Поликлональное антитело, специфически реагирующее с прионным протеином в ткани мозга млекопитающих, и диагностический реагент на его основе

Изобретение относится к области биотехнологии и касается поликлонального антитела, специфически реагирующего с прионным протеином PrP или его фрагментом, и диагностического реагента на его основе. Изобретение включает поликлональное антитело к новому синтетическому фрагменту 143-168 SEQ ID NO:1 бычьего прионного белка, получения высокоактивных кроличьих антисыворок без конъюгации пептидов с носителем, их очистку на аффинном сорбенте с получением высокоочищенных антител и создание диагностического реагента для определения прионного протеина "сэндвич-методом" ИФА в ткани мозга млекопитающих с использованием пары "антитело-конъюгат", включающей антитело к пептиду 143-168 и конъюгат антитела к пептиду 211-241 с пероксидазой хрена. Преимущество изобретения заключается в повышении способа определения прионного белка, 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается поликлонального антитела, специфически реагирующего с прионным протеином в ткани мозга млекопитающих, и диагностического реагента на его основе.

Прионные болезни человека и животных относятся к группе медленных инфекций, проявляются в дегенеративных изменениях центральной нервной системы и завершаются летальным исходом.

Инфекционный агент этих заболеваний представляет собой белковую молекулу - патогенную изоформу белка (PrPSc) нормального клеточного белка (PrPC) млекопитающих и не является бактерией или вирусом. Прионный белок закодирован в геноме млекопитающих, экспрессируется на поверхности многих клеток организма, но больше всего прионной мРНК найдено в нейронах. Механизм патогенеза прионных заболеваний объясняют превращением белка PrPC в PrPSc при контакте с патогенной изоформой с последующим накоплением полимеров PrPSc в нервной ткани. Изоформы прионного белка имеют одинаковую аминокислотную последовательность, а отличие PrPSc от PrPC заключается в увеличении содержания β-структуры [1]. Видимо, благодаря конформационным изменениям патогенная изоформа приобретает умеренную устойчивость к протеолизу [2], склонность к полимеризации и нерастворимость в не денатурирующих детергентах.

В настоящее время известно четыре болезни человека: болезнь Крейцфельда-Якоба, куру, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, фатальная семейная инсомния и шесть болезней животных: скрепи овец и коз, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота ("бешенство коров"), трансмиссивная энцефалопатия норок, изнуряющая болезнь оленей и лосей, губкообразная энцефалопатия кошек и губкообразная энцефалопатия экзотических копытных. Заражение обычно происходит через пищу, содержащую инфекционный материал. По крайней мере, причиной возникновения эпидемии губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Великобритании считают использование в рационе скота мясокостной муки, приготовленной из останков больных животных. В свою очередь, употребление в пищу зараженной говядины считают причиной появления неизвестной ранее разновидности болезни Крейцфельда-Якоба, так называемого "нового варианта". Ввиду высокой межвидовой гомологии прионного белка (90-95%) разработка методов его определения позволяет диагностировать прионные заболевания всей вышеуказанной группы.

До недавнего времени диагностику прионных заболеваний проводили только с помощью гистологического исследования возникающих в мозге патологических изменений. Однако аналогичные признаки могут встречаться и при других нейродегенеративных заболеваниях. В настоящее время разработаны различные тесты, основанные на иммунологическом выявлении патогенного прионного белка с помощью специфичных антител. Антитела к прионам также необходимы для дальнейшего изучения прионных болезней, а также поиска способов их профилактики и лечения. Для разработки чувствительных методов исследования и диагностики прионных болезней необходимы антитела, специфичные к различным участкам приона. Проблема получения антител к прионному белку связана с его низкой иммуногенностью. Для ее разрешения разрабатывают различные подходы, среди которых в настоящее время наиболее перспективным считается иммунизация синтетическими пептидными фрагментами приона.

В настоящее время методы диагностики прионных заболеваний основаны на применении иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных антител, полученных к различным участкам прионного белка. Так, известны моноклональные антитела, полученные к синтетическому пептиду 146-159 бычьего прионного белка, конъюгированному с малеимид-активированным KLH (гемоцианин улитки) и использованному в качестве иммуногена. Эти моноклональные антитела связывают консервативный эпитоп -Ile-His-Phe-Gli-PrP-Sc скрепи овец. Далее использование комбинации двух моноклональных антител к вышеуказанному синтетическому пептиду и к пептиду 225-241, которые связывают дополнительный консервативный эпитоп -Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-PrP-Sc позволило повысить чувствительность и специфичность определения патогенной формы прионного протеина методом ИФА, а также расширить его применение для диагностики прионных болезней жвачных домашних животных, кошек, норок, человека и нечеловекообразных приматов. Известна индукция иммунного ответа синтетическими фрагментами прионного белка и их аналогами у мышей разных линий. В работе использовали пять синтетических фрагментов и шесть их аналогов. Все пептиды, кроме одного в свободном виде без конъюгации с носителем индуцировали образование антител. При исследовании сывороток иммуногистологическим методом выявлены сыворотки, эффективно взаимодействующие с препаратами мозга крупного рогатого скота, больного губкообразной энцелофатией (ГЭ). Наиболее близким аналогом является источник информации, касающийся получения поликлональных антител против синтетических фрагментов бычьего прионного белка, используемых для диагностики ГЭ крупного рогатого скота [5, 6]. Для получения поликлональных сывороток авторы использовали 7 синтетических пептидов, полученных твердофазным методом на n-алкоксибензильном полимере. Для получения противопептидных сывороток кроликов иммунизировали трехкратно синтетическими пептидами или их конъюгатами с KLH. Первую иммунизацию проводили в дозе 500 мкг на одно животное в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), вторую иммунизацию осуществляли в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) в той же дозе и третью иммунизацию проводили в дозе 50 мкг пептида в НАФ. Наиболее иммунологически активными пептидами оказались пептиды с последовательностями аминокислот 106-134 бычьего PrP, которые далее использовались в иммуногистологическом методе определения прионного белка в срезах парафиновых блоков коров больных ГЭ. В указанной работе выявлены пептиды, позволившие получить сыворотки, связывающиеся с препаратами мозга крупного рогатого скота, больного ГЭ, и не взаимодействующие с препаратами мозга здоровых животных. Однако предложенный метод тестирования прионсодержащих протеинов не является количественным, а сыворотки, используемые для него, имеют сравнительно низкую специфичность. В связи с изложенным, задача данного изобретения заключается в обнаружении нового фрагмента бычьего прионного белка, включающего консервативный эпитоп -Ile-His-Phe-Gli- с целью получения к нему высокоактивных поликлональных антисывороток без использования конъюгации, дальнейшей очистки этих сывороток и создания диагностического реагента для ИФА. Технический результат предложенного изобретения заключается в разработке получения высокоспецифичных поликлональных антител с целью создания диагностикума для определения прионного протеина в ткани мозга млекопитающих методом ИФА.

Сущность изобретения заключается в следующем. Один аспект изобретения заключается в поликлональном антителе специфически реагирующем с прионным протеином PrP в ткани мозга млекопитающих, полученным посредством иммунизации кроликов синтетическим пептидом, включающем аминокислотную последовательность 143-168 SEQ ID NO:1. При этом синтетический пептид 143-168 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRY.

Следующим аспектом изобретения является иммуногенноактивный синтетический пептид 143-168 SEQ ID NO:1, характеризующийся тем, что имеет аминокислотную последовательность:

SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRY.

Дополнительно указанный иммуногенноактивный синтетический пептид имеет последовательность бычьего прионного белка.

Оптимальным вариантом изобретения является аффинно-очищенное поликлональное антитело, характеризующееся тем, что оно представляет собой поликлональное антитело, очищенное на агарозе с иммобилизованным пептидом 143-168 SEQ ID NO:1 и является кроличьим иммуноглобулином IgG с содержанием белка не менее 95% и IgGl изотипа не менее 70% и активностью не менее 0.008 мг/мл при определении методом непрямого ИФА.

Диагностический реагент для определения прионного протеина PrP в ткани мозга млекопитающих "сэндвич-методом" ИФА представляет собой пару: аффинно-очищенное антитело, полученное к пептиду 143-168, и антитело к синтетическому пептиду прионного протеина PrP, имеющее аминокислотную последовательность 211-241 SEQ ID NO:1, конъюгированное с пероксидазой хрена.

Изобретение также включает способ определения прионного протеина PrP в ткани мозга млекопитающих, характеризующийся тем, что блуждающий нерв мозга обрабатывают на фильтре лизирующим буфером и гомогенизируют, центрифугируют, отделяют осадок, обрабатывают его протеиназой К, останавливают реакцию денатурирующим буфером, нагревают при 100°С в течение 10 мин и определяют содержание прионного протеина "сэндвич-методом" ИФА с применением пары антител: аффинно-очищенного антитела, полученного к пептиду 143-168, и антитела к синтетическому пептиду прионного протеина PrP, имеющее аминокислотную последовательность 211-241 SEQ ID NO:1, конъюгированного с пероксидазой хрена.

Конкретные примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Синтез пептида: 143-168 SEQ ID NO:1:

H-Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-His-Arg-Tyr-OH

Получение Fmoc-Tyr(Bu^t)-Р (I).

n-алкоксибензильный полимер с содержанием гидроксильных групп 0.37 ммоль/г промывают диметилформамидом, диэтиловым эфиром и сушат на стеклянном фильтре. В минимальном объеме диметилформамида суспендируют 300 мг n-алкоксибензильного полимера и 13.2 мг диметиламинопиридина (0.11 ммоль). В 5 мл диметилформамида растворяют 0.51 г (1.1 ммоль) Fmoc-Tyr(Bu^t)-OH, 150 мг (1.1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, и 172 мкл (1.1 ммоль) NN'-диизопропилкарбодиимида, раствор перемешивают 10 мин при 0°С и затем приливают к суспендированному полимеру. Реакцию проводят 4 часа при периодическом перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают диметилформамидом и обрабатывают 5 мл смеси Ас₂О-пиридин-CH₂Cl₂ (20:20:60) в течение 1 ч, после чего полимер промывают изопропанолом и диметилформамидом.

Пример одного синтетического цикла.

Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Tyr(Bu^t)-Р (II).

а) Полученный на предыдущем этапе пептидил-полимер (I) в течение 20 мин обрабатывают 20%-ным раствором пиперидина в диметилформамиде. Полимер промывают последовательно 5 мл следующих растворителей: диметилформамидом - 3 раза по 2 мин, смесью диоксан-вода (2:1) - 2 раза по 5 мин, диметилформамидом - 5 раз по 2 мин.

б) В 5 мл диметилформамида растворяют 0.71 г (1.1 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 150 мг (1.1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, и 172 мкл (1.1 ммоль) NN'-диизопропилкарбодиимида, раствор перемешивают 10 мин при 0°С и затем приливают к суспендированному полимеру. Реакцию проводят 4 часа при периодическом перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают диметилформамидом и обрабатывают 5 мл смеси Ас₂O-пиридин-диметилформамид (20:20:60) в течение 1 ч, после чего полимер последовательно промывают диметилформамидом, изопропанолом, диметилформамидом.

Синтез фрагмента 143-168 бычьего прионного белка:

SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRY

Синтез полипептидной цепи проводят вручную в стеклянном проточном реакторе (2×20 см) по следующему протоколу для каждого синтетического цикла (из расчета 8-10 мл растворителя на 300 мг исходного полимера), при проведении реакции конденсации (операция 6) используют объем реакционной смеси 3-4 мл:

1. DMF(5×2 мин);

2. 20% пиперидин в DMF (20 мин);

3. DMF (3×2 мин);

4. диоксан-вода, 2:1, (2×5 мин);

5. DMF (5×2 мин);

6. Реакция конденсации: 10 экв. активированной Fmoc-аминокислоты (4 ч);

7. DMF (3×2 мин);

8. ацилирование: Ас₂О-пиридин-диметилформамид, 20:20:60, (1 ч);

9. DMF (3×2 мин);

10. изопропанол (3×2 мин);

Для активации Fmoc-производных аминокислот DIPC/HOBT-методом к раствору 10 экв.(1.1 ммоль) Fmoc-защищенной аминокислоты и 150 мг (10 экв., 1.1 ммоль) HOBt в 3-4 мл DMF добавляют 170 мкл (10 экв., 1.1 ммоль) DIPCDI, раствор перемешивают 10 мин.

Полноту протекания реакции конденсации контролируют с помощью нингидринового или в случае N-концевого пролина пикринового тестов после операции 6 синтетического протокола.

Для реакции отщепления пептида от полимера и одновременного деблокирования защитных групп боковых цепей аминокислот отбирают 300 мг пептидил-полимера (из 1.2 г пептидил-полимера). К пептидил-полимеру приливают 5 мл смеси TFA-EDT-DMS-м-крезол в объемном соотношении 91:3:3:3, суспензию перемешивают в течение 2 ч, затем полученный раствор пептида отфильтровывают от полимера, промывают 5 мл TFA и избыток TFA упаривают при пониженном давлении. Пептид осаждают 100 мл этилового эфира, отфильтровывают и промывают эфиром (5×20 мл). Осадок растворяют в 5 мл 10% АсОН 20 мин, отфильтровывали и промывают 5 мл 10% АсОН. Полученный раствор пептида лиофилизовывают и обессоливают на колонке (2.5×60 см) с Сефадексом G-10 в 0.1 М АсОН. Очистку пептида проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила (от 10% до 70% за 60 мин) в 0.1% TFA при расходе элюента 4 мл/мин, поглощение элюата регистрируют при длине волны 226 нм. Фракции, соответствующие основному пику на хроматограмме, собирают и лиофилизируют. Выход пептида в расчете на С-концевую аминокислоту составил 10%. Пептид анализируют с помощью аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводят в градиенте ацетонитрила в 0.1% TFA (от 10% до 70% за 60 мин) при расходе элюента 1 мл/мин, поглощение элюата регистрируют при длине волны 226 нм. Время удерживания пептида в условиях аналитической ВЭЖХ составило 20.3 мин. Экспериментальная молекулярная масса 3294, теоретическая молекулярная масса 3294.7.

Сокращения:

DIPCDI-N,N′-диизопропилкарбодиимид;

Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил; НОВТ-1гидроксибензотриазол;

TFA - трифторуксусная кислота; DMAP - диметиламинопиридин; EDT - этандитиол; DMS - диметилсульфид.

Другие синтетические пептиды 101-134 и 211-241 получают по методу, описанному в [5].

Пример 2. Получение иммунных сывороток.

Иммунизацию кроликов проводят вышеуказанными пептидами, параллельно по 2 кролика на пептид. Первичное введение антигена животным осуществляют в форме эмульсии в ПАФ. Последующие 4-кратные введения антигена осуществляют в НАФ согласно стандартной схеме иммунизации. В течение всего курса иммунизации (2.5 месяца) осуществляют контрольные заборы образцов крови для проведения ИФА-тестов. Выход кроличьей сыворотки составляет около 20 мл от каждого забора крови у животного.

Первичный этап получения сыворотки включает в себя обработку сгустка, центрифугирование антисыворотки и ее анализ методом ИФА с применением пептида, которым иммунизированы животные.

Пример 3. Очистка сывороток.

Приготовление аффинного сорбента.

Приготовление аффинного сорбента. К 5 мл свежеприготовленной CNBr-активированной агарозы добавляют 5-6 мг пептида в 5 мл боратно-солевого буфера (0.1 М NaCl, 0.05 М Na-борат, рН 8.0), инкубируют в течение и 2-х часов при непрерывном перемешивании на ротаторе. Концентрацию лиганда определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Реакцию останавливают добавлением 0.2 М этаноламина, рН 8.0, инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Промывают сорбент на фильтре 100 мл дистиллированной воды, 20 мл элюирующего буфера (0.1 М NaCl, 0.1 М Na-ацетат, рН 2.5) и 50 мл рабочего (0.15 М NaCl, 0.01 М Na-фосфат, рН 7.5) буфера. Содержание лиганда на сорбенте составляет 0.9-1.0 мг/мл. Сорбенты хранят в боратном буфере в присутствии 3 мМ азида натрия при температуре 4°С.

Очистка сыворотки и условия хроматографирования.

1) Наносят 20 мл антисыворотки на сорбент с иммобилизованным пептидом.

2) Собирают проскок фракциями по 5 мл - не менее 5 фракций.

3) Промывают 10 объемами (от объема колонки) рабочего буфера (0.15 М NaCl, 0.01 М Na-фосфат, рН 7.5).

4) Элюируют сорбированный материал 5 объемами элюирующего буфера (0.1 М NaCl, 0.1 M Na-ацетат, рН 2.5).

5) Доводят рН элюатов сухим тетраборатом натрия до рН 7.2 - 7.5. В табл.1 представлена характеристика антител.

Таблица 1. Характеристика аффинно-очищенных антител.
Пептид	Разведение сыворотки	Конечная концентрация антител, мкг/мл	Рабочая концентрация антител, мкг/мл
143-168	1:100000	0.008	0.1
211-241	1:250000	0.002	0.1

За конечную концентрацию противопептидных антител принимают такую концентрацию антител, при которой в ИФА развивается окрашивание не менее 0.1 ед. оптической плотности при 450 нм, превышающий фоновый уровень более чем в два раза.

Пример 4. Процедура определения приона в образце мозга методом ИФА.

Подготовка проб. Вносят 1,5 мл лизирующего буфера в пробирку. Вставляют фильтр в пробирку до щелчка и помещают 200±20 мг ткани блуждающего нерва мозга коровы (овцы) на фильтр. Далее ткань гомогенизируют при помощи пестика легкими полувращательными движениями. После удаления из пробирки держателя с фильтром декантируют надосадочную жидкость и просушивают пробирку в течение нескольких секунд на фильтровальной бумаге. Отделяют осадок от надосадочной жидкости центрифугированием, просушивают, обрабатывают протеиназой К и останавливают реакцию PMSF (фенилметансульфонидфторид). Затем добавляют денатурирующий буфер и инкубируют 10 мин при 100°С.

Пример 5. Определение активности конъюгатов аффинно-очищенных антител с пероксидазой хрена при определении прямым методом ИФА.

Конъюгаты аффинно-очищенных антител с пероксидазой хрена получают по методу [7] и сравнивают, оценивая их специфичность к приону в образце мозга, обработанным и не обработанным протеиназой К, приготовленном, как описано в предыдущем примере.

Образец мозга, не обработанный протеиназой К, считают условно патогенным, так как, как указывалось ранее, патогенная форма приона в отличие от непатогенной устойчива к действию протеиназы К [2].

На 96-луночную планшету в качестве антигена наносят образец мозга, обработанный протеиназой К, образец мозга, не обработанный протеиназой К, положительный и отрицательный контроли. В качестве положительного контроля применяют рекомбинантный прион в концентрации 2.5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена в лунки добавляют конъюгаты пероксидазы хрена с аффинно-очищенными антителами кролика к пептидам: 143-168 и 211-241. Затем инкубируют 1 час и в каждую лунку добавляют пероксидазный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). После развития в лунках с положительным контролем голубого окрашивания реакцию останавливают 10% H₂SO₄ и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм. Значения оптической плотности представлены в таблице 2.

Таблица 2 Сравнение специфичности конъюгатов
Антиген	Конъюгат 143-168	Конъюгат 211-241
положительный контроль	1100	2200
отрицательный контроль	45	65
образец+протеиназа	55	75
образец	800	2000
специфичность	14,5	26,6

Критерием выбора конъюгата для определения приона в образце мозга методом прямого ИФА является специфичность, рассчитываемая по формуле:

Специфичность=OD (образец)/OD (образец+протеиназа),

где OD (образец) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, не обработанным протеиназой К (сигнал);

OD (образец+протеиназа) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, обработанным протеиназой К (шум).

То есть специфичность характеризуется отношением значений оптической плотности в лунках с образцом мозга, не обработанным протеиназой К, и образцом мозга, обработанным протеиназой К. Чем больше это отношение, тем специфичнее конъюгат к приону в образце мозга.

Значения оптической плотности в лунках с положительным контролем являются максимальными, в лунках с отрицательным контролем - минимальными, что подтверждает корректность проведенных экспериментов.

На основании полученных результатов для определения приона в образце мозга прямым ИФА более специфичным оказался конъюгат- антител к пептиду 211-241. При использовании этого конъюгата отношение оптических плотностей в лунках с образцом, не обработанным протеиназой, и образцом, обработанным протеиназой, было большим по сравнению с конъюгатом 143-168.

Пример 6. Перекрестное взаимодействие конъюгатов аффинно-очищенных антител с чужеродными протеинами при определении методом прямого ИФА.

Важным параметром конъюгатов аффинно-очищенных антител является их избирательность, т.е. способность связываться только с прионом и не взаимодействовать с другими белками и пептидами. Для проверки избирательности на 96-луночную планшету в качестве антигена наносят различные белки и пептиды, положительный и отрицательный контроли. В качестве положительного контроля применяют синтетический пептид, соответствующий конъюгату, и рекомбинантный прион в концентрации 2.5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена добавляют в лунки конъюгаты пероксидазы хрена с аффинно-очищенными антителами кролика к пептидам: 143-168 и 211-241, затем инкубируют 1 час и добавляют в каждую лунку пероксидазный субстрат ТМБ. После развития в лунках с положительным контролем голубого окрашивания реакцию останавливают 10% Н₂SO₄ и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм. Значения оптической плотности представлены в таблице 3.

Таблица 3. Избирательность связывания конъюгатов.
Антиген	Конъюгат 143-168	Конъюгат 211-241
BSA	45	55
казеин	55	60
IgG кролика	70	78
211-241	80	2200
143-168	65	62
PBSt	50	65
Рекомбинантный PrP	1100	2200

Как видно из таблицы, связывание конъюгатов с чужими белками и пептидами минимально, так как значения оптической плотности в лунках, содержащих чужие белки и пептиды, приближены к значениям оптической плотности в лунках, содержащих PBSt. Данные представленной таблицы также свидетельствуют о более высокой специфичности в прямом ИФА антител к пептиду 211-241.

Пример 7. Определение приона в образце мозга "сэндвич-методом" ИФА. Сравнение аффинно-очищенных антител к пептидам: 143-168 и 211-241, а также их конъюгатов.

Для определения приона в образце мозга "сэндвич-методом" ИФА проверено несколько пар "антитело-конъюгат" с наибольшей специфичностью к приону. В предварительном эксперименте определяют специфичность пар "антитело-конъюгат" к рекомбинантному приону. Для этого на 96-луночную планшету с иммобилизованными на ней антителами 143-168, 101-134, 211-241 наносят рекомбинантный прион в концентрации 2.5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена добавляют в лунки конъюгаты пероксидазы хрена с аффинно-очищенными антителами кролика к пептидам 143-168, 101-134, 211-241, затем инкубируют 1 час и добавляют в каждую лунку пероксидазный субстрат ТМБ. После развития в лунках окрашивания реакцию останавливают 10% Н₂SO₄ и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм.

Далее рассчитывали специфичность пар "антитело-конъюгат" по формуле:

Специфичность=OD (прион)/OD (фон),

где OD (прион) - значение оптической плотности в лунках с рекомбинантным прионом в концентрации 2.5 мкг/мл (сигнал);

OD (фон) - значение оптической плотности в лунках с PBS (шум). Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4 Определение специфичности пар "антитело-конъюгат" по отношению OD (прион) к OD (фон).
Антитела, иммобилизованные на планшете	Конъюгаты
Кон. 143-168	Кон.101-134	Кон. 211-241
AT 143-168		40	48
AT 101-134	10		40
AT 211-241	13	20

На основании полученных результатов три пары "антитело-конъюгат" показали высокую специфичность.

1) AT 143-168 - Кон 101-134: 40-кратное превышение OD (прион) над OD (PBSt)

2) AT 101-134 - Кон 211-141: 40-кратное превышение OD (прион) над OD (PBSt)

3) AT 143-168 - Кон 211-241: 48-кратное превышение OD (прион) над OD (PBSt).

Антитело к пептиду 143-168 оказалось наиболее специфичным в "сэндвич-методе" ИФА.

Пример 8. Выбор оптимальной пары "антитело-конъюгат" при определении приона "сэндвич-методом" ИФА в образцах мозга.

Определение специфичности и выбор оптимальной пары "антитело-конъюгат" проводят по ранее описанной методике. Образец мозга, не обработанный протеиназой К, считают условно патогенным.

На 96-луночную планшету с иммобилизованными на ней антителами к пептидам 143-168, 101-134 наносят образец мозга, обработанный протеиназой К, и образец мозга, не обработанный протеиназой К. В качестве положительного контроля применяют рекомбинантный прион в концентрации 2.5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля (фона) используют PBS с 0.05% твином 20 (PBSt) и 1% BSA. После 1 часа инкубации антигена добавляют в лунки конъюгаты пероксидазы хрена с аффинно-очищенными антителами кролика к пептидам 143-168 и 211-241. Затем инкубируют в течение 1 часа и добавляют в каждую лунку пероксидазный субстрат ТМБ. После развития в лунках окрашивания реакцию останавливают 10% Н₂SO₄ и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм.

Далее рассчитывали специфичность пар "антитело-конъюгат" по формуле:

Специфичность=OD (образец)/OD (образец+протеиназа),

где OD (образец) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, не обработанным протеиназой К (сигнал);

OD (образец+протеиназа) - значение оптической плотности в лунках с образцом мозга, обработанным протеиназой К (шум).

Результаты расчетов приведены в таблице 5.

Таблица 5 Определение специфичности пары реагентов для определения прионного протеина в ткани мозга "сэндвич-методом" ИФА
Антиген	Значения оптической плотности OD450 нм
AT 143-168 - Кон 101-134	AT 143-168 - Кон 211-241	AT 101-134 - Кон 211-241
положительный контроль	1800	2200	2000
отрицательный контроль	45	45	50
образец+протеиназа	60	45	85
образец	500	1300	800
специфичность	8.3	28.8	9.4

Значения оптической плотности в лунках с положительным контролем были максимальными, в лунках с отрицательным контролем - минимальными, что подтверждает корректность проведенных экспериментов.

На основании полученных результатов для определения приона в образце мозга "сэндвич-методом" ИФА выбирают пару "антитело-конъюгат" AT 143-168-Кон 211-241.

Выводы:

В результате проведенных экспериментов в случае "сэндвич-метода" ИФА определения приона в образце мозга наиболее специфичной оказалась пара "антитело-конъюгат" AT 143-168 - Кон 211-241.

Пример 9. Определение приона в образце мозга овцы в прямом ИФА и "сэндвич-методе" с помощью выбранных антител и конъюгатов.

Используют обработанные и не обработанные протеиназой К образцы мозга овцы. Образец мозга, не обработанный протеиназой К считают условно патогенным. Определение проводят прямым методом с использованием наибоее активного конъюгата 101-134 и "сэндвич-методом" ИФА с использованием пары "антитело-конъюгат" - антитело к пептиду 143-168 и конъюгат к пептиду 211-241.

Результаты в приведены в таблице 6.

Превышение больше, чем в 2 раза оптической плотности лунок с образцом, не обработанным протеиназой, над оптической плотностью лунок с образцом, обработанным протеиназой, является достоверным.

OD (образец)/OD (образец+протеиназа)≥2

Как видно из таблицы 6, определение приона во всех образцах мозга овец является достоверным как в прямом ИФА, так и "сэндвич-методе", так как превышение оптической плотности лунок с образцом, не обработанным протеиназой К, значительно выше по сравнению с оптической плотностью в лунках с образцами, обработанными протеиназой К.

Таблица 6 Сравнительное определение содержания прионного протеина в ткани мозга овец.
Антиген	Значения оптической плотности OD450 нм
прямой ИФА	"сэндвич-метод"
положительный контроль	1550	1400
отрицательный контроль	48	74
образец 1+ протеиназа	52	70
образец 1	550	820
образец 2+ протеиназа	80	114
образец 2	1072	1020
образец 3+ протеиназа	56	130
образец 3	780	1278

Далее, на основании полученных в примере 9 данных приготавливают диагностический реагент для определения прионного протеина в ткани мозга, представляющий собой для "сэндвич-метода" ИФА пару "антитело-конъюгат": антитело к пептиду 143-168 - конъюгат антитела к пептиду 211-241. Таким образом, получена высокоактивная поликлональная сыворотка к новому синтетическому пептиду 143-168 бычьего прионного протеина без его конъюгации с носителем, что позволило создать диагностический реагент для определения прионного протеина в образцах мозга млекопитающих с применением "сэндвич-метода". Использование для создания диагностического реагента нового синтетического пептида позволяет наряду с прямым методом ИФА определять дополнительные эпитопы и, следовательно, повысить специфичность диагностики. Таким образом, в представленном изобретении разработаны методы, позволяющие создать диагностический набор для определения прионного протеина PrP-Sc в ткани мозга млекопитающих "сэндвич-методом" ИФА и последующей диагностики прионных болезней млекопитающих.

Источники информации

1. Prusiner S.B., Prion diseases and the BSE crisis. Science, 1997, okt 10, 278(5336), pp.245-251. Review.

2. Harmeyer S., Pfaff E., Groschup M.H., Synthetic peptide vaccines yield monoclonal antibodies to cellular and pathological prion proteins of ruminants, J. Gen. Virol, 1998, apr, 79, Pt 4, pp.937-945.

3. US 6165784.

4. US 6261790.

5. Вольпина О.М., Жмак М.Н., Обозная М.Б. и др., Антитела против синтетических фрагментов прионного белка для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота. Биоорганическая химия, 2001, т.27(5), стр.352-358.

6. Обозная М.Б., Вольпина О.М., Жмак М.Н., и др., Индукция иммунного ответа синтетическими фрагментами прионного белка и их аналогами у мышей разных линий. Биоорганическая химия, 2004, т.30(4), стр.353-356.

7. Nakane P.K., Kawaoi A., Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation, J.Histochem. Cytochem., 1974, dec, 22(12), pp.1084-91.

1. Поликлональное антитело, характеризующееся тем, что оно специфически реагирует с прионным протеином PrP в ткани мозга млекопитающих, полученное посредством иммунизации кроликов синтетическим пептидом, включающим аминокислотную последовательность 143-168 SEQ ID NO:1.

2. Антитело по п.1, характеризующееся тем, что пептид 143-168 SEQ ID NO:1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRY.

3. Иммуногенноактивный синтетический пептид 143-168 SEQ ID NO:1, характеризующийся тем, что имеет аминокислотную последовательность

SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRY SEQ ID NO:2.

4. Иммуногенноактивный синтетический пептид по п.3, который имеет последовательность фрагмента бычьего прионного протеина PrP.

5. Аффинно-очищенное поликлональное антитело, характеризующееся тем, что оно представляет собой поликлональное антитело по пп.1 и 2, очищенное на агарозе с иммобилизованным пептидом по пп.3 и 4, и представляет собой кроличий иммуноглобулин IgG с содержанием белка не менее 95% и IgG1 изотипа не менее 70% и активностью не менее 0,008 мг/мл при определении методом непрямого ИФА.

6. Диагностический реагент для определения прионного протеина PrP в ткани мозга млекопитающих "сэндвич-методом" ИФА, представляющий собой пару аффинно-очищенное антитело по п.5 и антитело к синтетическому пептиду прионного протеина PrP, имеющего аминокислотную последовательность 211-241 SEQ ID NO:1, конъюгированное с пероксидазой хрена.

7. Способ определения прионного протеина PrP в ткани мозга млекопитающих, характеризующийся тем, что блуждающий нерв мозга млекопитающих обрабатывают на фильтре лизирующим буфером и гомогенизируют, отделяют осадок центрифугированием, обрабатывают его протеиназой К, останавливают реакцию денатурирующим буфером, нагревают при 100°С в течение 10 мин и определяют содержание прионного протеина "сэндвич-методом" ИФА с применением диагностического реагента по п.6.