Рекомбинантная молекула днк, кодирующая модифицированный свиной фактор viii (pol 1212), экспрессирующие векторы, модифицированный свиной фактор viii, терапевтическая композиция, способы получения белка модифицированного свиного фактора viii (варианты) и линии клеток (варианты)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения модифицированного свиного фактора VIII (POL1212). Молекулу ДНК, кодирующую белок модифицированного свиного фактора VIII, клонируют в экспрессирующий вектор, функциональный в клетках млекопитающих. Белок модифицированного свиного фактора VIII получают путем культивирования линии клеток млекопитающего ВНК CRL-1632 (АТСС), ВНК 1632 или СНО-К1, трансфицированной вектором. Терапевтическая композиция для лечения пациентов, имеющих недостаточность фактора VIII, содержит белок свиного фактора VIII в эффективном количестве. Изобретение позволяет разрабатывать средства для лечения недостаточности фактора VIII, например, у пациентов, страдающих гемофилией, 10 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил. 4 табл.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет из патентной заявки Соединенных Штатов Америки №09/037601, поданной 10 марта 1998 года, которая является частичным продолжением патентной заявки Соединенных Штатов Америки №08/670707, поданной 26 июня 1996 года, по которой выдан патент США №5859204, и Международной патентной заявки PCT/US 97/11155, поданной 26 июня 1997 года.

УВЕДОМЛЕНИЕ О ФЕДЕРАЛЬНОЙ ПОДДЕРЖКЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Правительство имеет права в данном изобретении в результате использования гранта №HL46215 Национального Института здравоохранения, который частично финансировал исследование, приведшее к данному изобретению.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Свертывание крови начинается, когда тромбоциты прикрепляются к разрезанной стенке поврежденного кровеносного сосуда в участке повреждения. Затем, в каскаде ферментативно регулируемых реакций молекулы растворимого фибриногена превращаются ферментом тромбином в нерастворимые тяжи фибрина, которые удерживают тромбоциты вместе в тромбе. На каждой стадии в этом каскаде белок-предшественник превращается в протеазу, которая расщепляет следующий белок-предшественник последовательно. В большинстве этих стадий требуются кофакторы.

Фактор VIII циркулирует в крови в виде неактивного предшественника, связанного прочно и нековалентно с фактором фон Виллебранда. Фактор VIII протеолитически активируется тромбином или фактором Ха, который диссоциирует его от фактора фон Виллебранда и активирует его прокоагулянтную функцию в этом каскаде. В его активной форме белковый фактор VIIIa является кофактором, который увеличивает каталитическую эффективность фактора IXa в отношении активации фактора Х на несколько порядков величин.

Люди с недостаточностью фактора VIII или антителами против фактора VIII, которые не получают лечения с использованием фактора VIII, страдают от неостанавливаемого внутреннего кровотечения, которое может вызывать ряд серьезных симптомов, от воспалительных реакций в суставах до ранней смерти. Тяжелые гемофилические пациенты, число которых в Соединенных Штатах достигает приблизительно 10000, могут лечиться инфузией фактора VIII человека, который будет восстанавливать нормальную способность свертывания крови при введении с достаточными частотой и концентрацией. Классическое определение фактора VIII фактически является таким: это вещество, присутствующее в нормальной плазме крови, которое корректирует дефект свертывания в плазме, полученной из индивидуумов с гемофилией А.

Развитие антител («ингибиторов» или «ингибиторных антител»), которые ингибируют активность фактора VIII, является серьезным осложнением в лечении пациентов с гемофилией. Аутоантитела развиваются приблизительно в 20% пациентов с гемофилией А в ответ на терапевтические инфузии фактора VIII. В ранее не подвергавшихся лечению пациентах с гемофилией А, которые развивают ингибиторы, этот ингибитор обычно развивается в пределах одного года лечения. Кроме того, аутоантитела, которые инактивируют фактор VIII, иногда развиваются в индивидуумах с ранее нормальными уровнями фактора VIII. Если титр ингибитора является достаточно низким, пациенты могут лечиться увеличением дозы фактора VIII. Однако часто титр ингибитора является таким высоким, что невозможно преодолеть его фактором VIII. Альтернативной стратегией является обход необходимости в отношении фактора VIII во время нормального гемостаза при помощи комплексных препаратов фактора IX (например, KONYNE*, Proplex®) или рекомбинантного фактора VIIa человека. Кроме того, поскольку свиной фактор VIII обычно имеет существенно более низкую реактивность с ингибиторами, чем фактор VIII человека, использовали частично очищенный фактор VIII свиньи (HYATE:C®). Многие пациенты, которые развили ингибиторные антитела к фактору VIII человека, успешно лечились свиным фактором VIII и выносили такое лечение в течение продолжительных периодов времени. Однако введение свиного фактора VIII не является полным решением, так как в некоторых пациентах ингибиторы могут развиваться к свиному фактору VIII после одной или нескольких инфузий.

Некоторые препараты полученного из плазмы человека фактора VIII варьирующейся степени чистоты являются коммерчески доступными для лечения гемофилии А. Они включают в себя частично очищенный фактор VIII, полученный из объединенной крови многих доноров, который обработан нагреванием и детергентами против вирусов, но содержит существенный уровень антигенных белков; очищенный моноклональными антителами фактор VIII, который имеет более низкие уровни антигенных примесей и вирусного загрязнения; и рекомбинантный фактор VIII человека, клинические испытания для которого проводятся в настоящее время. К сожалению, человеческий фактор VIII является нестабильным при физиологических концентрациях и рН, присутствует в крови в крайне низкой концентрации (0,2 мкг/мл плазмы) и имеет низкую удельную активность свертывания. Обеспокоенность общественного здравоохранения в отношении риска вирусов или других несомых кровью примесей ограничивала применимость свиного фактора VIII, очищенного из крови свиней.

Больные гемофилией требуют ежедневного пополнения фактора VIII для предупреждения кровотечения и возникающей деформирующей гемофильной артропатии. Однако подачи были недостаточными и возникают проблемы в терапевтическом применении вследствие трудности выделения и очистки, иммуногенности и необходимости устранения риска инфективности СПИДа и гепатита. Применение рекомбинантного человеческого фактора VIII или частично очищенного свиного фактора VIII не решит всех проблем.

Проблемы, связанные с обычно используемым коммерчески доступным полученным из плазмы фактором VIII, стимулировали значительный интерес в развитии лучшего продукта фактора VIII. Существует потребность в более сильнодействующей молекуле фактора VIII, так чтобы большее число единиц свертывающей активности могло доставляться на молекулу; в молекуле фактора VIII, которая является стабильной при выбранных рН и физиологической концентрации; в молекуле фактора VIII, которая менее склонна вызывать продуцирование ингибиторных антител; и молекуле фактора VIII, которая избегает иммунного детектирования в пациентах, которые уже приобрели антитела к человеческому фактору VIII.

Таким образом, задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, который корректирует гемофилию в пациенте, недостаточном по фактору VIII или имеющем ингибиторы в отношении фактора VIII человека.

Следующей задачей данного изобретения является обеспечение способов лечения больных гемофилией.

Еще одной задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, который является стабильным при выбранных рН и физиологической концентрации.

Другой задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, который имеет более высокую коагулирующую (коагулянтную) активность, чем фактор VIII человека.

Следующей задачей данного изобретения является обеспечение фактора VIII, против которого образуется меньшее количество антител.

Следующей задачей данного изобретения является обеспечение способа получения рекомбинантного свиного фактора VIII и, в частности, модифицированного свиного фактора VIII.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определение всей последовательности ДНК, кодирующей свиной фактор VIII, представленной здесь, впервые сделало возможным синтез свиного фактора VIII экспрессией ДНК, кодирующей свиной фактор VIII, в подходящей клетке-хозяине. Таким образом, очищенный свиной фактор VIII является аспектом данного изобретения. ДНК, кодирующая каждый домен свиного фактора VIII, а также любой ее описанный фрагмент, также могут быть экспрессированы. Кроме того, свиной фактор VIII с делетированным полным В-доменом или делетированной частью В-домена (не содержащий В-домена свиной фактор VIII (fVIII)) сделан доступным как часть данного изобретения посредством экспрессии ДНК, кодирующей свиной fVIII, имеющей делецию одного или нескольких кодонов В-домена.

Обеспечены также фармацевтические композиции и способы лечения пациентов, имеющих недостаточность фактора VIII, предусматривающие введение рекомбинантного свиного фактора VIII или модифицированного свиного фактора VIII, в частности, не содержащего В-домена свиного фактора VIII.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1А-1Н, взятые вместе, представляют сравнение сопоставленных последовательностей аминокислот человеческого, свиного и мышиного фактора VIII.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если нет иного описания или указания, в применении здесь, "фактор VIII" обозначает любую функциональную молекулу белка фактора VIII из любого млекопитающего.

В применении здесь, "фактор VIII млекопитающих" включает в себя фактор VIII с аминокислотной последовательностью, полученной из любого млекопитающего, не являющегося человеком, если нет иных указаний. "Животное", в применении здесь, обозначает свинью и других млекопитающих, не являющихся человеком.

"Слитый белок" или "слитый фактор VIII или его фрагмент", в применении здесь, обозначает продукт гибридного гена, в котором кодирующая последовательность для одного белка изменена, например, присоединением ее к кодирующей последовательности для второго белка из отличающегося гена в правильной последовательности в рамке считывания, так что может происходить непрерывная транскрипция и трансляция соединенных сегментов, с образованием гибридного гена, который кодирует этот слитый белок.

"Соответствующая" последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, в применении здесь, является последовательностью, присутствующей в молекуле фактора VIII или ее фрагменте, которые имеют одну и ту же структуру и/или функцию, что и сайт в молекуле фактора VIII другого вида, хотя число нуклеотидов или аминокислот может быть неидентичным. ДНК-последовательность, "соответствующая" последовательности другого фактора VIII, по существу соответствует такой последовательности и гибридизуется с последовательностью обозначенного номера SEQ ID NO: при строгих условиях. ДНК-последовательность, "соответствующая" последовательности другого фактора VIII, включает в себя также последовательность, которая приводит к экспрессии фактора VIII или его фрагмента и могла бы гибридизоваться с обозначенной последовательностью SEQ ID NO:, если бы не избыточность генетического кода.

"Уникальный" аминокислотный остаток или "уникальная" последовательность, в применении здесь, обозначает аминокислотную последовательность или аминокислотый остаток в молекуле фактора VIII одного вида, которые отличаются от гомологичного остатка или гомологичной последовательности в молекуле фактора VIII другого вида.

"Удельная активность", в применении здесь, обозначает активность, которая будет корректировать дефект свертывания недостаточной в отношении фактора VIII плазмы человека. Удельную активность измеряют в единицах активности свертывания на миллиграмм общего белка фактора VIII в стандартном тесте, в котором время свертывания недостаточной в отношении фактора VIII плазмы человека сравнивают с временем свертывания нормальной плазмы человека. Одна единица активности фактора VIII равна активности, присутствующей в одном миллилитре нормальной плазмы человека. В этом тесте, чем короче время образования сгустков, тем выше активность анализируемого фактора VIII. Свиной фактор VIII является активным в тесте фактора VIII человека.

"Экспрессия" обозначает ряд процессов, которые имеют место, когда генетическая информация используется для получения продукта. ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность свиного фактора VIII, может "экспрессироваться" в клетке-хозяине млекопитающего с образованием белка свиного фактора VIII. Материалы, генетические структуры, клетки-хозяева и условия, которые позволяют происходить экспрессии конкретной последовательности ДНК, хорошо известны в данной области и могут манипулироваться для воздействия на время и количество экспрессии, а также на внутри- или внеклеточную локализацию экспрессируемого белка. Например, в результате включения ДНК, кодирующей сигнальный пептид на 5'-конце ДНК, кодирующей свиной фактор VIII (этот 5'-конец является, как это принято, концом, кодирующим NH₂-конец данного белка), зкспрессируемый белок становится экспортируемым из внутреннего пространства клетки-хозяина в культуральную среду. Обеспечение кодирующей сигнальный пептид ДНК в комбинации с ДНК, кодирующей свиной фактор VIII, является выгодным, так как экспрессируемый фактор VIII экспортируется в культуральную среду, что упрощает процесс очистки. Предпочтительным сигнальным пептидом является сигнальный пептид фактора VIII млекопитающего.

Нуклеотидная последовательность кДНК и предсказанная аминокислотная последовательность фактора VIII человека показаны в SEQ ID NO:1 и 2 соответственно. Фактор VIII синтезируется в виде одноцепочечного белка приблизительно 300 кДа с гомологией внутренней последовательности, которая определяет последовательность «домена» NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. В молекуле фактора VIII «домен», в применении здесь является непрерывной последовательностью аминокислот, которая определяется идентичностью внутренних аминокислот и сайтами протеолитического расщепления тромбином. Если нет иных указаний, домены фактора VIII включают в себя следующие аминокислотные остатки при выстраивании этих последовательностей с аминокислотной последовательностью человека (SEQ ID NO:2): A1, остатки Аlа1-Arg372; А2, остатки Sеr373-Arg740; В, остатки Sеr741-Arg1648; A3, остатки Ser1690-Ile2032; C1, остатки Arg2033-Asn2172; C2, остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность А3-С1-С2 включает в себя остатки Ser1690-Tyr2332. Оставшийся сегмент, остатки Glu1649-Arg1689, обычно называют пептидом активации легкой цепи фактора VIII. Фактор VIII протеолитически активируется тромбином или фактором Ха, который диссоциирует его от фактора фон Виллебранда с образованием фактора VIIIa, который обладает прокоагулянтной функцией. Биологическая функция фактора VIIIa заключается в увеличении каталитической эффективности фактора IXa в отношении активации фактора Х на несколько порядков величин. Активированный тромбином фактор VIIIa является гетеротримером А1/А2/А3-С1-С2 160 кДа, который образует комплекс с фактором IXa и фактором Х на поверхности тромбоцитов или моноцитов. «Частичный домен» в применении здесь является непрерывной последовательностью аминокислот, образующей часть домена.

«Субъединицы» фактора VIII человека или животного, в применении здесь, являются тяжелой и легкой цепями этого белка. Тяжелая цепь фактора VIII содержит три домена, A1, А2 и В. Легкая цепь фактора VIII также содержит три домена, A3, C1 и C2.

Термины "эпитоп", "антигенный сайт" и "антигенная детерминанта", в применении здесь, используются как синонимы и определяются как часть фактора VIII человека или животного или его фрагмент, которые специфически узнаются антителом. Они могут состоять из любого числа аминокислотных остатков и могут зависеть от первичной, вторичной или третичной структуры белка.

Термин "иммунодоминантный сайт", в применении здесь, определяется как район фактора VIII человека или животного или его фрагмент, который специфически индуцирует продуцирование антитела к фактору VIII или его фрагменту, в человеке или животном, измеряемое рутинными протоколами, такими как иммуноанализ, например анализ ELISA или Bethesda, описанные здесь. Он может состоять из любого числа аминокислотных остатков и может зависеть от первичной, вторичной или третичной структуры белка. В некоторых вариантах гибридный или эквивалентный гибридному фактор VIII или его фрагмент является неиммунодоминантным или менее иммунодоминантным в животном или человеке, чем фактор VIII человека или свиньи.

«Недостаточность фактора VIII», в применении здесь, включает в себя недостаточность активности свертывания, вызываемая продуцированном дефектного фактора VIII, недостаточным продуцированном или отсутствием продуцирования фактора VIII или частичным или полным ингибированием фактора VIII ингибиторами. Гемофилия А является типом недостаточности фактора VIII, происходящим из дефекта в Х-сцепленном гене и отсутствия или недостаточности белка фактора VIII, который он кодирует.

В применении здесь, «диагностические анализы» включают в себя анализы, которые некоторым образом используют взаимодействие антиген-антитело для детектирования и/или определения количества конкретного антитела, которое присутствует в тест-пробе, для облегчения выбора лекарственных терапий. Существуют много подобных анализов, известных специалистам с квалификацией в данной области. В применении здесь, ДНК фактора VIII человека, свиньи или модифицированного фактора VIII или ее фрагмент и белок, экспрессируемый из них, полностью или частично, могут заменять соответствующие реагенты в известных в других отношениях анализах, в результате чего эти модифицированные анализы могут использоваться для детектирования и/или количественного определения антител к фактору VIII. Именно применение этих реагентов, ДНК фактора VIII или ее фрагмента или белка, экспрессируемого ими, позволяет модифицировать известные анализы для обнаружения антител к фактору VIII человека или животного. Такие анализы включают в себя, но не ограничиваются ими, ELISA, иммунодиффузионный анализ и иммуноблоттинг. Подходящие способы для применения на практике этих анализов известны лицам с квалификацией в данной области. В применении здесь, фактор VIII или его фрагмент, который включает в себя по меньшей мере один эпитоп этого белка, может быть использован в качестве диагностического реагента. Примеры других анализов, в которых могут быть использованы фактор VIII человека, свиньи или модифицированный свиной фактор VIII или его фрагмент, включают в себя анализ Bethesda и антикоагуляционные анализы.

Термин кДНК, кодирующая белок, такой как свиной фактор VIII» означает полидезоксинуклеиновую кислоту, нуклеотидная последовательность которой заключает в себе кодирующую информацию для клетки-хозяина для аминокислотной последовательности белка, например, свиного фактора VIII, в соответствии с известными зависимостями генетического кода.

«Продукт экспрессии» ДНК, кодирующей фактор VIII человека или животного или модифицированный фактор VIII, представляет собой продукт, полученный из экспрессии ссылочной ДНК в подходящей клетке-хозяине, включающий в себя такие признаки пре- или посттрансляционной модификации белка, кодируемого ссылочной ДНК, как, в том числе, но не только, гликозилирование, протеолитическое расщепление и т.п. В данной области известно, что такие модификации могут встречаться и могут несколько отличаться в зависимости от типа клетки-хозяина и других факторов и могут приводить к молекулярным изоформам продукта с сохранением прокоагулянтной активности. См., например, Lind, P. et al., Eur. J. Biochem. 232:1927 (1995), включенный здесь в качестве ссылки.

«Экспрессирующий вектор» является ДНК-элементом, часто кольцевой структуры, имеющим способность автономной репликации в желаемой клетке-хозяине или способность интеграции в геном клетки-хозяина, а также обладающим определенными хорошо известными признаками, которые делают возможной экспрессию кодирующей ДНК, встроенной в этот вектор, в правильном сайте и в правильной ориентации. Такие признаки могут включать в себя, но не ограничиваются ими, одну или несколько промоторных последовательностей для запуска инициации транскрипции кодирующей ДНК и другие ДНК-элементы, такие как энхансеры, сайты полиаденилирования и т.п., все из них хорошо известны в данной области. Термин "экспрессирующий вектор" используют для обозначения как вектора, имеющего кодирующую последовательность ДНК, которая должна быть экспрессирована, встроенную в его последовательность, так и вектора, имеющего необходимые для экспрессии регуляторные элементы, расположенные таким образом относительно сайта инсерции, что он может служить для экспрессии любой кодирующей ДНК, встроенной в этот сайт, все эти регуляторные элементы хорошо известны в данной области. Так, например, вектор, не имеющий промотора, может стать экспрессирующим вектором в результате инсерции промотора вместе с кодирующей ДНК.

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ СПОСОБОВ

В патенте США 5364771 описано открытие гибридных молекул фактора VIII человека/свиньи, имеющих коагулянтную активность, в которых элементы молекулы фактора VIII человека или свиньи заменяют соответствующие элементы молекулы фактора VIII других видов. В патенте США 5663060 описаны прокоагулянтные гибридные молекулы фактора VIII человека/животного и эквивалентные гибридным молекулы фактора VIII, в которых элементы молекулы фактора VIII одного вида заменяют соответствующие элементы молекулы фактора VIII другого вида.

Поскольку существующая информация показывает, что В-домен не имеет ингибиторного эпитопа и не оказывает известного действия на функцию фактора VIII, в некоторых вариантах В-домен полностью или частично делетирован в активных гибридных или эквивалентных гибридным молекулах фактора VIII или его фрагментах ("В(-)-фактор VIII"), полученных любым из описанных здесь способов.

Ген фактора VIII человека был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих, как сообщалось Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood, W.I. et. al. (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. et al. (1984) Nature 312:337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; US Patent No. 4757006, и аминокислотная последовательность была расшифрована из кДНК. В патенте США с номером 4965199, выданном Capon et al., описан способ рекомбинантных ДНК для получения фактора VIII в клетках-хозяевах млекопитающих и очистки фактора VIII человека. Сообщалась экспрессия фактора VIII человека на клетках СНО (клетках яичника Китайского хомячка) и ВНКС (клетках почки детеныша хомячка). Фактор VIII человека был модифицирован для делеции части В-домена или всего В-домена (патент США №4868112) и была сделана попытка замены В-домена фактора VIII человека В-доменом фактора V человека (патент США №5004803). Последовательность кДНК, кодирующая фактор VIII человека, и предсказанная аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID NO:1 и 2 соответственно. В SEQ ID NO:1 кодирующий район начинается в положении нуклеотида 208, причем триплет GCC является кодоном для аминокислоты номер 1 (Ala) зрелого белка, показанного в SEQ ID NO:2.

Свиной фактор VIII был выделен из плазмы [Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594]. Частичная аминокислотная последовательность свиного фактора VIII, соответствующая частям N-концевой последовательности легкой цепи, имеющим гомологию относительно церулоплазмина и фактора коагуляции V, описана Church et al. (1984) Ргос, Natl. Acad. Sci. USA 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312:342-347 описали частичное секвенирование N-концевой стороны четырех аминокислотных фрагментов свиного фактора VIII, но не охарактеризовали эти фрагменты в отношении их положений в молекуле фактора VIII. Аминокислотная последовательность В-домена и части А2-домена свиного фактора VIII были сообщены Toole, J.J. et al. (1986) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. кДНК-последовательность, кодирующая полный А2-домен свиного фактора VIII, и предсказанная аминокислотная последовательность и гибридный фактор VIII человека/свиньи, имеющий замены всех доменов, все субъединицы и специфические аминокислотные последовательности описаны в патенте США 5364771, озаглавленном "Hybrid Human/Porcine factor VIII", выданном 15 ноября 1994 года и в WO 93/20093, опубликованном 14 октября 1993 года. кДНК-последовательность, кодирующая А2-домен свиного фактора VIII, соответствующий остаткам 373-740 в зрелом факторе VIII человека, показанном в SEQ ID NO:1, и предсказанная аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID NO:3 и 4 соответственно. Более недавно сообщались нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательности части А1-домена, не имеющего первых 198 аминокислот, и А2-домена свиного фактора VIII в WO 94/11503, опубликованном 26 мая 1994 года. Наконец, полная нуклеотидная последовательность, кодирующая свиной фактор VIII, включающий в себя полный А1-домен, пептид активации, A3-, С1- и С2-домены, а также кодируемая аминокислотная последовательность были получены Lollar, как описано в патенте США 5859204, выданном 12 января 1999 года, и в WO 97/49725, опубликованном 31 декабря 1997 года, оба включены здесь в качестве ссылки.

Как свиной, так и человеческий фактор VIII выделяют из плазмы в виде белка из двух субъединиц. Эти субъединицы, известные как тяжелая и легкая цепи, удерживаются вместе нековалентной связью, которая требует ионов кальция или другого двухвалентного металла. Тяжелая цепь фактора VIII содержит три домена, А1, А2 и В, которые связаны ковалентно. Легкая цепь фактора VIII также содержит три домена, названных A3, С1 и С2. В-домен не имеет известной биологической функции и может быть удален или частично удален из этой молекулы протеолитически или способами технологии рекомбинантных ДНК без значимого изменения какого-либо измеримого параметра фактора VIII. Рекомбинантный фактор VIII человека имеет структуру и функцию, сходную с полученным из плазмы фактором VIII, хотя он не является гликозилированным, если он не экспрессируется в клетках млекопитающих.

Активированный фактор VIII как человека, так и свиньи ("фактор VIIIa") имеет три субъединицы вследствие расщепления тяжелой цепи между доменами А1 и А2. Эта структура названа А1/А2/А3-С1-С2. Фактор VIIIa человека не является стабильным в условиях, которые стабилизируют свиной фактор VIIIa, предположительно вследствие слабой связи А2-субъединицы фактора VIIIa человека. Диссоциация А2-субъединицы фактора VIIIa человека и свиньи ассоциирована с потерей активности в молекуле фактора VIIIa. Yakhyaev, A. et al. (1997) Blood 90:Suppl. 1, Abstract #126 сообщали связывание А2-домена белком, родственным рецептору липопротеина низкой плотности, что позволяет предположить, что клеточное поглощение А2, опосредованное таким связыванием, действует, отрицательно регулируя активность фактора VIII.

Экспрессия «не содержащего В-домена фактора VIII» усиливается включением частей В-домена. Сообщалось, что включение этих частей В-домена, названных "SQ" [Lind, P. et al. (1995), supra], приводит к благоприятной экспрессии. Конструкции "SQ" не содержат всего В-домена человека за исключением 5 аминокислот N-конца В-домена и 9 аминокислот С-конца В-домена.

Очищенный гибридный фактор VIII или его фрагмент может быть тестирован на иммунореактивность и коагулирующую активность стандартными анализами, в том числе, например, анализом на свободный от плазмы фактор VIII, одностадийным анализом свертывания и твердофазным иммуноферментным анализом с использованием очищенного рекомбинантного фактора VIII человека в качестве стандарта.

Другие векторы, в том числе как плазмидные, так и эукариотические вирусные векторы, могут быть использованы для экспрессии рекомбинантной генной конструкции в эукариотических клетках в зависимости от предпочтения и оценки квалифицированного практика (см., например, Sambrook et al. Chapter 16). Могут быть использованы другие векторы и зкспрессионные системы, в том числе бактериальные, дрожжевые системы и системы клеток насекомых, но они не являются предпочтительными вследствие различий в гликозилировании или отсутствия гликозилирования.

Рекомбинантный белок фактора VIII может экспрессироваться в различных клетках, обычно используемых для культивирования и экспрессии рекомбинантных белков млекопитающих. В частности, было обнаружено, что ряд клеточных линий грызунов являются особенно применимыми хозяевами для экспрессии больших белков. Предпочтительные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур, Rockville, MD, включают в себя клетки почек детенышей хомячка и клетки яичников Китайского хомячка, которые культивируют с использованием рутинных процедур и обычных сред.

Основой для большей коагулянтной активности свиного фактора VIII является, по-видимому, более быстрая спонтанная диссоциация субъединицы А2 человека от фактора VIIIa человека, чем субъединицы А2 свиньи от свиного фактора VIIIa. Диссоциация субъединицы А2 приводит к потере активности, [Lollar, Р. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, P.J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13246-13250].

Молекулы фактора VIII с уменьшенной иммунореактивностью:

Эпитопы, которые являются иммунореактивными с антителами, ингибирующими коагулянтную активность фактора VIII («ингибиторами» или «ингибиторными антителами»), были охарактеризованы на основе известных взаимосвязей структуры и функции в факторе VIII. Предположительно, ингибиторы могли бы действовать разрушением любых макромолекулярных взаимодействий, связанных с доменной структурой фактора VIII, или его связей с фактором фон Виллебранда, тромбином, фактором Ха, фактором IXa или фактором X. Однако большинство ингибиторных антител к фактору VIII действуют посредством связывания с эпитопами, локализованными в А2-домене 40 кДа или С2-домене 20 кДа фактора VIII, разрушая специфические функции, связанные с этими доменами, как описано Fulcher et al. (2985) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; и Scandella et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85:6152-6156. Кроме эпитопов А2 и С2 может существовать третий эпитоп в домене A3 или домене С1 легкой цепи фактора VIII, согласно Scandella et al. (1993) Blood 82:1767-1775. Значение этого предположительного третьего эпитопа является неизвестным, но, по-видимому, он является ответственным за минорную часть реактивности эпитопа в факторе VIII.

Анти-А2-антитела блокируют активацию фактора X, как показано Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Прежние исследования по картированию с использованием делеционного мутагенеза, описанные Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3:703-716, локализовали А2-эпитоп в районе 20 кДа NH₂-концевой стороны А2-домена 40 кДа. Конкурентный иммунорадиометрический анализ показал, что ингибиторы А2 узнают либо общий эпитоп, либо тесно собранные эпитопы, как описано Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67:665-671 и как показано в патенте США 5859204.

Молекулы фактора VIII животных или модифицированного фактора VIII животных могут быть тестированы в людях на их уменьшенную антигенность и/или иммуногенность в клинических испытаниях. В одном типе испытания, предназначенном для определения, является ли фактор VIII иммунореактивным с ингибиторными антителами, фактор VIII вводят предпочтительно внутривенным вливанием приблизительно 25 пациентам, имеющим недостаточность фактора VIII, которые имеют антитела, ингибирующие коагулянтную активность терапевтического фактора VIII человека. Доза фактора VIII животного или модифицированного фактора VIII животного находится в диапазоне между 5 и 50 Единицами/кг веса тела, предпочтительно 10-50 Единицами/кг и наиболее предпочтительно 40 Единицами/кг веса тела. Спустя приблизительно 1 час после каждого введения выход фактора VIII из проб крови измеряют в одностадийном анализе свертывания. Пробы берут опять спустя приблизительно 5 часов после инфузии и измеряют выход. Общий выход и скорость исчезновения фактора VIII из этих проб являются предсказывающими в отношении титра антител и ингибиторной активности. Если титр антител является высоким, выход фактора VIII обычно не может быть измерен. Результаты извлечения сравнивают с результатами извлечения в пациентах, получавших полученный из плазмы фактор VIII человека, рекомбинантный фактор VIII человека, полученный из плазмы свиной фактор VIII и другие обычно применяемые терапевтические формы фактора VIII или заменителей фактора VIII.

После идентификации клинически важных эпитопов могут быть экспрессированы рекомбинантные молекулы фактора VIII, которые имеют меньшую или равную перекрестную реактивность в сравнении с полученным из плазмы свиным фактором VIII при испытании in vitro против широкого спектра ингибиторных плазм. Для снижения перекрестной реактивности может быть проведен дополнительный мутагенез в районах эпитопа. Пониженная перекрестная реактивность, хотя и желательная, не является необходимой для получения продукта, который может иметь преимущества над существующим концентратом полученного из плазмы свиного фактора VIII, который может давать побочные действия вследствие примесных свиных белков или загрязняющих инфекционных агентов, таких как вирусы или прионы. Рекомбинантная молекула свиного или модифицированного свиного фактора VIII не будет содержать чужеродных свиных белков.

Диагностические анализы

кДНК фактора VIII и/или экспрессируемый из нее белок, в целом виде или в виде части, могут быть использованы в анализах в качестве диагностических реагентов для обнаружения ингибиторных антител к фактору VIII человека или животных или к модифицированному фактору VIII животных в субстратах, в том числе, например, пробах сыворотки и жидкостей тела пациентов-людей с недостаточностью фактора VIII. Эти анализы антител включают в себя такие анализы, как ELISA, иммуноблоты, радиоиммуноанализы, иммунодиффузионные анализы и анализ биологической активности фактора VIII (например, анализ свертывания). Способы приготовления этих реагентов и способы их применения хорошо известны специалистам в данной области. Например, иммуноанализ для обнаружения ингибиторных антител в пробе сыворотки пациента может включать в себя реакцию тест пробы с достаточным количеством тестируемого фактора VIII, чтобы испытать, что детектируемый комплекс может быть образован с ингибиторными антителами в пробе или что тестируемый фактор VIII действительно является антигенным.

Могут быть приготовлены зонды нуклеиновых кислот и аминокислот на основе последовательности молекулы кДНК или молекулы белка гибридного фактора VIII или их фрагментов. В некоторых вариантах они могут быть помечены с использованием красителей или ферментных, флуоресцентных, хемилюминесцентных или радиоактивных меток, которые являются коммерчески доступными. Аминокислотные зонды могут использоваться, например, для скрининга сывороток или других физиологических жидкостей (жидкостей тела), где ожидается присутствие ингибиторов фактора VIII человека, животного или гибридного фактора VIII человека/животного. Уровни ингибиторов могут быть определены количественно в пациентах и сравнены со здоровыми контролями и могут быть использованы, например, для определения, может ли недостаточность фактора VIII лечиться фактором VIII животного или модифицированным фактором VIII животного. Зонды кДНК могут быть использованы, например, для исследовательских целей в скрининге библиотек ДНК.

Фармацевтические композиции.

Фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII, один или в комбинации с подходящими фармацевтическими стабилизирующими соединениями, доставляющими носителями и/или переносящими носителями, готовят в соответствии с известными способами, например, описанными в Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin.

В одном предпочтительном варианте предпочтительными носителями или доставляющими носителями для внутривенной инфузии являются солевой раствор или забуференный фосфатом солевой раствор.

В другом предпочтительном варианте подходящие стабилизирующие соединения, доставляющие носители и носители-переносчики, включают в себя, но не ограничиваются ими, другие белки человека или животного, такие как альбумин.

Фосфолипидные носители или липосомные суспензии также являются предпочтительными в качестве фармацевтически приемлемых переносящих или доставляющих носителей. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области, и могут содержать, например, фосфатидилсерин/фосфатидилхолин или другие композиции фосфолипидов или детергентов, которые вместе придают отрицательный заряд поверхности, так как фактор VIII связывается с отрицательно заряженными фосфолипидными мембранами. Липосомы могут быть получены растворением подходящего липида (подходящих липидов) (таких как стеароилфосфатидилэтаноламин, стеароилфосфатидилхолин, арахадоилфосфатидилхолин и холестерин) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают с оставлением тонкой пленки высушенного липида на поверхности контейнера. Затем в этот контейнер вводят водный раствор гибридного фактора VIII. Затем контейнер встряхивают вручную для высвобождения липидного материала от стенок контейнера и диспергирования липидных агрегатов с образованием таким образом суспензии липосом.

Рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII может быть комбинирован с другими подходящими стабилизирующими соединениями, доставляющими носителями и/или носителями-переносчиками, в том числе зависимыми от витамина К факторами свертывания, тканевым фактором, фактором фон Виллебранда (vWf) или фрагментом vWf, который содержит сайт связывания фактора VIII, и полисахаридами, такими как сахароза.

Рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII может также доставляться гемотерапией таким же образом, как может доставляться фактор VIII человека, с использованием таких средств доставки, как ретровирусные векторы. Этот способ состоит во включении желаемой конструкции кДНК фактора VIII в клетки человека, которые трансплантируют непосредственно в имеющего недостаточность фактора VIII пациента или которые помещают в имплантируемое приспособление, проницаемое для молекул фактора VIII, но не проницаемое для клеток, которое затем трансплантируют. Предпочтительным способом является опосредованный ретровирусом перенос гена. В этом способе экзогенный ген (например, кДНК фактора VIII) клонируют в геном модифицированного ретровируса. Этот ген встраивается посредством вирусного аппарата в геном клетки-хозяина, где он будет экспрессироваться этой клеткой. Ретровирусный вектор модифицируют таким образом, что он не будет продуцировать вирус, что предотвращает вирусную инфекцию хозяина. Общие типы терапии этого типа известны специалистам в данной области и были рассмотрены в литературе [например, Kohn, D.B. et al. (1989) Transufusion 29:812-820].

Свиной или модифицированный свиной фактор VIII может храниться в связанном с vWf виде для увеличения полупериода существования и срока хранения этой гибридной молекулы. Дополнительно, лиофилизация фактора VIII может улучшить выход активных молекул в присутствии vWf. Существующие способы хранения фактора VIII человека и животных, используемые коммерческими поставщиками, могут применяться для хранения рекомбинантного фактора VIII. Эти способы включают в себя: (1) лиофилизацию фактора VIII в частично очищенном состоянии (в виде "концентрата" фактора VIII, который используют для инфузии без дополнительной очистки); (2) иммуноаффинную очистку фактора VIII по способу Циммермана и лиофилизацию в присутствии альбумина, который стабилизирует фактор VIII; (3) лиофилизацию рекомбинантного фактора VIII в присутствии альбумина.

Кроме того, было обнаружено, что свиной или модифицированный свиной фактор VIII является бесконечно стабильным при 4°С в 6 М NaCl, 20 мМ MES и 5 мМ CaCl₂ при рН 6,0 и может также храниться замороженным в этих буферах и оттаиваться с минимальной потерей активности.

Способы лечения

Рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII используют для лечения неостанавливаемого кровотечения, вызываемого недостаточностью фактора VIII (например, внутрисуставного, внутричерепного или желудочно-кишечного кровотечения) в больных гемофилией с ингибиторными антителами или без ингибиторных антител и в больных с приобретенной недостаточностью фактора VIII, вызываемой развитием ингибиторных антител. Активные материалы вводят предпочтительно внутривенно.

Кроме того, рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII может вводиться трансплантацией клеток, сконструированных генетически для продуцирования белка, имплантацией приспособления, содержащего такие клетки, как описано выше.

В предпочтительном варианте фармацевтические композиции рекомбинантного свиного или модифицированного свиного фактора VIII, одного или в комбинации со стабилизаторами, доставляющими носителями и/или переносчиками, вводят внутривенной инфузией в пациентов в соответствии стой же самой процедурой, которую используют для инфузии фактора VIII человека или животного.

Терапевтические дозы композиции рекомбинантного свиного или модифицированного свиного фактора VIII, которые должны вводиться пациенту, нуждающемуся в такой терапии, будут варьироваться в зависимости от тяжести недостаточности фактора VIII. Обычно уровень доз корректируют по частоте, продолжительности и количеству единиц в соответствии с тяжестью и продолжительностью каждого эпизода кровотечения пациента. Таким образом, фактор VIII включают в фармацевтически приемлемый носитель, доставляющий носитель или стабилизатор в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества этого белка для остановки кровотечения, измеряемого стандартными анализами свертывания.

Фактор VIII определяется классически как вещество, присутствующее в плазме нормальной крови, которое корректирует дефект свертывания в плазме, полученной из индивидуумов с гемофилией А. Коагулирующую (коагулянтную) активность in vitro очищенных или частично очищенных форм фактора VIII используют для расчета дозы фактора VIII для инфузий в пациентов-людей, и она является надежным индикатором активности, извлекаемой из плазмы пациента и коррекции дефекта кровотечения in vivo. He сообщались противоречия между стандартным анализом новых молекул фактора VIII in vitro и их поведением в инфузионной модели собаки или в пациентах-людях, согласно Lusher, J.M. et al. New Engl. J. Med. 328:453-459; Pittman, D.D. et al. (1992) Blood 79:389-397 и Brinkhous et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8752-8755.

Обычно желаемый уровень активности фактора VIII в плазме, который должен быть достигнут в пациенте посредством введения рекомбинантного свиного или модифицированного свиного фактора VIII, находится в диапазоне 30-100% от нормального уровня. В предпочтительном способе введения терапевтического фактора VIII эта композиция предоставляется внутривенно в предпочтительной дозе в диапазоне от приблизительно 5 до 50 единиц/кг веса тела, более предпочтительно в диапазоне 10-50 единиц/кг веса тела и наиболее предпочтительно в дозе 20-40 единиц/кг веса тела; интервал частоты введения находится в диапазоне от приблизительно 8 до 24 часов (в больных с тяжелой гемофилией); и продолжительность лечения в днях находится в диапазоне от 1 до 10 дней или до тех пор, пока эпизод кровотечения не прекратится. См., например, Roberts, H.R., and M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions - Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)," Ch. 153, 1453-1474, 1460, in Hematology, Williams, W.J., et al., ed. (1990). Пациентам с ингибиторами может потребоваться отличающееся количество рекомбинантного свиного или модифицированного свиного фактора VIII, чем их прежней формы фактора VIII. Например, пациентам может потребоваться меньшее количество рекомбинантного свиного или модифицированного свиного фактора VIII вследствие его более высокой удельной активности, чем удельная активность фактора VIII человека, и его уменьшенной реактивности с антителами. Как и в лечении человеческим или полученным из плазмы свиным фактором VIII, количество терапевтического фактора VIII, вводимого инфузией, определяется при помощи одностадийного анализа свертывания фактора VIII и в выбранных случаях выход in vivo определяют измерением фактора VIII в плазме пациента после инфузии. Должно быть понятно, что для любого конкретного субъекта конкретная схема введения доз должна корректироваться на протяжении времени в соответствии с индивидуальной потребностью и в соответствии с профессональной оценкой лица, вводящего композиции и или отвечающего за введение композиций, и что диапазоны концентраций, установленные здесь, являются лишь примерными и не предназначены для ограничения объема или практики применения заявленной композиции.

Лечение может иметь форму единственного внутривенного введения композиции или периодического или непрерывного введения на протяжении продолжительного периода времени, по необходимости. Альтернативно, терапевтический фактор VIII может вводиться подкожно или перорально с липосомами в виде одной или нескольких доз при варьирующихся интервалах времени.

Рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII может быть также использован для лечения неостанавливаемого кровотечения вследствие недостаточности фактора VIII в больных гемофилией, которые развили антитела к фактору VIII человека. В этом случае коагулирующая активность, которая превосходит коагулирующую активность одного фактора VIII человека или животного, не является необходимой. Коагулирующая активность, которая является более низкой, чем коагулирующая активность фактора VIII человека (т.е. меньшая, чем 3000 единиц/мг), будет применима, если эта активность не нейтрализуется антителами в плазме пациента.

Здесь было показано, что рекомбинантный свиной или модифицированный свиной фактор VIII может отличаться по удельной активности от фактора VIII человека. Белки фактора VIII, имеющие более высокую прокоагулянтную активность, чем фактор VIII человека, применимы в лечении гемофилии, так как будут требоваться более низкие дозы для коррекции недостаточности фактора VIII человека. Факторы VIII, имеющие более низкую прокоагулянтную активность, чем фактор VIII человека, также пригодны для терапевтического применения при условии, что они имеют по меньшей мере 1% удельной активности в сравнении с фактором VIII здорового человека. Таким образом, фактор VIII данного изобретения, имеющий прокоагулянтную активность, определяется как имеющий по меньшей мере 1% удельной активности фактора VIII человека.

Молекула рекомбинантного свиного или модифицированного свиного фактора VIII и способы ее выделения, характеристики, получения и применения, описанные выше в общих чертах, будут более понятными со ссылкой на следующие не ограничительные примеры.

Пример 1: Анализ свиного фактора VIII и гибридного фактора VIII человека/свиньи

Свиной фактор VIII имеет более высокую коагулирующую активность, чем фактор VIII человека, на основе удельной активности этой молекулы. Этот вывод основывается на применении подходящих стандартных кривых, которые позволяют беспристрастно сравнивать фактор VIII человека и свиньи. Анализы свертывания основаны на способности фактора VIII укорачивать время свертывания плазмы, полученной из пациента с гемофилией А. Используют два типа анализов: одностадийный и двухстадийный анализ.

В одностадийном анализе 0,1 мл плазмы больного гемофилией A (George King Biomedical, Inc.) инкубировали с 0,1 мл реагента для активированного парциального тромбопластинового времени (АРТТ) (Organon Teknika) и пробой 0,01 мл или стандарта, состоящего из разбавленной цитратной плазмы здорового человека, в течение 5 мин при 37°С на водяной бане. Инкубирование сопровождалось добавлением 0,1 мл 20 мМ CaCl₂, а время развития фибринового сгустка определяли визуальным наблюдением.

Единица фактора VIII определяется как количество, присутствующее в 1 мл цитратной плазмы нормального человека. С плазмой человека в качестве стандарта сравнивали непосредственно активность свиного и человеческого фактора VIII. Разведения стандартной плазмы или очищенных белков готовили в 0,15 М NaCl, 0,02 М HEPES, рН 7,4. Стандартную кривую строили на основании 3 или 4 разведении плазмы, причем наивысшим было разведение 1/50, и на основании log₁₀-времени свертывания, построенного против log₁₀-концентрации плазмы, что приводило к линейному графику. Единицы фактора VIII в неизвестной пробе определяли интерполяцией из стандартной кривой.

Одностадийный анализ основан на эндогенной активации фактора VIII активаторами, образуемыми в плазме человека с гемофилией А, тогда как двухстадийный анализ измеряет прокоагулянтную активность предварительно активированного фактора VIII. В двухстадийном анализе пробы, содержащие фактор VIII, которые взаимодействовали с тромбином, добавляли к смеси реагента для активированного парциального тромбопластинового времени и плазмы человека с гемофилией А, которая была прединкубирована в течение 5 мин при 37°С. Затем полученные времена свертывания преобразовывали в единицы/мл на основе той же самой стандартной кривой плазмы человека, описанной выше. Относительная активность в двухстадийном анализе была более высокой, чем в одностадийном анализе, поскольку фактор VIII был предварительно активирован.

Пример 2: Характеристика функционального различия между фактором VIII человека и свиньи

Выделение полученного из плазмы фактора VIII человека и рекомбинантый фактор VIII человека были описаны в литературе в Fulcher, С.A. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1648-1652; Toole et al. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier et al. (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar et al. Nature 312:337-342 (Genentech); Fass et al. (1982) Blood 59:594; Toole etal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. Это может быть выполнено несколькими путями. Все эти препараты являются сходными по составу субъединиц, хотя имеется функциональное различие в стабильности между человеческим и свиным фактором VIII.

Для сравнения человеческого рекомбинантного и свиного фактора VIII препараты высокоочищенного рекомбинантного фактора VIII человека (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) и свиного фактора VIII [иммуннно очищенного, как описано в Fass et al. (1982) Blood 59:594] подвергали жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) через Mono Q™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) анионообменную колонку (Pharmacia, Inc.). Целью стадии Mono Q™-ЖХВД было элиминирование минорных примесей обмена человеческого и свиного фактора VIII в общем буфере для сравнительных целей. Флаконы, содержащие 1000-2000 единиц фактора VIII, восстанавливали до раствора 5 мл Н₂О. Затем добавляли HEPES (2 М при рН 7,4) до конечной концентрации 0,02 М. Фактор VIII наносили на колонку Mono Q™ HR 5/5, уравновешенную в 0,15 М NaCl, 0,02 М HEPES, 5 мМ CaCl₂, при рН 7,4 (Буфер А плюс 0,15 М NaCl); промывали 10 мл смеси Буфер А + 0,15 М NaCl и элюировали 20 мл линейного градиента 0,15 М-0,90 М NaCl в Буфере А при скорости тока 1 мл/мин.

Для сравнения полученного из плазмы фактора VIII человека (очищенного при помощи Mono Q™-ЖХВД) и свиного фактора VIII иммуноаффинно очищенного, полученный из плазмы свиной фактор VIII разбавляли 1:4 0,04 М HEPES, 5 мМ CaCl₂, 0,01% Твин-80, при рН 7,4, и подвергали Mono Q™-ЖХВД при тех же самых условиях, которые описаны в предыдущем абзаце для фактора VIII человека. Эти процедуры для выделения фактора VIII человека и свиньи являются стандартными для специалистов с квалификацией в данной области.

Колоночные фракции анализировали на активность фактора VIII с использованием одностадийного анализа свертывания. Средние результаты этих анализов, выраженные в единицах активности на A₂₈₀ материала, приведены в таблице и показывают, что свиной фактор VIII имеет по меньшей мере в 6 раз более высокую активность, чем фактор VIII человека, при применении одностадийного анализа.

Таблица Сравнение коагулирующей активности фактора VIII человека и свиньи
	Активность (Е/А280
Свиной	21300
Полученный из плазмы человека	3600
Рекомбинантный человеческий	2400

Пример 3: Сравнение стабильности фактора VIII человека и свиньи

Результаты одностадийного анализа для фактора VIII отражают активацию фактора VIII до фактора VIIIa в пробе и, возможно, потерю активности образовавшегося фактора VIIIa. Проводили прямое сравнение стабильности фактора VIII человека и свиньи. Пробы из Mono Q™-ЖХВД (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) разбавляли до одной и той же концентрации и буфером одного и того же состава и давали им взаимодействовать с тромбином. В разные временные точки пробы брали для двух стадийного анализа свертывания. Обычно максимум (пик) активности (при 2 мин) был в 10 раз более высоким для свиного фактора VIIIa, чем для человеческого фактора VIIIa, и активности как свиного, так и человеческого фактора VIIIa затем уменьшались, причем активность фактора VIIIa человека уменьшалась более быстро.

Обычно попытки выделения стабильного фактора VIIIa человека являются безуспешными, даже когда используют условия, дающие стабильный свиной фактор VIIIa. Для демонстрации этого Mono Q™-ЖХВД-очищенный фактор VIII человека активировали тромбином и подвергали Mono S™-катионообменной ЖХВД (Pharmacia, Inc.) в условиях, которые дают стабильный свиной фактор VIIIa, как описано Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666.

Человеческий фактор VIII, 43 мкг/мл (0,2 мкМ) в 0,2 М NaCl, 0,01 М HEPES, 2,5 мМ CaCl₂ при рН 7,4, в 10 мл общего объема, взаимодействовал с тромбином (0,036 мкМ) в течение 10 мин, и в это время добавляли FPR-CH₂Cl (D-фенил-пролил-аргинил-хлорметилкетон) до концентрации 0,2 мкМ для необратимой инактивации тромбина. Затем эту смесь разбавляли 1:1 40 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 5 мМ CaCl₂, при рН 6,0 и наносили при скорости 2 мл/мин на колонку Mono S™-HR 5/5-ЖХВД (Pharmacia, Inc.), уравновешенную в 5 мМ MES, 5 мМ CaCl₂, при рН 6,0 (Буфер В) плюс 0,1 М NaCl. Фактор VIIIa элюировали без промывания колонки 20 мл градиента от 0,1 М NaCl до 0,9 М NaCl в Буфере В при скорости тока 1 мл/мин.

Фракции с коагулирующей активностью в двухстадийном анализе элюировались в виде единственного пика при этих условиях. Удельная активность фракций пика была приблизительно 7500 Е/А₂₈₀. Гель-электрофорез в додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) пика фактора VIIIa с колонки Mono S™ с последующим окрашиванием серебром выявил две полосы, соответствующие гетеродимерному производному фактора VIII (А3-С1-С2/А1). Хотя А2-фрагмент не был идентифицирован окрашиванием серебром при этих условиях вследствие его низкой концентрации, он был идентифицирован как компонент в следовых количествах посредством ¹²⁵I-мечения.

В противоположность результатам с фактором VIII человека, свиной фактор VIIIa, выделенный Mono S™-ЖХВД при тех же самых условиях, имел удельную активность 1,6×10⁶ Е/А₂₈₀. Анализ свиного фактора VIIIa при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ выявил 3 фрагмента, соответствующих субъединицам А1, А2 и А3-С1-С2, что показало, что свиной фактор VIIIa имеет три субъединицы.

Результаты Mono S™-ЖХВД препаратов активированного тромбином фактора VIII человека при рН 6,0 показали, что фактор VIIIa человека является лабильным при условиях, которые дают стабильный свиной фактор VIIIa. Однако хотя следовые количества А2-фрагмента были идентифицированы во фракции пика, определение, происходила ли коагулирующая активность из небольших количеств гетеротримерного фактора VIII или из гетеродимерного фактора VIIIa, который имеет низкую удельную активность, является невозможным при применении только этого способа.

Для решения этого вопроса желательным является способ выделения фактора VIIIa человека до того, как он потеряет его А2-субъединицу. Для этой цели выделение выполняли с использованием процедуры, которая включает в себя снижение рН Mono S™-буферов до рН 5. Mono Q™-очищенный фактор VIII человека (0,5 мг) разбавляли H₂O с получением конечной концентрации 0,25 мг/мл (1 мкМ) фактора VIII в 0,25 М NaCl, 0,01 М HEPES, 2,5 мМ CaCl₂, 0,005% Твине-80, при рН 7,4 (общий объем 7,0 мл). Тромбин добавляли до конечной концентрации 0,072 мкм и давали реагировать в течение 3 мин. Затем тромбин инактивировали FPR-CH₂Cl (0,2 мкм). Затем эту смесь разбавляли 1:1 40 мМ ацетатом натрия, 5 мМ CaCl₂, 0,01% Твином-80, при рН 5,0 и наносили при скорости тока 2 мл/мин на колонку Mono S™-HR 5/5-ЖХВД, уравновешенную в 0,01 М ацетате натрия, 5 мМ CaCl₂, 0,01% Твине-80, при рН 5,0, плюс 0,1 М NaCl. Фактор VIIIa элюировали без промывания колонки 20 мл градиента от 0,1 М NaCl до 1,0 М NaCl в том же самом буфере при скорости тока 1 мл/мин. Это приводило к извлечению коагулирующей активности в пике, который содержал детектируемые количества фрагмента А2, как показано электрофорезом в ДСН-ПААГ и окрашиванием серебром. Удельная активность фракции пика была в 10 раз более высокой, чем удельная активность, которая извлекалась при рН 6,0 (75000 Е/А₂₈₀ против 7500 Е/А₂₈₀). Однако в противоположность свиному фактру VIIIa, выделенному при рН 6,0, который был бесконечно стабильным при 4°С, активность фактора VIIIa человека уменьшалась равномерно на протяжении периода нескольких часов после элюции из Mono S™. Кроме того, удельная активность фактора VIIIa, очищенного при рН 5,0, определенная немедленно, составляет только 5% от активности свиного фактора VIIIa, что указывает на то, что перед анализом имеет место существенная диссоциация.

Эти результаты демонстрируют, что как человеческий, так и свиной фактор VIIIa состоит из трех субъединиц (А1, А2 и А3-С1-С2). Диссоциация субъединицы А2 является ответственной за потерю активности как человеческого, так и свиного фактора VIIIa в определенных условиях, таких как физиологические ионная сила, рН и концентрация. Относительная стабильность свиного фактора VIIIa в определенных условиях объясняется более сильной связью с субъединицей А2.

Пример 4: Выделение и секвенирование ДНК, кодирующей А2-домен свиного фактора VIII

Ранее была секвенирована только нуклеотидная последовательность, кодирующая В-домен и часть А2-домена свиного фактора VIII [Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942]. Здесь описаны последовательность кДНК и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3 и 4 соответственно) для всего А2-домена свиного фактора VIII.

А2-домен свиного фактора VIII клонировали обратной транскрипцией тотальной РНК свиной селезенки и ПЦР-амплификацией; использовали вырожденные праймеры на основе известной кДНК-последовательности фактора VIII человека и точный свиной праймер на основе части последовательности свиного фактора VIII. ПЦР-продукт 1 т.п.н. выделяли и амплифицировали инсерцией в фагмидный вектор Bluescript™ (Stratagene).

Свиной А2-домен был полностью секвенирован дидезокси-секвенированием. кДНК-последовательность и предсказанная аминокислотная последовательность представлены в SEQ ID NO:3 и 4 соответственно.

Пример 5: Полная последовательность ДНК, кодирующей свиной фактор VIII

Фрагмент Кленова, фосфорилированные линкеры Clal, линкеры Notl, лигазу Т4 и ДНК-полимеразу Taq покупали из Promega (Madison, Wisconsin). Полинуклеотидкиназу приобретали из Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. γ³²Р-АТФ (Redivue, >5000 Ки/ммоль) покупали из Amersham. pBluescript II-KS- и клетки Е. coli Epicurean XL1-Blue покупали из Stratagene (La Jolla, California). Синтетические олигонуклеотиды покупали из Life Technologies, Inc. или Cruachem, Inc. Когда ПЦР-продукты получали для целей клонирования, использовали 5'-фосфорилированные праймеры. Нуклеотидная (nt) нумерация олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров для амплификации с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК или геномной ДНК свиного фактора fVIII (fVIII), использует кДНК fVIII человека в качестве стандарта (ссылки) (Wood et al. (1984) supra).

Тотальную РНК селезенки свиньи выделяли экстракцией смесью кислый гуанидинийтиоцианат-фенол-хлорофом [Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]. Свиную кДНК получали из тотальной РНК селезенки с использованием обратной транскриптазы (ОТ) вируса лейкоза Молони мышей и случайных гексамеров для праймирования этой реакции (набор для синтеза первой цепи кДНК, Pharmacia Biotech), если нет иных указаний. ОТ-реакции содержали 45 мМ Трис-Cl, рН 8,3, 68 мМ KCl, 15 мМ ДТТ, 9 мМ MgCl₂, 0,08 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 1,8 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP). Свиную геномную ДНК выделяли из селезенки с использованием стандартной процедуры (Strauss, W.M. (1995) In Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., editors, John Wiley and Sons, pp. 2.2.1-2.2.3). Выделение ДНК из агарозных гелей выполняли с использованием набора для экстракции гелей Geneclean II (Bio 101) или Quiex II (Qiagen).

ПЦР-реакции выполняли с использованием термоциклера Hybaid OmniGene. Для ПЦР-реакций с использованием ДНК-полимеразы Taq реакционные смеси включали в себя 0,6 мл MgCl₂, 0,2 мМ dNTP, 0,5 мкМ олигонуклеотидных праймеров, 50 Е/мл полимеразы и 0,1 объем реакционной смеси для первой цепи кДНК. За исключением случаев, где даны другие указания, ПЦР-продукты очищали из геля, концы затупляли фрагментом Кленова, осаждали этанолом и либо лигировали с сайтом EcoRV дефосфорилированной плазмиды pBluescript II KS-, либо лигировали с фосфорилированными линкерами Clal при помощи Т4-лигазы, расщепляли Clal, очищали посредством Sephacryl 3400-хроматографии и лигировали с разрезанной Clal, дефосфорилированной плазмидой pBluescript II KS-. Лигирования выполняли с ДНК-лигазой Т4 (набор для быстрого лигирования ДНК, Boehringer Mannheim) за исключением случаев, где указано по-другому. Содержащие инсерт плазмиды pBluescript II KS- использовали для трансформации клеток Е.coli Epicurean XL1-Blue.

Секвенирование плазмидной ДНК выполняли с использованием автоматического ДНК-секвенатора Applied Biosystems 373a и набора для терминации с использованием красителя PRISM или мануально с использованием набора для секвенирования Sequenase v. 2,0 (Amersham Corporation). Прямое секвенирование ПЦР-продуктов, в том числе ³²Р-концевое мечение олигонуклеотидов, выполняли с использованием протокола циклического секвенирования (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies).

Выделение кДНК-клонов свиного fVIII. содержащих 5' UTR-последовательность, кодоны сигнального пептида и А1-домена

кДНК свиного fVIII 5' (слева) от А2-домена амплифицировали ОТ-ПЦР с вмонтированными праймерами тотальной РНК селезенки самки свиньи с использованием протокола быстрой амплификации 5'-конца кДНК (5'-RACE) (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). Этот протокол включал в себя синтез первой цепи кДНК с использованием докирующего (стыкующего) по типу затвора олиго(дТ)-праймера [Borson, N.D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2:144-148], синтез второй цепи кДНК с использованием ДНК-полимеразы I Е.coli и лигирование с 5'-удлиненным двухцепочечным адаптером, SEQ ID NO:5

5'-СТА АТА CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3

3'-H₂N-CCCGTCCA-PO₄-5'

короткую цепь которого блокировали на 3'-конце аминогруппой для уменьшения неспецифического ПЦР-праймирования и который был комплементарен 8 нуклеотидам на 3'-конце (Siebert, P.D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23:1087-1088). Первый раунд ПЦР выполняли с использованием адаптер-специфического олигонуклеотида, SEQ ID NO:6 5'-ССА ТСС ТАА ТАС GAC ТСА СТА TAG GGC-3' (названного АР1) в качестве смыслового праймера и специфического для А2-домена свиного fVIII олигонуклеотида SEQ ID NO:7 5'-CCA TTG АСА TGA AGA CCG TTT CTC-3' (нуклеотиды 2081-2104) в качестве антисмыслового праймера. Второй раунд ПЦР выполняли с использованием вмонтированного, адаптер-специфического олигонуклеотида, SEQ ID NO:8 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (названного АР2) в качестве смыслового праймера и вмонтированного специфического для А2-домена свиного fVIII олигонуклеотида SEQ ID NO:9 5'-GGG TGC AAA GCG CTG АСА ТСА GTG-3' (нуклеотиды 1497-1520) в качестве антисмыслового праймера. ПЦР проводили с использованием коммерческого набора (Advantage cDNA PCR core kit), который использует опосредованный антителом протокол с горячим стартом [Kellogg, D.E. et al. (1994) BioTechniques 16:1134-1137]. Условия ПЦР включают в себя денатурацию при 94°С в течение 60 сек, затем 30 циклов (первая ПЦР) или 25 циклов (вторая ПЦР) денатурации в течение 30 сек при 94°С, отжиг в течение 30 сек при 60°С и удлинение в течение 4 мин при 68°С с использованием температурного контроля пробирки. Эта процедура давала заметный продукт -1,6 т.п.н., который согласовался с амплификацией фрагмента, удлиняющегося на приблизительно 150 п.н. в 5'-UTR. ПЦР-продукт клонировали в pBluescript с использованием линкеров Clal. Инсерты четырех клонов секвенировали в обоих направлениях.

Последовательность этих клонов включала районы, соответствующие 137 п.н. 5'-UTR, сигнальному пептиду, А1-домену и части А2-домена. Консенсус достигался по меньшей мере в 3 из 4 сайтов. Однако эти клоны содержали в среднем 4 очевидные ПЦР-генерируемые мутации, предположительно вследствие множественных раундов ПЦР, требуемых для генерирования клонируемого продукта. Таким образом, авторы изобретения использовали последовательность, полученную из района сигнального пептида, для конструирования фосфорилированного ПЦР-праймера смысловой цепи, SEQ ID NO:10 5'-CCT CTCGAG ССА ССА TGT CGA GCC ACC ATG CAG СТА GAG CTC TCC ACC TG-3', названного RENEOPIGSP, для синтеза другого ПЦР-продукта для подтверждения этой последовательности и для клонирования в экспрессирующий вектор. Последовательность, показанная жирным шрифтом, обозначает стартовый кодон. Последовательность 5' (слева) от него обозначает последовательность, идентичную последовательности 5' (слева) от сайта инсерции в экспрессирующий вектор млекопитающего ReNeo, используемый для экспрессии fVIII (Lubin et al. (1994) supra). Этот сайт включает в себя сайт расщепления Xhol (подчеркнутый). RENEOPIGSP и олигонуклеотид из нуклеотидов 1497-1520 использовали для праймирования опосредованной ДНК-полимеразой Taq ПЦР-реакции с применением кДНК селезенки самки свиньи в качестве матрицы. ДНК-полимеразы от нескольких других поставщиков не могли давать детектируемый продукт. Условия ПЦР включали в себя денатурацию при 94°С в течение 4 мин, затем 35 циклов денатурации в течение 1 мин при 94°С, отжиг в течение 2 мин при 55°С и удлинение в течение 2 мин при 72°С с последующей конечной стадией удлинения в течение 5 мин при 72°С. ПЦР-продукт клонировали в pBluescript с использованием линкеров Clal. Инсерты двух из этих клонов секвенировали в обоих направлениях и сопоставляли консенсусную последовательность.

Выделение кДНК-клонов свиного fVIII, содержащих кодоны доменов A3. С1 и 5'-половины домена С2

Сначала клонировали два ОТ-ПЦР-продукта селезенки свиньи, соответствующие фрагменту В-А3-домена (нуклеотиды 4519-5571) и фрагменту домена С1-С2 (нуклеотиды 6405-6990). 3'-конец С2-домена, который получали, удлинялся в район экзона 26, который является концевым экзоном в fVIII. B-A3-продукт получали с использованием специфического для В-домена свиньи праймера, SEQ ID NO:11 5'-CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T-3', где подчеркнутый район соответствует району в свином fVIII, который сопоставляется с нуклеотидами 4519-4530 в fVIII человека. 5'-район этого олигонуклеотида включает в себя сайт Notl, который первоначально предназначался для целей клонирования. Антисмысловой праймер, использованный в генерировании В-А3-продукта, SEQ ID NO:12 5'-GAA ATA AGC ССА GGC TTT GCA GTC RAA-3' был основан на обратном комплементе кДНК-последовательности fVIII человека при нуклеотидах 5545-5571. ПЦР-реакция содержала 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-Cl, рН 9,0, 0,1% Тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl₂, 2,5 мМ dNTP, 20 мкМ праймеры, 25 единиц/мл ДНК-полимеразы Taq и 1/20 объема реакционной смеси ОТ. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 3 мин с последующими 30 циклами денатурации в течение 1 мин при 94°С, отжиг в течение 2 мин при 50°С и удлинение в течение 2 мин при 72°С. ПЦР-продукты фосфорилировали с использованием ДНК-киназы Т4 и добавляли линкеры Notl. После разрезания Notl ПЦР-фрагменты клонировали в сайт Notl pBluescript II KS- и трансформировали в клетки XL1-Blue.

С1-С2-продукт получали с использованием известной последовательности кДНК человека для синтеза смыслового и антисмыслового праймеров, SEQ ID NO: 13 5'-AGG AAA ТТС САС TGG AAC CTT N-3' (нуклеотиды 6405-6426) и SEQ ID NO: 14 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (обратный комплемент нуклеотидов 6966-6990 соответственно. Условия ПЦР были идентичны условиям, используемым для генерирования В-А2-продукта. Полученный фрагмент лигировали с клонирующим вектором pNOT с использованием системы клонирования Prime PCR Cloner Cloning system (5 Prime-3-Prime, Inc., Boulder, Colorado) и выращивали в клетках JM109.

В-А3- и С1-С2-плазмиды частично секвенировали для получения специфических для свиньи смыслового и антисмыслового олигонуклеотидов, SEQ ID NO:15 5'-GAG ТТС АТС GGG AAG ACC TGT TG-3' (нуклеотиды 4551-4573) и SEQ ID NO:16 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (нуклеотиды 6541-6564) соответственно. Эти олигонуклеотиды использовали в качестве праймеров для получения ОТ-ПЦР-продукта 2013 п.н. с использованием набора для ПЦР кДНК Clontech Advantage cDNA PCR kit. Этот продукт, который соответствует нуклеотидам 4551-6564 человека, включает в себя район, соответствующий пептиду активации легкой цепи (нуклеотиды 5002-5124), А3-домену (нуклеотиды 5124-6114) и большей части С1-домена (нуклеотиды 6115-6573). Последовательность С1-С2-клона установила, что кДНК человека и свиньи от нуклеотида 6565 до 3'-конца С1-домена были идентичными. ПЦР-продукт клонировали в сайт EcoRV pBluescript II KS-. Четыре клона были полностью секвенированы в обоих направлениях. Консенсус достигался по меньшей мере в 3 из 4 сайтов.

Выделение кДНК-клонов свиного fVIII, содержащих 3'-половину кодонов С2-домена

С2-домен fVIII человека (нуклеотиды 6574-7053) содержится в экзонах 24-26 [Gitschier J. et al. (1984) Nature 312:326-330]. Экзон человека 26 содержит 1958 п.н., соответствующих нуклеотидам 6901-8858. Он включает в себя 1478 п.н. 3'-нетранслируемой последовательности. Попытки клонировать кДНК экзона 26, соответствующую 3'-концу С2-домена и 3'UTR, с использованием 3'-RACE [Siebert et al. (1995) supra], обратной ПЦР [Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology (N.Y.), 8:759-760], ПЦР с использованием сайта рестрикции [Sarkar, G. et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322], «непредсказуемо праймированной» ПЦР [Dominguez, О. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:3247-3248] и скринингом кДНК-библиотеки печени свиньи не дали успеха. 3'-RACE пытались провести с использованием той же самой библиотеки лигированных с адаптором двухцепочечных кДНК, которую успешно использовали для клонирования 5'-стороны кДНК свиного fVIII. Таким образом, отсутствие успеха с использованием этого способа не было обусловлено отсутствием кДНК, соответствующей экзону 26.

Процедуру ПЦР «прогулки» по гену-мишени [Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055-3060] использовали для клонирования 3'-половины С2-домена. Специфический для свиньи смысловой праймер, SEQ ID NO:17 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (нуклеотиды 6904-6924) синтезировали на основе первоначальной последовательности С2-домена и использовали в ПЦР-реакции с неспецифическими «прогулочными» праймерами, выбранными из олигонуклеотидов, доступных в лаборатории. Затем ПЦР-продукты испытывали в качестве мишеней с использованием анализа удлинения праймеров [Parker et al. (1991) BioTechniques 10:94-101] с применением ³²Р-меченного на конце специфического для свиньи внутреннего праймера, SEQ ID NO: 18 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (нуклеотиды 6932-6952). Интересно, что из 40 испытанных неспецифических праймеров только два давали положительные продукты в анализе удлинения праймеров, и эти два праймера соответствовали точной и вырожденной последовательности человека на 3'-стороне С2-домена: SEQ ID NO:19 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (нуклеотиды 7030-7053) и SEQ ID NO:20 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3', (нуклеотиды 7027-7053). Эти праймеры первоначально были сконструированы для получения продукта обычной ОТ-ПЦР, но не имели успеха в генерировании достаточного количества продукта, которое могло быть визуализировано связыванием с красителем бромидом этидия. Однако ПЦР-продукт удалось идентифицировать более чувствительным способом анализа удлинения праймеров. Этот продукт очищали из геля и непосредственно секвенировали. Это позволило удлинить последовательность свиного fVIII 3' (вправо) до нуклеотида 7026.

Дополнительную последовательность получали анализом удлинения праймеров продукта ПЦР с вмонтированным праймером, генерируемого с использованием библиотеки лигированных с адаптором двухцепочечных кДНК, применяемой в протоколе 5'-RACE, описанном ранее. Реакция первого раунда использовала точный праймер свиньи SEQ ID NO:21 5'-CCTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (нуклеотиды 6541-6564) и AP1-праймер. Реакция второго раунда использовала SEQ ID NO:22 5'-ААТСАССАСТССТССАСССССС-3'(нуклеотиды 6913-6934) и АР2-праймер. Прямое ПЦР-секвенирование удлиняло эту последовательность 3" (вправо) до конца С2-домена (нуклеотид 7053). Последовательность С2-домена была уникальной за исключением нуклеотидов при 7045 вблизи 3'-конца С2-домена. Анализ повторяемых несколько раз ПЦР-реакций давал либо A, G, либо двойное считывание A/G в этом сайте.

Секвенирование продлевалось в 3'-UTR с использованием двух дополнительных праймеров, SEQ ID NO:23 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (нуклеотиды 6977-6996) и SEQ ID NO:24 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (нуклеотиды 7008-7031). Получали приблизительно 15 п.н. последовательности 3'-UTR, хотя эта последовательность была неясной в нескольких сайтах. Затем синтезировали несколько антисмысловых праймеров на основе наилучших приближенных оценок 3'-нетранслируемой последовательности. Эти праймеры включает в себя обратный комплемент стоп-кодона TGA на их 3'-концах. ПЦР-продукты получали как из геномной ДНК селезенки свиньи, так и из кДНК селезенки свиньи, и их визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромидом этидия с использованием специфического смыслового праймера SEQ ID NO:25 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (нуклеотиды 6913-6934) и антисмыслового праймера 3'-UTR, SEQ ID NO:26 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Для получения достаточных количеств материала для целей клонирования второй раунд ПЦР выполняли с использованием вмонтированного смыслового праймера, SEQ ID NO:27 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (нуклеотиды 6932-6952) и того же самого антисмыслового праймера. ПЦР-продукт 141 п.н. клонировали в разрезанную EcoRV pBluescript II KS-. Получали в обоих направлениях последовательность трех клонов, полученных из геномной ДНК, и трех клонов, полученных из кДНК. Эта последовательность была недвусмысленной за исключением положения нуклеотида 7045, где геномная ДНК всегда имела А, а кДНК всегда имела G.

Сопоставления множественных ДНК-последовательностей человеческого, свиного и мышиного fVIII (фиг.1А-1Н)

Сопоставления районов сигнального пептида, районов А1, А2, A3, С1 и С2 выполняли с использованием программы CLUSTALW [Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22:4673-4680]. Штрафы (пенальти) открывания гэпа и удлинения гэпа были 10 и 0,05 соответственно. Сопоставления В-доменов человека, мыши и свиньи были описаны ранее [Elder et al. (1993) supra]. Последовательность А2 человека соответствует аминокислотам 373-740 в SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность свиного А2 представлена в SEQ ID NO:4, а аминокислотная последовательность мышиного А2-домена представлена в SEQ ID NO:28, аминокислоты 392-759.

Пример 6: Экспрессия активного, рекомбинантного не содержащего В-домена свиного фактора VIII (РВ^-)

Материалы

Цитратные плазмы человека с гемофилией А и здорового человека покупали из George King Biomedical, Inc. Фетальную телячью сыворотку, генетицин, пенициллин, стрептомицин, среду DMEM/F12 и среду AIM-V покупали из Life Technologies, Inc. ДНК-полимеразу Taq покупали из Promega. ДНК-полимеразу Vent покупали из New England Biolabs. ДНК-полимеразу Pfu и фагмиду pBluescript II KS-покупали из Stratagene. Синтетические олигонуклеотиды покупали из Life Technologies или Cruachem, Inc. Рестрикционные ферменты покупали из New England Biolabs или Promega. При получении ПЦР-продуктов для целей клонирования использовали 5'-фосфорилированные праймеры. Нуклеотидная (nt) нумерация олигонуклеотидов, применяемых в качестве праймеров для амплификации с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК или геномной ДНК свиного fVIII, использует кДНК fVIII человека в качестве ссылки [Wood et al. (1984) Nature 312:330-337]. Экспрессирующий вектор fVIII, названный НВ' /ReNeo, получали из Biogen, Inc. HB'/ReNeo содержит гены устойчивости к ампициллину и генетицину и кДНК fVIII человека, которая не имеет всего В-домена, что определяется по фрагменту расщепления Ser741-Arg1648, продуцируемому тромбином. Для упрощения мутагенеза кДНК С2-домена fVIII, который находится на 3'-конце инсерта fVIII в ReNeo, вводили сайт Notl на два основания 3' (справа) относительно стоп-кодона HB'/ReNeo посредством мутагенеза со сплайсингом и последующим перекрывающимся удлинением (SOE) [Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217:270-279]. Эта конструкция была названа HB'ReNeo/Notl.

Тотальную РНК выделяли с использованием экстракции смесью кислый гуанидинийтиоцианат-фенол-хлороформ [Chomczynski, P. etal. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]. кДНК синтезировали из мРНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ) вируса лейкоза Молони мышей и случайных гексамеров в соответствии с инструкциями, поставляемыми изготовителем (набор для синтеза первой цепи кДНК, Pharmacia Biotech). Плазмидную ДНК очищали с использованием максинабора для плазмид Qiagen ((Qiagen, Inc.). ПЦР-реакции выполняли с использованием термоциклера Hybaid OmniGene и ДНК-полимераз Taq, Vent или Pfu. ПЦР-продукты очищали из геля, осаждали этанолом и лигировали в ДНК плазмиды с использованием ДНК-лигазы Т4 (набор для быстрого лигирования ДНК (Boehringer Mannheim). Содержащие инсерт плазмиды использовали для трансформации клеток Е. coli Epicurean XL1-Blue. Все новые ДНК-последовательности fVIII, генерированные при помощи ПЦР, подтверждали дидезокси-секвенированием с использованием автоматического ДНК-секвенатора 373а Applied Biosystems и набора для терминации с красителем PRISM.

Конструирование экспрессирующего вектора гибридного fVIII, HP20, содержащего С2-домен свиньи

кДНК свиного fVIII, соответствующую 3'-стороне С1-домена и всему С2-домену, клонировали в pBluescript при помощи ОТ-ПЦР из тотальной РНК селезенки с применением праймеров на основе известной кДНК-последовательности свиного fVIII [Healey, J.F. et al. (1996) Blood 88:4209-4214]. Эту конструкцию и HBVReNeo использовали в качестве матриц для конструирования слитого продукта С1 человека - С2 свиньи в pBluescript при помощи SOE-мутагенеза. С1-С2-фрагмент в этой плазмиде удаляли при помощи Apal и Notl и лигировали в разрезанную Apal/Notl HBVReNeo/Notl с получением HP20/ReNeo/Notl.

Конструирование лишенного В-домена гибридного fVIII человека/свиньи, содержащего свиную легкую цепь (НР18)-

Легкая цепь fVIII человека состоит из аминокислотных остатков Asp1649-Туг2332. Соответствующими остатками в кДНК свиного fVIII заменяли этот район НВ' с получением гибридной молекулы fVIII человека/свиньи, названной НР18. Это выполняли заменой ПЦР-продуктом, соответствующим А2-району, А3-домену, С1-домену и С2-домену свиньи, соответствующего района в HP20. Для облегчения получения конструкций синонимический сайт Avrll вводили в nt 2273 в месте соединения А2- и А3-доменов HP20 посредством SOE-мутагенеза.

Конструирование лишенного В-домена гибридного fVIII человека/свиньи, содержащего сигнальный пептид, А1-домен и А2-домен свиньи (НР22)-

Сигнальный пептид fVIII человека, А1-домен и А2-домен состоят из аминокислотных остатков Met(-19)-Arg740. Соответствующими остатками в кДНК свиного fVIII заменяли этот район НВ' с получением молекулы, названной НР22. Кроме этого, синонимический сайт Avrll вводили в nt 2273 в месте соединения А2- и А3-доменов НР22 посредством SOE-мутагенеза. НР22 конструировали слиянием сигнального пептида-А1-фрагмента-частичного А2-фрагмента свиньи в pBluescript [Healy et al. (1996) supra] с лишенным В-домена гибридным fVIII человека/свиньи, содержащим А2-домен свиньи, названным НР1 [Lubin et al. (1994) supra].

Конструирование лишенного В-домена свиного fVIII-(PB^-)

Spel/Notl-фрагмент HP18/BS (+ Avrll) расщепляли Avrll/Notl и лигировали в расщепленный Avrll/Notl HP22/BS (+ Avrll) с получением конструкции PB^-/BS (+ Avrll), которая состоит из свиного fVIII, лишенного всего В-домена. РВ- клонировали в ReNeo лигированием Xba/Notl-фрагмента PB^-/BS (+ Avrll) в H22/ReNeo/Notl (+ Avrll).

Экспрессия рекомбинантных молекул fVIII

PB^-/ReNeo/Notl (+ Avrll) и H22/ReNeo/Notl (+ Avrll) временно трансфицировали в клетки COS и экспрессировали, как описано ранее [Lubin, I.M. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:8639-8641]. HB^-/ReNeo/Notl и без ДНК (ложная трансфекция) трансфицировали в качестве контроля.

Активность fVIII РВ^-, НР22 и НВ^- измеряли при помощи хромогенного анализа следующим образом. Пробы fVIII в супернатантах клеточной культуры активировали 40 нМ тромбином в 0,15 М NaCl, 20 мМ HEPES, 5 мМ cACl₂, 0,01% Твине-80, рН 7,4, в присутствии 10 нМ фактора IX, 425 нМ фактора Х и 50 мкМ однослойных пузырьков (везикулов) фосфатидилсерина-фосфатидилхолина (25/75 масса/масса). Спустя 5 мин реакцию останавливали 0,05 М ЭДТА и 100 нМ рекомбинантным десульфатогирудином и полученный фактор Ха измеряли анализом с хромогенным субстратом. В анализе с хромогенным субстратом добавляли 0,4 мМ Spectrozyme Ха и скорость высвобождения пара-нитроанилида определяли измерением поглощения раствора при 405 нм.

Результаты супернатантов клеточных культур независимо трансфицированных двойных повторностей клеток (поглощение при 405 нм/мин)

НВ^-: 13,9

РВ^-: 139

НР22:100

ложно трансфицированные: <0,2

Эти результаты показывают, что свиной лишенный В-домена fVIII и лишенный В-домена fVIII, состоящий из свиных субъединиц А1 и А2, являются активными, и предполагают, что они имеют более высокую активность в сравнении с лишенным В-домена fVIII человека.

РВ^- частично очищали и концентрировали из среды для выращивания хроматографией на гепарин-Сефарозе. Гепарин-Сефарозу (10 мл) уравновешивали 0,075 М NaCl, 10 мМ HEPES, 2,5 мМ CaCl₂, 0,005% Твином-80, 0,02% азидом натрия, рН 7,40. Среду (100-200 мл) от экспрессирующих клеток наносили на гепарин-Сефарозу, которую затем промывали 30 мл буфера для уравновешивания без азида натрия. РВ^- элюировали 0,65 М NaCl, 20 мМ HEPES, 5 мМ CaCl₂, 0,01% Твином-80, рН 7,4, и хранили при -80°С. Выход коагулирующей активности fVIII был обычно 50-75%.

Стабильная экспрессия свиного лишенного В-домена fVIII (РВ^-)

Трансфицированные клеточные линии поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла-F12, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, 50 Е/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. Фетальную телячью сыворотку инактивировали нагреванием при 50°С в течение одного часа перед использованием. HB^-/ReNeo и PB^-ReNeo/Notl (+ Avrll) стабильно трансфицировали в клетки ВНК и отбирали на устойчивость к генетицину с использованием общего протокола, который был описан ранее [Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269:8639-8641], за исключением того, что экспрессирующие клетки поддерживали в среде для выращивания, содержащей 600 мкг/мл генетицина. Клетки из колб Corning T-75, выращенные до конфлюентности, переносили в тройные колбы Nunc в среде, содержащей 600 мкг/мл генетицина, и выращивали до конфлюентности. Среду удаляли и заменяли бессывороточной средой AIM-V (Life Technologies, Inc.) без генетицина. Экспрессию фактора VIII подвергали мониторингу посредством одностадийного анализа коагулирующей активности фактора VIII (vide supra) и собирали 100-150 мл среды один раз в день в течение четырех-пяти дней. Максимальные уровни экспрессии в среде для НВ^- и РВ^- были 102 единицы на мл и 10-12 единиц на мл коагулирующей активности фактора VIII соответственно.

Очистка РВ^-

РВ^- осаждали из культурального супернатанта с использованием 60% насыщенного сульфата аммония и затем очищали W3-3 иммуноаффинной хроматографией и mono Q-жидкостной хроматографией высокого давления, как описано ранее для очистки полученного из плазмы свиного фактора VIII [Lollar et al. (1993) Factor VIII/factor VIIIa. Methods Enzymol. 222:128-143]. Удельную коагулирующую активность РВ^- измеряли одностадийным анализом свертывания [Lollar et al. (1993) supra], и она была сходной с активностью полученного из плазмы свиного фактора VIII.

При анализе при помощи гель-электрофореза в ДСН-ПААГ препарат РВ^- содержал три полосы со средними молекулярными массами 160 кДа, 82 кДа и 76 кДа. Полосы 82 кДа и 76 кДа были ранее описаны как гетеродимер, содержащий А1-А2- и ар-А3-С1-С2-домены (где ар обозначает пептид активации) [Toole et al.(1984) Nature 312:342-347]. Полосу 160 кДа переносили на поливинилиденфторидную мембрану и подвергали NH₂-концевому секвенированию, которое давало Arg-Ile-Хх-Хх-Tyr (где Хх обозначает «не определен»), который является NH₂-концевой последовательностью одноцепочечного фактора VIII [Toole et al. (1984) supra]. Таким образом, РВ^- частично процессируется расщеплением между доменами А2 и A3, так что он состоит из двух форм, одноцепочечного белка А1-А2-ар-С1-С2 и гетеродимера А1-А2/ар-А3-С1-С2. Подобный процессинг рекомбинантного НВ^- сообщался [Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:19-27].

Характеристика свиного фактора VIII

Авторы изобретения определили кДНК-последовательность свиного fVlll, соответствующую 137 п.н. 5'-UTR, кодирующему сигнальный пептид району (57 п.н.) и доменам А1 (1119 п.н.), A3 (990 п.н.), С1 (456 п.н.) и С2 (483 п.н.). Вместе с ранее опубликованной последовательностью В-домена и районов активации пептида легкой цепи [Toole et al. (1986) supra] и А2-домена [Lubin et al. (1994) supra] последовательность, сообщенная здесь, завершает определение кДНК свиного fVIII, соответствующей транслируемому продукту. Фрагмент, который включал в себя район 5'-UTR, кДНК сигнального пептида и А1-домена, клонировали с использованием протокола ОТ-ПЦР 5'-RACE. Праймер на основе последовательности С2 человека был успешным в получении ОТ-ПЦР-продукта, который привел к клонированию A3, С1 и 5'-половины С2-домена. Трудным оказалось клонирование кДНК, соответствующей 3'-половине С2-домена и кДНК 3'-UTR. Остальную часть С2-домена в конце концов клонировали при помощи процедуры прогулки по гену-мишени [Parker et al. (1991) supra].

Последовательность, представленная здесь в виде SEQ ID NO:29, является недвусмысленной за исключением кодона при nt 7045 вблизи 3'-конца С2-домена, который является либо А, либо G, как описано выше. Соответствующий кодон представляет собой GAC (Asp) или AAC (Asn). Кодоны человека и мыши являются кодонами GAC и CAG (Gin) соответственно. Неизвестно, означает ли это полиморфизм или воспроизводимый артефакт ПЦР. Рекомбинантные кДНК гибридного (человек-свинья) лишенного В-домена fVIII, содержащие замены свиного С2-домена, соответствующие как кодону GAC, так и кодону AAC, были стабильно экспрессированы без детектируемого различия в прокоагулянтной активности. Это показывает, что между этими двумя вариантами С2-домена нет функционального различия.

Сопоставление предсказанной аминокислотной последовательности полноразмерного свиного fVIII SEQ ID NO:30 с опубликованными последовательностями человека [Wood et al. (1984) supra] и мыши [Elder et al. (1993) supra] показано на фиг.1А-1Н вместе с сайтами для посттрансляционной модификации, протеолитического расщепления и узнавания другими макромолекулами. Как отмечалось ранее, В-домены этих видов являются более дивергентными, чем домены А или С. Это согласуется с наблюдением, что В-домен не имеет известной функции, несмотря на его большой размер [Elder et al. (1993) supra; Toole et al. (1986) supra]. Результаты данного изобретения подтверждают, что В-домен свиного fVIII не является необходимым для активности. На основании информации о последовательности, представленной здесь, свиной fVIII, имеющий делецию всего В-домена или части В-домена, может быть синтезирован экспрессией кодирующей свиной fVIII ДНК, в которой делетирован весь свиной В-домен или часть кодонов свиного В-домена. Имеется также более высокая дивергенция последовательностей, соответствующих пептиду расщепления АРС А1-домена/фактора IXa (остатки 337-372) и пептиду активации легкой цепи. Сайт расщепления тромбином в положении 336 для генерирования пептида 337-372, по-видимому, утрачен в мыши, так как этим остатком является глутамин вместо аргинина [Elder et al. (1993) supra]. Относительно быстрая дивергенция пептидов расщепления тромбином (или в мышином fVIII, возможно, рудиментарного пептида активации 337-372) отмечалась ранее для фибринопептидов [Creighton, Т.Е. (1993) In Proteins: Struvtures and Molecular Properties, W.H. Freeman, New York, pp.105-138]. Отсутствие биологической функции этих пептидов после расщепления трактовалось как возможная причина быстрой дивергенции. Было высказано предположение, что Arg562 в fVIII человека является более важным сайтом расщепления для активированного белка С во время инактивации fVIII и fVIIIa [Fay, P.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145]. Этот сайт является консервативным в fVIII человека, свиньи и мыши.

Потенциальные N-связанные сайты гликозилирования (NXS/T, где Х не является пролином) можно видеть на фиг.1А-1Н. Имеются восемь консервативных N-связанных сайтов гликозилирования: один находится в А1-домене, один в А2-домене, четыре в В-домене, один в А3-домене и один в С1-домене. 19 цистеинов А- и С-доменов являются консервативными, тогда как имеется дивергенция цистеинов В-домена. Шесть из семи дисульфидных связей в fVIII обнаружены в гомологичных сайтах в факторе V и церулоплазмине, и обе дисульфидные связи С-домена обнаружены в факторе V [McMullen, B.A. et al. (1995) Protein Sci. 4:740-746]. fVIII человека содержит сульфатированные тирозины в положениях 346, 718, 719, 723, 1664 и 1680 [Pittman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102]. Эти остатки являются консервативными в мышином fVIII и свином fVIII (фиг.1), хотя программа CLUSTALW не смогла сопоставить мышиный тирозин, соответствующий Tyr346 в fVIII человека.

Мышиная и свиная плазма может корректировать дефект свертывания в плазме человека с гемофилией А, что согласуется с уровнем консервативности остатков в доменах А и С этих видов. Прокоагулянтная активность свиного fVIII превосходит прокоагулянтную активность человеческого fVIII [Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657]. Рекомбинантный свиной фактор VIII (лишенный В-домена), экспрессируемый и очищенный, как описано здесь, также проявляет более высокую удельную коагулирующую активность, чем fVIII человека, при сравнении с полученным из плазмы свиным fVIII. Это может быть обусловлено уменьшенной скоростью спонтанной диссоциации субъединицы А2 от активного гетеротримера А1/А2/А3-С1-С2 fVIIIa. Неизвестно, отражает ли это различие в прокоагулянтной активности эволюционное изменение в функции как пример адаптации видов [Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. 36:213-244]. Теперь, когда кДНК-последовательность свиного fVIII, соответствующая транслируемому продукту, является полной, сканирующий гомологию мутагенез [Cunningham, B.C., etal. (1989) Science 243:1330-1336] может обеспечить способ идентификации структурных различий между факторами fVIII человека и свиньи, которые являются ответственными за превосходящую активность последнего.

Обычно свиной fVIII является менее реактивным с ингибирующими (ингибиторными) антителами, которые возникают в больных с гемофилией, которых трансфузировали fVIII, или которые возникают в виде аутоантител во всей популяции. Это является основанием для применения концентрата свиного fVIII в лечении пациентов с ингибиторными антителами [Hay and Lozier (1995) supra]. Большинство ингибиторов нацелены против эпитопов, локализованных в А2-домене или С2-домене [Fulcher, C.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74:1618-1626]. Дополнительно был идентифицирован эпитоп неизвестной функции, который находится либо в A3-, либо в С1-домене [Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84:224a]. Эпитоп А2 был картирован в остатках 484-508 сканирующим гомологию мутагенезом [Healey et al. (1995) supra]. В этом сегменте из 25 остатков имеется относительно низкая доля идентичной последовательности (16/25 или 64%). Интересно, что этот район, который, по-видимому, является функционально важным на основании того факта, что антитела к нему являются ингибиторными, очевидно, подвергался относительно более быстрому дрейфу генов. Сопоставление свиного А2-домена и А3-доменов показывают, что эпитоп А2 не имеет общей детектируемой гомологии с соответствующим районом в А3-домене.

На основании делеционного картирования было сделано предположение, что ингибиторный эпитоп С2 fVIII человека локализован в остатках 2248-2312 [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819]. fVIII человека и свиньи являются идентичными на 83% в этом сегменте из 65 остатков. Однако сканирующий гомологию мутагенез этого района для характеристики С2-эпитопа обнаружил, что основная детерминанта С2-эпитопа неожиданно была локализована в районе, соответствующем аминокислотам 2181-2243 человека (SEQ ID NO:2) и фиг.1Н.

Получали белки гибридного (человек-свинья) фактора VIII, в которых различные части С2-домена человеческого фактора VIII были заменены соответствующими частями свиного фактора VIII при помощи описанной здесь стратегии (пример 5). Синтез различных С2-гибридных факторов VIII сопровождался конструированием гибридной кодирующей ДНК с использованием нуклеотидной последовательности, кодирующей свиной С2-район, представленной в SEQ ID NO:30. Каждую гибридную ДНК экспрессировали в трансфицированных клетках, так что гибридный фактор VIII мог быть частично очищен из среды для выращивания. Активность в отсутствие какого-либо ингибитора измеряли в одностадийном анализе свертывания.

Группу из пяти ингибиторов человека использовали для испытания каждого гибридного фактора VIII. Предварительно было показано, что ингибиторные плазмы, содержащие антитело против фактора VIII, нацелены против С2-домена человека на основании способности рекомбинантного С2-домена человека нейтрализовать это ингибирование. Во всех этих тестируемых плазмах (тест-плазмах) титр ингибитора нейтрализовался более чем на 79%, С2-доменом или легкой цепью, но менее чем на 10%, рекомбинантным А2-доменом человека. Кроме того, С2-гибридные факторы VIII испытывали против мышиного моноклонального антитела, которое связывает С2-домен, и подобно С2-ингибиторным антителам человека оно ингибировало связывание фактора VIII с фосфолипидом и с фактором фон Виллебранда.

Посредством сравнения титров ингибиторных антител против С2-гибридного фактора VIII было показано, что основная детерминанта С2-ингибиторного эпитопа человека является районом из остатков 2181-2243 (SEQ ID NO:2, см. фиг.1Н). Антитела против С2, направленные на СООН-конец района до остатка 2253, не были идентифицированы в четырех из пяти сывороток пациентов. В сравнении с гибридами, имеющими свиную последовательность, соответствующую номерам аминокислотных остатков человека 2181-2199 и 2207-2243, было очевидно, что оба района способствуют связыванию антител. Свиная аминокислотная последовательность, соответствующая остаткам человека 2181-2243, имеет номера 1982-2044 в SEQ ID NO:30. Последовательность свиной ДНК, кодирующая аминокислоты 1982-2044, имеет номера 5944-6132 в SEQ ID NO:29.

На фиг.1Н можно видеть, что в районе 2181-2243 имеются 16 различий аминокислот между последовательностями человека и свиньи. Различия обнаружены в остатках 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 и 2243. Может быть произведена замена аминокислоты в одном или нескольких остатках с указанными номерами, чтобы сделать фактор VIII человека нереактивным с ингибиторными антителами против С2-человека. Аланин-сканирующий мутагенез обеспечивает удобный способ для генерирования аланиновых замен природно встречающихся остатков, как описано ранее. Для замены могут быть использованы также другие, чем аланин, аминокислоты, как описано здесь. Аланиновые замены индивидуальных аминокислот, в частности тех, которые не являются идентичными между человеком/свиньей или человеком/мышью или которые, наиболее вероятно, способствуют связыванию антител, могут давать модифицированный фактор VIII с уменьшенной реактивностью в отношении ингибиторных антител.

Фиг.1А-1Н, взятые вместе, обеспечивают сравнение сопоставленных последовательностей аминокислот фактора VIII человека, свиньи и мыши. Фиг.1А сравнивает районы сигнальных пептидов (человека, SEQ ID NO:31; свиньи, SEQ ID NO:30, аминокислоты 1-19; мыши, SEQ ID NO:28, аминокислоты 1-19). Обратите внимание, что аминокислоты на фиг.1А-1Н нумеруются при условии, что первый Аланин зрелого белка имеет номер 1, так что аминокислотам сигнального пептида даются отрицательные номера. Последовательность fVIII человека в SEQ ID NO:2 также начинается с первого Аланина зрелого белка, имеющего номер 1. В аминокислотных последовательностях мышиного fVIII (SEQ ID NO: 28) и свиного fVIII (SEQ ID NO:30) первая аминокислота (аланин) зрелой последовательности является аминокислотой с номером 20. Фиг.1А-1Н показывает сопоставление соответствующих последовательностей fVIII человека, мыши и свиньи таким образом, что районы наивысшей идентичности аминокислот сопоставляются. Номера аминокислот в фиг.1А-1Н относятся только к fVIII человека. Фиг.1В дает аминокислотные последовательности для А1-домена человека (SEQ ID NO:2, аминокислоты 1-372), свиньи (SEQ ID NO:30, аминокислоты 20-391) и мыши (SEQ ID NO:28, аминокислоты 20-391). Фиг.1С обеспечивает аминокислотные последовательности для А2-доменов фактора VIII из человека (SEQ ID NO:2, аминокислоты 373-740), свиньи (SEQ ID NO:30, аминокислоты 392-759) и мыши (SEQ ID NO:28, аминокислоты 392-759). Фиг.1D обеспечивает аминокислотные последовательности В-доменов фактора VIII человека (SEQ ID NO:2, аминокислоты 741-1648), свиньи (SEQ ID NO:30, аминокислоты 760-1449) и мыши (SEQ ID NO:28, аминокислоты 760-1640). Фиг.1Е сравнивает аминокислотные последовательности пептидов активации легкой цепи фактора VIII человека, свиньи и мыши (SEQ ID NO:2, аминокислоты 1649-1689; SEQ ID NO:30, аминокислоты 1450-1490 и SEQ ID NO:28, аминокислоты 1641-1678 соответственно). Фиг.1F обеспечивает сравнение последовательностей для А3-доменов фактора VIII человека, свиньи и мыши (SEQ ID NO:2, аминокислоты 1690-2019; SEQ ID NO:30, аминокислоты 1491-1820 и SEQ ID NO:28, аминокислоты 1679-2006 соответственно). Фиг.1G обеспечивает аминокислотные последовательности С1-доменов фактора VIII человека, свиньи и мыши (SEQ ID NO:2, аминокислоты 2020-2172; SEQ ID NO:30, аминокислоты 1821-1973 и SEQ ID NO:28, аминокислоты 2007-2159 соответственно). Фиг.1Н обеспечивает данные последовательности для С2-доменов фактора VIII, С2-доменов человека, свиньи и мыши (SEQ ID NO:2, аминокислоты 2173-2332; SEQ ID NO:30, аминокислоты 1974-2133 и SEQ ID NO:28, аминокислоты 2160-2319 соответственно).

Ромбы обозначают сайты сульфатирования тирозина, предполагаемые сайты для фактора IXa, фосфолипида и Белка С подчеркнуты двойной чертой, а районы, участвующие в связывании ингибиторных антител против А2 и против С2, указаны курсивом. Звездочки указывают аминокислотные последовательности, которые являются консервативными. См. также SEQ ID NO:29 (кДНК свиного фактора VIII) и SEQ ID NO:30 (расшифрованная аминокислотная последовательность свиного фактора VIII). Система нумерации человека используется в качестве ссылки [Wood et al. (1984) supra]. Домены А1, А2 и В определяются сайтами расщепления тромбином в положениях 372 и 740 и сайтом расщепления неизвестной протеазой при 1648 в виде остатков 1-372, 373-740 и 741-1648 соответственно [Eaton, D.L et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347]. Домены A3, C1 и С2 определяются как остатки 1690-2019, 2020-2172 и 2173-2332 соответственно [Vehar et al. (1984) supra]. Сайты расщепления для тромбина (фактора На), фактора IXa, фактора Ха и АРС [Fay et al. (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. et al. (1992) Blood 80:3120-3128] показаны помещением названия фермента над реактивным аргинином. Кислый пептид отщепляется от легкой цепи fVIII тромбином или фактором Ха в положении 1689. Предполагаемые сайты связывания для фактора IXa [Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), фосфолипида (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004) и белка С (Walker, F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1484-1489] подчеркнуты двойной чертой. Районы, участвующие в связывании антител против А2 [Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra] и ранее предполагаемые для ингибиторных антител против С2, показаны курсивом. Ингибиторный эпитоп С2, идентифицированный, как описано здесь (аминокислоты 2181-2243 человека), показан как подчеркнутый одной линией на фиг.1Н. Сайты сульфатирования тирозина [Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994) supra] показаны ромбом ◆.

Пример 7: Конструирование POL1212 и экспрессия в клетках почки детеныша хомячка

POL1212 представляет собой частично лишенный В-домена свиной фактор VIII, имеющий делецию В-домена, за исключением того, что сохраняются 12 аминокислот NH₂-конца В-домена и 12 аминокислот -СООН-конца.

кДНК, кодирующие последовательности для доменов А1, А2, ар-А3-С1 и С2 свиного fVIII, получали, как описано в примере 5. Нуклеотидная последовательность ДНК и произведенная аминокислотная последовательность свиного фактора VIII представлены в виде SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:30 соответственно. Амплифицированные фрагменты отдельно клонировали в плазмиду pBluescript II KS- (pBS).

POL1212 относится к кДНК, кодирующей свиной fVIII, лишенный большей части В-домена, но содержащий ДНК-последовательность, кодирующую линкер из 24 аминокислот между доменами А2 и ар (пептида активации). POL1212 конструировали в экспрессирующем векторе млекопитающих, ReNeo, который был получен из Biogen. ReNeo может реплицироваться в бактериях, реплицироваться в виде эписомы в клетках COS для временной экспрессии фактора VIII или стабильно интегрироваться в различные клетки млекопитающих. Он состоит из 1) последовательностей, полученных из плазмиды pBR322, которые включают в себя начало репликации и ген устойчивости к ампициллину, 2) гена устойчивости к неомицину, экспрессиия которого находится под контролем регуляторных элементов промотора/энхансера SV40, малого t интрона SV40 и сигнала полиаденилирования SV40, 3) сайта для инсерции fVIII и его сигнального пептида, экспрессия которого находится под контролем энхансера SV40, основного позднего промотора аденовируса типа 2 и трехчастной лидерной последовательности аденовируса типа 2. Любой вектор, имеющий сходные функциональные компоненты, может быть использован вместо вектора ReNeo.

POL1212/ReNeo получали в нескольких стадиях. Сначала кДНК, кодирующие тяжелую цепь свиного fVIII (A1-A2), и кДНК, кодирующие легкую цепь свиного fVIII (ар-А3-С1-С2), собирали отдельно в pBS. Из этих конструкций, ДНК, кодирующую лишенный В-домена свиной fVIII, собирали в pBS (PB^-/pBS). Эта форма свиного fVIII не имела всего В-домена, определяемого аминокислотами, соответствующими остаткам 741-1648 в fVIII человека (нуклеотиды человека 2278-5001). Затем этой ДНК, кодирующей свиной А2, заменяли А2 человека в содержащем лишенный В- домена fVIII человека экспрессирующем векторе ReNeo (HB^-/ReNeo). ДНК, кодирующей остальную часть свиной тяжелой цепи, и ДНК, кодирующей свиную легкую цепь заменяли домены человека в двух дополнительных стадиях с использованием конструкций тяжелая цепь свиньи/pBS и PB^-/pBS, приготовленных заранее. Фрагмент В-домена человека, кодирующий 5 С-концевых и 9 N-концевых аминокислот, встраивали между доменами А2 и A3 с образованием конструкции, названной PSQ/ReNeo [Healey et al. (1998) 92:3701-3709]. Остатки Glu2181-Val2243 содержат основную детерминанту ингибиторного эпитопа в С2-домене фактора VIII человека. Эту конструкцию использовали в качестве матрицы для получения фрагмента свиного В-домена, кодирующего 12 С-концевых и 12 N-концевых аминокислот. Этот фрагмент встраивали между доменами А2 и A3 с получением конечной конструкции POL1212/ReNeo.

Линкер из 24 аминокислот POL1212 состоит из первых 12 и последних 12 остатков В-домена свиного fVIII. Линкер POL1212 имеет следующую последовательность:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEQ ID NO:32)

Нуклеотидная последовательность, соответствующая линкеру 1212 и окружающим его аминокислотам, представляет собой:

GTC АТТ GAA CCT AGG AGC TTT GCC CAG ААТ ТСА AGA CCC CCT AGT GCG

(SEQ ID NO:33)

V I E P R S F A Q N S R P P S A

AGC GCT ССА AAG CCT CCG GTC CTG CGA CGG CAT CAG AGG GAC АТА

S A P K P P V L R R H Q R D I

AGC CTT CCT ACT

S L Р Т

Линкер POL1212 синтезировали мутагенезом со сплайсингом и последующим перекрывающимся удлинением (SOE) следующим образом:

Реакции ПЦР, используемые для получения продуктов SOE, были следующими:

РЕАКЦИЯ №1

Наружный праймер: Rev 4, который является праймером свиного А2, нуклеотиды 1742-1761 SEQ ID NO:29. Эта последовательность представляет собой:

5'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3'(SEQ ID NO:34)

Внутренний праймер: OL12, который является обратным свиным праймером, включающим в себя первые (5') 15 аминокислот OL1212 и последние (3') 5 аминокислот свиного А2. Эта последовательность представляет собой: 5'-CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTCAAT

GAC-3' (SEQ ID NO:35)

Матрица: PSQ/ReNeo

Продукт: ДНК свиньи от нуклеотида 1742 в А2-домене до нуклеотида 2322 в OL1212, 580 п.н.

РЕАКЦИЯ №2

Наружный праймер: Р2949 представляет собой сввиной обратный праймер A3, нуклеотиды 2998-3021 SEQ ID NO:29. Эта последовательность представляет собой: 5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (см. SEQ ID NO:29).

Внутренний праймер: OL12+, свиной праймер, включающий в себя последние (3') 16 аминокислот OL1212 и первые (5') 6 аминокислот пептида активации, нуклеотиды 2302-2367 SEQ ID NO:29. Эта последовательность представляет собой:

5'-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATAAGCC ТТССТАСТ-3' (SEQ ID NO:36).

Матрица:PSQ/ReNeo.

Продукт: ДНК свиньи от нуклеотида 2302 в OL1212 до нуклеотида 3021 в А3-домене, 719 п.н.

РЕАКЦИЯ SOE

Праймеры: Rev 4, Р2949-

Матрица: Фрагмент из rxn #1 (п.н.) и фрагмент с низкой температурой плавления из rxn #2 (п.н.).

Продукт: ДНК свиньи от нуклеотида 1742 в А2-домене до нуклеотида 3021 в А3-домене (SEQ ID NO:29), в том числе OL1212, 1279 п.н. Продукт реакции осаждали этанолом.

Этот линкер 1212 встраивали в PSQ/ReNeo разрезанием продукта SOE (инсерта) и PSQ/ReNeo (вектора) BsaBI. Вектор и инсерт лигировали при помощи лигазы Т4 и этот продукт использовали для трансформации клеток Е. coli XL1-Blue. Плазмидную ДНК получали из нескольких колоний и последовательность линкера 1212 и другой ПЦР-генерируемой последовательности подтверждали анализом секвенирования ДНК.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК CRL-1632 ПОЧКИ ДЕТЕНЫША ХОМЯЧКА (ВНК)

Клеточную линию ВНК получали из АТСС, идентификационный номер доступа CRL-1632 и хранили в замороженном виде при -20°С до последующего использования. Клетки оттаивали при 37°С и помещали в 10 мл полной среды, названной DMEM/F12, содержащей 50 Е/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина плюс 10% фетальную телячью сыворотку (ФТС). ФТС приобретали из Hyclone, Logan Utah. Клетки центрифугировали в течение 2 минут при 300 об/мин. Среду отсасывали и клетки ресуспендировали в двух мл полной среды в колбе Т-75, содержащей 20 мл полной среды.

POL1212 экспрессировали как в клетках почки детеныша хомячка (ВНК), так и в клетках яичника Китайского хомячка (СНО). Использовали две линии ВНК, линию CRL-1632 из АТСС и другую линию ВНК, полученную от R. Mcgillivray, University of British Columbia [Funk, et al. (1990) Biochemistry 29:1654-1660]. Последнюю субкультивировали без отбора в лаборатории авторов изобретения и она была названа ВНК1632 (Emory). Линия клеток СНО была линией СНО-К1, номер доступа АТСС CCL-61. Экспрессия среднего клона из клеточной линии Emory и из клеток СНО-К1 была несколько более высокой, чем экспрессия клеток CRL-1632, как оценивали по активности в хромогенном тесте.

Клетки, выращиваемые в колбе Т-75, образовывали конфлюентный монослой. Получали 60 мл культуры клеток Е. coli XL-1-Blue в LB/ампициллине (50 мг/мл), несущих РOL1212/Ре[Мео-плазмиду.

ТРАНСФЕКЦИЯ ВНК-КЛЕТОК CRL-1632 ПЛАЗМИДОЙ POL1212/ReNeo

ДНК из ночной культуры POL1212/ReNeo-KneTOK Е. coli XLI-Blue получали с использованием набора Qiagen, Valencia, CA Spin-Miniprep kit. Одну колбу клеток CRL-1632 распределяли между колбой с исходным раствором с 0,2 мл и колбой для трансфекции с 0,3 мл из общего объема 2 мл. Другую колбу снабжали свежей средой. Среда была DMEM/F12 + 10% ФТС (Hyclone FBS) + 50 Е/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. CRL-1632 распределяли в 6-луночные планшеты для достижения 50-90% конфлюентности для трансфекции (0,3 мл клеток из колбы Т-75 в 2 мл 1:5000 Версена [Life Technologies, Gaithersburg, MD] в каждой лунке) с использованием свежей среды DMEM/F12 + 10% ФТС (Hyclone FBS) + 50 Е/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина.

В стерильных тест-пробирках на 1-2 мл готовили следующие растворы:

A) 48 мкл (10 мкг) минипрепарата ДНК POL1212/ReNeo плюс мкл среды без сыворотки (DMEM/F12) плюс 10 мкл Липофектина™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) 10 мкл Липофектина плюс 190 мкл среды (ложная трансфекция) осторожно смешивали и ДНК и Липофектину давали взаимодействовать в течение 15 минут при комнатной температуре. В это время клетки промывали дважды 2 мл DMEM/F12. Затем к клеткам добавляли 1,8 мл DMEM/F12. К этим клеткам добавляли по каплям комплекс ДНК/Липофектин и перемешивали осторожно для смешивания. Клетки оставляли в термостате в течение ночи. ДНК/Липофектин удаляли и добавляли 3 мл среды с сывороткой к клеткам. Клетки инкубировали в течение 30-48 часов. Генетицин приобретали из Life Technologies, Gaithersburg, MD. Культуры клеток разводили 1:20, 1:50 и 1:100, 1:2450, 1:500 на чашки 10 см в 10 мл среды с сывороткой, содержащей 535 мкг/мл генецитина. На протяжении следующих нескольких дней клетки, которые не поглощали плазмиду POL1212/ReNeo, были убиты вследствие присутствия генецитина. Оставшиеся клетки продолжали реплицироваться, образуя видимые монослойные колонии на чашках.

ЭКСПРЕССИЯ И АНАЛИЗ POL1212 ИЗ ВНК-КЛЕТОК CRL-1632

Вокруг колоний помещали небольшие пластиковые цилиндрические кольца. Колонии осторожно отсасывали раздельно с использованием полной среды и переносили в тест пробирки. Эти колонии называли клонируемыми в кольцах колониями. Клонируемые в кольцах колонии высевали раздельно на 24-луночные планшеты и выращивали в полной среде.

АНАЛИЗ С ХРОМОГЕННЫМ СУБСТРАТОМ НА ЭКСПРЕССИЮ ФАКТОРА VIII ТРАНСФИЦИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ CRL-1632

Пробы POL1212 из супернатантов клеточных культур смешивали с 50 нМ очищенным свиным фактором IXa и 0,05 мМ пузырьками фосфатидилхолина/фосфатидилсерина (PCPS) в 0,15 М NaCl, 20 М HEPES, 5 мМ CaCl₂, 0,01% Твине 80, рН 7,4. В качестве контроля использовали среду культуры ложнотрансфицированных клеток. Добавляли одновременно тромбин и фактор Х до конечных концентраций 40 и 425 нМ соответственно. Тромбин активирует фактор VIII, который затем, вместе с PCPS, служит в качестве кофактора для фактора IXa во время активации фактора X.

Спустя 5 мин активацию фактора Х смесью фактор IXa/фактор VIIIa/PCPS останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 50 мМ. В то же самое время активацию фактора VIII тромбином останавливали добавлением ингибитора тромбина, рекомбинантного десульфатогирудина, до конечной концентрации 100 нМ. Пробу 25 мкл реакционной смеси переносили в микротитрационную лунку, к которой добавляли 74 мкл Spectrozyme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), который является хромогенным субстратом для фактора Xa. Конечная концентрация Spectrozyme Xa была 0,6 мМ. Поглощение при 405 нм, обусловленное расщеплением Spectrozyme Xa фактором Xa, наблюдали непрерывно в течение 5 минут с использованием планшет-ридера Vmax Kinetic Plate Reader (Molecular Devices, Inc., Menio park, CA). Результаты выражали в А₄₀₅/мин.

Хромогенный анализ фактора VIII десяти клонированных в кольцах колоний:

Номер колонии	А405/мин (×103)
Буфер	0,2
1	2,1
2	8,4
3	6,4
4	10,7
5	12,5
6	7,6
7	51,3
8	139,5
9	3,8
10	8,4

Эти результаты показывают, что все десять колоний, которые были отобраны, экспрессируют активность фактора VIII, которая является по меньшей мере в 10 раз большей, чем фон.

Активность из среды колонии 8, которая является наиболее высокоэкспрессирующей колонией, исследовали дополнительно с использованием одностадийного анализа свертывания для фактора VIII. В этом анализе 50 мл недостаточной по фактору VIII плазмы (George King Biomedical Overland Park, KA), 5 мл пробы или стандарта и 50 мл активированного реагента для парциального тромбопластинового времени (Organon Teknika, Durham, NC) инкубировали 3 мин при 37°С. Пробы включают в себя среду колонии 8, разбавленную в 0,15 М NaCl, мМ HEPES, pH 7,4) (HBS) или, в качестве контроля, полную среду. Свертывание инициировали добавлением 50 мл 20 мМ CaCl₂. Время свертывания измеряли с использованием прибора для свертывания ST4 В10 Coagulation Instrument (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). Стандартную кривую получали приготовлением разведении объединенной, цитратной плазмы здорового человека, партии 0641 (George King Biomedical Overland Park, KA). Концентрация фактора VIII стандарта была 0,9 единиц/мл.

Стандартная кривая:

	Разведение	Е/мл	Время свертывания
1)	Неразведенная	0,96	45,2
2)	1/3 (HBS)	0,32	53,7
3)	1/11 (HBS)	0,087	62,5
4)	1/21 (HBS)	0,046	68,9

Линейная регрессия времен свертывания против логарифма концентрации стандарта давала коэффициент корреляции 0,997.

Тестируемые вещества дали следующие величины времени свертывания, которые преобразовывали в единицы на мл с использованием стандартной кривой.

Проба	Время свертывания (сек)	Единицы/мл
1) Колония 8 (24 ч), 1/10 в HBS	40,6	1,74×10=17,4
2) Колония 8 (24 ч), 1/10 в HBS	41,1	1,63×10=16,3
3) Колония 8 (24 ч), 1/20 в HBS	47,7	0,69×20=13,8
4) Колония 8 (24 ч), 1/20 в HBS	47,2	0,73×20=14,6
5) Полная среда	82,9	0,007
6) Полная среда	83,3	0,006

Эти результаты показывают, что активность свертывания колонии 8 является приблизительно в 2000 раз большей, чем активность свертывания контрольной пробы.

Последовательность ДНК, кодирующая POL1212, представлена в виде SEQ ID NO:37. Кодируемая аминокислотная последовательность POL1212 представлена в виде SEQ ID NO:38. Может быть проведена дополнительная очистка POL1212 с использованием различных известных способов, таких как иммуноаффинная хроматография и ЖХВД - см. примеры 2 и 3.

ОБЩИЕ ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Должно быть понятно, что минорные вариации аминокислотной последовательности или ДНК, кодирующей такую последовательность, относящиеся к POL1212, могут быть введены без влияния на важные характерные свойства функции. Например, длина последовательности В-домена, сохраняемая в качестве линкера между А2-доменом и пептидом активации, может быть увеличена или уменьшена в пределах границ, известных в данной области. Варианты последовательности могут быть введены в этот линкерный район при сохранении эквивалентных функциональных характерных признаков POL1212, описанных здесь, и свиного лишенного В-домена фактора VIII, как описано здесь и как известно в данной области. На основании сравнений известных аминокислотных последовательностей фактора VIII, имеющих коагулирующую активность в крови человека, могут быть получены варианты последовательностей в основной аминокислотной последовательности POL1212, такие как замены индивидуальных аминокислот или замены пептидных сегментов известными функциональными вариантами, при сохранении ее эквивалентных функциональных характерных признаков. Предыдущие типы вариаций не являются исчерпывающими, а являются лишь примерами модификаций последовательности, которые могли бы быть произведены специалистом с обычной квалификацией в данной области, по существу без модификации функциональных характерных свойств данного белка. Подразумевается, что все подобные варианты и модификации входят в объем данного изобретения, определенный формулой изобретения или ее эквивалентами. Список последовательностей с указанными идентификационными номерами:

SEQ ID NO:	Идентификация
1	кДНК фактора VIII человека. Кодирование аминокислоты 1 зрелого белка начинается при номере нуклеотида 208.
2	Аминокислотная последовательность фактора VIII человека
3	кДНК А2-домена свиного фактора VIII
4	Аминокислотная последовательность А2- домена свиного фактора VIII
5-27	Последовательность олигонуклеотидного праймера (пример 5)
28	Аминокислотная последовательность мышиного фактора VIII
29	кДНК свиного фактора VIII
30	Аминокислотная последовательность свиного фактора VIII
31	Аминокислотная последовательность сигнального пептида фактора VIII человека
32-36	Олигонуклеотидный праймер (пример 7)
37	Кодирующая ДНК POL1212
38	Аминокислотная последовательность POL1212

1. Рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая модифицированный свиной фактор VIII (POL 1212) и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, которая определяет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:38.

2. Рекомбинантная молекула ДНК по п.1, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:37.

3. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК по п.1, оперативно связанную с регуляторными последовательностями.

4. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК по п.2, оперативно связанную с регуляторными последовательностями.

5. Экспрессирующий вектор по п.3 или 4 для использования в клетках млекопитающего.

6. Модифицированный свиной фактор VIII, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38.

7. Терапевтическая композиция, содержащая эффективное количество модифицированного свиного фактора VIII по п.6 для лечения пациентов, имеющих недостаточность фактора VIII, и физиологически приемлемый носитель.

8. Способ получения белка модифицированного свиного фактора VIII, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38. предусматривающий:

a) трансформирование клетки-хозяина экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, кодирующую модифицированный свиной фактор VIII (POL1212);

b) культивирование указанной клетки-хозяина в оптимальных условиях для экспрессии указанной ДНК, с получением модифицированного свиного фактора VIII.

9. Способ получения белка модифицированного свиного фактора VIII, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38 и сигнальный пептид, предусматривающий:

a) трансформирование клетки-хозяина экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, кодирующую модифицированный свиной фактор VIII (POL1212) и сигнальную последовательность;

b) культивирование указанной клетки-хозяина в оптимальных условиях для экспрессии указанной ДНК, с получением модифицированного свиного фактора VIII, который экспортируется из клетки-хозяина.

10. Способ по п.9, где сигнальный пептид имеет последовательность аминокислот 1-19 SEQ ID NO:30.

11. Линия клеток ВНК CRL-1632 (АТСС) для получения модифицированного свиного фактора VIII, включающая и реплицирующая экспрессирующий вектор по п.3, 4 или 5.

12. Линия клеток ВНК 1632 для получения модифицированного свиного фактора VIII, включающая и реплицирующая экспрессирующий вектор по п.3, 4 или 5.

13. Линия клеток СНО-К1 для получения модифицированного свиного фактора VIII, включающая и реплицирующая экспрессирующий вектор по п.3, 4 или 5.