1800 | 2200 |
| отрицательный контроль | 45 | 50 | 65 |
| образец+протеиназа | 55 | 50 | 75 |
| образец | 800 | 1600 | 2000 |
| специфичность | 14.5 | 32 | 26.6 |
Пример 5. Перекрестное взаимодействие с чужеродными протеинами в прямом ИФА.
Важным параметром конъюгатов является их избирательность, т.е. способность связываться только с прионом и не взаимодействовать с другими протеинами и пептидами. Для проверки избирательности на 96-луночную планшету в качестве антигена наносят различные протеины и пептиды, положительный и отрицательный контроли. В качестве положительного контроля применяют синтетический пептид, соответствующий конъюгату, и рекомбинантный прион в концентрации 2.5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена в лунки добавляют конъюгаты пероксидазы хрена с аффиноочищенными антителами кролика к пептидам: 143-168, 101-134 и 211-241, затем инкубируют 1 час и добавляют в каждую лунку пероксидазный субстрат ТМБ. После развития в лунках с положительным контролем голубого окрашивания реакцию останавливают 10% H2SO4 и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм. Значения оптической плотности представлены в таблице 5.
| Таблица 5. Избирательность связывания конъюгатов. | |||
| Антиген | Конъюгаты | ||
| Конъюгат 143-168 | Конъюгат 101-134 | Конъюгат 211-241 | |
| BSA | 45 | 40 | 55 |
| казеин | 55 | 52 | 60 |
| IgG кролика | 70 | 66 | 78 |
| 211-241 | 80 | 70 | 2200 |
| 101-134 | 65 | 1800 | 70 |
| 143-168 | 1650 | 55 | 62 |
| PBSt | 50 | 55 | 65 |
| Рекомбинантный PrP | 1100 | 1800 | 2200 |
Как видно из таблицы, связывание конъюгатов с чужими протеинами и пептидами минимально, так как значения оптической плотности в лунках, содержащих чужие протеины и пептиды, приближены к значениям оптической плотности в лунках, содержащих PBSt.
Пример 6. Определение приона в образце мозга "сэндвич-методом" ИФА. Сравнение аффинно-очищенных антител к пептидам: 143-168, 101-134, 211-241, и их конъюгатов.
Для определения приона в образце мозга "сэндвич-методом" ИФА необходимо выбрать из 6 пар "антитело-конъюгат" пару с наибольшей специфичностью к приону. В предварительном эксперименте определяют специфичность пары "антитело-конъюгат" к рекомбинантному приону. Для этого на 96-луночную планшету с иммобилизованными на ней антителами к пептидам 143-168, 101-134, 211-241 наносят рекомбинантный прион в концентрации 2.5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена добавляют в лунки конъюгаты пероксидазы хрена с аффиноочищенными антителами кролика к пептидам 143-168, 101-134, 211-241, затем инкубируют 1 час и добавляют в каждую лунку пероксидазный субстрат ТМБ. После развития в лунках окрашивания, реакцию останавливают 10% H2SO4 и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм.
Далее рассчитывали специфичность пар "антитело-конъюгат" по формуле:
Специфичность=OD (прион)/OD (фон),
где OD (прион) - значение оптической плотности в лунках с рекомбинантным прионом в концентрации 2.5 мкг/мл (сигнал)
OD (фон) - значение оптической плотности в лунках с PBS (шум)
Результаты в приведены в таблице 6.
| Таблица 6. Определение специфичности пар "антитело-конъюгат" антитела по отношению OD (прион) к OD (фон). | |||
| Антитела, иммобилизованные на планшете | Конъюгаты | ||
| Кон.143-168 | Кон.101-134 | Кон. 211-241 | |
| AT 143-168 | 40 | 48 | |
| AT 101-134 | 10 | 40 | |
| AT 211-241 | 13 | 20 | |
| На основании полученных результатов были выбраны три пары "антитело-конъюгат": 1) AT 143-168 - Кон 101-134: 40-кратное превышение OD (прион) над OD (PBSt) 2) AT 101-134 - Кон 211-141: 40-кратное превышение OD (прион) над OD (PBSt) 3) AT 143-168 - Кон 211-241: 48-кратное превышение OD (прион) над OD (PBSt), как наиболее специфичные к белку. |
Пример 7. Выбор оптимальной пары "антитело-конъюгат" при определении приона "сэндвич-методом" ИФА в образцах мозга.
Определение специфичности и выбор оптимальной пары "антитело-конъюгат" проводят по ранее описанной методике, а затем обрабатывают либо не обрабатывают его протеиназой К. Образец мозга, не обработанный протеиназой К, считают условно патогенным.
На 96-луночную планшету с иммобилизованными на ней антителами к пептидам 143-168, 101-134 наносят образец мозга, обработанный протеиназой К, и образец мозга, не обработанный протеиназой К. В качестве положительного контроля применяют рекомбинантный прион в концентрации 2.5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена добавляют в лунки конъюгаты пероксидазы хрена с аффиноочищенными антителами кролика к пептидам 143-168 и 211-241. Затем инкубируют в течение 1 часа и добавляют в каждую лунку пероксидазный субстрат ТМБ. После развития в лунках окрашивания реакцию останавливают 10% H2SO4 и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм.
Далее рассчитывали специфичность пар "антитело-конъюгат" по формуле:
Специфичность=OD (образец)/OD (образец+протеиназа),
где OD (образец) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, не обработанным протеиназой К (сигнал);
OD (образец+протеиназа) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, обработанным протеиназой К (шум).
Результаты расчетов приведены в таблице 7.
| Таблица 7 Выбор оптимальной пары реагентов для определения прионного протеина в ткани мозга "сэндвич-методом" ИФА. | |||
| Антиген | Значения оптической плотности OD450 нм | ||
| AT 143-168 - Кон 101-134 | AT 143-168 - Кон 211-241 | AT 101-134 - Кон 211-241 | |
| положительный контроль | 1800 | 2200 | 2000 |
| отрицательный контроль | 45 | 45 | 50 |
| образец+протеиназа | 60 | 45 | 85 |
| образец | 500 | 1300 | 800 |
| специфичность | 8.3 | 28.8 | 9.4 |
Значения оптической плотности в лунках с положительным контролем были максимальными, в лунках с отрицательным контролем - минимальными, что подтверждает корректность проведенных экспериментов.
На основании полученных результатов для определения приона в образце мозга "сэндвич-методом" ИФА выбирают пару "антитело-конъюгат" AT 143-168 - Кон 211-241.
Выводы.
В результате проведенных экспериментов выбран конъюгат 101-134 для определения приона в образце мозга прямым ИФА. В случае "сэндвич-метода" определения приона в образце мозга наиболее специфичной оказалась пара "антитело-конъюгат" AT 143-168 - Кон 211-241.
Пример 8. Определение приона в образце мозга овцы в прямом ИФА и "сэндвич-методе" с помощью выбранных антител и конъюгатов.
Используют обработанные и не обработанные протеиназой К образцы мозга овцы. Образец мозга, не обработанный протеиназой К, считают условно патогенным. Прионный протеин в мозге овцы определяют прямым ИФА по вышеизложенной методике, используя выбранный наиболее специфичный конъюгат антител к пептиду 101-134. Также определяют прион в мозге овцы "сэндвич-методом" ИФА с использованием пары "антитело-конъюгат" AT 143-168 - Кон 211-241.
Результаты измерения представлены в таблице 8.
Превышение больше, чем в 2 раза оптической плотности лунок с образцом, не обработанным протеиназой, над оптической плотностью лунок с образцом, обработанным протеиназой, является достоверным.
OD (образец)/OD (образец+протеиназа)≥2
Как видно из таблицы 8, определение приона во всех образцах мозга овец является достоверным как в прямом ИФА, так и "сэндвич-методе", так как превышение оптической плотности лунок с образцом, не обработанным протеиназой, над оптической плотностью лунок с образцом, обработанным протеиназой, во всех случаях больше чем в два раза.
| Таблица 8. Определение содержания приона в образцах мозга овец. | ||
| Антиген | Значения оптической плотности 00450 нм | |
| прямой ИФА | "сэндвич-метод" | |
| положительный контроль | 1550 | 1400 |
| отрицательный контроль | 48 | 74 |
| образец 1+ протеиназа | 52 | 70 |
| образец 1 | 550 | 820 |
| образец 2+ протеиназа | 80 | 114 |
| образец 2 | 1072 | 1020 |
| образец 3+ протеиназа | 56 | 130 |
| образец 3 | 780 | 1278 |
Далее, на основании полученных в примере 8 данных приготавливают диагностический набор для определения прионного протеина в ткани мозга. Для прямого метода ИФА в качестве оптимального варианта в набор входит диагностический реагент - конъюгат антител к пептиду 101-134. Для "сэндвич-метода" ИФА в набор включена пара "антитело-конъюгат": антитело к пептиду 143-168 - конъюгат антител к пептиду 211-241. Конъюгаты как диагностические реагенты представляют собой раствор аффиноочищенных антител в 0.1М фосфатном буфере рН 7.4 с добавлением 50% глицерина и БСА. Конъюгат антител с концентрацией 1 мг/мл содержит 5 мг/мл БСА.
В состав набора также входят вспомогательные вещества: лизирующий буфер, денатурирующий буфер, ингибирующий реагент, реагент для разведения протеиназы К, протеиназа К, буфер для разведения проб, промывающий буфер, пероксидазный субстратный буфер, ТМБ, останавливающий раствор.
Таким образом, в представленном изобретении разработаны методы, позволяющие создать диагностический набор для определения прионного протеина PrP-Sc в ткани мозга млекопитающих и последующей диагностики прионных болезней млекопитающих.
Оптимизация выбора синтетических неконъюгированных пептидов для получения поликлональных антисывороток, выделение аффинно-очищенных неденатурированных антител и их конъюгация с пероксидазой позволяет создать специфический диагностикум для определения ГЭ, получаемый в промышленных масштабах.
Источники информации
1. Prusiner S.B., Prion diseases and the BSE crisis. Science, 1997, okt, 10, 278 (5336), pp.245-251. Review.
2. Harmeyer S., Pfaff E., Groschup M.H., Synthetic peptide vaccines yield monoclonal antibodies to cellular and pathological prion proteins of ruminants, J.Gen. Virol., 1998, apr, 79, Pt 4, pp.937-945.
3. US 6165784.
4. US 6261790.
5. US 6514707.
6. Вольпина О.М., Жмак М.Н., Обозная М.Б. и др., Антитела против синтетических фрагментов прионного белка для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота, Биоорганическая химия, 2001, т.27 (5), стр.352-358.
7. Nakane P.K., Kawaoi A., Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation, J. Histochem. Cytochem., 1974, dec, 22 (12), pp.1084-91.
1. Поликлональное антитело, специфически связывающееся с прионным протеином PrP или его фрагментом, включающим аминокислотные последовательности, выбранные из группы:
а) пептид или его иммунологически активный фрагмент, имеющий аминокислотную последовательность
SEQ ID NO:1
б) пептид, включающий аминокислотную последовательность
143-168 SEQ ID NO:1,
в) пептид, включающий аминокислотную последовательность
101-134 SEQ ID NO:1,
г) пептид, включающий аминокислотную последовательность
211-241 SEQ ID NO:1,
и представляющее собой иммуноглобулин IgG с содержанием белка не менее 95% и содержанием IgG1 не менее 70%.
2. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что пептид 143-168 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:
SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRY.
3. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что пептид 101-134 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:
WGQLGTHWNKPSKPKTNMKKKHVAGAAAAGAVVG.
4. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что пептид 211-241 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:
ETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGA.
5. Способ получения поликлонального антитела по пп.1-4 путем иммунизации кроликов синтетическими пептидами, выбранными из группы, включающей аминокислотные последовательности 43-168 SEQ ID NO:1, 101-134 SEQ ID NO:1 и 211-241 SEQ ID NO:1, при этом первичная иммунизация включает 1 мг белка на одного кролика, смешанного с ПАФ с последующими 4 иммунизациями пептидами в дозе 1 мг, смешанными с НАФ, получение сыворотки и ее очистку на аффинном сорбенте, представляющем собой агарозу с иммобилизованным пептидом.
6. Конъюгат для проведения ИФА, представляющий собой антитело, полученное по способу п.5, конъюгированное с пероксидазой хрена со степенью модификации 1.3 моль пероксидазы хрена на 1 моль IgG1 кролика.
7. Конъюгат по п.6, где используют антитело по п.3.
8. Конъюгат по п.6, где используют антитело по п.4.
9. Диагностический реагент для определения прионного протеина PrP или его фрагментов методом ИФА, представляющий собой раствор конъюгата для проведения ИФА по пп.6-8 в 50%-ном глицерине в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4, содержащем БСА, при следующем содержании компонентов: конъюгат для проведения ИФА - 1 мг/мл; БСА - 5 мг/мл
10. Применение диагностического реагента по п.9 для определения прионного протеина PrP посредством прямого и «сэндвич-метода» ИФА.
11. Применение диагностического реагента по п.10 для определения прионного протеина PrP в ткани млекопитающего.
12. Применение диагностического реагента по пп.10-11 для определения патогенной формы прионного протеина PrP.
13. Набор для определения прионного протеина PrP в ткани мозга млекопитающих включающий диагностический реагент по п.9, аффинно-очищенное антитело, полученное по способу по п.5, вспомогательные вещества и инструкция по применению.
14. Набор по п.13, где для «сэндвич-метода» ИФА используют пару антитело по п.2 и конъюгат по п.8.
15. Набор по п.13, характеризующийся тем, что в качестве вспомогательных веществ набор содержит лизирующий буфер, денатурирующий буфер, ингибирующий реагент, реагент для разведения протеиназы К, протеиназу К, буфер для растворения проб, промывающий буфер, пероксидазный субстратный буфер, раствор ТМВ и останавливающий раствор.
