Метод стабилизации индивидуального субстрата для спектрального определения злокачественности

Изобретение относится к области биохимии. Сущность состоит в методе стабилизации индивидуального субстрата для спектрального определения злокачественности, с исходными компонентами 93,8-98,5 мас.% экссудата из плевральных выпотов или перикардаильных выпотов или асцита, 1,5-6,2 мас.% стабилизатора для разделения мутного и прозрачного центрифугатов, 10,0-26,8 мас.% прозрачного растворителя, такого как этанол, диоксан или тетрагидрофуран, спектральной чистоты, новизной является то, что из организма человека обычным образом в стерильных условиях берут 93,8-98,5 мас.% экссудата, состоящего из плевральных выпотов или перикардиальных выпотов или асцита, к которому в качестве стабилизатора прибавляют 1,5-6,2 мас.% 10% водного раствора сульфата гуанидиния, сульфата цезия, первичного кислого фосфата калия или сульфата аммония, и полученную смесь центрифугируют в течение 800-1050 сек со скоростью вращения от 22,8-26,6 об/сек, причем из всего объема полученного прозрачного образца берут аликвотную часть 73,5-90,0 мас.%, а к этому добавляют от 10,0-26,8 мас.% прозрачного растворителя и полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 248-257 К до использования или немедленно используют для спектрального определения злокачественности. Технический результат - повышение точности диагностики злокачественности исследуемых субстратов. 1 табл., 3 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новому методу стабилизации индивидуального субстрата для спектрального определения злокачественности в медицине.

Техническая проблема

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является обеспечение осуществления нового метода стабилизации индивидуального субстрата для спектрального определения злокачественности в медицине. Это позволяет использовать известные UV-VIS диагностические методы спектрального скрининга следующим образом: метод осуществляют in vitro (после экстракции жидкости организма) и независимо от места экстракции в любое время и в любом месте, где это возможно осуществить.

Предшествующий уровень техники

Поставить диагноз является обычной клинической и технической проблемой. Любая дополнительная информация в диагностике, в смысле дополнительных диагностических методов, является очень важной, потому что дополняет картину патологического процесса в организме и таким способом облегчает постановку правильного окончательного диагноза.

Основной проблемой каждого метода диагностики (классического и дополнительного), является то, что он должен быть наиболее возможно менее инвазивным или неинвазивным, быстрым и надежным. Пример трудности такой задачи - диагноз гипертензии, т.е. самое точное измерение кровяного давления осуществляется инвазивным методом при помощи внутриартериального катетера. Из-за инвазивности, технических ограничений и по финансовым причинам такой метод не пригоден для ежедневного применения и скрининга (Momčilo Babic, Skrining u medicini, Markom-publik, Beograd, 2001).

К сожалению, точность диагностического метода часто пропорциональна его инвазивности, и поэтому его используют как последний диагностический метод. Поэтому проводят работы по развитию и открытию дополнительных диагностических методов, которые менее инвазивны, но обычно менее точны.

Учитывая то, что все методы имеют свои преимущества и недостатки и что ни один из них не является 100% надежным или одназначным, окончательный диагноз всегда устанавливается при использовании нескольких различных диагностических методов. Решение проблемы правильной диагностики достигается развитием новых дополнительных, быстрых, скрининг диагностических методов, облегчающих и ускоряющих обычную стандартную клиническую процедуру.

Известны многочисленные диагностические методы в онкологии и пульмологии, например рентгеновский анализ, ультразвук, ядерно-магнитный резонанс, СТ scan MRI (срез КТ ЯМР) плевроцентез, биопсия больной ткани, анализы крови и т.п. (Ruckdeschel JC. Malignant Pleural Effusions, Recent Advances in Diagnosis and Management, Princeton, J. Jersey, Bristol Myers Squibb Company, 1992, 8-11). Количество и наличие злокачественных клеток, например, в плевральном выпоте невозможно определить цитологическим анализом только в одном испытании. Несколько последовательных испытаний дают более надежный результат, но не всегда. В случае биопсии ткани ткань представляет собой субстрат для дальнейшего диагностического метода. Анализируемая ткань должна быть репрезентативной, т.е. должна удовлетворять определенным условиям, а именно образец должен содержать ткань тестируемой опухоли, а также и часть ткани, граничащей с нормальной тканью. Также важно, чтобы в опухолевой ткани не было вторичных изменений (некроз, кровотечение и пр.). Самое большое количество ложноположительных и ложноотрицательных диагнозов установлено именно на образцах тканей, которые были сдавленными, коагулированными, набухшими от крови, некротическими, фиксированными несоответствующим образом или из-за недостаточности материала.

В настоящее время в диагностике рака используются следующие диагностические методы:

1. Биопсия ex tempore (одновременная) (Frozen Section, FS).

2. Аспирационная биопсия с цитологическим мазком (Fine needle Aspiration, FNA).

Также используются:

3. Гистохимия.

4. Иммуногистохимия.

5. Электронная микроскопия.

6. Культура тканей (гибридизация in situ, рецепторная ауторадиография и другие новые методы, недоступные нам по финансовым причинам).

Ex tempore биопсия должна быть точной, надежной и быстрой, а чтобы это осуществить, должны существовать и соответствующие предусловия для работы:

1. Хорошее знание патологии (солидный опыт).

2. Репрезентативный материал (хорошо приготовленный субстрат).

3. Соответствующие технические условия.

При выполнении вышеуказанных условий опытный патолог может поставить точный диагноз в 90-96% случаев, учитывая и продолжительные ответы (на длительных препаратах), что является существенным, так как точный диагноз дает возможность хирургу сразу применить очень длительное хирургическое вмешательство.

Репрезентативный материал подразумевает, что патолог получит достаточно тканей и что образец содержит именно патологическое изменение с частью ткани, окружающей его. При выполнении биопсии ex tempore в случаях, в которых подозревается злокачественность, существуют три возможных ответа:

(a) положительно на злокачественность,

(b) отрицательно на злокачественность,

(c) диагноз отсрочен.

(Beahrs O.H.: Staging of cancer of the breast as a guide to therapy. Cancer 53, 592, 1984; Bugis S.P., Yuoung J.E.M. et al.: Diagnosis accuracy of fine needle aspiration biopsy versus frozen section in solitary thyroid nodules. Amer J Surg 152, 411, 1986; Carter D.: Interpretation of Breast Biopsies. New York, Raven Press, 1988.)

Цитологические мазки (Папаниколау) обеспечивают еще один метод диагностики рака. Данный метод имеет широкое применение в определении рака шейки матки, часто в преинвазивной стадии, но также используется для утверждения случаев потенциальной злокачественности, какими являются рак эндометрия, бронхогенный рак, рак мочевого пузыря и предстательной железы, рак желудка. Данный метод также используют для идентификации клеток опухоли в абдоминальной, плевральной, синовиальной и цереброспинальной жидкостях.

Как известно, клетки рака теряют свойство сцепления, шелушатся и отваливаются, и показывают весь спектр морфологических изменений, охваченных термином анаплазия. Поэтому следует тестировать чешуйчатые клетки на признаки анаплазии, указывающие на их происхождение. В отличие от гистологического анализа сделанные выводы опираются исключительно на нарушение цитологии индивидуальной клетки или иногда небольшой группы клеток, без наличия знаков нарушения архитектуры, потери ориентации или доказательства инвазии. Данный метод позволяет дифференцировать нормальные, дисплазивные и клетки рака, а иногда обеспечивает выявление клеточных изменений, характерных для карциномы in situ.

Мазки остальных типов опухоли - легких, желудка, простаты - намного труднее оценить. Следует подчеркнуть, что все положительные результаты нужно подтвердить применением биопсии и гистологическим испытанием, до применения любой терапии. Также следует указать на то, что отрицательный цитологический результат не исключает злокачественную опухоль.

Хотя гистология и эксфолиативная цитология остаются методами, чаще всего применяемыми в диагностике рака, постоянно появляются новые методы, способствующие более быстрой и точной диагностике. (Cancer statistics, 1989, Cancer 39, 13, 1989; Robbins L.S., Cotran R.S., Kumar V.: Pathologic Basis of Disease, 4th ed. WB Saunders Co. Philadelphis 1989.)

В случае злокачественного процесса в легких самым надежным методом является плевроскопия, но как и при диагнозе гипертензии внутриартериальным катетером, он представляет собой самый агрессивный и инвазивный метод для человека. При лапароскопии используется так называемая лапароскопия media stinuma и плевральной полости, известная как инвазивная техника. При изучении литературы можно найти данные о развитии новых, дополнительных диагностических методов, которые или менее инвазивны, чем вышеупомянутые, или более надежны, чем цитологический анализ в смысле установления качественного окончательного диагноза.

При детальном рассмотрении доступной научной и специальной литературы обнаружено, что существует очень небольшое количество ссылок, относящихся к данной проблеме, и одновременно старающихся преодолеть недостатки известных инвазивных диагностических методов. Так, например, "Biomax Technologies Inc." в своей патентной заявке от 24 июня 1999 г. (WO 9966830, СА 9900586) описывает устройство и методы, которые дают возможность прямого осмотра ткани, индуцированной флюоресценцией при помощи эндоскопа, без использования больших и дорогих вспомогательных аппаратов. С другой стороны, Board of Regents, The University of Texas System, в своей заявке от 24.12.1997 (WO 97/48329, PCT/US 97/10204) описывает NIR Raman спектроскопию для in vitro и in vivo определения предраковых поражений шейки матки. Ни одна из указанных патентных заявок в своих работах не описывает такой простой метод ранней диагностики, как это предоставляет наш метод при помощи относительно простой UV-VIS спектроскопии, указывающей на наличие злокачественной опухоли в стабилизированном субстрате in vitro.

Сущность изобретения

Метод стабилизации индивидуального субстрата in vitro для спектрального определения злокачественности включает в соответствии с настоящим изобретением добавление 10 мас.% водных растворов стабилизаторов к жидкости организма человека, взятой in vivo (плевральный пунктат, асцит, перикардиальный выпот). Полученную смесь цетрифугируют. Берут аликвотную часть от общего объема полученного прозрачного образца. После этого добавляют прозрачные растворители спектральной чистоты. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 248-257 К до использования или сразу снимают спектр на UV-VIS спектроскопе.

В соответствии с предпочтительным вариантом изобретения стабилизаторами, обладающиими функцией денатурирования и стабилизирования жидкости организма, в которой, между прочим, содержатся и протеины, являются сульфат аммония, сульфат цезия, первичный кислый фосфат калия и гуанидиния сульфат.

В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом изобретения в качестве стабилизатора используются водные растворы сульфата аммония или первичного кислого фосфата калия. В то же время, в соответствии с наиболее предпочтительным вариантом настоящего изобретения, прозрачными растворителями спектральной чистоты являются 95% этанол и тетрагидрофуран.

Все UV-VIS спектры сняты при длине волны 200-800 нм. Получены два типа спектров, один, характерный для злокачественных заболеваний, а второй для доброкачественных заболеваний, наличие которых однозначно обнаружено в плевральных выпотах, асцитах, перикардиальных выпотах.

На спектре первого типа при 230-275 нм обнаруживаются два пика. Оба пика очень хорошо оформлены и определены. Поглощение обоих пиков имеет значение между 4 и 5. В диапазоне от 380 до 500 нм обнаружено одно очень ровное плато с низким значением поглощения (около 0,5). Это обычный тип спектра всех указанных жидкостей организма (плевральных выпотов, асцитов и перикардиальных выпотов) при наличии злокачественного заболевания в любой части организма. У 620 из 650 испытуемых жидкостей организма с подозрением на наличие злокачественности в организме получен такой тип спектра. Диагноз, поставленный UV-VIS спекроскопией, был подтвержден и совпадает с диагнозом, поставленным обычными клиническими, радиологическими, цитологическими и гистопатологическими процедурами.

Второй тип полученных спектров показал вместо двух хорошо определенных пиков в области 230-280 нм одну очень широкую полосу, которая на верху в основном имеет много шумов. Значение поглощения составляет 4-5. Данная широкая полоса типична для жидкостей организма, являющихся последствием доброкачественных заболеваний в организме. В диапазоне от 380 до 599 нм появляется высокое плато, которое в четыре - пять раз выше, чем плато в случае злокачественных заболеваний. Диагноз отсутствия злокачественности опухоли подтвержден у 300 из 325 испытуемых жидкостей организма (плевральный выпот, асцит, перикардиальный выпот). Существенным отличием является то, что новым скрининг диагностическим методом можно обнаружить злокачественное заболевание в трех испытуемых видах жидкостей организма.

Таблица содержит все данные в связи с выбранным образцом определенного числа (30) пациентов, стабилизированную жидкость организма которых анализировали, в которой диагноз, поставленный UV-VIS спектроскопией, однозначно совпадает с клиническими диагнозами, установленными посредством различных клинических методов.

Шифр пациента	Возраст/пол	Экссудат (вид взятой тел. жидкости)	Клинический диагноз	Результат цитологии	UV-VIS диагноз
ХХ02	1967/ж	перикардиальный выпот	Non-Hodgkin lymphoma st IVB; St. post irrad. CNS am I / iand VCS ami	злокачественные клетки	М
ХХ05	1914/ж	плевральный выпот	Adenocarcinoma pulm.I. dex.		М
ХХ07	1951/ж	асцит	St.post.resec.sigmae pp ca aa II		М
ХХ08	1939/ж	асцит	St.post.amp. Mammae I.sin pp Ca aaXII; Effusio pleurae I.sin. maligna; Pleurodesis am III; Ascites	злокач. клетки, происходящие из очага карциномы	М
ХХ09	1947/ж	асцит	St.post hysterectomiam totalis cum adnexextomiam bill.pp ca ovarii st.IC		М
XY10	1934/м	асцит	Neo ventriculi cum meta hepatitis		М
XX13	1940/ж	асцит	Ca ventriculi typus diffusum (anaplasticum) cum meta in lymphonodis	злокач. клетки, происходящие из аденокарциномы	М
ХХ14	1948/ж	асцит	St.post.amput. Mammae I.dex.pp Ca. Meta hepatis		М
ХХ22	1925/ж	асцит	Tu ovarii lat dex.		М
XY24	1945/м	асцит	Adenocarcinoma partim anaplasticum f. ventriculi. Meta hepatitis. Carcinosis peritonei. Ascites		М
XY27	1941/м	асцит	Ascites. Carcinosis peritonei ex origine ignote.	клетки аденокарциномы, частью гигантоклеточной	М
ХХ28	1940/ж	плевральный выпот	St.post.amp mammae I. dex. pp Ca ductale inv. exilic. Gr. Ill aa III. St.post. irrad. Post op.Meta. Pulmo. bil. cum pleuritis carcinomatosa I. dex. Meta ossium gen. St.post. incultus vascularis cerebri.		М
ХХ29	1956/ж	плевральный выпот	St.post.amp. Mammae I. dex. pp Ca ductale inv. GIII aalX, meta hepatis, meta pulmonum.		М
ХХ30	1938/ж	асцит	St.post.amp. mammae I. Dexpp Ca aaXXSt. post irradiationem praeoper. ssXX Hepattomeglia. Infiltratio hepatis susp.Ascites. Effusio pleurae I. dex. Infiltratio mal. Peritonei. Cystitis ovarii I. dex. Hzdronephrosis ren. Pancreatitis chronica. Noduli	эритроциты, лимфоциты, макрофаги и масса отдельных и клеток сосочковых опухолей. Злокачественные. происхождение из очага слабо дифферен. гигантокл. карциномы	М
XY32	1953/м	асцит	Adenocarcinoma corporis ventriculi typus diffusum inop. carcinosis peritonei. ascites. hypoalbuminemia. St.post. lap.Expl. a.m. II.		М
ХХ33	1945/ж	асцит	St.post. amp.m.Isin. p.p. Ca aa V. St.post. TCT postop. A.a. IV/V. St.post. ovariect. bil. Pp Meta aa II meta ossium gen. St.post. ira. Palitiva coxae pp meta pangastritis chronica erosiva. anemia complexa sec. trombocythopaen.		М
ХХ34	1972/ж	перикардиальный выпот	Morbus Hodgkin.		М
ХХ35	1920/ж	асцит	Tu ovarii sus. Ascites. Effusio pleurae bil.		М
ХХ45	1952/ж	плевральный выпот	St.post. AMLD pp.Ca ductale infiltrativum aa V/VI. Recidivum locale. Effiisio pleurae	смешанная насыщенность клетками	М
ХХ46	1936/ж	асцит	Ca ovarii st IV. Carec inosis perifonei parietalis et visceralis		М
ХХ47	1931/ж	асцит	Laesio hepatitis. Ascites. St.post. nephrectomiam I. dex. St.post. ICV	злокачественный мезителиом	М
ХХ50	1946/ж	плевральный выпот	Status post laryngectomiam partialis horisontalis supragolottica et explorationem cillibilateralis A.A. III Ca laryngis recidivans		М
ХХ51	1975/ж	асцит	St. post. extirpationem Tu mesosigmae a.a.I/II Ph: Schwanoma cellulare		М
XY54	1930/м	асцит	Ca ventriculi, meta hepatis, carcinosis peritonei	эритроциты, макрофаги и клетки мезителиома	М
ХХ58	1924/ж	асцит	Tu abdominalis		М
ХХ59	1934/ж	плевральный выпот	Schwanoma malignum regio cruris lat. Dex. susp. Meta		М
ХХ61	1942/ж	асцит	Tu ovarii sin.		М
ХХ62	1946/ж	асцит	St.post. extirpatio I. gli. colli. I. sin. pp		М
XY65	1931/м	асцит	St.post. resecsigmae. Meta hepatis		М
ХХ66	1934/ж	асцит	Adenocarcinoma uteri necroticum		М

В таблице указан возраст пациентов, вид испытуемой жидкости организма (экссудат), клинический диагноз и цитологический результат. В последней графе указан результат (диагноз), полученный UV-VIS спектральным методом, и наличие злокачественной опухоли, обозначенное М. Анализируемые жидкости (экссудаты): плевральный пунктат (жидкость, являющаяся последствием патологического процесса в организме и накапливающаяся в плевральном пространстве), асцит (жидкость, накапливающаяся как последствие патологического процесса в перитонеальной полости) и перикардиальный выпот (жидкость, накапливающаяся как последствие патологического процесса между двумя листками перикарда).

Таблица четко показывает (на образцах, выбранных от 30 пациентов), что клинический диагноз, т.е. наличие злокачественной опухоли при различных опухолевых процессах однозначно совпадает с диагнозом, поставленным UV-VIS спектроскопией. Независимо от вида процесса злокачественной опухоли в организме (некоторые примеры из таблицы: ХХ05 - Adenocarcinoma pulm.I.dex., XY10 - Neo ventriculi cum meta hepatitis, XX59 - Schwanoma malignum, XX66 - Adenocarcinoma uteri necroticum, XX02 - Non-Hodgkin lymphoma) методом UV-VIS спектроскопии однозначно обнаружено наличие злокачественной опухоли (в таблице обозначено М).

Независимо от вида испытуемой жидкости организма (экссудата) наличие злокачественного процесса обнаружено UV-VIS спектроскопией и однозначно совпадает с клиническим диагнозом, полученным стандартными клиническими методами диагностики рака (биопсия, патогистологический осмотр). Это показывают примеры из таблицы: в перикардиальном выпоте (XX02) обнаружено наличие злокачественной опухоли - Non-Hodgkin lymphoma, обозначенное в таблице М. В плевральном выпоте (ХХ05) обнаружено наличие злокачественной опухоли - Adenocarcinoma pulm.I.dex, обозначенное в таблице М. В асците обнаружено наличие злокачественной опухоли (ХХ46) - Са ovarii st IV. Carcinosis peritonei pariet alis et visceralis, обозначено в таблице М.

Информацию относительно болезни всех исследуемых пациентов собирали в соответствии со стандартным клиническим протоколом и формой, включающими возраст, пол, профессию, появление первых симптомов, привычку к курению, вес тела и результаты других анализов. Для всех исследуемых пациентов с плевральными или перикардиальными выпотами характерно то, что в момент снятия UV-VIS спектров у них не было диагноза и 90% пациентов не проходили курс терапии (за исключением тех, которые в течение взятия анамнеза не сказали, какое лечение принимают вне контроля и ведома врача). До настоящего времени провели испытания на 232 пациентах с плевральными выпотами, 565 с асцитами и 178 с перикардиальными выпотами. Средний возраст испытуемых пациентов составляет 44,6 лет с соотношением мужчины : женщины 519:456.

Детальное описание изобретения

Метод стабилизации индивидуального субстрата in vitro для спектрального определения злокачественности включает в соответствии с настоящим изобретением добавление 1,5-6,2 мас.% 10% водного раствора стабилизатора к взятым in vivo жидкостям организма человека (плевральный пунктат, асцит, перикардиальный выпот) и полученную смесь центрифугируют в течение 800-1050 сек со скоростью 22,8-26,6 об/сек. Берут образец полученного прозрачного содержимого и добавляют 10,0-26,8 мас.% прозрачного растворителя спектральной чистоты. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 248-257 К до использования или немедленно снимают спектр.

Преимуществом нового метода является то, что посредством метода стабилизации индивидуального субстрата для спектральной диагностики злокачественности предоставляется более быстрый и более качественный способ определения злокачественности по сравнению с известными методами.

Примеры методик получения индивидуального субстрата для спектральной диагностики злокачественности

Пример 1. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,375 мг плеврального выпота или перикардиального выпота или асцита в качестве экссудата и добавляют 0,125 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водный раствор сульфата цезия или сульфата аммония или сульфата гунидиния или первичного кислого фосфата калия. Полученную смесь центрифугируют в течение 900 сек со скоростью 25 об/сек. К аликвоте полученного прозрачного раствора прибавляют 0,5 мг прозрачного растворителя спектральной чистоты 95% этанола или диоксана или тетрагидрофурана и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 253 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Пример 2. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,375 мг асцита в качестве экссудата и прибавляют 0,125 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водный раствор сульфата цезия. Полученную смесь центрифугируют в течение 950 сек со скоростью 25 об/сек. К аликвоте полученного прозрачного раствора добавляют 0,5 мг прозрачного растворителя спектральной чистоты 95% этанола и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 253 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Пример 3. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,34 мг асцита в качестве экссудата и прибавляют 0,06 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водный раствор сульфата аммония. Полученную смесь центрифугируют в течение 800 сек со скоростью 26,6 об/сек. К аликвоте полученного прозрачного раствора добавляют 0,6 мг прозрачного растворителя спектральной чистоты 95% этанола и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 250 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Пример 4. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,56 мг асцита в качестве экссудата и прибавляют 0,04 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водный раствор первичного кислого фосфата калия. Полученную смесь центрифугируют в течение 1000 сек со скоростью 23,3 об/сек. К аликвоте полученного прозрачного раствора прибавляют 0,4 мг растворителя спектральной чистоты 95% этанола и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 257 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Пример 5. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,58 мг асцита в качестве экссудата и прибавляют 0,12 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водного раствора гуанидиния сульфата. Полученную смесь центрифугируют в течение 1050 сек со скоростью 22,8 об/сек. К аликвоте полученного прозрачного раствора прибавляют 0,3 мг спектрального растворителя 95% этанола и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 248 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Пример 6. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,065 мг асцита в качестве экссудата и добавляют 0,135 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водный раствор сульфата аммония. Полученную смесь центрифугируют в течение 850 сек со скоростью 25,8 об/сек. К аликвоте, взятой из полученного прозрачного раствора, прибавляют 0,7 мг спектрального растворителя 95% этанола и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 250 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Пример 7. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,36 мг плеврального выпота в качестве экссудата и прибавляют 0,14 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водный раствор сульфата аммония. Полученную смесь центрифугируют в течение 880 сек со скоростью 25 об/сек. К аликвоте, взятой из полученного прозрачного раствора, прибавляют 0,9 мг спектрального растворителя 95% этанола и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 250 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Пример 8. Берут стерильно обычным образом из человеческого организма 2,36 мг перикардиального выпота в качестве экссудата и прибавляют 0,14 мг стабилизатора. В качестве стабилизатора используют 10% водный раствор сульфата аммония. Полученную смесь центрифугируют в течение 880 сек со скоростью 25,0 об/сек. К аликвоте, взятой из полученного прозрачного раствора, прибавляют 0,9 мг спектрального растворителя 95% этанола и хорошо перемешивают. Полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 250 К до использования или сразу употребляют для спектрального исследования злокачественности.

Примеры использования полученных индивидуальных субстатов для спектрального определения злокачественности

Пример А. У пациента XY01 (1955/м) провели экстракцию асцита из абдоминальной области и 2,2 мл асцита (без дополнительной обработки) перенесли в кварцевую кюветку для UV-VIS спектроскопа. Сняли UV-VIS спектр на UV-VIS спектрофометре Hewlett Packard, модель 8452А, в диапазоне 200-800 нм. В качестве эталонного раствора использовали дистиллированную воду. На фиг.1 изображен полученный UV-VIS спектр. В диапазоне от 230 до 275 нм замечаются два хорошо сформированных и определенных пика. Поглощение пиков имеет значение между 3 и 4. В диапазоне 380-500 нм четко видимо ровное плато с низким значением поглощения, около 0,5 (фиг.1).

Это обычный тип спектра для жидкости организма человека, являющейся последствием злокачественных заболеваний в организме, в данном случае UV-VIS спектр снятого асцита четко указывает на злокачественность. Клинический диагноз, установленный посредством других диагностических методов, следующий: Adenocarclnoma ventriculi inop. Carcinosis peritonei ascites.

Пример В. У пациента ХХ01 (1932/ж) экстрагировали 2,375 мг плеврального выпота из преврального пространства и в момент экстракции не был установлен клинический диагноз. Индивидуальный субстрат был приготовлен в соответствии с методом по примеру 1 и его перенесли в кварцевую кюветку для UV-VIS спектроскопии. В качестве эталонного раствора использовали дистиллированную воду. Сняли спектр на UV-VIS спектрофометре Hewlett Packard, модель 8452А, при 200-800 нм. В качестве эталонного раствора использовали дистиллированную воду. На фиг.2 изображен полученный UV-VIS спектр. В диапазоне от 230 до 280 нм видима широкая полоса с множеством пиков со значением поглощения, составляющим 4-5. Широкая полоса с множеством пиков типична для наличия доброкачественных болезней в организме. В диапазоне от 380 до 599 нм появляется высокое плато, которое также характерно для наличия доброкачественной болезни (фиг.2). Клиническим диагнозом, полученным позже посредством остальных классических диагностических методов, является пневмония.

Пример С. У пациентки ХХ02 (1967/ж) экстрагировали 19 мг перикардиального выпота из перикарда, потому что она страдала от сердечной недостаточности. Индивидуальный субстат был приготовлен в соответствии с примером 4 и его перенесли в кварцевую кюветку для UV-VIS спектроскопии. Сняли спектр на UV-VIS спектрофотометре Hewlett Packard, модель 8452А, диапазон 200-800 нм. В качестве эталонного раствора использовали дистиллированную воду. На фиг.3 изображен полученный UV-VIS спектр. В диапазоне от 230 до 275 нм замечаются два хорошо сформированных и определенных пика. Поглощение пиков имеет значение между 3 и 4. В диапазоне 380-500 нм четко видимо ровное плато с низким значением поглощения, около 0,5. Это обычный тип спектра для жидкости организма человека, являющейся последствием злокачественного заболевания в организме (фиг.3). В данном случае снятый UV-VIS спектр перикардиального выпота четко указывает на злокачественность. У пациентки ХХ02 посредством различных диагностических методов установили, что она болеет также Non-Hodgkin lymphoma st, IVB; st. post irrad. CNS am I/II and VCS am.

Преимущество UV-VIS диагностического метода снятием спектра жидкости организма человека является то, что полученный спектр указывает на злокачественный процесс в организме независимо от того, из какой части организма взяли жидкость и в каком органе происходит развитие злокачественного процесса.

Лучший способ осуществления изобретения

2,56 мг асцита в стерильных условиях берут в качестве экссудата из организма человека и добавляют 0,04 мг стабилизатора. 10% водный раствор первичного кислого фосфата калия используют в качестве стабилизатора. Полученную смесь центрифугируют в течение 1000 сек со скоростью 23,3 об/сек. К аликвоте полученного прозрачного раствора добавляют 0,4 мг растворителя спектральной чистоты, 95% этанол, и тщательно перемешивают. Образец полученного индивидуального субстрата замораживают при 257 К до использования или немедленно используют для спектрального определения злокачественности.

Метод стабилизации индивидуального субстрата для спектрального определения злокачественности, в котором экссудатом, взятым стерильно из организма человека, является плевральный выпот, перикардиальный выпот или асцит и в качестве стабилизатора используют сульфат аммония, сульфат гуанидиния, сульфат цезия или первичный кислый фосфат калия и в качестве спектрального растворителя используют 95%-ный этанол, тетрагидрофуран или диоксан, отличающийся тем, что 93,8-98,5 мас.% экссудата стабилизируют 1,5-6,2 мас.% 10%-ного водного раствора стабилизатора и полученную смесь центрифугируют в течение 800-1050 с со скоростью 22,8-26,6 об/с, затем к полученному прозрачному образцу добавляют 10,0-26,8 мас.% прозрачного растворителя спектральной чистоты и полученный образец индивидуального субстрата замораживают при 248-257 К до использования или немедленно снимают спектр.