Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний с использованием комбинации элиминирующего в-клетки/иммунорегуляторного антител

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для лечения аутоиммунных заболеваний. Для этого вводят композицию, состоящую из иммунорегуляторного анти-CD80 антитела или его иммунорегуляторного CD-80-связывающего фрагмента, и анти-СD20 антитела, обладающего активностью, направленной на истощение В-клеток, в заявленных дозах и режиме введения. Способ обеспечивает эффективное лечение аутоиммунных заболеваний за счет истощения популяции В-клеток, что определяется селективной направленностью заявленной комбинации антител против антигенов как активированных, так и неактивированных В-клеток. 2 н. и 34 з.п.ф-лы, 1 табл.

 

Родственные заявки

Данная заявка относится к и заявляет приоритет предварительной заявки США №60/233607, поданной 18 сентября 2000 г. под названием «Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний, включающая CD40L-антагонист и антитела против В7, СD19, CD20, CD22 или CD23», Nabil Hanna, и предварительной заявки №60/257147, поданной 22 декабря 2000 г. под названием «Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний с использованием комбинации элиминирующего В-клетки/иммунорегуляторного антител», Nabil Hanna.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новой комбинированной терапии для лечения аутоиммунных заболеваний. В частности, изобретение относится к комбинированному применению иммунорегуляторного антитела, предпочтительно антитела, которое модулирует дифференцировку, пролиферацию и/или функцию Т- и/или В-клеток, и/или элиминирующего В-клетки антитела для терапии аутоиммунных заболеваний. Данные антитела можно вводить по отдельности или в комбинации, и в любом порядке.

Предпосылки изобретения

В настоящее время применение антител для лечения заболеваний, включая злокачественные опухоли, особенно не-ходжкинскую лимфому, лейкозы, опосредуемые вирусом заболевания и аутоиммунные заболевания, получило широкое признание. В частности, сообщалось о применении антител против CD20 или против CD22, которые обладают способностью элиминировать клетки, для лечения злокачественных опухолей, например, не-ходжкинской лимфомы и связанных с В-клетками лимфом. Также, среди прочего, имелось сообщение об использовании элиминирующих В-клетки антител, специфичных к CD19 или CD37.

Кроме того, сообщалось о применение различных иммунорегуляторных антител, т.е. антител, которые проявляют терапевтическое действие при модуляции, т.е. усиливая или ингибируя определенный иммунный путь. Например, такие антитела модулируют дифференцировку, пролиферацию, активацию и/или функцию Т- или В-клеток, или других клеток, участвующих в регуляции иммунитета. Такие иммунорегуляторные антитела связываются с лигандом или рецептором на иммунной клетке, обычно антигеном В- или Т-клетки, который принимает участие в регуляции гуморального или клеточного иммунитета. Примерами таких лигандов являются иммунные сигнальные молекулы, такие как В7.1, В7.2, Т-клеточные регуляторные молекулы, такие, как CD40-L, CD40 и CD4. Обсуждение функции некоторых из этих антигенов и применение антител, специфичных к ним, для терапии на предшествующем уровне кратко представлено ниже.

CD40L представляет рецептор, экспрессирующийся на поверхности активации клеток-хелперов, и является противорецептором для CD40, лиганда, экспрессирующегося на поверхности В-лимфоцитов, а также других антигенпрезентирующих клеток. Зависимое от контакта взаимодействие CD40L на активированных Т-клетках с CD40, экспрессированного на В- и других антигенпрезентирующих клетках, называемое «хелперной функцией Т-клеток», приводит к активации и дифференцировке В-лимфоцитов и служит средством регуляции гуморальных иммунных ответов. Данная регуляция включает функции модуляции специфичности, секреции и изотип-зависимых функций молекул антител. Процесс, с помощью которого Т-клетки помогают В-клеткам дифференцироваться, подразделяется на две отдельные стадии: индукционную и эффекторную стадии (Vitetta et al., Adv. Immunol. 45:1 (1989); Noelle et al., Immunol. Today 11:361 (1990)).

Молекулярная основа помощи Т-клеток в гуморальном иммунитете посредством взаимодействия CD40 и его лиганда gp39 (также известен, как CD40L и CD154) в настоящее время хорошо понятна. В основном, известно, что активированные Т-хелперные клетки экспрессируют гены лимфокина и CD40L, мембранный белок, который важен для взаимной активации родственных, антигенпрезентирующих В-клеток. Взаимодействие CD40L с его рецептором CD40 на В-клетках стимулирует поступление В-клеток и индуцирует реактивность В-клеток воздействию лимфокинов к росту и дифференцировки.

Кроме того, известно, что CD40L играет большую, более важную роль в иммунных процессах, связанных с Т-клетками, т.е. помимо его роли в помощи Т-клеткам и регуляции гуморального иммунитета. Данная роль CD40L не совсем понятна. Например, имеется теория о том, что патология опосредованных через Т-клетки аутоиммунных заболеваний, включая, например, рассеянный склероз, диабет типа 1, воспалительное заболевание кишечника, оофорит и тиреоидит, включает наличие определенного лиганда CD40, экспрессирующегося популяцией супрессорных Т-клеток, которые играют роль в патологии заболевания, возможно, за счет подавления роли эффекторных Т-клеток. Кроме того, сообщалось о роли CD40 и CD40L в периферической и центральной крови в толерантности и участии в развитии аутоиммунных заболеваний (Durie et al., Res. Immunol. Vol.145 (3):200-205 (1994)).

Сообщалось о применении антагонистов CD40L для лечения опосредуемых В-клетками и опосредуемых Т-клетками аутоиммунных заболеваний. Например, в Европейском патенте 555880, патенте США 5474771 и WO 93/09212 раскрывается применение антагонистов CD40L для лечения гуморального аутоиммунного заболевания. Применение антагонистов CD40L для лечения опосредуемых Т-клетками аутоиммунных заболеваний раскрывается в патенте США 5833987 и его аналоге - РСТ/US96/09В7.

Как обсуждалось выше, также сообщалось о применении в качестве лекарственных средств молекул, которые специфически связываются с мишеневыми антигенами на В-лимфоцитах и которые элиминируют В-клетки. Возможно, наиболее признанной мишенью В-клеток для терапии является антиген CD20, получивший разрешение FDA на применение ритуксан^®, химерное моноклональное антитело, направленное против антигена CD20 для лечения не-ходжкинской лимфомы.

Антиген CD20 (также называемый антигеном ограниченной дифференцировки человеческих В-лимфоцитов, -р-33) представляет гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой примерно 35 кДа, расположенный на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264 (19):11282-11287 (1989); and Einfeld et al., EMBO et al., EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). Антиген также экспрессируется более чем на 90% в В-клетках не-ходжкинской лимфомы HL, Anderson et al., Blood 63(6):1424-1433 (1984), но он не обнаружен на гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках и клетках других нормальных тканей (Tedder et al., J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). CD20 регулирует начальные стадии активации для инициации клеточного цикла и дифференцировки (Tedder et al., выше) и, возможно, функционирует в качестве кальциевых ионных каналов (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D:195(1990)).

При экспрессии CD20 в В-клетках лимфомы, данный антиген может служить в качестве кандидата для "целенаправленного" воздействия на такую лимфому. В сущности, подобное целенаправленное воздействие может осуществляться следующим образом: антитела, специфичные к поверхностному антигену CD20 В-клеток, вводят пациенту; данные антитела против CD20 специфично связываются с антигеном CD20 (по видимости) как нормальных, так и злокачественных В-клеток; и антитела, связанные с поверхностным антигеном CD20, приводят к разрушению и элиминации злокачественных В-клеток. Кроме того, химические средства или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, можно конъюгировать с антителами против CD20, таким образом, чтобы препарат специфично «доставлялся» к злокачественным В-клеткам. Независимо от подхода, основной целью является разрушение опухоли; конкретный подход можно определить использованием конкретных антител против CD20 и таким образом, доступные подходы к целенаправленному воздействию на антиген CD20 могут в значительной степени варьировать.

CD19 представляет другой антиген, который экспрессируется на поверхности клеток В-линий дифференцировки. Как и CD20, CD19 обнаружен на клетках во время дифференцировки линий со стадии стволовых клеток до точки, непосредственно предшествующей конечной дифференцировке в плазматические клетки (Nadler L., Lymphocyte Typing II2:3-37 and Appendix, Renling et al., eds. (1986) by Springer Verlag). В отличие от CD20, антитела, связывающиеся с CD19, вызывают интернализацию антигена CD19. Антиген CD19 идентифицируется антителами HD237-CD19 (также называемыми антителами «В4») (Kiesel et al., Leukemia Research II, 12:1119 (1987)), среди прочего. CD19 присутствует у 4,8% мононуклеарных клеток периферической крови и более чем у 90% В-клеток, выделенных из периферической крови, селезенки, лимфатических узлов или миндалин. CD19 не обнаружен в Т-клетках периферической крови, моноцитах или гранулоцитах. Фактически все не-Т-клеточные острые лимфобластные лейкозы (ALL), В-клеточные хронические лимфоцитарные лейкозы (CLL) и В-клеточные лимфомы экспрессируют CD19, обнаруживаемый антителом В4 (Nadler et al., J. Immunol. 131:244 (1983); and Nadler et al. in Progress in Hematology Vol.XII pp.187-206. Brown, E. ed. (1981) by Grune & Stratton, Inc.

CD22 представляет другой антиген, который экспрессируется на поверхности клеток В-линий дифференцировки. Данный антиген также называют «BL-CAM» и «LyB8». Данный антиген является мембранным связанным с иммуноглобулином белком, имеющим молекулярную массу около 140000, который фосфорилирован по тирозину, когда он лигирован с поверхностным Ig (Engel et al., J. R&PMed 181(4):1521-1526 (1995); Campbell and Eur. J. Immunol. 25:1573). Сообщалось, что данный антиген является отрицательным регулятором сигнальной передачи рецепторов В-клеток (Nitschke et al., Curr. Biol. 7:133 (1997) и способствует атизму моноцитов и эритроцитов (Stamenkovich et al. Nature 345:74(1990)). Чистое антитело, специфическое к CD22, называемое лимфоцидом^™, находится в настоящее время на стадии клинических испытаний для лечения медленно текущей не-ходжкинской лимфомы, производства Immunomedics, Inc. Также на стадии клинических испытаний находится меченная иттрием 90 форма данного антитела для лечения медленно текущей и агрессивной не-ходжкинской лимфомы.

CD23 представляет еще один антиген, экспрессирующий на В-клетках, и является рецептором с низкой аффинностью для IgE, также известный, как FcERII. В патентной и непатентной литературе предложено применение антител, которые связываются с CD23 для лечения воспалительных, аутоиммунных и аллергических заболеваний.

В7.1. и В7.2. представляют другие примеры антигенов В-клеток, в отношении которых сообщалось об использовании лигандов, которые специфично связываются и которые действуют в качестве иммунорегуляторов, обладающих лечебной применимостью. В частности, сообщалось, что анти-В7, особенно которые связываются с В7.1 (CD80), В7.2 (CD86) или В7.3 трансмембранными гликопротеинами, экспрессирующимися на поверхности В-клеток, обладают потенциалом применяться в качестве иммуносупрессоров и для лечения различных заболеваний. Например, в патенте США 5869040, опубликованном 9 февраля 1999 г., DeBoer et al. и принадлежащем Chiron Corporation, раскрывается применение антител против В7.1 в комбинации с другим иммуносупрессором для лечения отторжения трансплантата, болезни «трансплантат против хозяина» и ревматоидного артрита. Кроме того, в патенте США 5885579, опубликованном 23 марта 1999 г., Linsley et al., раскрывается лечение иммунных заболеваний, в котором участвуют взаимодействия Т-клеток с В7-положительными клетками введением лиганда, специфического для антигена В7, например, В7.1 (CD80) или В7.2 (CD86).

Кроме того, в патенте США 6113198 Anderson et al., раскрывается применение антител, специфичных для антигена В7.1, которые в противоположность антителам против В7 не ингибируют взаимодействие В7.1/CTLA-4 и пригодны для лечения заболеваний, включая аутоиммунные заболевания. Однако не раскрывается комбинированное применение данных антител с антителом, специфичным к CD40L, как и не сообщается о применении антител в сочетании с антителами, элиминирующими В-клетки.

Антитело ритуксимаб (ритуксан^®), в частности, представляет рекомбинантное химерное мышиное/человеческое моноклональное антитело, направленное против антигена CD20. Ритуксан^® предназначен для лечения пациентов с рецидивной или рефракторной, или фолликулярной, CD20 положительной В-клеточной не-ходжкинской лимфомой (патент США №5736 В7, опубликованный 7 апреля 1998 г., Anderson et al.). При изучении механизма действия в условиях in vitro было показано, что ритуксан^® связывается с человеческим комплементом и лизирует лимфоидные В-клеточные линии посредством комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Кроме того, оно обладает существенной активностью в тестах на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Недавно было показано, что ритуксан^® обладает антипролиферативной активностью в тестах по включению меченного тритием тимидина и непосредственно индуцирует апоптоз; в то время, как другие антитела против CD19 и CD20 нет (Maloney et al. Blood 88(10):637a (1996)). В эксперименте также наблюдали синергизм между ритуксаном^® и химиотерапией, и токсинами. В частности, ритуксан^® сенсибилизировал резистентные к препаратам человеческие В-клеточные лимфомы к цитотоксическому действию доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)). В условиях in vivo ритуксан^® очень эффективно элиминирует В-клетки из периферической крови, лимфоузлов и костного мозга макаков-крабоедов, в основном посредством процессов, опосредуемых комплементом и клетками (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)).

Perrotta и Abuel Blood:92 Abstract # 3360, 40-ая ежегодная встреча ASH (ноябрь 1998 г.), представляют неизвестное ранее сообщение о пятидесятилетней женщине с идиопатической тромбоцитопенической пурпуре (ITP), поддавшейся лечению ритуксаном^®.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к лечению аутоиммунного заболевания, предпочтительно опосредуемого В-клетками аутоиммунного заболевания, с использованием комбинации, по меньшей мере, одного иммунорегуляторного антитела и по меньшей мере одного элиминирующего В-клетки антитела, например, антитела, направленного к CD20, CD19, CD22, CD23 или CD37. Введение данных антител по отдельности или в комбинации проявляет синергитическое действие при использовании для лечения аутоиммунных заболеваний. Это происходит потому, что элиминирующее В-клетки антитело приводит к снижению числа В-клеток и, следовательно, уменьшает количество циркулирующего IgE и других антител, которые принимают участие в патологии аутоиммунитета. Однако элиминирующее В-клетки антитело, например, ритуксан^®, приводит к предпочтительному элиминированию активированных В-клеток. В противоположность иммунорегуляторные антитела, например, антитела против В7 и против CD40L проявляют их иммунорегуляторный эффект, т.е. иммуносупрессию в отношении неактивированных В-клеток, т.е. неактивированных антигенпрезентирующих В-клеток. Следовательно, предполагается, что применение двух функционально различных типов антител будет проявлять синергитическое действие в том плане, что оно будет способствовать удалению как активированных, так и неактивированных В-клеток из кровотока. Тем самым уровень циркулирующих антител будет значительно снижен, поскольку будет в значительной мере уменьшен уровень антителопродуцирующих В-клеток. Это будет приводить к существенному лечебному эффекту особенно при аутоиммунных заболеваниях, при которых В-клетки и, конкретнее, аутоантитела принимают активное участие в патологии заболевания.

Как обсуждается ниже, предпочтительные иммунорегуляторные антитела включают антитела против В7.1 или против В7.2, против CD40, против CD40L и против CD4. Предпочтительные примеры элиминирующих В-клетки антител включают специфичные к CD20, CD19, CD21, CD37 и CD22.

В его самом широком аспекте изобретение обеспечивает комбинированную терапию для лечения аутоиммунного заболевания, например, ревматоидного артрита, SLE, ITP, комбинированным применением i) иммунорегуляторного антитела, предпочтительно которое ингибирует неактивированные В-клетки; и ii) элиминирующего В-клетки антитела, где каждые антитела можно вводить по отдельности или в комбинации и в любом порядке.

В более конкретном аспекте изобретение включает лечение аутоиммунного заболевания комбинированным применением i) антитела против В7.1 или В7.2 и/или против CD40L и ii) элиминирующего В-клетки антитела, выбранного из анти-CD20, анти-CD19, анти-CD22 и анти-CD37.

Дополнительно изобретение относится к предметам производства для лечения аутоиммунных заболеваний, которые включают контейнер и одну или более композиций, содержащихся в них, которые включают эффективное количество иммунорегуляторного антитела, например, антитела против CD40L или против В7.1, или против В7.2 (иммунорегуляторного антитела) и элиминирующего В-клетки антитела или его фрагмента, анти-CD20, анти-CD19, анти-CD22 или анти-CD37 (элиминирующего В-клетки антитела).

Подробное описание предпочтительных воплощений

I. Определения

В данном случае «элиминирующим В-клетки антителом» является антитело или фрагмент, которые связываются с маркером В-клеток, которые при введении приводят к заметной элиминации В-клеток. Предпочтительно данное антитело после введения, обычно в течение примерно нескольких дней или менее, приведет к снижению числа В-клеток примерно на 50% или более. В предпочтительном воплощении элиминирующим В-клетки антителом будет ритуксан^® (химерное антитело против CD20) или таковое, обладающее в основном такой же или выше элиминирующей активностью. Было показано, что данное антитело обеспечивает в основном 90% элиминирование В-клеток в течение 24 ч после назначения в эффективном количестве.

Термин «иммунорегуляторное антитело» относится к антителу, которое оказывает эффект на иммунную систему механизмом, отличным от элиминации активированных В-клеток. Его примеры включают антитела, которые ингибируют Т-клеточный иммунитет, В-клеточный иммунитет, например, индукцией толерантности (анти-CD40L, анти-CD40) или другие иммуносупрессорные антитела (анти-В7.1, анти-В7.2 или анти-CD4). В некоторых случаях иммунорегуляторное антитело иммунных клеток может также обладать способностью усиливать апоптоз.

В данном случае «поверхностный маркер В-клеток» представляет антиген, экспрессирующийся на поверхности В-клеток, на который может быть целенаправленно действовать антагонист, который связывается с ним. Примерные поверхностные маркеры В-клеток включают лейкоцитарные поверхностные маркеры CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79а, CD79b, CD80 (В7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 (В7.2). Особый интерес представляет поверхностный маркер В-клеток, предпочтительно экспрессирующийся на В-клетках, по сравнению с другими тканями млекопитающих, не содержащими В-клеток, и который может экспрессироваться как предшественниками В-клеток, так и зрелыми В-клетками. В одном воплощении маркер представляет таковой, как CD20 или CD19, который обнаружен на В-клетках во время дифференцировки линии из стволовой клеточной стадии до точки, предшествующей конечной дифференцировке в плазматические клетки. В данном случае предпочтительными поверхностными маркерами В-клеток являются CD19, CD20, CD23, CD80 и CD86.

Антиген «CD20» представляет негликозилированный фосфобелок с массой 35 кДа, обнаруженный на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов. CD20 экспрессируется на ранней стадии развития пре-В-клеток и остается до дифференцировки в плазматические клетки. CD20 присутствует как в нормальных В-клетках, так и злокачественных В-клетках. Другие названия CD20 в литературе включают «стабильный антиген В-лимфоцитов» и «Вр35». Антиген CD20 описан Clark et al. PNAS (USA), 82:1766 (1985).

Антиген «CD19» относится к антигену с массой 90 кДа, идентифицированному, например, HD237-CD19- или В4-антителом (Kiesel et al. Leukemia Research II, 12:1119 (1987)). Подобно CD20, CD19 обнаружен на клетках во время дифференцировки линии из стволовой клеточной стадии до точки, предшествующей конечной дифференцировке в плазматические клетки. Связывание антагониста с CD19 может вызвать интернализацию антигена CD19.

Антиген «CD22» относится к антигену, экспрессирующемуся на В-клетках, также известному, как «BL-CAM» и «LybB», который принимает участие в передаче сигнала и адгезии В-клеток (смотри Nitschke et al., Curr. Biol. 7:133 (1997); Stamenkovic et al., Nature 345:74 (1990)). Данный антиген представляет мембранный, связанный с иммуноглобулином антиген, который фосфорилирован по тирозину, когда лигирован с мембранным Ig (Engel et al., J. Etyp. Med. 18(4):1521, 1586 (1995)). Клонирован ген, кодирующий данный антиген, и охарактеризованы его Ig-домены.

Антиген В7 включает антигены В7.1 (CD80), В7.2 (CD86) и В7.3, которые представляют трансмембранные антигены, экспрессирующиеся на В-клетках. В данной области известны антитела, которые специфично связываются с антигенами В7, включая человеческие антигены В7.1 и В7.2. Предпочтительные антитела к В7 включают антитела приматизед^® В7, раскрытые Anderson et al. в патенте США №6113198, принадлежащем IDEC Pharmaceuticals Corporation, а также человеческие и гуманизированные антитела к В7.

CD23 относится к рецептору IgE с низкой аффинностью, экспрессирующемуся В- и другими клетками. В настоящем изобретении CD23 предпочтительно будет человеческим антигеном CD23. В данной области также известны антитела к CD23. Наиболее предпочтительно в настоящем изобретении антитело к CD23 будет человеческим или химерным античеловеческим-CD23-антителом, включающим константные домены IgGI или IgG3, и наиболее предпочтительно элиминирующими антителами против CD23, раскрытыми в патенте США №6011138.

«Аутоиммунное заболевание» представляет доброкачественное заболевание или нарушение, возникающее из и направленное против собственных тканей индивидуума. В данном случае доброкачественные аутоиммунные заболевания особо исключают злокачественные или раковые заболевания или состояния, особенно исключая В-клеточную лимфому, острую лимфобластную лейкемию (ALL), хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL), волосатоклеточный лейкоз и хроническую миелобластную лейкемию. Примеры данных заболеваний или нарушений включают воспалительные реакции, такие как воспалительные заболевания кожи, включая псориаз и дерматит (например, атопический дерматит); системную склеродерму и склероз; реакции, связанные с воспалительным заболеванием кишечника (такие, как болезнь Крона и язвенный колит); синдром нарушения дыхания (включая респираторный дистресс-синдром у взрослых; ARDS); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; колит; гломерулонефрит; аллергические состояния, такие как экзема и астма, и другие состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток, и хронические воспалительные реакции; атеросклероз; недостаточность адгезии лейкоцитов; ревматоидный артрит; системную красную волчанку (SLE); сахарный диабет (например, сахарный диабет типа I или инсулинзависимый сахарный диабет); рассеянный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит; аллергический энцефаломиелит; синдром Шегрена; ювенильный диабет и иммунные реакции, связанные с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами, обычно обнаруживаемой при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, грануломатозе и васкулите; пернициозную анемию (болезнь Аддисона); заболевания, включающие лейкоцитарный диапедез; воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС); синдром множественного повреждения органов; гемолитическую анемию (включая криоглобулинемию); тяжелую псевдопаралитическую миастению; заболевания, опосредуемые комплексом антиген-антитело; антигломерулярное мембранное заболевание; антифосфолипидный синдром; аллергический неврит; болезнь Грэйвза; миастенический синдром Лэмберта-Итона; буллезный пемфигоид; пузырчатка; аутоиммунные полиэндокринопатии; болезнь Рейтера; синдром негнущегося человека; болезнь Бехчета; гигантоклеточный артериит; нефрит с иммунным комплексом; IgA-нефропатию; IgM-полиневропатии; иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), аутоиммунную тромбоцитопению и оофорит.

«Антагонист» В-клеток представляет молекулу, которая при связывании с поверхностным маркером В-клеток разрушает или элиминирует В-клетки у млекопитающего и/или нарушает одну или более функций В-клеток, например, снижая или предупреждая гуморальный ответ, проявляемый В-клетками. В противоположность элиминирующее В-клетки антитело удаляет В-клетки (т.е. снижает число циркулирующих В-клеток) у млекопитающего, обработанного им. Такую элиминацию можно достичь различными механизмами, такими как антителозависимая опосредуемая клетками цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индукция гибели В-клеток (например, апоптозом). Антагонисты в объеме настоящего изобретения включают антитела, пептиды с синтетической или природной последовательностью и небольшие молекулы-антагонисты, которые связываются с маркером В-клеток, необязательно конъюгированные с или слитые с цитотоксическим агентом.

Антагонист CD40L представляет молекулу, которая специфично связывается с CD40L, и предпочтительно мешает взаимодействию CD40L и CD40. Их примеры включают антитела и фрагменты антител, которые специфично связываются с CD40L, растворимый CD40, растворимые слитые белки CD40 и небольшие молекулы, которые связываются с CD40L. Предпочтительный антагонист по изобретению включает антитело или фрагмент антитела, специфического к CD40.

«Антигензависимая опосредуемая клетками цитотоксичность» или «ADCC» относится к опосредуемой клетками реакции, при которой неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcRs) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Основные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR в гемопоэтических клетках представлена в обобщенном виде в таблице 3 на стр. 464 у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Для оценки интересующей молекулы на ADCC-активность можно провести ADCC-тест in vitro, как описано в патентах США №5500362 или 5821337. Подходящие эффекторные клетки для таких тестов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно интересующую молекулу на ADCC-активность можно оценить in vivo, например, на модели на животных, раскрытой Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Человеческие эффекторные клетки» представляют лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры человеческих лейкоцитов, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при том, что предпочтительными являются клетки РВМС и NK. Эффекторные клетки можно выделить из их естественного источника, например, из крови или РВМС, как здесь описано.

Термины «Fc-рецептор» или «FcR» используются для обозначения рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительный FcR представляет естественную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительным FcR является таковой, который связывается с IgG-антителом (гамма-рецептор), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы данных рецепторов. FcγRII-рецепторы включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRUB («ингибирующий рецептор»), которые имеют одинаковые аминокислотные последовательности, которые различаются в основном по их цитоплазматическим доменам. Активирующий FcγRIIA-рецептор включает мотив активации на основе тирозина иммунорецептора (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий FcγRUB-рецептор включает мотив ингибирования на основе тирозина иммунорецептора в его цитоплазматическом домене. (Смотри обзор M.Daeon, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор по FcR имеется у Ravetch and Kiner, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, включая таковые, которые будут идентифицированы в будущем, объединены здесь термином «FcR». Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который ответственен за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

«Комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь с активацией комплемента начинается со связывания первого компонента комплементарной системы (Clq) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно провести CDC-тест, например, как описано у Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

«Ингибирующими рост» антагонистами являются таковые, которые предупреждают или подавляют пролиферацию клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается антагонист. Например, антагонист может предупредить или уменьшить пролиферацию В-клеток in vitro и/или in vivo.

Антагонистами, которые «индуцируют апоптоз», являются таковые, которые индуцируют запрограммированную гибель клеток, например, В-клеток, что определяют по связыванию с аннексином V, фрагментации ДНК, сморщиванию клеток, расширению эндоплазматического ретикулюма, фрагментации клеток и/или образованию мембранных пузырьков (называемых апоптозными тельцами).

В данном случае термин «антитело» используется в самом широком смысле и конкретно включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

«Фрагменты антитела» включают часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают Fab-, Fab'-, F(ab')²- и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

«Естественные антитела» обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами с массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух одинаковых легких (L) цепей и двух одинаковых тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время, как число дисульфидных связей варьирует среди тяжелых цепей иммуноглобулинов различных изотипов. Также каждая тяжелая и легкая цепь имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует число константных доменов. Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VL) и константный домен на другом ее конце; константный домен легкой цепи расположен по одной линии с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи расположен по одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин «вариабельный» относится к факту, что определенные участки вариабельных доменов в значительной степени различаются по последовательности среди антител, и используются при связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность распределена неравномерно в вариабельных доменах антител. Она концентрируется в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками, как в вариабельных доменах легкой цепи, так и тяжелой цепи. Наиболее высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов естественной тяжелой и легкой цепей включает четыре FR, в основном имеющих 13-складчатую конфигурацию, соединенных с тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющиеся и в некоторых случаях образующие часть В-складчатой структуры. Гипервариабельные участки в каждой цепи поддерживаются вместе в тесной пространственной близости с помощью FR и с гипервариабельными участками другой цепи, участвуя в образовании антигенсвязывающего сайта антител (смотри Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции такие, как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

В результате расщепления антител папаином получается два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим сайтом, и остаточный «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Обработка пепсином дает F(ab')²-фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих сайта и по-прежнему способен перекрестно связываться с антигеном.

«Fv» представляет минимальный фрагмент антитела, который включает полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Данный участок состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в близкой, нековалентной связи. Он находится в такой конфигурации, что три гипервариабельных участка каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. Совместно шесть гипервариабельных участков придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три гипервариабельных участка, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя, с меньшей аффинностью, чем связывающий сайт целиком.

Fab-фрагмент также включает константный домен легкой цепи и первый константный домен (CHI) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CHI тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. В данном случае Fab'-SH является обозначением Fab', в котором цистеиновый остаток(и) константных доменов имеет по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. Fab'Z-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пары Fab'-фрагментов, которые имеют между ними шарнирные цистеины. Известны также другие химические связи фрагментов антитела.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) позвоночных можно приписать к одному из двух четко различаемых типов, названных каппа и лямбда, на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, антитела можно причислить к различным классам. Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называют соответственно альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Предпочтительно константные домены тяжелой цепи будут включать гамма-1, гамма-2, гамма-3 и гамма-4 константные области. Предпочтительно, чтобы данные константные домены также включали модификации для повышения стабильности антитела такие, как Р- и Е-модификация, раскрытые в патенте США №6011138, включенном здесь полностью путем ссылки. Хорошо известны структуры субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антитела включают домены VH и VL антитела, где данные домены находятся в одной полипептидной цепи. Предпочтительно, чтобы полипептид Fv дополнительно включал полипептидный линкер между доменами VH и VL, который способствует scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор по scFv смотри у Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты образуют вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом (VL) легкой цепи в одной полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который является слишком коротким для объединения двух доменов в одной цепи, домены принуждают к конъюгации с комплементарными доменами другой цепи и созданию двух антигенсвязывающих сайтов. Более полно диатела описаны, например, в Европейском патенте 404097; WO 93/11161 и у Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Термин «моноклональное антитело», в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу, полученному из популяции в основном гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются одинаковыми, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут находиться в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, будучи направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность обычным (поликлональным) препаратам антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты в антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они синтезируются гибридомной культурой, незагрязненной другими иммуноглобулинами. Определение «моноклональное» обозначает характер антитела, полученного в основном из гомогенной популяции антител, и не ограничивается необходимостью получения антитела определенным методом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (смотри, например, патент США №4816567). «Моноклональные антитела» также можно выделить из фаговых библиотек антител с использованием методик, описанных, например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

В данном случае моноклональные антитела особо включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых участок тяжелой и/или легкой цепи является идентичным с или гомологичным соответствующим последовательностям в антителах, полученных от определенных видов или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепей является идентичным с или гомологичным соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагментов таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США №4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). В данном случае интересующие химерные антитела включают «приматизированные» антитела, содержащие последовательности антигенсвязывающего вариабельного домена, полученные от приматов, не относящихся к человеку (например, низших узконосых обезьян, Аре и т.д.), и последовательности человеческих константных областей.

«Гуманизированные» формы отличных от человеческих (например, мышиных) антител являются химерными антителами, которые включают минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В основном, гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельного участка реципиента замещены остатками из гипервариабельного участка, отличных от человеческих видов (донорное антитело) таких, как мышь, крыса, кролик и примат, не относящийся к человеку, обладающих желаемой специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина замещаются соответствующими, отличными от человеческих, остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Данные модификации проводят для дополнительного совершенствования функциональной активности антитела. В основном, гуманизированное антитело будет включать, главным образом, все по меньшей мере из одного и, обычно, двух вариабельных доменов, в которых все, или в основном все, из гипервариабельных петлей соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все, или в основном все, FR являются таковыми с последовательностью человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также необязательно будет включать по меньшей мере участок константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно таковой человеческого иммуноглобулина. Дополнительные подробности смотри у Jones et al., Nature 32 1:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Термин «гипервариабельный участок» в том смысле, в котором он здесь используется, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок включает аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)), и/или таковые остатки из «гипервариабельный петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). «Каркасными» или «FR» остатками являются остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка, определенного здесь.

Антагонист, «который связывается» с интересующим антигеном, например, поверхностным маркером В-клеток, представляет таковой, способный связываться с этим антигеном с достаточной аффинностью, чтобы антагонист был пригодным в качестве терапевтического средства для направленного воздействия на клетку, т.е. В-клетку, экспрессирующую антиген.

В данном случае «антитело против CD» представляет антитело, которое специфично связывается с антигеном CD20, предпочтительно человеческим CD20, обладающее заметной элиминирующей В-клетки активностью, предпочтительно обладающее по меньшей мере примерно 10% активности ритуксана^® элиминировать В-клетки (смотри патент США №5736137, включенный здесь полностью путем ссылки) при введении в таком же количестве и условиях, как и ритуксан^®.

В данном случае «антитело против CD22» представляет антитело, которое специфично связывается с антигеном CD22, предпочтительно человеческим CD22, обладающее заметной элиминирующей В-клетки активностью, предпочтительно обладающее по меньшей мере примерно 10% активности ритуксана^® элиминировать В-клетки (смотри патент США №5736137, включенный здесь полностью путем ссылки) при введении в таком же количестве и условиях, как и ритуксан^®.

В данном случае «антитело против CD19» представляет антитело, которое специфично связывается с антигеном CD19, предпочтительно человеческим CD19, обладающее заметной элиминирующей В-клетки активностью, предпочтительно обладающее по меньшей мере примерно 10% активности ритуксана^® элиминировать В-клетки (смотри патент США №5736137, включенный здесь полностью путем ссылки) при введении в таком же количестве и условиях, как и ритуксан^®.

В данном случае «антитело против CD23» представляет антитело, которое специфично связывается с антигеном CD23, предпочтительно человеческим CD23, обладающее заметной элиминирующей В-клетки активностью, предпочтительно обладающее по меньшей мере примерно 10% активности ритуксана^® элиминировать В-клетки (смотри патент США №5736137, включенный здесь полностью путем ссылки) при введении в таком же количестве и условиях, как и ритуксан^®.

В данном случае «антитело против CD37» представляет антитело, которое специфично связывается с антигеном CD37, предпочтительно человеческим CD37, обладающее заметной элиминирующей В-клетки активностью, предпочтительно обладающее по меньшей мере примерно 10% активности ритуксана^® элиминировать В-клетки (смотри патент США №5736137, включенный здесь полностью путем ссылки) при введении в таком же количестве и условиях, как и ритуксан^®.

В данном случае «антитело против В7» представляет антитело, которое специфично связывается с В7.1, В7.2 или В7.3, наиболее предпочтительно человеческим В7.1. Предпочтительно данное антитело будет специфично ингибировать взаимодействия В7/CD28 и более предпочтительно ингибировать взаимодействия В7.1/CD28 и не будет в основном ингибировать взаимодействия В7/CTLA-4. Еще более предпочтительно антитело против В7.1 будет одним из специфичных антител, описанных в патенте США №6113898, включенным здесь полностью путем ссылки.

«Антитело против CD40L» представляет антитело, которое специфично связывается с CD40L (также известным, как CD154, gp39, ТВАМ), предпочтительно таковым, обладающим агонистической активностью. Предпочтительное антитело против CD40L представляет таковое, обладающее специфичностью гуманизированного антитела, раскрытого в патенте США №6011358 (принадлежащем IDEC Pharmaceuticals Corporation), включенном здесь полностью путем ссылки.

«Антитело против CD4» представляет таковое, которое специфично связывается с СD4, предпочтительно человеческим CD4, более предпочтительно приматизированным или гуманизированным антителом против CD4, предпочтительно человеческим гамма 4 анти-человеческий CD4-антителом.

«Антитело против CD40» представляет таковое, которое специфично связывается с СD40, предпочтительно человеческим CD40, такие, как раскрытые в патентах США №5874085, 5874082, 5801227, 5674442 и 5667165, которые все включены здесь путем ссылки.

Предпочтительно, чтобы элиминирующее В-клетки антитело и иммунорегуляторное антитело включали человеческие константные домены. Подходящие антитела могут включать изотипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Конкретные примеры антител, которые связываются с антигеном CD20, включают: «ритуксимаб» (ритуксан^®) (патент США №5736137, специально включенный здесь путем ссылки); меченное иттрием [90]-2В8 мышиное антитело «Y2B8» (патент США №5736137, специально включенный здесь путем ссылки); мышиное IgG2a «В1», необязательно меченное 131I антитело (бексар™) (патент США №5595721, специально включенный здесь путем ссылки); мышиное моноклональное антитело «1F5» (Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987) и «химерное 2Н7» антитело (патент США №5677180, специально включенный здесь путем ссылки).

Конкретные примеры антител, которые связываются с CD22, включают лимфоцид™, о котором сообщали Immunomedics, находящийся в настоящее время на стадии клинических испытаний для лечения не-ходжкинской лимфомы. Примеры антител, которые связываются с антигеном В7, включают антитело В7, о котором сообщается в патенте США №5885577, опубликованном Linsley et al., антитело против В7, о котором сообщается в патенте США №5869050, опубликованном DeBoer et al. и принадлежащем Chiron Corporation и приматизированное^® антитело против В7.1 (CD80), раскрытое в патенте США №6113198, Anderson et al., которые все включены здесь полностью путем ссылки.

Предпочтительные примеры антител, которые связываются с CD23, включают приматизированные^® антитела, специфичные к человеческому CD23, о которых сообщали Reff et al. в патенте США №6011138, опубликованном 4 июля 1999 г., принадлежащем совместно IDEC Pharmaceuticals Corp. и Seikakagu Corporation (Япония). Другие антитела против CD23 и фрагменты антител включают таковые, о которых сообщали Bonnefoy et al., No. 96 12741; Rector et al., J. Immunol. 55:481-488 (1985); Flores-Rumeo et al. Science 241:1038-1046 (1993); Sherr et al. J. Immunol., 142:481-489 (1989) и Pene et al., PNAS, USA 85:6820-6824 (1988). Имеются сообщения, что подобные антитела пригодны для лечения аллергии, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний.

В данном случае термины «ретуксимаб» или «ритуксан^®» относятся к генно-инженерному химерному мышиному/человеческому моноклональному антителу, направленному против антигена CD20 и обозначенному «C2В8» в патенте США №5736137, специально включенном здесь путем ссылки. Антитело представляет IgGI каппа иммуноглобулин, включающий мышиные последовательности вариабельной области легкой и тяжелой цепей и человеческие последовательности константной области. Ритуксимаб обладает аффинностью связывания в отношении антигена CD20, равной примерно 8,0 нМ.

«Выделенный» антагонист представляет таковой, который идентифицирован, отделен и/или выделен из компонента его естественной среды. Загрязняющие компоненты его естественной среды являются соединениями, которые будут мешать диагностическим или терапевтическим применениям антагониста, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворимые вещества. В предпочтительных воплощениях антагонист будет очищен (1) до более чем 95% по массе антагониста, что определяют по методу Лоури, и наиболее предпочтительно до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков с N-конца или из внутренней аминокислотной последовательности при использовании вращательного секвенатора или (3) гомогенности по SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или предпочтительно серебром. Выделенный антагонист включает антагонист in situ внутри рекомбинантных клеток, если не будет присутствовать, по меньшей мере, один компонент естественного окружения антагониста. Однако обычно выделенный антагонист получают с использованием, по меньшей мере, одной стадии очистки.

«Млекопитающее» для целей лечения относится к животному, относящемуся к млекопитающему, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных и зоопарковых, спортивных или домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее является человеком.

«Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мероприятиям. Нуждающиеся в лечении включают индивидуумов уже с имеющимся заболеванием или нарушением, а также индивидуумов, у которых заболевание или нарушение следует предупредить. Следовательно, у млекопитающего может быть уже поставлен диагноз заболевания или нарушения, или оно может быть предрасположено или восприимчиво к заболеванию.

Выражение «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антагониста, которое эффективно для профилактики, ослабления или лечения интересующего аутоиммунного заболевания.

Термин «иммуносупрессорное средство» в том смысле, в котором он здесь используется для дополнительной терапии, относится к соединениям, которые подавляют или маскируют иммунную систему млекопитающего, которое подвергается лечению. Оно включает соединения, которые подавляют продукцию цитокина, снижают или подавляют экспрессию аутоантигена или маскируют антигены МНС. Примеры таких средств включают 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (смотри патент США №4665077, раскрытие которого включено здесь путем ссылки), азатиоприн, циклофосфамид, бромкриптин; даназол; дапзон; глутаровый альдегид (который маскирует антигены MHC, как описано в патенте США №4120649); антиидиотипические антитела к антигенам МНС и фрагментам МНС; циклоспорин А, стероиды, такие как глюкокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон; антагонисты цитокина или рецепторов цитоксина, включая антитела против интерферона-α, β- или δ-, антитела против фактора некроза опухолей-α-, антитела против фактора некроза опухолей-β-, антитела против интерлейкина-2 и антитела против рецептора IL-2; антитела против LFA-1, включая антитела против CD11а и против CD18; антитела против L3T4; гетерологичный анти-лимфоцитарный глобулин; пан-Т-антитела, предпочтительно антитела против CD3 или против CD4/CD4а; растворимый пептид, включающий связывающий домен LFA-3 (WO 90/08187, опубликованная 7/26/90), стрептоланаза; TGF-β; стрептодорназа; РНК или ДНК от хозяина; FR506; RS-61443; дезоксиспергуанин; рапамицин; рецептор Т-клеток (Cohen et al., патент США №5114721); фрагменты рецепторов Т-клеток (Offner et al., Science, 251:430-432 (1991); WO 90/11294; laneway, Nature, 341:482 (1989) и WO 91/01133) и антитела к рецепторам Т-клеток (Европейский патент 340109) такие, как Т10В9.

Термин «цитотоксический агент» в том смысле, в котором он здесь используется, относится к соединению, которое ингибирует или предупреждает функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин предназначен для включения радиоактивных изотопов (например, At211 1131 1125 Y9o Re 186 Re lg8 sM153 Bi212 p32 и радиоактивных изотопов Lu), химиотерапевтических средств и токсинов, таких как небольшие молекулы-токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты.

«Химиотерапевтическое средство» представляет химическое соединение, пригодное для лечения опухолей. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (цитоксан™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквуон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфаорамид и триметилоломеламин; производные азотистого иприта такие, как хиорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретамина окись гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики такие, как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, мукофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зоробицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов такие, как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиоруанин; аналоги пиримидинов такие, как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, карморфур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-ФУ; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антагонисты надпочечников такие, как аминоглютетимид, митотан, трилостан; аналоги фолиевой кислоты, такие как фролиниковая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихинон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; этоглуцид; галлия нитрат; оксимочевина лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK^®; разоксан; сизофиран, спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазихинон; 2,2′,2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (таксол^®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доксетаксел (таксотер, Rh-Poulenc Rorer, Antony, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанного. Также в это определение включены антигормональные средства, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли такие, как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-окситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, льюпролид и гозерелин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанного.

Термин «цитокин» представляет родовой термин для белков, выделяемых одной клеточной популяцией, которые действуют на другие клетки в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные полипептидные гормоны. В цитокины входит гормон роста такой, как человеческий гормон роста; N-метионил человеческий гормон роста и бычий гормон роста; гормон паращитовидной железы; инсулин; проинсулин; релакеин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреостимулирующий гормон (ТСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ); печеночный фактор роста; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; α- и β-фактор некроза опухолей; ингибирующее мюллерии вещество; мышиный связанный с гонадотропином пептид; инхибин; активин; васкулярный эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (ТПО); факторы роста нервов такие, как NGF-13; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие рост факторы (TGF) такие, как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор-I и -II роста; эритропоэтин (ЭПО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF) такие, как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитомакрофагальный-CSF (GM-CSF) и гранулоцитарный-CSF (G-CSF); интерлейкины (IL) такие, как IL-1, IL-1а, IL-2, IL-g, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; фактор некроза опухолей такой, как TNF-α или TNF-β и другие полипептидные факторы, включая LIF и кит-лиганд (KL). Как здесь использовано, термин цитокин включает белки из естественных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты естественных последовательностей цитокинов.

Термин «пролекарство» в том смысле, в котором он здесь используется, относится к предшественнику или производному фармацевтически активного вещества, которое является менее цитотоксическим в отношении опухолевых клеток по сравнению с исходным препаратом, и которое способно ферментативно активироваться или превращаться в более активную исходную форму. Смотри, например, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, pp. 374-382, 615^th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по данному изобретению включают, но не ограничиваются фосфатсодержащими пролекарствами, тиофосфатсодержащими пролекарствами, сульфатсодержащими пролекарствами, пептидсодержащими пролекарствами, модифицированными D-аминокислотными пролекарствами, гликозилированными пролекарствами, β-лактамсодержащими пролекарствами, необязательно замещенными феноксиацетамидсодержащими пролекарствами или необязательно замещенными фенилацетамидсодержащими пролекарствами, 5-фторцитозином иди другими 5-фторуридиновыми пролекарствами, которые могут превращаться в более активные цитотоксические препараты. Примеры цитотоксических препаратов, которые можно превратить в пролекарство для применения по данному изобретению, включают, но не ограничиваются химиотерапевтическими средствами, описанными выше.

«Липосома» представляет небольшую везикулу, состоящую из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которая используется для доставки препарата (такого, как антагонисты, раскрытые здесь, и необязательно химиотерапевтического средства) млекопитающему. Компоненты липосомы обычно расположены бислоем, подобно расположению липидов в биологических мембранах.

Термин «упаковочный вкладыш», используемый здесь, относится к инструкциям, обычно включаемым в промышленно доступные упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

II. Получение антител

В способах и предметах производства по настоящему изобретению используют или включают антитело, которое обладает иммунорегуляторной активностью, например, антитело против В7, против CD40L или против CD40, и антитело, которое связывается с поверхностным маркером В-клеток, обладающее активностью элиминировать В-клетки. Следовательно, здесь будут описаны способы получения таких антител.

Молекула, которая используется для получения или скрининга антигена(ов), может быть, например, растворимой формой антигена или его частью, содержащей желаемый эпитоп. Альтернативно или дополнительно можно использовать клетки, экспрессирующие антиген на их клеточной поверхности, или подвергнуть скринингу на антагонист(ы). Очевидно, специалистам в данной области известны другие формы поверхностного маркера В-клеток, пригодные для получения антагонистов. Подходящие источники антигенов для антигена CD40L, CD40, CD19, CD20, CD22, CD23, CD37 и В7 (В7.1 или В7.2) для получения антител по изобретению хорошо известны.

Предпочтительно, чтобы антитело CD40L или антитело против CD40L было гуманизированным антителом против CD40L, раскрытым в патенте США №6001358, опубликованном 14 июля 1999 г. и принадлежащем IDEC Pharmaceuticals Corporation.

Несмотря на то, что предпочтительным антагонистом CD40L является антитело, в данном случае рассматриваются другие антагонисты, чем антитела. Например, антагонист может включать растворимый CD40, слитый белок CD40 или небольшую молекулу-антагонист, необязательно слитую с или конъюгированную с цитотоксическим агентом (таким, как здесь описаны). В данном случае можно подвергнуть скринингу библиотеки небольших молекул против интересующего поверхностного маркера В-клеток для того, чтобы идентифицировать небольшую молекулу, которая связывается с данным антигеном. Небольшие молекулы дополнительно можно подвергнуть скринингу на антагонистические свойства и/или конъюгировать с цитотоксическим агентом.

Антагонистом может быть также пептид, полученный при рациональном конструировании или воспроизведении в фаге, например (WO 98/35036, опубликованная 13 августа 1998 г.). В одном воплощении молекула выбора может быть «мимическим CDR» или, например, аналогом антитела, сконструированным на основе CDR антитела. Несмотря на то, что пептид может быть сам по себе антагонистическим, пептид можно необязательно слить с цитотоксическим агентом или Fc-областью иммуноглобулина (например, для придания пептиду ADCC и/или CDC активности).

Описание последует в виде примерных способов получения антител-антагонистов, используемых по настоящему изобретению.

(i) Поликлональные антитела

Предпочтительно поликлональные антитела получают у животных при многократных подкожных (п/к) или внутрибрюшных (в/б) введениях соответствующего антигена и адъюванта. Может быть полезным конъюгировать соответствующий антиген с белком, который является иммуногенным для видов, которые подвергаются иммунизации, например, гемоцианином, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или ингибитором соевого трипсина с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидного эфира (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (конъюгация через остатки лизина), глутарового альдегида, янтарного ангидрида, SOC l₂ или R¹N=C=NR, где R и R¹ представляют различные алкильные группы.

Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных при сочетании, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюганта (соответственно для кроликов или мышей) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и введении раствора внутрикожно в несколько мест. Через один месяц животным проводят бустер-иммунизацию с 1/5-1/10 от первоначального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда подкожным введением в несколько мест. Через 7-14 суток у животных отбирают кровь и в сыворотке крови определяют титр антител. Животным проводят бустер-иммунизацию, пока значение титра будет оставаться неизменным. Предпочтительно проводить бустер-иммунизацию животного конъюгатом одного и того же антигена, но конъюгированным с другим белком и/или с помощью другого перекрестносшивающего реагента. Конъюгаты также можно получить в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Также выгодно использовать агрегирующие агенты, такие как квасцы, для усиления иммунного ответа.

ii) Моноклональные антитела

Моноклональные антитела получают из популяции в основном гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются одинаковыми за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Таким образом, определение «моноклональное» указывает на характер антитела, находящегося не в виде смеси различных антител.

Например, моноклональные антитела можно получить с использованием гибридомного метода, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или можно получить методами рекомбинантной ДНК (патент США №4816567).

В гибридомном методе мышь или другое соответствующее животное-хозяин такое, как хомяк, иммунизируют, как здесь описано выше, для выявления лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфично связываются с белком, использованным для иммунизации. Альтернативно лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты подвергают слиянию с клетками миеломы с использованием подходящего агента для слияния такого, как полиэтиленгликоль, с получением гибридомных клеток (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более соединений, которые ингибируют рост или выживание неслитых, исходных миеломных клеток. Например, если в исходных миеломных клетках отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), кульуральная среда для гибридом обычно будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), эти соединения препятствуют росту HGPRT-дефицитных клеток.

Предпочтительно миеломными клетками являются таковые, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную высокую продукцию антитела отобранными антителообразующими клетками и чувствительны к среде такой, как среда НАТ. Среди них предпочтительными линиями миеломных клеток являются линии мышиных миелом такие, как полученные из мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11 от Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, США, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653 от American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, США. Для получения человеческих моноклональных антител были также описаны линии человеческих миеломных и мышиных-человеческих гетеромиеломных клеток (Kozbor, J. Immunol., 133:300 1 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду, в которой растут гибридомные клетки, тестируют на продукцию моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно определяют специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, иммунопреципитацией или в тесте связывания in vitro, таком как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определить тестом 30 Scatchard, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать ограничивающим разведением и выращивают обычными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие культуральные среды для этой цели включают, например, среду D-MEM или RPML-1640. Кроме того, гибридомные клетки можно вырастить in vivo в виде асцитных опухолей у животного.

Моноклональные антитела, секретированные субклонами, соответственно выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки обычными методами очистки иммуноглобулинов, такими как хроматографии на белок А-Сефарозе, гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать с использованием обычных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Гибридомные клетки служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК можно поместить в экспрессирующие векторы, которые затем трансфектируют в клетки-хозяева такие, как клетки E.coli, обезьяние клетки COS, клетки яичника китайского хомяка (СНО) или миеломные клетки, которые иначе не продуцируют белок-иммуноглобулин, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзоры по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

В дополнительном воплощении антитела или фрагменты антител можно выделить из фаговых библиотек антител, полученных методами, описанными McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описывают выделение соответственно мышиных и человеческих антител с использованием фаговых библиотек. В последующих публикациях было описано получение человеческих антител с высокой аффинностью (порядка нМ) перестановкой цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторным заражением и рекомбинацией in vivo в качестве стратегии для конструирования очень крупных фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, данные методы являются плодотворными альтернативами традиционному гибридомному методу получения моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

Также ДНК можно модифицировать, например, заменой кодирующей последовательности константных доменов человеческой тяжелой и легкой цепей вместо гомологичных мышиных последовательностей (патент США №4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851 (1984)) или ковалентным связыванием со всей кодирующей иммуноглобулин последовательностью или частью кодирующей последовательности полипептида, не являющегося иммуноглобулином.

Обычно такие полипептиды, не являющиеся иммуноглобулинами, заменяют константные домены антитела, или они заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела с получением химерного бивалентного антитела, включающего один антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.

iii) Гуманизированные антитела

В данной области описаны способы гуманизирования отличных от человеческих антител. Предпочтительно гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеческим. Данные, отличные от человеческих, аминокислотные остатки часто относят к «заимствованным» остаткам, которые обычно взяты из «заимствованного» вариабельного домена. Гуманизирование в основном можно проводить, следуя способу Winter и соавторов (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), заменой последовательностями гипервариабельного участка соответствующих последовательностей человеческого антитела. Следовательно, такие «гуманизированные» антитела являются химерными антителами (патент США №4816567), в которых в основном меньше, чем интактный человеческий вариабельный домен замещен соответствующей последовательностью отличных от человеческих видов. На практике гуманизированные антитела обычно представляют человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка и, возможно, некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов.

Выбор человеческих вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепей, которые следует использовать при получении гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности. По так называемому «наиболее соответствующему» методу последовательность вариабельного домена антитела грызунов подвергается скринингу против целой библиотеки известных последовательностей человеческих вариабельных доменов. Человеческая последовательность, которая наиболее близка к таковой у грызуна, затем принимается в качестве человеческой каркасной области (FR) для гуманизированного антитела (Suns et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В другом методе используется конкретная каркасная область, полученная из согласованной последовательности всех человеческих антител определенной подгруппы легкой или тяжелой цепей. Ту же каркасную область можно использовать для нескольких других гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Также является важным, что антитела гуманизируют с сохранением высокой аффинности в отношении антигена и других полезных биологических свойств. Для достижения данной цели по предпочтительному способу гуманизированные антитела получают анализом исходных последовательностей и различных виртуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходной и гуманизированной последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются доступными и известны специалистам в данной области. Имеются компьютерные программы, которые показывают и воспроизводят возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Проверка данных воспроизведений позволяет проанализировать возможную роль остатков в функционировании последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов, особенно проанализировать остатки, которые оказывают влияние на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с его антигеном. Данным методом можно выбрать остатки FR и объединить с реципиентной и важной последовательностями так, чтобы достичь желаемого свойства антитела, такого как повышенная аффинность в отношении мишеневого антигена(ов). В основном остатки гипервариабельного участка непосредственно и в наиболее значительной степени участвуют во влиянии на связывание с антигеном.

iv) Человеческие антитела

В качестве альтернативы гуманизированию можно получить человеческие антитела. Например, в настоящее время возможно получение трансгенных животных (например, мышей), которые способны при иммунизации продуцировать полный набор человеческих антител при отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена связывающей области тяжелой цепи антитела (РН) у химерных и линейных мутантных мышей приводит к полному подавлению продукции эндогенных антител. Перенос гена человеческого зародышевого иммуноглобулина в такую зародышевую линию мутантных мышей приведет к продукции человеческих антител при введении антигена. Смотри, например, Jakobovits et al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362-255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in immuno., 7:33 (1993) и патенты США №5591669, 5589369 и 5545807.

Альтернативно можно использовать технологию воспроизведения в фаге (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из набора генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина от неиммунузированных доноров. По данному способу гены V-домена антитела клонируют в ген основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как М13 или fd, и располагают в виде функциональных фрагментов антител на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитевидная частица содержит одноцепочечную копию ДНК генома фага, отборы, основанные на функциональных свойствах антитела, также будут приводить к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющего данные свойства. Таким образом, фаг подражает некоторым свойствам В-клеток. Воспроизведение в фаге можно осуществлять в различных форматах, обзор по ним смотри, например, у Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Можно использовать несколько источников сегментов V-гена для воспроизведения в фаге. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили разнообразный спектр антител против оксазолона из небольшой производной комбинаторной библиотеки V-генов, полученных из селезенки иммунизированных мышей. Можно сконструировать целый спектр V-генов из неиммунизированных человеческих доноров и выделить антитела к разнообразному спектру антигенов (включая аутоантигены), в основном следуя методам, описанным Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Также смотри патенты США №5565332 и 5573905.

Человеческие антитела могут также быть генерированы in vitro активированными В-клетками (смотри патенты США №5567610 и 5229275).

v) Фрагменты антител

Разработаны различные методы получения фрагментов антител. Обычно данные фрагменты получают протеолитическим расщеплением интактных антител (смотри, например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако в настоящее время данные фрагменты можно получить непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител можно выделить из фаговых библиотек антител, обсужденных выше. Альтернативно Fab'-SH-фрагменты можно непосредственно выделить из E.coli и химически соединить с получением F(ab')2-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Используя другой подход F(ab')2-фрагменты, можно непосредственно выделить из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Очевидно, специалистам в данной области известны другие методы получения фрагментов антител. В других воплощениях антителом выбора является Fv-фрагмент с одной цепью (scFv). Смотри WO 93/16185; патент США №5571894 и патент США №5587458. Фрагмент антитела может также быть «линейным антителом», как описано, например, в патенте США №5641870. Подобные линейные фрагменты антител могут быть моноспецифичными или биспецифичными.

vi) Биспецифичные антитела

Биспецифичные антитела представляют антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении, по меньшей мере, двух различных эпитопов. Примерные биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами поверхностного маркера В-клеток. Другие такие антитела могут связываться с первым маркером В-клеток и дополнительно связываться со вторым поверхностным маркером В-клеток. Альтернативно связывающее плечо маркера анти-В-клеток может быть соединено с плечом, которое связывается со стимулирующей молекулой на лейкоците, такой как молекула рецептора Т-клеток (например, CD2 или CD3) или Fc-рецепторы для IgG (FcR) такие, как FcRI (CD64), FcRII (CD32) и FcRIII (CD16) для того, чтобы сосредоточить клеточные защитные механизмы на В-клетках. Биспецифичные антитела также можно использовать для локализации цитотоксических средств на В-клетках. Данные антитела обладают связывающим плечом для маркера В-клеток и плечом, которое связывается с цитотоксическим средством (например, сапорином, анти-интерфероном-α, винка алкалоидом, цепью рицина А, метотрексатом или меченным радиоактивным изотопом гаптеном). Биспецифичные антитела можно получить в виде антител с полной длиной или фрагментов антител (например, F(ab)2 биспецифичные антитела).

Способы получения биспецифичных антител известны в данной области. Обычное получение биспецифичных антител с полной длиной основано на соэкспрессии двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулинов, где две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). В результате произвольного выбора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов данные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно проводят аффинной хроматографией, является довольно громоздкой, а выход продукта - низким. Подобные методы раскрыты в WO 93/08829 и у Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)).

Используя другой подход, вариабельные домены антител с желаемой специфичностью связывания (сайты соединения антитела-антигена) подвергают слиянию с последовательностями константного домена иммуноглобулинов. Слитый белок предпочтительно с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулинов, включающим по меньшей мере часть шарнирной области, области СН2 и СН3. Предпочтительно иметь первую константную область тяжелой цепи (CHI), содержащую сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, находящуюся по меньшей мере в одном из слитых белков. ДНК, кодирующие слитые белки тяжелой цепи иммуноглобулинов и, если желательно, легкой цепи, вставляют в разные экспрессирующие векторы и совместно трансфектируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает высокую гибкость при установке взаимозависимых участков трех полипептидных фрагментов в воплощениях, когда используются неравные соотношения трех полипептидных цепей в конструкции с оптимальным выходом. Однако, возможно вставить кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высокому выходу, или когда соотношения не имеют особого значения.

В предпочтительном воплощении данного подхода биспецифичные антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулинов с первой специфичностью связывания в одном плече и гибридной пары тяжелой цепи - легкой цепи иммуноглобулинов (обеспечивая вторую специфичность связывания) в другом плече. Было установлено, что данная асимметричная структура облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку наличие легкой цепи иммуноглобулинов только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь отделения. Данный подход раскрыт в WO 94/04690. Дополнительные подробности по получению биспецифичных антител смотри, например, у Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

С использованием другого подхода, описанного в патенте США №5731168, поверхность раздела между парой молекул антител можно сконструировать с максимальным увеличением процента гетеродимеров, которые выделяют из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела включает, по меньшей мере, часть домена СН3 константного домена антитела. В данном способе одна или более небольших аминокислотных боковых цепей из поверхности раздела первой молекулы антитела замещают более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). На поверхности раздела второй молекулы антитела создают компенсаторные «полости», одинаковые или соответствующие по размеру крупным боковым цепям, заменой крупных аминокислотных боковых цепей на меньшие (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифичные антитела включают перекрестносшитые или «гетероконъюгатные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате можно соединить с авидином, другое с биотином. Например, такие антитела были предложены для целенаправленного воздействия на клетки иммунной системы в отличие от нежелательных клеток (патент США №4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и Европейский патент 03089). Гетероконъюгатные антитела можно получить с использованием любых обычных методов перекрестного сшивания. Подходящие перекрестносшивающие агенты хорошо известны в данной области и раскрыты в патенте США №4676980, наряду с рядом методов перекрестного сшивания.

Способы получения биспецифичных антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифичные антитела можно получить с использованием химической связи. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описывают метод, в котором интактные антитела протеолитически расщепляют с получением F(ab')2-фрагментов. Данные фрагменты восстанавливают в присутствии дитиолового комплексообразующего агента на основе арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предупреждения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные F(ab')2-фрагменты затем превращают в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из производных F(ab')-TNB вновь превращают в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного F(ab')-TNB с образованием биспецифического антитела. Полученные биспецифичные антитела можно использовать в качестве агентов для избирательной иммобилизации ферментов.

Недавно достигнутый прогресс способствовал непосредственному выделению Fab'-SH-фрагментов из E.coli, которые можно было соединить химически с образованием биспецифичных антител. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) описывают получение F(ab')2-молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент по отдельности секретировался из E.coli и подвергался непосредственному химическому соединению in vitro с образованием биспецифического антитела. Образованное таким образом биспецифическое антитело было способным связываться с клетками с гиперэкспрессией рецептора ErbB2 и нормальными человеческими Т-клетками, а также стимулировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов против клеток-мишеней опухоли молочной железы человека.

Также описаны различные методы получения и выделения фрагментов биспецифичных антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифичные антитела получали с использованием лейциновой «застежки-молнии». Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Лейциновые пептиды-«застежки-молнии» из белков Fos и Jun соединяли с Fab'-участками двух различных антител слиянием генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с образованием мономеров и затем вновь окисляли с образованием гетеродимеров антител. Данный способ можно также использовать для получения гомодимеров антител. Технология получения «диатела», описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечивала альтернативный механизм получения фрагментов биспецифического антитела. Фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) с помощью линкера, который является слишком коротким, чтобы произошло соединение между двумя доменами в одной и той же цепи. Следовательно, домены V_H и V_L одного фрагмента вынуждены конъюгировать с комплементарными доменами V_L и V_H другого фрагмента, тем самым образуя два антигенсвязывающих сайта. Сообщалось о другой стратегии получения фрагментов биспецифичных антител при использовании димеров с одной цепью Fv (sFv). Смотри Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Предполагаются антитела с более чем двумя валентностями. Например, можно получить триспецифичные антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

III. Конъюгаты и другие модификации антагониста

Антагонист, используемый в способах или включенный в предметы производства, необязательно конъюгируется с цитотоксическим средством.

Химиотерапевтические средства, пригодные для получения таких конъюгатов антагонист-цитотоксическое средство, описаны выше.

В данном случае также рассматриваются конъюгаты антагониста и одной или более небольших молекул токсинов, таких как калихеамицин, маитанзин (патент США №5208020), трихотен и СС1065. В одном предпочтительном воплощении изобретения антагонист конъюгируют с одной или более молекул маитанзина (например, примерно от 1 до 10 молекул маитанзина на молекулу антагониста). Маитанзин можно, например, превратить в May SS-Me, который можно восстановить до May-SH3 и подвергнуть взаимодействию с модифицированным антагонистом (Charm et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)) с получением конъюгата маитанзиноид-антагонист.

Альтернативно антагонист конъюгируют с одной или более молекул калихеамицина. Семейство антибиотиков калихеамицинов способно вызывать разрывы двухцепочной ДНК в субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-ацетил-γ₁ ^I, PSAG и O₁ ^I (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993) и Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)).

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеккина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор момордиса харантиа, курцин, кротин, ингибитор сапаонариа оффициналис, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Смотри, например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает антагонист, конъюгированный с соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой такой, как дезоксирибонуклеаза; DNaза).

Доступными являются различные радиоактивные изотопы для получения радиоконъюгированных антагонистов. Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, RE¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu.

Конъюгаты антагониста и цитотоксического средства можно получить с использованием различных бифункциональных агентов для сочетания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие, как диметиладипимидат HCL), активные эфиры (такие, как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие, как глутаровый альдегид), бис-азидо-соединения (такие, как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие, как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие, как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фтористые соединения (такие, как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, можно приготовить иммунотоксин рицин, как описано Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом 14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МХ-DTPA) представляет пример хелатообразующего агента для конъюгации радиоизотопа с антагонистом. Смотри WO 94/11026. Линкер может быть «отщепляемым линкером», способствующим высвобождению цитотоксического препарата в клетке. Например, можно использовать неустойчивый к кислоте линкер, чувствительный к пептидазе линкер, диметил-содержащий или дисульфид-содержащий линкер (Charm et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)).

Альтернативно можно получить слитый белок, включающий антагонист и цитотоксическое средство, например, рекомбинантными методами или синтезом пептидов.

В еще одном воплощении антагонист можно конъюгировать с «рецептором» (таким, как стрептавидин) для применения в целях предварительного целенаправленного воздействия на опухоль, где конъюгат антагонист-рецептор вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровообращения с использованием выводящего агента и затем введением «лиганда» (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим агентом (например, радиоизотопом).

Антагонисты по настоящему изобретению также можно конъюгировать с ферментом, активирующим пролекарство, который превращает пролекарство (например, пептидиловое химиотерапевтическое средство, смотри WO 81/01145) в активное противоопухолевое средство. Смотри, например, WO 88/07378 и патент США №4975278.

Ферментный компонент таких конъюгатов включает любой фермент, способный воздействовать на пролекарство таким образом, чтобы превратить его в более активную, цитотоксическую форму.

Ферменты, которые являются пригодными в способе по данному изобретению, включают, но не ограничиваются щелочной фосфатазой, пригодной для превращения фосфат-содержащих пролекарств в свободные препараты; арилсульфатазой, пригодной для превращения сульфат-содержащих пролекарств в свободные препараты; цитозиндезаминазой, пригодной для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противоопухолевый препарат, фторурацил; протеазами, такими как внеклеточная протеиназа Serratia marcescens, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие, как катепсины В и L), которые пригодны для превращения пептид-содержащих пролекарств в свободные препараты; D-аланилкарбоксипептидазами, пригодными для превращения пролекарств, которые включают заместители D-аминокислоты; ферментами, расщепляющими углеводы такими, как 13-галактозидаза и нейраминидаза, пригодные для превращения гликозилированных пролекарств в свободные препараты; 13-лактамазой, пригодной для превращения препаратов, дериватизированых 13-лактамами, в свободные препараты, и пенициллинамидазами, такими как пенициллин-V-амидаза или пенициллин-G-амидаза, пригодными для превращения препаратов, дериватизированных по их аминным азотам соответственно феноксиацетильной или фенилацетильной группами, в свободные препараты. Альтернативно можно использовать антитела с ферментативной активностью, также известные в данной области, как «абзимы» для превращения пролекарств по изобретению в свободные активные препараты (смотри, например, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Конъюгаты антагонист-абзим можно получить, как здесь описано, для доставки абзима к популяции опухолевых клеток.

Ферменты можно ковалентно связать с антагонистом методами, хорошо известными в данной области, такими как использование гетеробифункциональных перекрестносшивающих реагентов, которые обсуждались выше. Альтернативно можно сконструировать слитые белки, включающие, по меньшей мере, антигенсвязывающую область антагониста по изобретению, связанного по меньшей мере с функционально активным участком фермента по изобретению с использованием методов рекомбинантной ДНК, хорошо известных в данной области (смотри, например, Neuberger et al., 312:604-608 (1984)).

В данном случае предусматриваются другие модификации антагониста. Например, антагонист можно связать с одним из различных небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

Антитела, раскрытые здесь, можно также включить в липосомы. Липосомы, содержащие антагонист, получают методами, известными в данной области, такими как описаны Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980): патенты США №4485045 и 4544545 и WO 97/38731, опубликованной 23 октября 1997 г. Липосомы с повышенным временем циркуляции раскрыты в патенте США №5013556.

Особенно пригодные липосомы можно получить методом обращенной фазы при выпаривании с липидным составом, включающим фосфатидилхолин, холестерин и дериватизированный ПЭГом фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ПЭ). Липосомы проталкивают через фильтры с определенным размером пор с получением липосом желаемого диаметра. Fab'-фрагменты антител по настоящему изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) посредством дисульфидной обменной реакции. Химиотерапевтическое средство необязательно находится внутри липосомы. Смотри Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989).

Предусматривается модификация(и) аминокислотной последовательности белковых или пептидных антагонистов, описанных здесь. Например, может быть желательным улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антагониста. Варианты аминокислотной последовательности получают введением соответствующих нуклеотидных заменов в нуклеиновую кислоту антагониста или синтезом пептидов. Подобные медификации включают, например, делеции из, и/или вставки в, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антагониста. Проводят любую комбинацию делеции, вставки и замены для получения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми свойствами. Замены аминокислот также могут изменить посттрансляционные процессы антагониста такие, как изменение числа или положения сайтов гликозилирования.

Пригодный метод для идентификации определенных остатков или областей антагониста, которые представляют предпочтительные местоположения для мутагенеза, называется «аланин сканирующий мутагенез», описанный Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). В данном случае идентифицируется остаток или группа мишеневых остатков (например, заряженные остатки такие, как arg, asp, his, lys и glu) и замещается нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для воздействия на взаимодействие аминокислот с антигеном. Данные местоположения аминокислот, показывающие функциональную чувствительность к заменам, затем обрабатывают введением дополнительных или других вариантов в или для сайтов замещения. Таким образом, несмотря на то, что сайт для введения вариации аминокислотной последовательности определяется заранее, природу мутаций per se не требуется определять заранее. Например, для анализа проведения мутации в данном сайте проводят аланин сканирующий или неспецифичный мутагенез в мишеневом кодоне или области, и экспрессированные варианты антагониста подвергают скринингу на желаемую активность.

Вставки в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксил-концевые слияния, находящиеся в пределах по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или многих аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антагонист с N-концевым метиониловым остатком или антагонист, слитый с цитотоксическим полипептидом. Другие варианты молекулы антагониста со вставками включают слияние с N- или С-концом антагониста фермента или полипептида, который повышает период полувыведения антагониста из сыворотки крови.

Другим типом варианта является вариант с аминокислотной заменой. Данные варианты имеют, по меньшей мере, один аминокислотный остаток в молекуле антагониста, замещенный другим остатком. Сайты наибольшего интереса для заместительного мутагенеза антител-антагонистов включают гипервариабельные участки, но также предусматриваются изменения FR. Консервативные замены представлены в таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Если такие замещения приводят к изменению биологической активности, тогда можно ввести более существенные замены, названные в таблице 1 «примерными заменами», или дополнительно описанные ниже в отношении классов аминокислот, и продукты подвергнуть скринингу.

Таблица 1
Первоначальный остаток	Примерные замены Предпочт. замены
Ala (А)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gin; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
GIn (Q	asn: glu	asn
Glu (E)	asp; gin	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gin; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucine	leu
Leu (L)	norleucine; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucine	leu

Существенные модификации биологических свойств антагониста проводят отборочными заменами, которые значительно различаются по их воздействию на сохранение (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в мишеневом сайте или (с) величины боковой цепи. Естественные остатки разделяют на группы, основываясь на общих свойствах боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;

(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;

(3) кислые: asp, glu;

(4) основные: asn, gln, his, lys, arg;

(5) остатки, которые оказывают влияние на ориентацию цепи: gly, pro или

(6) ароматические: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замещения вызывают замену члена одного из данных классов на другой класс.

Любой остаток цистеина, не участвующий в сохранении правильной конформации антагониста, также можно заместить, как правило, на серин для повышения стабильности молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. Напротив, цистеиновые связи можно ввести в антагонист для повышения стабильности (особенно, когда антагонист представляет фрагмент антитела такой, как Fv-фрагмент).

Особенно предпочтительным типом варианта с заменой является замена одного или более остатков гипервариабельного участка исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученные варианты, отобранные для дальнейшей разработки, будут обладать улучшенными биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом, из которого они получены. Удобным путем получения таких вариантов с замещением является аффинное созревание с использованием воспроизведения в фаге. Кратко, несколько сайтов гипервариабельного участка (например, сайты 6-7) мутируют для получения всех возможных замен аминокислот в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител помещают моновалентным образом из нитевидной фаговой частицы в виде слитых конструкций с продуктом гена III М13, упакованного внутри каждой частицы. Воспроизведенные в фаге варианты затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как здесь раскрыто. Для того чтобы идентифицировать сайты-кандидаты гипервариабельного участка для модификации, можно провести аланин сканирующий мутагенез идентифицированных остатков гипервариабельного участка, вносящего значительный вклад в связывание антигена. Альтернативно или в дополнение может быть полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и смежные остатки представляют кандидаты для замещения по методам, детально разработанным здесь. При получении таких вариантов, ряд вариантов подвергается скринингу, как здесь описано, и можно отобрать для дальнейшей разработки в одном или более соответствующем тесте антитела с наилучшими свойствами.

Другой тип аминокислотного варианта антагониста изменяет характер первоначального гликозилирования антагониста. Изменение означает делецию одной или более углеводных групп, обнаруженных в антагонисте, и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в антагонисте.

Гликозилирование полипептидов является обычно N-связанным или О-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарани-Х-треонин, где Х представляет любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к аспарагиновой боковой цепи. Таким образом, наличие любой из данных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт для гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к оксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также можно использовать 5-оксипролин или 5-оксилизин.

Добавление сайтов для гликозилирования к антагонисту обычно проводят изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит одну или более из вышеуказанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Изменение также можно осуществить добавлением или заменой одного или более остатков серина или треонина в последовательности исходного антагониста (для сайтов О-связанного гликозилирования).

Можно получить молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей варианты аминокислотной последовательности антагониста различными методами, известными в данной области. Данные методы включают, но не ограничиваются выделением из естественного источника (в случае естественных вариантов аминокислотной последовательности) или получением опосредуемым олигонуклеотидами (или сайт-направленным) мутагенезом, ПСР-мутагенезом и кассетным мутагенезом ранее полученного варианта или невариантной версии антагониста.

Может быть желательным модифицировать антитела по изобретению для улучшения эффекторной функции, например, для усиления антигензависимой опосредуемой клетками цитотоксичности (ADCC) и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) антагониста. Этого можно достичь введением одной и более замен аминокислот в Fc-область антитела-антагониста. Альтернативно или дополнительно можно ввести остаток(и) цистеина в Fc-область, тем самым позволяя образоваться дисульфидным связям между цепями в данной области. Полученное таким образом гомодимерное антитело обладает улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной опосредуемой комплементом киллерной для клеток функцией и антителозависимой цитотоксичностью (ADCC). Смотри Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes B., J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Можно также получить гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью с использованием гетеробифункциональных кросс-линкеров, как описано Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно можно сконструировать антитело, которое обладает двойными Fc-областями, и тем самым можно повысить способность к комплементарному лизису и ADCC. Смотри Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Для увеличения периода полувыведения антагониста из сыворотки крови можно включить сохраняющий связывающийся с рецептором эпитоп в антагонист (особенно фрагмент антитела), как описано, например, в патенте США №5739277. В том смысле, в котором он здесь используется, термин «сохраняющий связывающийся с рецептором эпитоп» относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (например, IgGI, IgG2, IgG3 или IgG4), которая ответственна за увеличение периода полувыведения молекулы IgG из сыворотки крови in vivo.

IV. Фармацевтические композиции

Терапевтические композиции, включающие антагонисты, используемые по настоящему изобретению, готовят для хранения смешиванием антагониста, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизованных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие, как октадецилдиметилбензиламмоний хлорид; гексаметоний хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки такие, как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины, хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара такие, как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества такие, как твин™, плуроникс™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Иммунорегуляторное антитело или фрагмент антитела и элиминирующее В-клетки антагонист-антитело могут быть в одной композиции или в различных композициях. Введение может быть совместным или последовательным и осуществляется в любом порядке. Введение можно проводить при повторных введениях обоих антител в течение продолжительного периода времени.

Примерные композиции с антителом против CD20 описаны в WO 98/56418, специально включенной здесь путем ссылки. В данной публикации описывается жидкая многодозовая композиция, включающая 40 мг/мл ритуксимаба, 25 мМ ацетата, 150 мМ трегалозы, 0,9% бензилового спирта, 0,02% полисорбата 20 при рН 5,0, которая имеет минимальный срок хранения в течение двух лет при хранении при 2-8°С. Другая интересующая композиция анти-CD20 включает 10 мг/мл ритуксимаба в 9,0 мг/мл хлориде натрия, 7,35 мг/мл цитрата натрия дигидрата, 0,7 мг/мл полисорбата-80 и стерильную воду для инъекций, рН 6,5.

Лиофилизованные композиции, адаптированные для подкожного введения, описаны в WO 97/04801. Такие лиофилизованные композиции можно восстановить подходящим разбавителем до высокой концентрации белка и восстановленную композицию можно вводить подкожно млекопитающему, которое подвергается лечению.

В данном случае композиция может также включать более чем одно активное соединение, если необходимо для особого указания для лечения, предпочтительно таковые с комплементарной активностью, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, может быть желательным дополнительно обеспечить химиотерапевтическим средством, цитокином или иммуносупрессором (например, таковым, который действует на Т-клетки, таким, как циклоспорин или антитело, которое связывается с Т-клетками, например, которое связывается с LFA-1). Эффективное количество подобных иных агентов зависит от количества антагониста, находящегося в композиции, типа заболевания или нарушения, или лечения и других факторов, которые обсуждались выше. Как правило, их используют в тех же дозах и при путях введения, как использовались до того или примерно от 1 до 99% от используемых доз.

Активные ингредиенты могут быть также включены в приготовленные микрокапсулы, например, с помощью 30 методов коацервации или межфазной полимеризацией, соответственно, например, в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина или микрокапсулы из поли(метилметацилата), в коллоидные системы для доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микрогранулы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Смотри методики, раскрытые в Remington's Pharmaceutical Science 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Можно приготовить препараты с непрерывным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с непрерывным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антагонист, данные матрицы находятся в виде имеющих определенную форму предметов, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с непрерывным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919, сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микрогранулы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и льюпролида ацетата) и поли-D-(-)-3-оксимасляную кислоту. Композиции, которые используют для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко выполнить фильтрованием через стерильные мембраны для фильтрования.

V. Лечение элиминирующим В-клетки антителом и иммунорегуляторным антителом

Готовят одну или более композиций, включающих элиминирующее В-клетки антитело и/или иммунорегуляторное антитело, дозируют и вводят путем, согласующимся с принятой медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают конкретное аутоиммунное заболевание или нарушение, которое подвергается лечению, конкретное млекопитающее, которое подвергается лечению, клиническое состояние отдельного пациента, течение заболевания или нарушения, место доставки средства, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Терапевтически эффективное количество антагониста для введения будет определяться данными соображениями.

Как отмечалось ранее, элиминирующее В-клетки антитело и иммунорегуляторное антитело могут быть в одной или различных композициях. Данные композиции антител можно вводить по отдельности или совместно, и в любом порядке. Предпочтительно элиминирующее В-клетки антитело, специфическое к антигену-мишени В-клеток, например, CD20, CD19, CD22, CD23 или CD37, будет вводиться отдельно от иммунорегуляторного антитела, например, антитела против СD40L или антитела против CD40, против В7.1 и против В7.2. Предпочтительно, чтобы CD40L-антитело было гуманизированным антителом против CD40L-, раскрытым в патенте США №6001358. Было показано, что данное антитело обладает эффективностью для лечения как Т-, так и В-клеточных аутоиммунных заболеваний, например, рассеянного склероза и ITP. Кроме того, сообщалось Biogen, что, в отличие от другого гуманизированного антитела против CD40L (5с8), известно, что данное антитело не вызывает побочных гематологических реакций.

В качестве общего предложения, терапевтически эффективное количество антитела, вводимое парентерально на дозу, обычно будет находиться в пределах примерно от 0,1 до 500 мг/кг массы тела пациента в день, при обычном начальном пределе используемого антагониста в пределах примерно от 2 до 100 мг/кг. Предпочтительным элиминирующим В-клетки антителом является ритуксан^®. Подходящая доза для данного антитела находится в пределах, например, примерно от 20 мг/м² до примерно 1000 мг/м². Доза антитела может быть такой же или отличаться от рекомендуемой в настоящее время для ритуксана^® для лечения не-ходжкинской лимфомы. Например, пациенту можно вводить одну или более доз значительно меньше, чем 375 мг/м² антитела, например, когда доза находится в пределах примерно от 20 мг/м² до примерно 250 мг/м², например, примерно от 50 мг/м² до примерно 200 мг/м².

Кроме того, можно вводить одну или более начальных доз антитела с последующим введением одной или более последующей доз(ы), где доза мг/м² антитела в последующих дозах превышает дозу мг/м² антитела в начальной дозе(ах). Например, начальная доза может находиться в пределах примерно от 20 мг/м² до примерно 250 мг/м² (например, примерно от 50 мг/м² до примерно 200 мг/м²), и последующая доза может находиться в пределах примерно от 250 мг/м² до примерно 1000 мг/м².

Однако, как отмечалось выше, данные предполагаемые количества обоих иммунорегуляторных антител в значительной степени подвержены выбору при лечении. Ключевым фактором при выборе соответствующей дозы и схемы является полученный результат, как отмечалось выше. Например, первоначально могут быть необходимы относительно более высокие дозы для лечения прогрессирующего и острого заболеваний. Для получения наиболее высоких результатов в зависимости от аутоиммунного заболевания или нарушения, антагонист вводят как можно раньше к появлению первого признака заболевания, постановки диагноза, вида и проявления заболевания или нарушения или во время ремиссий заболевания или нарушения.

Антитела вводят любыми подходящими путями, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, интрапульмонарный и интраназальный и, если желательно, для местного лечения иммуносупрессором, при введении в очаг поражения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антитело можно соответственно вводить пульсирующий инфузией, например, со снижением доз антитела. Предпочтительно проводить введение в инъекциях, наиболее предпочтительно во внутривенных или подкожных инъекциях, в зависимости отчасти от того, является введение коротким или продолжительным.

Кроме того, дополнительно можно вводить другие соединения такие, как химиотерапевтические средства, иммуносупрессоры и/или цитокины с антителами. Комбинированное введение включает совместное введение с использованием отдельных композиций или одной фармацевтической композиции и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительным является, чтобы имелся период времени, когда оба или все активные агенты одновременно проявляют их биологическую активность.

Помимо введения антител пациенту настоящая заявка предусматривает введение антител генной терапией. Подобное введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антитела, входит в выражение «введение терапевтически эффективного количества антагониста». Смотри, например, WO 96/07321, опубликованную 14 марта 1996 г., касающуюся применения генной терапии для генерации внутриклеточных антител.

Существует два основных подхода для доставки нуклеиновой кислоты (необязательно находящейся в векторе) в клетки пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту вводят непосредственно пациенту, обычно в месте, где необходим антагонист. Для лечения ex vivo извлекают клетки пациента, нуклеиновую кислоту вводят в данные выделенные клетки и модифицированные клетки вводят пациенту непосредственно или, например, инкапсулированные внутри пористых мембран, которые имплантируют пациенту (смотри, например, патенты США №4892538 и 5283187). Имеются различные методы для введения нуклеиновых кислот в живые клетки. Методы варьируют в зависимости от того, переносится ли нуклеиновая кислота в культивируемые клетки in vitro или in vivo в клетки предполагаемого хозяина. Методы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, DEAF-декстрановый метод и метод преципитации фосфатом кальция и т.д. Обычно используемым вектором для доставки гена ex vivo является ретровирус.

В настоящее время предпочтительные методы переноса нуклеиновой кислоты in vivo включают трансфекцию вирусными векторами (такими, как аденовирус, вирус герпеса простого I или адено-связанный вирус) и системы на основе липидов (пригодными липидами для опосредуемого липидами переноса гена являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых ситуациях желательно обеспечить источник нуклеиновой кислоты агентом, который целенаправленно воздействует на клетки-мишени, таким, как антитело, специфическое к поверхностному мембранному белку клетки или клетке-мишени, лиганду для рецептора на клетке-мишени и т.д. Там, где используются липосомы, можно использовать белки, которые связываются с поверхностным мембранным белком клетки путем эндоцитоза, для целенаправленного воздействия и/или облегчения поглощения, например, капсидные белки или их фрагменты, обладающие тропностью для определенного типа клеток, антитела для белков, которые проходят интернализацию в цикле, и белки, которые воздействуют на внутриклеточную локализацию и повышают внутриклеточный период полувыведения. Описан метод опосредуемого рецепторами эндоцитоза, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). Обзор известных в настоящее время методов получения генов и генной терапии смотри у Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Смотри также WO 93/25673 и указанные в ней ссылки.

VI. Предметы производства

В другом воплощении изобретения обеспечивается предмет производства, включающий вещества, пригодные для лечения заболеваний или нарушений, описанных выше.

Предмет производства включает контейнер и этикетку или упаковочный вкладыш на или входящий в состав контейнера. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. В контейнере хранится или содержится композиция, которая эффективна для лечения выбранного заболевания или нарушения и может иметь стерильную доступную емкость (например, контейнер может быть мешком для внутривенного введения раствора или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). В целом может быть одна или несколько композиций. По меньшей мере, один активный агент в одной из данных композиций представляет антитело, обладающее активностью элиминировать В-клетки, и, по меньшей мере, одно антитело представляет иммунорегуляторное антитело, такое как антитело против CD40L, против CD40, против CD4- или против CDВ7. На этикетке или упаковочном вкладыше указывается, что композиция используется для лечения пациента, имеющего или предрасположенного к аутоиммунному заболеванию, такому как перечислены выше. Предмет производства может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер такой, как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, желаемые с точки зрения коммерции и пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Дополнительные детали изобретения иллюстрируются неограничивающими примерами. Раскрытие всех цитируемых материалов в описании специально включено здесь путем ссылки.

Пример 1

Пациентов с клиническим диагнозом ревматоидного артрита (RA) первоначально лечат антителом ретуксимабом (ритуксан^®). У данного пациента также может быть или может не быть элиминирующее В-клетки антитело, т.е. злокачественность. Кроме того, пациента необязательно дополнительно лечат любым одним или более средств, используемых для лечения RA таким, как салицилат; нестероидные противовоспалительные препараты, такие как индометацин, фенилбутазон, производные фенилуксусной кислоты (например, ибупрофен и фенопрофен), нафталинуксусные кислоты (напроксен), пирролалкановая кислота (тометин), индолуксусные кислоты (сулиндак), галогенированная антраниловая кислота (меклофенамат натрия), пироксикам, зомепирак и дифлунизал; препараты против малярии, такие как хлорохин; соли золота; пеницилламин или иммуносупрессоры, такие как метотрексат или кортикостероиды в дозах, известных для этих препаратов, или сниженных дозах. Однако предпочтительно, чтобы пациент лечился только ритуксаном^®.

Ритуксан^® вводят внутривенно (в/в) пациенту с RA по любой из следующих схем введения:

(А) 50 мг/м² в/в в день 1

150 мг/м² в/в в дни 8, 15 & 22

(В) 150 мг/м² в/в в день 1

375 мг/м² в/в в дни 8, 15 & 22

(С) 375 мг/м² в/в в дни 1, 8, 15 & 22.

Затем пациента лечат гуманизированным антителом против CD40L, раскрытым в патенте США №6001358, вводимым внутривенно по той схеме введения.

Основную ответную реакцию определяют по индексу Паулюса (Paulus et al., Athritis Rheum. 33:477-484 (1990)), т.е. улучшению в отношении ригидности утром, числу болезненных и воспаленных суставов, реакции оседания эритроцитов (ESR) и по меньшей мере 2-балльное улучшение по 5-балльной шкале тяжести заболевания, оцениваемое пациентом и врачом. Введение ритуксана^® и антитела против CD40L будет ослаблять один или более симптомов RA у пациента, подвергнутого лечению, описанному выше.

Пример 2

Пациентов с диагнозом аутоиммунная гемолитическая анемия (AIHA), например, криоглобулинемии или положительной анемии Кумба, первоначально лечат антителом ритуксаном^®. AIHA представляет приобретенную гемолитическую анемию за счет аутоантител, которые реагируют с эритроцитами пациента. У пациента, подвергшегося лечению, необязательно также может быть В-клеточная злокачественность. Пациента первоначально лечат композицией, включающей гуманизированное антитело против человеческого CD40L, вводимое в дозе 500 мг/м², в/в. Эту дозу вводят дважды в неделю в целом в течение четырех (4) недель.

Затем пациенту вводят ритуксан^® внутривенно (в/в) по любой из следующих схем введения:

(А) 50 мг/м² в/в в день 1

150 мг/м² в/в в дни 8, 15 & 22

(В) 150 мг/м² в/в в день 1

375 мг/м² в/в в дни 8, 15 & 22

(С) 375 мг/м² в/в в дни 1, 8, 15 & 22.

Можно присоединить дополнительную терапию (такую, как глюкокортикоиды, преднизон, азатиоприн, циклофосфамид, тромбоциты винка-ладен или даназол) с лечением антителом против CD40L и ритуксаном^®. Предпочтительно пациента лечат ритуксаном^® и тем же антителом против CD40L, как в предыдущем примере, в качестве только одного другого средства во время курса лечения.

Полную оценку ответной реакции проводят на основе улучшения показателей крови, пониженной потребности в переливании крови, повышении уровня гемоглобина и/или снижении признаков гемолиза, что определяют обычными биохимическими параметрами. Введение антитела против CD40L и ритуксана^® будет улучшать один или более симптомов гемолитической анемии у пациента, подвергнутого лечению, описанному выше.

Пример 3

Иммунная тромбоцитопеническая пурпура у взрослых (ITP) является относительно редким гематологическим заболеванием, которое составляет наиболее часто встречаемую из опосредуемых иммунной системой цитопений. Заболевание обычно протекает с тяжелой тромбоцитопенией, которая может быть связана с острым кровотечением при наличии от нормального до повышенного количества мегакариоцитов в костном мозге. У большинства пациентов с ITP имеются IgG-антитела, направленные против мишеневых антигенов на внешней поверхности мембраны тромбоцитов, что приводит к секвестрации тромбоцитов в селезенке и повышенному разрушению тромбоцитов в органах ретикулоэндотелиальной системы (Bussell, J.B. Hematol. Oncol. Clin. North. Am. (4):179 (1990)). Был показан ряд терапевтических вмешательств, эффективных для лечения ITP. Основными препаратами для лечения, как правило, считаются стероиды, после которых пациентам внутривенно вводят иммуноглобулин (в/в IG), проводят спленэктомию или проводят другую терапию, включая винкристин или иммуносупрессоры/цитотоксические средства. До 80% пациентов с ITP первоначально реагируют на курс лечения стероидами, но значительно меньше таковых, у которых имеют место полные и продолжительные ремиссии. Спленэктомия рекомендована в качестве второго стандартного метода лечения при отсутствии эффективности при лечении стероидами, и приводит к длительной ремиссии примерно в 60% случаев, но может привести к снижению иммунитета к инфекции. Спленэктомия является основной хирургической процедурой, которая может быть связана со значительной заболеваемостью (15%) и смертностью (2%). В/в IG также используют в качестве второго вида лечения, хотя только у небольшой части взрослых пациентов с ITP достигается ремиссия.

Выбор лечения, которое будет нарушать продукцию активированных В-клеток без проявления заболеваемости, которая имеет место при лечении кортикостероидами и/или спленэктомии, будет обеспечивать важный подход лечения для части пациентов с ITP.

Пациентов с клиническим диагнозом ITP (например, числом тромбоцитов <75000/мкл) лечат антителом ритуксимабом (ритуксан^®) необязательно в комбинации с терапией стероидами. У подвергнутого лечению пациента отсутствует В-клеточная злокачественность.

Вновь ритуксан^® вводят внутривенно (в/в) пациенту с ITP по любой из следующих схем введения:

(А) 50 мг/м² в/в в день 1

150 мг/м² в/в в дни 8, 15 & 22

(В) 150 мг/м² в/в в день 1

375 мг/м² в/в в дни 8, 15 & 22

(С) 375 мг/м² в/в в дни 1, 8, 15 & 22.

Совместно с введением ритуксана^® пациента лечат одним из приматизированных антител против В7.1, раскрытым в патенте США №6113898, включенном здесь полностью путем ссылки. Антитело против В7.1 вводят внутривенно в отдельной композиции в дозе 500 мг/м², дважды в неделю в течение 3 недель.

Пациентов предварительно лечат одной дозой каждого из дифенгидрамина, 25-50 мг внутривенно и ацетаминофена, 650 мг перорально перед введением ритуксана^® и композиций с антителом против В7.1. С использованием стерильного шприца и иглы номера 21 или большего необходимое количество ритуксана^® и антитела против В7.1 переносят из флакона в мешок для внутривенного введения, содержащий непирогенный 0,9% раствор хлорида натрия, USP (физиологический раствор). Конечная концентрация ритуксана^® и антитела против В7.1 составляет примерно 1 мг/мл. Начальная скорость инфузии равняется 25 мг/час в течение первого получаса, затем ее повышают каждые 30 мин на 50 мг/час до максимальной скорости 200 мг/час. Если первый курс лечения ритуксаном^® и антителом против В7.1 переносится хорошо, скорость инфузии при последующих курсах начинают с 50 мг/час и увеличивают каждые 30 мин на 100 мг/час до максимальной скорости, не превышающей 300 мг/час. Следят за жизненными показателями (давлением крови, пульсом, дыханием, температурой) каждые 15 мин × 4 или до стабильных показателей, и затем каждый час до окончания инфузии.

Полную оценку ответной реакции проводят на основе числа тромбоцитов, которое определяют дважды через две недели после окончания четырехнедельного курса лечения ритуксаном^® и через три недели введения композиции с антителом против В7.1. У пациентов, подвергнутых лечению антителом против В7.1 и ритуксаном^®, будет улучшаться количество тромбоцитов по сравнению с пациентами, которым вводят плацебо.

Несмотря на то, что изобретение описано с помощью примеров и предпочтительных воплощений, различные модификации изобретения в дополнение к таковым, показанным в данной области из предшествующего описания, входят в объем изобретения. Предусматривается, что подобные модификации попадают в объем последующей формулы изобретения.

1. Способ лечения аутоиммунного заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему композиции или композиций, состоящей(их) из:

а) комбинации терапевтически эффективного количества иммунорегуляторного анти-CD80 антитела или его иммунорегуляторного CD-80-связывающего фрагмента и терапевтически эффективного количества анти-СD20 антитела, обладающего активностью, направленной на истощение В-клеток, где указанное иммунорегуляторное антитело или его фрагмент и указанное анти-CD20 антитело могут быть введены отдельно или в комбинации и в любом порядке; и кроме того, состоящей(их) из

б) одного или нескольких фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей, стабилизаторов, микрокапсул, коллоидных систем доставки лекарственных средств, макроэмульсий или полупроницаемых матриц твердых гидрофобных полимеров.

2. Способ по п.1, в котором анти-CD80 антитело или его фрагмент вводят перед анти-СD20 антителом.

3. Способ по п.1, в котором анти-СD20 антитело вводят перед анти-CD80 антителом или его фрагментом.

4. Способ по п.1, в котором анти-СD20 антитело и анти-CD80 антитело или его фрагмент вводят одновременно в комбинации друг с другом.

5. Способ по п.1, в котором аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из псориаза, аутоиммунного дерматита; системной склеродермы и аутоиммунного склероза; реакций, связанных с воспалительным заболеванием кишечника; болезни Крона; язвенного колита; аутоиммунного респираторного дистресс-синдрома; респираторного дистресс-синдрома у взрослых (ARDS); аутоиммунного менингита; аутоиммунного энцефалита; увеита; аутоиммунного колита; аутоиммунного гломерулонефрита; экземы; состояний, включающих инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные реакции; аутоиммунного атеросклероза; недостаточности адгезии лейкоцитов; ревматоидного артрита; системной красной волчанки (SLE); сахарного диабета; рассеянного склероза; синдрома Рейно; аутоиммунного тиреоидита; синдрома Шегрена; ювенильного диабета; иммунных реакций, связанных с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами; саркоидоза; полимиозита; аутоиммунного грануломатоза; аутоиммунного васкулита; аутоиммунной пернициозной анемии (болезни Аддисона); аутоиммунных заболеваний, характеризующихся диапедезом лейкоцитов; синдрома множественного поражения органов; аутоиммунной гемолитической анемии; миастении gravis; заболеваний, опосредуемых комплексом антиген-антитело; антигломерулярного мембранного заболевания; антифосфолипидного синдрома; аллергического неврита; болезни Грэйвза; миастенического синдрома Лэмберта-Итона; буллезного пемфигоида; пузырчатки; аутоиммунных полиэндокринопатий; болезни Рейтера; синдрома негнущегося человека; болезни Бехчета; гигантоклеточного артериита; нефрита с иммунным комплексом; IgA-нефропатий; IgM-полиневропатий; идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) и аутоиммунной тромбоцитопении и аутоиммунного оофорита.

6. Способ по п.1, в котором млекопитающее представляет собой человека.

7. Способ по п.1, в котором ни анти-CD80 антитело или его фрагмент, ни анти-СD20 антитело не конъюгировано с цитотоксическим агентом.

8. Способ по п.1, в котором анти-CD80 антитело представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело против человеческого CD80 и анти-CD20 антитело представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело против человеческого CD20.

9. Способ по п.1, в котором анти-CD20 антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.

10. Способ по п.9, в котором цитотоксический агент представляет собой радиоактивный изотоп.

11. Способ по п.10, в котором радиоактивный изотоп представляет собой иттрий-90 или йод 131.

12. Способ по п.1, в котором антитела вводят внутривенно.

13. Способ по п.1, в котором антитела вводят инфузией.

14. Способ по п.8, включающий введение млекопитающему дозы антитела значительно меньшей 375 мг/м².

15. Способ по п.14, в котором доза находится в пределах примерно от 20 до примерно 250 мг/м².

16. Способ по п.15, в котором доза находится в пределах примерно от 50 до примерно 200 мг/м².

17. Способ по п.1, включающий введение начальной дозы указанного анти-CD80 антитела или его фрагмента и/или указанного анти-СD20 антитела с последующим введением дозы того же самого антитела, в котором доза антитела в мг/м² в последующей дозе превышает дозу антитела в мг/м² в начальной дозе.

18. Способ по п.1, который дополнительно включает введение синтетического иммуносупрессора.

19. Способ по п.18, в котором указанный иммуносупрессор представляет циклоспорин или FK506.

20. Способ по п.1, в котором фрагмент антитела, связывающийся с CD80, выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, диатела, линейного антитела, одноцепочечной молекулы антитела и мультиспецифического анти-CD80 антитела, образованного из фрагментов антитела.

21. Способ по п.11, в котором радиоактивно меченным анти-СD20 антителом является 2В8 или В1.

22. Способ по п.21, в котором радиоактивно меченным анти-СD20 антителом является Y2B8.

23. Способ по п.21, в котором радиоактивно меченным анти-СD20 антителом является 1311-В1.

24. Способ по п.1, в котором анти-СD20 антителом является химерное моноклональное анти-СD20 антитело.

25. Способ по п.24, в котором анти-СD20 антителом является приматизированное антитело, содержащее вариабельные антигенсвязывающие области домена антитела примата, не являющегося человеком, и константные области человеческого антитела.

26. Способ по п.24, в котором анти-СD20 антителом является Rituximab.

27. Способ по п.1, в котором анти-СD20 антителом является гуманизированное моноклональное анти-СD20 антитело.

28. Способ по п.1, в котором анти-CD80 антитело или его фрагмент или анти-СD20 антитело модифицируют так, чтобы они были способны к интернализации, либо и анти-CD80 антитело или его фрагмент, и анти-СD20 антитело уже являются модифицированными таким образом.

29. Способ по п.1, в котором анти-CD80 антитело или его фрагмент или анти-СD20 антитело модифицируют так, чтобы они имели более длительное время полужизни в сыворотке, либо и анти-CD80 антитело или его фрагмент, и анти-СD20 антитело уже являются модифицированными таким образом.

30. Способ по п.1, в котором анти-СD20 антитело модифицируют так, чтобы оно имело повышенную антигензависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность.

31. Способ по п.1, в котором анти-СD20 антитело модифицируют так, чтобы оно имело повышенную комплементзависимую цитотоксичность.

32. Способ по п.1, в котором один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей и стабилизаторов выбраны из буферов, антиоксидантов, консервантов, низкомолекулярных полипептидов, сывороточного альбумина, желатина, гидрофильных полимеров, аминокислот, моносахаридов, дисахаридов и других углеводов, хелатообразующих агентов, сахаров, солеобразующих противоионов и неионогенных поверхностно-активных веществ.

33. Способ по п.1, в котором одна или несколько коллоидных систем доставки лекарственных средств выбраны из липосом, микросфер альбумина, микроэмульсий, наночастиц и нанокапсул.

34. Способ по п.1, в котором одна или несколько полупроницаемых матриц твердых гидрофобных полимеров обеспечивают пролонгированное высвобождение анти-CD80 антитела или его фрагмента и анти-СD20 антитела.

35. Продукт для лечения аутоиммунных заболеваний состоящий из

а) контейнера, который содержит композицию или композиции, состоящую(ие) из

i) иммунорегуляторных анти-CD80 антител или их иммунорегуляторных СD80-связывающих фрагментов,

ii) анти-СD20 антител, обладающих активностью, направленной на истощение В-клеток, и

iii) одного или нескольких фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей, стабилизаторов, микрокапсул, коллоидных систем доставки лекарственных средств, макроэмульсий или полупроницаемых матриц твердых гидрофобных полимеров;

и, кроме того, состоящий из

б) помещаемого в упаковку вкладыша, содержащего инструкции по использованию композиции для лечения пациента, страдающего аутоиммунным заболеванием или имеющего предрасположенность к такому заболеванию.

36. Продукт по п.35, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из псориаза; аутоиммунного дерматита; системной склеродермии и аутоиммунного склероза; реакций, связанных с воспалительным заболеванием кишечника; болезни Крона; язвенного колита; аутоиммунного респираторного дистресс-синдрома; респираторного дистресс-синдрома у взрослых (ARDS); аутоиммунного менингита; аутоиммунного энцефалита; увеита; аутоиммунного колита; аутоиммунного гломерулонефрита; аллергических состояний; экземы; состояний, характеризующихся инфильтрацией Т-клеток и хроническими воспалительными реакциями; аутоиммунного атеросклероза; недостаточности адгезии лейкоцитов; ревматоидного артрита; системной красной волчанки (SLE); сахарного диабета; рассеянного склероза; синдрома Рейно; аутоиммунного тиреоидита; синдрома Шегрена; ювенильного диабета; иммунных реакций, связанных с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами; саркоидоза; полимиозита; аутоиммунного грануломатоза; аутоиммунного васкулита; аутоиммунной пернициозной анемии (болезни Аддисона); аутоиммунных заболеваний, характеризующихся диапедезом лейкоцитов; синдрома множественного поражения органов; аутоиммунной гемолитической анемии; миастении gravis; заболеваний, опосредуемых комплексом антиген-антитело; антигломерулярного мембранного заболевания; антифосфолипидного синдрома; болезни Грэйвза; миастенического синдрома Лэмберта-Итона; буллезного пемфигоида; пузырчатки; аутоиммунных полиэндокринопатий; болезни Рейтера; синдрома негнущегося человека; болезни Бехчета; гигантоклеточного артериита; нефрита с иммунным комплексом; IgA-нефропатии; IgM-полиневропатий; идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) и аутоиммунной тромбоцитопении и аутоиммунного оофорита.