Способ выделения эпотилонов из реакционной смеси и десорбции из синтетической смолы (варианты), применение слабополярного или аполярного растворителя для осуществления способов

Изобретение относится к выделению эпотилонов, используемых в медицине при лечении раковых заболеваний. Способ десорбции эпотилонов А, В, D и/или Е из синтетической смолы основан на использовании слабополярного или аполярного растворителя, выбранного из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители или смесь двух или большего количества таких растворителей, где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода. Применяемый ароматический растворитель выбран из группы, включающей нафталин, бензол или нафталин и бензол, замещенные одним или несколькими заместителями, выбранными из группы: (низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппа, галоген, нитрогруппа и (низш.)алкокси-(низш.)алкил, где приставка (низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода. Растворитель удаляют до необходимого уровня, предпочтительно до получения сухого остатка. При необходимости остаток растворяют в смеси спирт/углеводород в соответствующем объемном соотношении. Спиртовую фазу упаривают, предпочтительно досуха, и затем спиртовой экстракт кристаллизуют из смеси спирта и углеводорода, затем образовавшийся твердый кристаллизованный продукт растворяют в смеси нитрил/вода, предпочтительно в смеси ацетонитрил/вода в соотношении 2:3 (об./об.). Образовавшийся раствор вносят (при необходимости после разделения на несколько погонов) на колонку для препаративной хроматографии с обращенной фазой. Затем осуществляют элюирование нитрилом /водой; после этого удаляют нитрил и образовавшуюся водную фазу экстрагируют сложным эфиром. Сложноэфирный экстракт упаривают и после этого образовавшийся продукт подвергают перекристаллизации. Способ получения эпотилонов А, В, D и/или Е из смолы или реакционной смеси, включает: десорбцию эпотилонов слабополярным или аполярным растворителем, выбранным из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители или смесь двух или большего количества таких растворителей, причем стадию десорбции можно повторять для достижения более полной десорбции; удаление применяемого для десорбции растворителя из образовавшихся растворов путем упаривания; необязательно кристаллизацию эпотилона(ов) после десорбции; прежде всего для кристаллизация эпотилона В, путем добавления смеси спирта и углеводорода, и упаривание спиртовой фазы досуха и кристаллизацию эпотилона В из соответствующей смеси растворителей; (обязательная стадия) отделение эпотилонов с помощью хроматографии с обращенной фазой с последующим растворением остатка, полученного на предыдущей стадии, в пригодном растворителе, и элюирования смесью нитрила и воды, и удаление нитрила из собранных содержащих эпотилон фракций упариванием; при необходимости оставшуюся с эпотилоном воду затем экстрагируют сложным эфиром с последующим упариванием досуха содержащей эпотилон сложноэфирной фазы; необязательно очистку адсорбционной хроматографией; и конечную перекристаллизацию очищенного эпотилона из соответствующих растворителей или смесей растворителей. В этом процессе при необходимости между каждой применяемой стадией образовавшиеся растворы или суспензии концентрируют и/или жидкие или твердые компоненты отделяют друг от друга. Разделение эпотилонов А и В осуществляют с помощью хроматографии на основе моделирования движущегося слоя (SMB). Технический результат - упрощение способов наработки больших количеств эпотилонов для удовлетворения потребностей в этих агентах. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, табл.

 

Изобретение относится к новому способу десорбции эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или эпотилона В, из смол и к новым методам получения, обработки и очистки или производства эпотилонов, включающим указанный процесс десорбции, а также к применению некоторых растворителей для десорбции эпотилонов из смол.

Предпосылки создания изобретения

Эпотилоны А и В представляют собой новый класс стабилизирующих микротрубочки цитотоксических действующих веществ (см. Gerth К. и др., J. Antibiot. 49, 560-3 (1966)) формулы:

где R обозначает водород (эпотилон А) или метил (эпотилон В).

С момента описания этих эпотилонов (см. WO 93/10121) было предложено несколько методов синтеза и получения обоих этих эпотилонов и прежде всего многочисленных производных эпотилонов (далее в контексте настоящего описания имеют групповое название «эпотилоны»), например, эпотилонов, описанных в WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, патенте US 6043372, патенте US 5969145, WO 99/40047, WO 99/01124 и WO 99/43653.

Помимо эпотилона А и эпотилона В интересными свойствами обладают, прежде всего, эпотилоны D и Е, описанные в WO 97/19086 и WO 98/22461, и эпотилоны Е и F, описанные в WO 98/22461, а также эпотилоны, описанные в WO 99/02514.

В качестве примера терапевтического применения в международной заявке WO 99/43320 описаны многочисленные пути использования эпотилонов в качестве агентов против пролиферативных заболеваний, прежде всего, связанных с опухолью заболеваний, которые вследствие сходства их механизма действия с хорошо известным и поступающим в продажу противораковым агентом таксолом (Taxol^®), обладают сопоставимым действием. В WO 99/39694 описаны некоторые специфические композиции эпотилонов, прежде всего, А и В.

Лечение эпотилонами, прежде всего эпотилоном А и наиболее предпочтительно эпотилоном В, имеет ряд преимуществ по сравнению с принятыми системами лечения, прежде всего в тех случаях, когда опухоли становятся устойчивыми к таксолу. Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке методов синтеза больших количеств эпотилонов с целью удовлетворения потенциальных потребностей в этих агентах.

Наиболее эффективные методы получения включают по меньшей мере несколько стадий биосинтеза и выделения эпотилонов из культуральных сред или т.п.

Ранее описана экстракция природных субстанций с помощью миксобактерий, прежде всего экстракция эпотилонов из клеток штамма Sorangium cellulosum Soce90 (депонирован по номером 6773 в Немецкой коллекции микроорганизмов, см. WO 93/10121). Для получения достаточной концентрации природных субстанций, прежде всего эпотилонов, ранее всегда в культуральную среду добавляли в качестве адсорбирующего агента среды полистироловую смолу, например Amberlite XAD-1180 (фирма Rohm & Haas, Франкфурт, Германия).

Однако недостатком этого метода является то, что при его использовании для крупномасшабного производства возникает целый ряд проблем. Клапаны повреждаются глобулами смолы, трубы могут блокироваться и устройство может подвергать большему износу из-за механического трения. Глобулы смолы являются пористыми и поэтому имеют большую площадь внутренней поверхности (примерно 825 м²/г смолы). Возникают проблемы со стерилизацией, поскольку воздух, находящийся внутри смолы, не автоклавируется. Таким образом, метод, предусматривающий добавление смолы в процессе культивирования продуцирующих эпотилоны микроорганизмов, нельзя осуществлять на практике в крупных масштабах.

Был открыт и описан усовершенствованный метод получения эпотилонов, прежде всего эпотилонов А и В (WO 99/42602). Этот метод заключается в образовании включающих эпотилоны комплексов в культуральных средах продуцирующих эпотилоны микроорганизмов, где эти среды содержат циклодекстрины или другие комплексообразующие агенты, в смешении с целью абсорбции эпотилонов бесклеточной культуральной среды (например, фильтрата или центрифугата этой культуральной среды) с синтетической смолой, например со смолой, основой матрицы которой являются сополимеры стирола/дивинилбензола, такие как Amberlite XAD-16 (фирма Rohm & Haas Germany GmbH, Франкфурт, Германия) или Diaion HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Милан, Италия), и в десорбции, прежде всего спиртом, наиболее предпочтительно изопропанолом. После этого в спиртовую фазу добавляют воду, удаляют фазу растворителя (предпочтительно упариванием), разделяют фазы полученного остатка в присутствии сложного эфира, прежде всего этилацетата или изопропилацетата, как правило, осуществляют молекулярную фильтрацию (гель-хроматографию) высушенной сложноэфирной фазы, разделяют полученную смесь эпотилонов с помощью ЖХВР с обращенной фазой (предпочтительно, осуществляя элюирование смесью нитрил/вода, например, ацетонитрил/вода), и необязательно осуществляют дополнительную очистку путем разделения фаз в присутствии смеси вода/простой эфир, предпочтительно с последующей адсорбционной хроматографией на силикагеле для дополнительного удаления примесей и осуществляют кристаллизацию/перекристаллизацию.

Несмотря на его прогрессивность и пригодность для крупномасштабного промышленного производства, этот метод страдает некоторыми недостатками.

Например, для получения требуемой чистоты целесообразно применять либо стадию молекулярной фильтрации, либо стадию адсорбционной хроматографии на силикагеле, либо оба этих процесса. Большие трудности связаны с разделением фаз в присутствии сложного эфира, такого как этилацетат, что (особенно из-за длительного времени, необходимого для осуществления фазы разделения водно/сложноэфирной фазы при крупномасшабном производстве) требует больших временных затрат, а также с последующей фазой упаривания, осуществление которой также затрудненно из-за пенообразования и разбрызгивания.

Указанная задача решается с помощью настоящего изобретения, позволяющего избежать указанных недостатков и найти новые и наиболее целесообразные пути выделения эпотилонов, прежде всего эпотилонов А и В, после их адсорбции на смоле.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения совершенно неожиданно было установлено, что путем простой замены спиртов, применяемых в качестве растворителя для десорбции, определенными другими растворителями (которые обозначены как слабополярные или аполярные растворители, которые перечислены ниже), можно достигать реального прорыва в решении отмеченных выше проблем с получением дополнительных преимуществ, таких как повышенная десорбция и более высокий конечный выход продукта. Из дополнительных преимуществ следует отметить (I) более высокую избирательную десорбцию; (II) более высокое количество десорбированных эпотилонов, свидетельствующее о более полной десорбции; (III) отсутствие потребности в повторной экстракции сложным эфиром (например, этилацетатом), что сопряжено с большими проблемами, связанными с разделением водно/сложноэфирной фазы и не требует упаривания эфира; (IV) отсутствие стадии молекулярной фильтрации и, как правило, адсорбционной хроматографии; (V) значительное снижение временных затрат на десорбцию; (VI) снижение количества стадий процесса, (VII) снижение риска загрязнения (что важно для высокотоксичных эпотилонов) и/или (VIII) более простое и безопасное изготовление (в зависимости от растворителя, применяемого для десорбции = экстракции); и (IX) также в зависимости от растворителя неожиданно еще более низкие количества побочных продуктов или примесей, имеющих полярность, близкую к полярности эпотилонов, прежде всего эпотилона В, которые необходимо удалять после хроматографии с обращенной фазой. Эти и другие преимущества должны стать очевидны после ознакомления с приведенным ниже подробным описанием изобретения:

Подробное описание изобретения

Одним из объектов изобретения является способ десорбции эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или В, в частности эпотилона В, из смолы, прежде всего синтетической смолы, с помощью слабополярного или аполярного растворителя.

Следующим объектом изобретения является способ обработки (или очистки) эпотилонов, прежде всего после их получения в стандартной среде для химического синтеза или предпочтительно в культуральной среде, которая содержит микроорганизмы, прежде всего миксобактерии, в частности представителей рода Sorangium, которые можно применять для производства эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или В, и комплексообразующий компонент, причем указанный процесс предусматривает применение слабополярного или аполярного растворителя для десорбции эпотилонов из смолы.

Третьим объектом изобретения является применение слабополярного или аполярного растворителя для десорбции эпотилонов, прежде всего эпотилона А и/или В, прежде всего эпотилона В, из смолы, прежде всего из синтетичесокй смолы.

Применяемые в контексте настоящего описания общие понятия имеют следующие значения:

Понятие «эпотилоны» предпочтительно относится к любому эпотилону или производному эпотилона, упомянутым в заявках на патент WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, патент US 6043372, патент US 5969145, WO 99/40047, WO 99/01124 и/или WO 99/43653, более предпочтительно к эпотилону А и прежде всего эпотилону В, но в более широком объекте изобретения также к эпотилонам D и Е, описанным в WO 97/19086 и WO 98/22461, к эпотилонам Е и F, описанным в WO 98/22461, или к эпотилонам, описанным в WO 99/02514. Все эти документы, прежде всего, касающиеся производных эпотилонов и упомянутых выше предпочтительных производных эпотилонов, включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Слабополярный или аполярный растворитель предпочтительно имеет следующие характеристки:

Предпочтительным является растворитель, для которого элюотропный ряд, определяемый согласно Snyder и др., J. Chromatogr. Sci. 16, 223 (1978), обладает приведенными ниже характеристиками, где X_d обозначает параметр протонного акцептора (индикатор тенденции образовывать водородные связями в качестве акцептора водорода), Х_d обозначает параметр протонного донора (индикатор тенденции образовывать водородные связи в качестве донора водорода) и x_n обозначает параметр диполя (индикатор характеристики диполя), при условии, что x_е+x_d+x_n=1, или смесь таких растворителей:

x_е=0,20-0,40; x_d=0,15-0,36; и x_n=0,38-0,60; предпочтительно

x_е=0,22-0,32; x_d=0,17-0,34; и x_n=0,39-0,54.

Наиболее предпочтительными среди слабополярных или аполярных растворителей являются (низш.)алкил-(низш.)алкилкетоны или циклические кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, 2-пентанон, метилизобутилкетон или циклогексанон, более предпочтительно простые эфиры, прежде всего циклические просты эфиры, в частности тетрагидрофуран или диоксан; еще более предпочтительно алифатические галогенсодержащие соединения, прежде всего (низш.)алкилгалогениды, прежде всего метилендихлорид (= метиленхлорид) или этилендихлорид; или наиболее предпочтительно ароматические растворители, прежде всего нафталин или (предпочтительно) бензол или нафталин или (предпочтительно) бензол, замещенные одним или несколькими, предпочтительно 1-3 заместителями, выбранными из группы, включающей (низш.)алкил, прежде всего метил, этил или изопропил, (низш.)алкоксигруппу, прежде всего метокси- или этоксигруппу, галоген, прежде всего фтор, хлор, бром или йод, нитрогруппу и (низш.)алкокси-(низш.)алкил, прежде всего этоксиметил; прежде всего толуол, этилбензол, ксилол, прежде всего орто-, мета- или параксилол, мезитилен, псевдокумен, гемиллитен, кумен, изопропилтолуол, фенилгалогениды, прежде всего фторбензол, хлорбензол, бромбензол или йодбензол, (низш.)алкоксибензолы, прежде всего этоксибензол или метоксибензол, или (низш.)алкокси-(низш.)алкилбензолы, прежде всего этоксиметилбензол (простой бензиловый эфир); или любые смеси двух или большего количества, например, 2-4 этих растворителей; наиболее предпочтительными являются (низш.)алкилбензолы, прежде всего этилбензол, ксилол, прежде всего орто-, мета- или параксилол, мезитилен, псевдокумен, гемаллитен, кумен, изопропилтолуол и наиболее предпочтительно толуол.

Понятие «слабополярный или аполярный растворитель» включает также смеси двух или большего количества растворителей, описанных выше и ниже, например 2-4 таких растворителей.

Приставка «(низш.)» во всех случаях свидетельствует о том, что соответствующим образом обозначенный радикал предпочтительно содержит до 7 атомов углерода, в частности до 4 атомов углерода, и является разветвленным или неразветвленным. (Низш.)алкил может, например, быть неразветвленным или иметь одно или большее количество боковых цепей и обозначает, например, метил, этил, пропил, такой как изопропил или н-пропил, бутил, такой как изобутил, втор-бутил, трет-бутил или н-бутил, а также пентил, такой как амил или н-пентил.

Галоген предпочтительно обозначает йод, бром, хлор или фтор.

Углеводород предпочтительно представляет собой органическое соединение, состоящее из 4-32, более предпочтительно из 4-20, еще более предпочтительно из 6-16 атомов углерода, которое может представлять собой алифатический, например, линейный, разветвленный или циклический насыщенный алкан, например, циклогексан, линейное, разветвленное или циклическое (неароматическое) органическое соединение с одной или большим количеством двойных и/или тройных связей или ароматический углеводород, который может быть незамещенным или может быть замещен одним или несколькими, например, вплоть до 3 заместителей, выбранных из группы, включающей (низш.)алкил, прежде всего метил, этил или изопропил, (низш.)алкоксигруппу, прежде всего метокси- или этоксигруппу, галоген, прежде всего фтор, хлор, бром или йод, нитрогруппу и (низш.)алкокси-(низш.)алкил, прежде всего этоксиметил; предпочтительно 1-3 (низш.)алкильными группами.

Спирт предпочтительно представляет собой гидрокси(низш.)алкан, прежде всего метанол, этанол или н- или изопропанол.

Смола предпочтительно представляет собой синтетическую смолу, предпочтительно смолу, основой которой являются сополимеры стирола и дивинилбензола, более предпочтительно Amberlite XAD-4 или предпочтительно Amberlite XAD-16 [фирма Rohm & Haas Germany GmbH, Франкфурт] или Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Милан]. Следует отметить, что эпотилоны находятся в нековалентном контакте со смолой, из которой эпотилон или эпотилоны требуется десорбировать согласно изобретению, (например, обратимо связаны или абсорбированы на ней). Другими словами, когда используется понятие «смола», то следует понимать, что «смола содержит одни или несколько эпотилонов, которые находятся в контакте с ней, прежде всего обратимо связаны или адсорбированы на ней».

Предпочтительные варианты осуществления изобретения.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу, предусматривающему десорбцию из смолы с помощью слабополярного или аполярного растворителя, указанного выше или ниже, и любые дополнительные стадии очистки, желательные или необходимые для получения в чистой форме соответствующих эпотилонов, прежде всего эпотилона А и наиболее предпочтительно эпотилона В, предпочтительно описанных в настоящем изобретении в качестве предпочтительных.

Обработке эпотилонов предшествует реакция или процесс, приводящие к получению содержащего эпотилоны продукта реакции, которые необходимо обработать, их выделяют (I) либо из смесей химических реакций после растворения в соответствующей полярной водной среде, либо (II) более предпочтительно из супернатанта (например, из содержащего эпотилон циклодекстрина, согласно методу, описанному в WO 99/42602) культуральной среды, содержащей продуцирующие эпотилоны микроорганизмы, путем разделения культуры на жидкую фазу (например, центрифугат или фильтрат) и твердую фазу (клетки), прежде всего с помощью фильтрации или центрифугирования (трубчатая центрифуга или сепаратор).

После этой предварительной обработки предпочтительно осуществляют непосредственное смешение раствора ((I)) или жидкой фазы ((II)) со смолой, прежде всего синтетической смолой, прежде всего смолой, основой которой являются сополимеры стирола и дивинилбензола в качестве матрицы (далее обозначена как полистирол), такой как Amberlite XAD-16 или Diaion HP-20 (предпочтительно в объемном соотношении центрифугат: смола примерно от 10:1 до 100:1, предпочтительно примерно 50:1). После контакта продолжительностью предпочтительно 0,25-50 ч, предпочтительно 0,8-22 ч, смолу отделяют, например, фильтрацией, седиментацией или центрифугированием. При необходимости после адсорбции смолу промывают высокополярным растворителем, предпочтительно водой.

Затем начинают предпочтительный процесс обработки по настоящему изобретению. Десорбцию эпотилонов (согласно наиболее предпочтительному объекту изобретения) осуществляют слабополярным или аполярным растворителем, в частности (низш.)алкилгалогенидами, прежде всего метилендихлоридом или этилендихлоридом, или более предпочтительно ароматическими растворителями, прежде всего нафталином или (предпочтительно) бензолом, или нафталином или (предпочтительно) бензолом, замещенным одним или несколькими, предпочтительно 1-3 радикалами, выбранными из группы, включающей (низш.)алкил, прежде всего метил, этил или изопропил, (низш.)алкоксигруппу, прежде всего метокси- или этоксигруппу, галоген, прежде всего фтор, хлор, бром или йод, нитрогруппу и (низш.)алкокси-(низш.)алкил, прежде всего этоксиметил; наиболее предпочтительно толуолом. Стадию экстракции можно повторять один или несколько раз, предпочтительно 0-3 раза, прежде всего 1 раз, для того, чтобы достичь более полной десорбции если это необходимо или желательно.

После обработки полученных таким образом растворов десорбированных эпотилонов (которые объединяют в случае повторной экстракции) предпочтительно осуществляют удаление применяемого для десорбции растворителя из образовавшихся растворов путем упаривания (дистилляция), предпочтительно с помощью концентрирования в реакторе и затем с использованием роторного испарителя под вакуумом.

Затем осуществляют дополнительную обработку с помощью перечисленных ниже стадий, причем стадия очистки с помощью хроматографии с обращенной фазой с элюированием нитрилом является обязательной, а другие стадии не являются обязательными:

- кристаллизация эпотилона(ов) после десорбции; прежде всего для кристаллизация эпотилона В, добавляют смесь спирта и углеводорода, прежде всего (низш.)алканола и циклического алифатического углеводорода с 3-10 кольцевыми атомами, наиболее предпочтительно метанола и циклогексана (предпочтительно в соотношении (об./об.) от 1:10 до 10:1, прежде всего от 1:3 до 3:1. Добавление воды приводит к быстрому разделению фаз и спиртовую фазу упаривают досуха, например, с помощью роторного испарителя под вакуумом. Образовавшийся экстракт, который содержит эпотилон В, затем кристаллизуют из соответствующей смеси растворителей, прежде из смеси спирта/циклического алифатического углеводорода, наиболее предпочтительно из смеси изопропанола/циклогексана, предпочтительно в соотношении (об./об.) от 1:10 до 10:1, более предпочтительно от 1:6 до 6:1, наиболее предпочтительно от 1:6 до 1:4;

- (обязательная стадия) отделение эпотилонов с помощью хроматографии с обращенной фазой с последующем растворением в пригодном растворителе, прежде всего в смеси нитрила и воды, предпочтительно ацетонитрила/воды, в предпочтительном соотношении (об./об.) от 1:10 до 10:1, прежде всего от 1:3 до 1:1, и элюированием смесью нитрила и воды, предпочтительно эта стадия отличается тем, что хроматографию осуществляют на колонке из материала с обращенной фазой, который загружен углеводородами, например углеводородами, содержащими 18 атомов углерода, прежде всего материалом RP-18, и используют элюент, содержащий нитрил, прежде всего (низш.)алкилнитрил, в частности ацетонитрил, в частности используют смесь нитрила/воды, прежде всего смесь ацетонитрила/воды, предпочтительно в соотношении нитрила и воды примерно от 1:99 до 99:1, прежде всего от 1:9 до 9:1, например, от 2:8 до 7:3, например, 3:7 или 4:6; и удаляют нитрил из собранных содержащих эпотилон (прежде всего эпотилон А или наиболее предпочтительно эпотилон В) фракций упариванием (дистилляцией; при необходимости оставшуюся с эпотилоном воду затем экстрагируют сложным эфиром, прежде всего (низш.)алкил-(низш.)алканоатом, предпочтительно изопропилацетатом, с последующим упариванием досуха (предпочтительно сначала в реакторе, затем в роторном испарителе под вакуумом) содержащей эпотилон сложноэфирной фазы; (при необходимости исходных раствор эпотилона можно разделять на части и для отделения использовать более одного погона на обращенной фазе);

- только при необходимости (например, в качестве альтернативы кристаллизации после десорбции) адсорбционная хроматография, в частности, с использованием колонки из силикагеля и элюирования соответствующим растворителем или смесью растворителей, прежде всего смесью сложного эфира /углеводорода, например, (низш.)алкилалканоата /С₄-С₁₀алкана, прежде всего этил- или изопропилацетата/ н-гексана, причем, соотношение сложного эфира и углеводорода предпочтительно составляет от 99:1 до 1:99, предпочтительно от 10:1 до 1:10, например 4:1;

- и конечная перекристаллизация, например, из соответствующих растворителей или смесей растворителей, например сложных эфиров, смесей сложных эфиров/углеводородов или спиртов, прежде всего этил- или изопропилацетата: толуола в соотношении от 1:10 до 10:1, предпочтительно 2:3 (эпотилон А) или метанола или этилацетата (эпотилон В);

в этом процессе, при необходимости и/или при желании, между каждой применяемой стадий образовавшиеся растворы или суспензии концентрируют и/или жидкие или твердые компоненты отделяют друг от друга, в частности, седиментацией, фильтрацией или центрифугированием растворов/суспензий. Более точные рекомендации, указанные выше и ниже, можно предпочтительно использовать при осуществлении вышеперечисленных индивидуальных стадий.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ выделения эпотилонов, адсорбированных на синтетической смоле, прежде всего эпотилона А или наиболее предпочтительно эпотилона В, который предусматривает

(I) десорбцию эпотилонов из синтетической смолы слабополярным или аполярным растворителем, в частности (низш.)алкилгалогенидами, прежде всего метилендихлоридом или этилендихлоридом, или более предпочтительно ароматическими растворителями, прежде всего нафталином или (предпочтительно) бензолом, или нафталином или (предпочтительно) бензолом, замещенным одним или несколькими, предпочтительно 1-3 радикалами, выбранными из группы, включающей (низш.)алкил, прежде всего метил, этил или изопропил, (низш.)алкоксигруппу, прежде всего метокси- или этоксигруппу, галогеном, прежде всего фтором, хлором, бромом или йодом, нитрогруппой и (низш.)алкокси-(низш.)алкилом, прежде всего этоксиметилом; наиболее предпочтительно толуолом; или в более широком объекте изобретения смесью двух или большего количества таких растворителей; и

(II) отделение эпотилонов с помощью хроматографии с обращенной фазой с последующем растворением в приемлемом растворителе, прежде всего в смеси нитрила и воды, предпочтительно ацетонитрила/воды, в предпочтительном соотношении (об./об.) от 1:10 до 10:1, прежде всего от 1:3 до 1:1, и элюирование смесью нитрила и воды, предпочтительно эта стадия отличается тем, что хроматографию осуществляют на колонке из материала с обращенной фазой, прежде всего материала RP-18, который загружен углеводородами, например, углеводородами, содержащими 18 атомов углерода, и используют элюент, содержащий нитрил, прежде всего (низш.)алкилнитрил, в частности ацетонитрил, в частности используют смесь нитрила/воды, прежде всего смесь ацетонитрила/воды, предпочтительно в соотношении нитрила и воды примерно от 1:99 до 99:1, прежде всего от 1:9 до 9:1, например, от 2:8 до 7:3, например, 3:7 или 4:6.

Следующим предпочтительным объектом изобретения является способ, описанный в предыдущем параграфе, который начинается со стадии (I) и содержит стадию (II), и который дополнительно включает любые дополнительные стадии очистки, желательные или необходимые для получения в чистой форме соответствующих эпотилонов, прежде всего эпотилона А и наиболее предпочтительно эпотилона В, предпочтительно описанных в качестве предпочтительных согласно настоящему изобретению.

Подготовку к обработке предпочтительно осуществляют следующим образом: адсорбцию эпотилонов, прежде всего из химических реакционных смесей или более предпочтительно из супернатантов культур микроорганизмов, можно осуществлять согласно методу, описанному в WO 99/4260, или аналогичным методом; в целом метод состоит в следующем: содержащий эпотилоны центрифугат непосредственно смешивают с синтетической смолой, прежде всего сополимером стирола/дивинилбензола, таким как Amberlite XAD-16 или Diaion HP-20 (предпочтительно в объемном соотношении центрифугата:смолы примерно от 10:1 до 100:1, предпочтительно примерно 50:1) и перемешивают в смесителе. На этой стадии эпотилоны переносят в смолу. После периода времени, достаточного для адсорбции, например после периода контакта примерно 0,2-10 ч, смолу отделяют центрифугированием или фильтрацией. Адсорбцию эпотилонов смолой можно осуществлять также на хроматографической колонке, внося смолу в колонку и разгоняя центрифугат на смоле. После адсорбции смолу промывают водой.

Затем начинают осуществление предпочтительного процесса по изобретению, который проводят следующим образом: десорбцию эпотилонов из смолы предпочтительно осуществляют с помощью слабополярного или аполярного растворителя по изобретению, прежде всего растворителя, указанного выше или ниже в качестве предпочтительного, предпочтительно метиленхлорида или наиболее предпочтительно толуола. Растворитель затем удаляют до требуемой степени, предпочтительно до получения сухого остатка. При необходимости остаток растворяют в относительно небольшом объеме в смеси спирт/углеводород, прежде всего в метаноле/циклогексане, предпочтительно взятых в описанных выше соотношения. Спиртовую фазу упаривают, предпочтительно досуха, и спиртовый экстракт затем кристаллизуют из смеси спирта, прежде всего изопропанола, и углеводорода, прежде всего циклогексана, предпочтительно взятых в описанных выше соотношениях. Образовавшийся твердый кристаллизованный продукт затем растворяют в смеси нитрил/вода, предпочтительно как описано выше, прежде всего в смеси 2:3 (об./об.) ацетонитрил/вода, и образовавшийся исходный раствор вносят, при необходимости после разделения на несколько погонов, в колонку для препаративной хроматографии с обращенной фазой. После этого осуществляют элюирование нитрилом/водой, прежде всего согласно описанному выше методу. (Ацето)нитрил полученных фракций, содержащих эпотилон, прежде всего эпотилон А и наиболее предпочтительно эпотилон В, удаляют выпариванием (дистилляция), и образовавшуюся водную фазу экстрагируют сложным эфиром, прежде всего изопропилацетатом. Затем сложноэфирный экстракт упаривают, предпочтительно досуха, и затем образовавшийся продукт подвергают перекристаллизации, например, фракцию эпотилона А кристаллизуют непосредственно из смеси сложный эфир/углеводород, например, этилацетат:толуол = 2:3, а фракцию эпотилона В кристаллизуют из сложного эфира, прежде всего этилацетата, или предпочтительно из спирта, прежде всего метанола.

Был открыт элюент с высоким избирательным действием (десорбант), прежде всего толуол, применение которого позволяет достигать примерно 100%-ного выхода за половину промежутка времени, необходимого для осуществления десорбции при использовании изопропанола, который был применен в WO 99/42602. При создании изобретения неожиданно было установлено, что количество десорбированных эпотилонов увеличивается, например, до 130%, после десорбции с помощью толуола по сравнению с десорбцией с помощью изопропанола. (Хотя на первый взгляд это представляется невозможным с теоретической точки зрения, именно этот факт наиболее полно иллюстрирует основное преимущество настоящего изобретение: результат связан с анализом загруженной смолы. Поскольку этот результат получен при использовании изопропанола для десорбции, за основу был взят неполный процесс десорбции, что исходно привело к заниженным результатам анализа, которые после создания настоящего изобретения должны рассматриваться как ложные). Смесь эпотилонов можно (без предварительной кристаллизации или с предварительной кристаллизацией) вносить непосредственно в колонку с обращенной фазой. Этот процесс в значительной степени становится не зависимым от количества растворителя, скорости перемешивания и температур. При использовании спиртов (например, этанол или изопропанол) при перемешивании может наблюдаться двухфазная десорбция, когда в первый период времени происходит десорбция первого количества (первой порции) содержащего эпотилон продукта (что можно объяснить распределением размера пор в полистироле XAD-16, который характеризуется двумя максимумами распределения), и после дополнительного промежутка времени происходит десорбция второй порции продукта, это нежелательное поведение не наблюдается при использовании толуола или также дихлорметана, когда десорбция всего продукта происходит уже в первый период времени. При сопоставимых условиях образовавшийся после упаривания остаток эпотилонов А и В, полученных из супернатантов содержащих циклодекстрины культур, описанных в WO 99/42602, при использовании изопропанола, составляет, согласно одному из примеров, 40 г, при использовании метиленхлорида - 3,3 г, а в случае толуола только 0,9 г, по сравнению, например, с тем, что остаток эпотилона В составляет 17-18 г - % после десорбции из смол на основе сополимера стирола/дивинилбензола, эти результаты свидетельствуют о более высокой чистоте продукта. Несмотря на то, что толуол обладает наиболее выраженными преимуществами, преимуществом дихлорметана является простота его удаления вследствие низкой температуры кипения.

Разделение эпотилонов А и В можно осуществлять также с помощью хроматографии, приведенной в настоящем описании, используя подход моделирования движущегося слоя (SMB). SMB-хроматографию широко используют для разделения бинарных смесей, например, разделения рацематов на хиральных стационарных фазах, например, в SORBEX-процессах в нефтехимическом производстве, типа Parex или Molex, или в SAREX-процессе при производстве сахара. По сравнению с хроматографией периодического действия преимуществом SMB-хроматографии является непрерывный процесс противотока, что приводит к повышенной производительности и снижению поглощения подвижной фазы. Некоторые систематические процедуры для осуществления метода SMB-хроматографии известны специалистам в данной области. Такие процедуры описаны, например, у R.-M.Nicoud, M.Bailly, J.Kinkel, R.M.Devant, T.R.E.Hampe и Е.Küsters в: Proceedings of the 1^st European Meeting on Simulated Moving Bed Chromatography, (1993), ISBN 2-905-267-21-6, cc.65-88; E.Küsters, G.Gerber и F.D.Antia, Chromatographia, 40 (1995) 387; Т.Pröll и Е.Küsters, J.Chromatogr. A, 800 (1998) 135; или С.Heuer, E.Кüsters, T.Plattner и A.Seidel-Morgenstern, J.Chromatogr. A, 827 (1998) 175. Основные параметры, необходимые для разделения эпотилона А и В с помощью SMB-хроматографии, можно получить непосредственно из общепринятого разделения с использованием ЖХ. Предпочтительно, силикагель с обращенной фазой (RP 18) используют в качестве стационарной фазы и смеси вода/ацетонитрил в качестве подвижных фаз. Конечный диапазон скоростей потока (для индивидуальных зон SMB и времени включения соответственно) можно выбирать либо, исходя из простой схемы потока, предложенной Е.Кüsters, и др. в: Chromatographia, 40 (1995) 387, либо после тщательного определения изотерм адсорбции согласно методике, описанной в J.Chromatogr. А, 800 (1998) 135 и J.Chromatogr. A, 827 (1998) 175. Обработку экстракта и очищенных потоков можно осуществлять также согласно методу, применяемому для обычного разделения с использованием стандартной ЖХ.

Изобретение наиболее предпочтительно относится к процессам и способам, которые описаны ниже в примерах.

Примеры.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем.

Меры предосторожности: При работе с эпотилонами следует при необходимости применять соответствующие средства защиты в связи с их высокой токсичностью.

Пример 1. Процесс обработки эпотилона В

Десорбцию 591,7 кг загруженной смолы (смола, представляющая собой сополимер стирола/дивинилбензола XAD-16, несущая эпотилоны А и В из культуральной среды) осуществляют путем перемешивания смолы с двумя порциями толуола по 720 л каждая в течение примерно 8 ч. Отделение толуольной фазы от смолы осуществляют с помощью вакуум-фильтра. Объединенные толуольные фазы промывают двумя порциями воды по 250 л каждая. После разделения фаз толуольный экстракт концентрируют в 1000-литровом реакторе до объема примерно 20-40 л и затем концентрируют досуха с помощью роторного испарителя под вакуумом. В результате получают толуольный экстракт массой 4,095 кг, содержащий 209 г эпотилона В. Толуольный экстракт растворяют в 16,5 л метанола и 24,5 л циклогексана. После добавления 0,8 л воды немедленно происходит разделение фаз. Метанольную фракцию упаривают досуха с помощью роторного испарителя под вакуумом, получая 1,025 кг упаренной смолы, содержащей 194 г эпотилона В. Метанольный экстракт затем кристаллизуют в смеси растворителей, содержащей 2,05 л изопропанола и 10,25 л циклогексана, получая 0,4 кг кристаллизованного продукта, который содержит 184 г эпотилона В. Кристаллы растворяют в 3,2 л смеси ацетонитрил/вода = 2/3 (об./об.) и образовавшийся исходный раствор разделяют с использованием 3 различных погонов на колонке для препаративной хроматографии с обращенной фазой (25 кг сферического силикагеля RP-18, YMC-Gel ODS-A 120; 5-15 мкм; Waters Corp., Милфорд, штат Массачусетс, США.) Элюирование осуществляют с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил/вода = 2/3 (об./об.) со скоростью потока 2,3 л/мин;

время удерживания эпотилона А составляет 77-96 мин, время удерживания эпотилона В - 96-119 мин. Мониторинг фракционирования осуществляют с помощью УФ-детектора при длине волны 250 нм. Ацетонитрил вместе с фракциями, содержащими эпотилон В (по трем погонам), отгоняют и оставшуюся водную фазу экстрагируют с помощью 504 л изопропилацетата. Изопропилацетатный экстракт концентрируют в 630-литровом реакторе до объема примерно 20-40 л и затем концентрируют досуха с помощью роторного испарителя под вакуумом. Масса упаренного остатка фракций эпотилона В составляет 170 г, что соответствует содержанию 98,4% по данным ЖХВР (с внешним стандартом). Образовавшийся продукт окончательно кристаллизуют в 2,89 л метанола при 0-5°С, получая 150 г чистого кристаллизата эпотилона В. Температура плавления: 124-125°С;

¹Н-ЯМР данные для эпотилона В (500 МГц-ЯМР, растворитель: ДМСО-d6. Химический сдвиг 6 в част./млн относительно ТМС (тетраметилсилан). S = синглет, d = дублет, m = мультиплет):

δ (Мультиплетность)	Интеграл (количество Н)
7,34 (s)	1
6,50 (s)	1
5,28 (d)	1
5,08 (d)	1
4,46 (d)	1
4,08 (m)	1
3,47 (m)	1
3,11 (m)	1
2,83 (dd)	1
2,64 (s)	3
2,36 (m)	2
2,09 (s)	3
2,04 (m)	1
1,83 (m)	1
1,61 (m)	1
1,47-1.24 (m)	4
1,18 (s)	6
1,13 (m)	2
1,06 (d)	3
0,89 (d+s, перекрытие)	6
	∑=41

Пример 2. Сравнение различных процессов десорбции для препаратов эпотилона В

По 360 мл каждой водной суспензии смолы, представляющей собой сополимер стирола/дивинилбензола типа XAD-16, загруженной эпотилоном А и В из культур миксобактерий, с помощью метода, описанного в WO 99/42602 (что соответствует 194 г массы во влажном состоянии смолы Amberlite® XAD-16), экстрагируют растворителями и в условиях, указанных ниже в таблице, перемешивают (обычная лабораторная якорная мешалка) в стеклянном реакторе с фриттой из нержавеющей ткани на дне (изготовленный вручную твердофазный реактор периодического действия, 10 см (внутренний диаметр) ×20 см (длина), (далее обозначен как «мешалка /фритта»).

Из этих экспериментов и других данных можно сделать вывод о том, что по сравнению с изопропанолом экстракция метиленхлоридом обладает большей селективностью, укорачивает продолжительность экстракции (примерно в 2 раза), ускоряет дистилляцию растворителя (температура кипения метиленхлорида примерно 40°С, а изопропанола 81-83°С), в этом случае не требуется осуществления продолжительной и сопряженной с многими проблемами фазы отделения этилацетата/воды, больше не требуется проводить вторую дистилляцию растворителя, в результате меньшего количества стадий процесса снижается риск загрязнения, улучшается и становится более безопасной обработка; появляется возможность осуществления процесса в половине объема (например, в 1000-литровом вместо 2000-литрового реактора); продукт эпотилон В имеет улучшенный профиль чистоты (меньшее количество побочных продуктов, имеющих полярность, близкую к полярности эпотилона В), и остаток после упаривания не разбрызгивается и не образует пену, как в случае экстракции этилацетатом. При десорбции толуолом получают более высокий выход по сравнению с экстракцией изопропанолом (примерно 100 вместо 80%), при этом можно достигать улучшенной селективности (при использовании изопропанола примерно 10-кратное количество побочных продуктов подвергается десорбции), продолжительность экстракция значительно укорачивается (примерно в 3 раза), упрощается сложный процесс фильтрации после десорбции изопропанолом (экстракция изопропанолом затруднена при крупномасшабном производстве), больше не требуется вторая дистилляция растворителя, обработку можно производить в реакторах меньшего размера (и в этом случае, например, можно использовать 1000-литровый реактор вместо 2000-литрового), можно отказаться от хроматографии на силикагеле (упаренный остаток после десорбции уже содержит примерно 40% смеси эпотилонов А/В), и упаренный остаток после десорбции не обладает способностью к пенообразованию и разбрызгиванию, что происходит в случае остатка после экстракции этилацетатом.

1. Способ десорбции эпотилонов А, В, D и/или Е из смолы, основанный на применении слабополярного или аполярного растворителя, выбранного из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители или смесь двух или большего количества таких растворителей, где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода.

2. Способ по п.1, где эпотилоны, которые требуется десорбировать, представляют собой эпотилон А или эпотилон В.

3. Способ по любому из п.1 или 2, где смола представляет собой синтетическую смолу.

4. Способ по п.3, где смола представляет собой синтетическую смолу, основой которой являются сополимеры стирола/дивинилбензола.

5. Способ по любому из пп.1-4, где применяют ароматический растворитель, выбранный из группы, включающей нафталин, бензол или нафталин и бензол, замещенные одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, включающей (низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, галоген, нитрогруппу и (низш.)алкокси-(низш.)алкил, где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода.

6. Способ выделения эпотилонов А, В, D и/или Е, адсорбированных на синтетической смоле, предусматривающий (III) десорбцию эпотилонов из синтетической смолы с помощью слабополярного или аполярного растворителя, выбранного из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители или смесь двух или большего количества таких растворителей, где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода, и (IV) разделение эпотилонов с помощью хроматографии с обращенной фазой после их растворения в приемлемом растворителе и элюирования смесью нитрила и воды.

7. Способ получения эпотилонов А, В, D и/или Е из реакционной смеси, предусматривающий десорбцию эпотилонов слабополярным или аполярным растворителем, выбранным из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители или смесь двух или большего количества таких растворителей, причем стадию десорбции можно повторять для достижения более полной десорбции; удаление применяемого для десорбции растворителя из образовавшихся растворов путем упаривания; необязательно кристаллизация эпотилона(ов) после десорбции; прежде всего для кристаллизации эпотилона В путем добавления смеси спирта и углеводорода, и упаривание спиртовой фазы досуха и кристаллизацию эпотилона В из соответствующей смеси растворителей; (обязательная стадия) отделение эпотилонов с помощью хроматографии с обращенной фазой с последующим растворением остатка, полученного на предыдущей стадии, в пригодном растворителе, и элюирования смесью нитрила и воды, и удаление нитрила из собранных содержащих эпотилон фракций упариванием; при необходимости оставшуюся с эпотилоном воду затем экстрагируют сложным эфиром с последующим упариванием досуха содержащей эпотилон сложноэфирной фазы; необязательно очистку адсорбционной хроматографией; и конечную перекристаллизацию очищенного эпотилона из соответствующих растворителей или смесей растворителей; в этом процессе при необходимости и/или при желании, между каждой применяемой стадией образовавшиеся растворы или суспензии концентрируют и/или жидкие или твердые компоненты отделяют друг от друга; причем приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода.

8. Способ по п.7, где десорбцию эпотилонов из смолы осуществляют слабополярным или аполярным растворителем, выбранным из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители или смесь двух или большего количества таких растворителей, затем растворитель удаляют до необходимого уровня, предпочтительно до получения сухого остатка, при необходимости остаток растворяют в смеси спирт/углеводород в соответствующем объемном соотношении; спиртовую фазу упаривают предпочтительно досуха и затем спиртовой экстракт кристаллизуют из смеси спирта и углеводорода, затем образовавшийся твердый кристаллизованный продукт растворяют в смеси нитрил/вода по п.7, прежде всего в смеси ацетонитрил/вода в соотношении 2:3 (об./об.), и образовавшийся исходный раствор вносят, при необходимости после разделения на несколько погонов, на колонку для препаративной хроматографии с обращенной фазой; затем осуществляют элюирование нитрилом/водой; после этого удаляют нитрил из полученных фракций, содержащих эпотилон, и образовавшуюся водную фазу экстрагируют сложным эфиром; затем сложноэфирный экстракт упаривают и после этого образовавшийся продукт подвергают перекристаллизации; где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода.

9. Способ по любому из пп.6, 7 или 8, где разделение эпотилов А и В осуществляют с помощью хроматографии на основе моделирования движущегося слоя (SMB).

10. Способ по любому из пп.1, 6, 7 или 8, где слабополярный или аполярный растворитель, выбранный из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители, где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода, или смесь двух или большего количества таких растворителей, или смесь таких растворителей обладает характеристиками элюотропного ряда, определяемыми согласно Snyder и др.:

x_е-0,22-0,32; x_d=0,17-0,34; x_n=0,39-0,54,

где x_е обозначает параметр протонного акцептора, x_d обозначает параметр протонного донора и x_n обозначает параметр диполя, при условии, что x_e+x_d+x_n=1.

11. Применение слабополярного или аполярного растворителя для десорбции А, В, D и/или Е эпотилонов из смолы, который выбирают из группы, включающей (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители или смесь двух или большего количества таких растворителей, где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода.

12. Применение по п.11, где слабополярный или аполярный растворитель, который выбирают из ряда, включающего (низш.)алкилгалогениды и ароматические растворители, прежде всего нафталин, бензол или нафталин или бензол, замещенные одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, включающей (низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, галоген, нитрогруппу и (низш.)алкокси-(низш.)алкил; или смесей двух или большего количества таких растворителей; и смола представляет собой синтетическую смолу, где приставка «(низш.)» обозначает, что радикал содержит до 7 атомов углерода.