Антигриппозное средство
Владельцы патента RU 2286770:
Закрытое акционерное общество "Научно-производственное объединение "Антивирал" (ЗАО "НПО "Антивирал") (RU)
Изобретение относится к области фармацевтики и касается средства для лечения гриппа. Изобретение заключается в том, что композиция на основе парацетамола ремантадина, аскорбиновой кислоты рутина, лоратадина и глюконата кальция представляет собой комплексный препарат для перорального приема. Изобретение является лекарственной формой длительного срока хранения и благодаря стабильности состава пригодно для промышленного производства в виде ГЛС (готового лекарственного средства). Стабильность композиции достигается тем, что входящие в состав композиции ингредиенты разнесены в две разные капсулы или таблетки, которые при одновременном приеме обеспечивают лечебный терапевтический эффект. Изобретение обеспечивает воздействие на основные симптомы гриппа, обладает жаропонижающим, противовирусным, противовоспалительным, антиаллергическим, общеукрепляющим действием. Он также влияет на выработку организмом альфа-интерферона и гамма-интерферона, при этом сроки лечения гриппа и ОРВИ сокращаются на 2-3 дня, а сама болезнь протекает легче и без осложнений. 10 табл.
Изобретение относится к медицине, предназначено для лечения гриппа путем приема перорально композиции на основе известных лекарственных препаратов. Композиция представляет собой готовое лекарственное средство (ГЛС) с длительным сроком хранения при сохранении своей биологической активности, пригодна для промышленного производства.
Грипп - вирусное заболевание, имеющее массовый характер в период эпидемии. Грипп часто сопровождается осложнениями. Он характеризуется острым началом. Инкубационный период при гриппе А - от нескольких часов до 2-х суток, при гриппе В - до 3-х суток (Грипп. Под ред. Г.И.Карпухина, Лениздат, "Медицина", 1986).
Во время гриппа больной страдает от высокой температуры, головной боли, лихорадки, происходит общая интоксикация организма, поражаются слизистая оболочка дыхательных путей, нервная и сердечно-сосудистая системы. У больных отмечается появление мышечных и суставных болей, общая слабость и нарушение со стороны крови (лейкопения), со стороны лимфатической системы (лимфопения).
Лечение гриппа осуществляют таким образом, чтобы предотвратить осложнения, одновременно облегчая течение гриппа (снижая высокую температуру, интоксикацию организма, головную боль и т.д.), активизируя борьбу организма с вирусной инфекцией.
Для этого в композициях для лечения гриппа используют жаропонижающие, противовоспалительные, противовирусные, антиаллергические, общеукрепляющие препараты.
При гриппе больному назначают для ликвидации симптоматических проявлений болезни такие препараты, как ацетилсалициловая кислота (Справочник Видаль, Лекарственные препараты в России, 1999, Е-5), иные жаропонижающие и болеутоляющие средства.
В качестве антигистаминных препаратов назначают димедрол (М.Д.Машковский, Лекарственные средства, Москва, 1987, т.1, с.309), супрастин М.Д.Машковский, Лекарственные средства, Москва, 1987, т.1, с.316) и подобные препараты. Они предупреждают развитие вызываемого гистамином отека тканей, понижают токсичность гистамина, уменьшают проницаемость капилляров.
Лучшие результаты лечения гриппа получают при назначении больным комплексных препаратов, т.е. композиций, которые воздействуют на различные клинические проявления болезни одновременно.
Такие композиции удобны для приема во время болезни, т.к. в них содержатся разнонаправленные лекарственные компоненты.
Известна для лечения гриппа композиция "Колдрекс". Она состоит из парацетамола, фенилэфрина, кофеина, терпингидрата и аскорбиновой кислоты (Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. 1999, Б-307).
В состав "Колдрекса" входит кофеин, который является психостимулятором, способным нарушать сон, а нарушение сна свойственно самому заболеванию - гриппу.
В результате этот симптом усиливается при приеме "Колдрекса", что является недостатком данной композиции. Также неудачным является использование в композиции фенилэфрина, который способствует нарушению гемодинамики в таких органах, как легкие, головной мозг.
Прототипом предлагаемого изобретения является композиция, состоящая из ацетилсалициловой кислоты, аскорбиновой кислоты, рутина, димедрола и солей кальция. Данная смесь препаратов была предложена в качестве аптечной прописи (Грипп. Под ред. Г.И.Карпухина. Лениздат, "Медицина", 1986, с.285).
Ее недостатком является невысокая анальгетическая активность.
В процессе лечения таким составом препаратов сохранялись головная боль, ломота в суставах, температурная реакция организма. Длительный прием такого лекарственного средства из-за присутствия в композиции ацетилсалициловой кислоты (более 50%) может вызвать обострение язвенной болезни желудка или двенадцатиперстной кишки.
Целью предлагаемого изобретения является создание такой композиции для лечения гриппа, которая облегчает течение болезни и уменьшает ее проявления (угнетение сознания, головная боль, тянущие боли в конечностях, потеря вкуса и обоняния, замедление пульса, чувство раздражения в трахее и гортани и т.д.), а также обладает противовирусной активностью, антитоксическим действием.
Композиция должна быть пригодна для промышленного выпуска и обладать стабильностью в течение длительного времени.
Сущностью предлагаемого изобретения является сочетанное использование парацетамола и ремантадина в композиции и комбинациях в лекформе таких препаратов, как парацетамол, ремантадин, аскорбиновая кислота, лоратадин, рутин, глюконат кальция. За счет присутствия в композиции парацетамола удалось снизить разовую дозу ремантадина для взрослых с 100 мг до 50 мг, получая высокий лекарственный эффект композиции. Для стабилизации композиции при промышленном производстве ее составляющие разнесены в 2 капсулы или таблетки, которые предназначены для одновременного приема и которые при совместном приеме дают высокий сочетанный лечебный эффект.
Комбинированный препарат обладает противовирусным и интерфероногенным, жаропонижающим, противовоспалительным, обезболивающим, антигистаминным, ангиопротекторным действием.
Выбор компонентов для композиции был основан на их известных фармакологических свойствах, но лечебный эффект превзошел ожидания.
По-видимому, сочетание парацетамола с ремантадином усиливает интерфероногенное действие, за счет чего в композиции стало возможным уменьшить разовую дозу ремантадина до 50 мг при общей дневной дозе 100-150 мг. Сочетание компонентов в композиции позволяет уже в первые сутки лечения облегчить состояние больного, сократив срок болезни на 2-3 дня, т.е. курс лечения в течение 5 дней дает высокий процент излечившихся больных, осложнения болезни не отмечены.
Входящие в состав композиции препараты подбирали с учетом их биологической активности. Ремантадин (римантадин) блокирует включение вируса в клетку-хозяина, ингибирует высвобождение вирусного генома в клетке. Вирус гриппа обладает пневмотропными свойствами, чем отчасти объясняется частота гриппозных пневмоний. За счет присутствия в организме вируса гриппа резко снижается сопротивляемость организма к различным вторичным инфекциям (пневмококк, стрептококк, палочка Пфейфера).
Ремантадин обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа типа А (особенно А2), уменьшает токсические проявления, вызванные вирусом гриппа типа В и вирусами, вызывающими ОРВИ. Он обладает выраженными интерфероногенными свойствами, повышая общее содержание интерферонов и особенно интерферона-гамма в крови.
Лечебная доза для взрослых в чистом виде - 100 мг 3 раза в сутки или 300 мг одноразово.
Включив ремантадин в композицию в дозе 50 мг на разовый прием, при общей суточной дозе 100-150 мг, получили очень высокий лечебный эффект, когда в антигриппозной композиции одновременно присутствует парацетамол.
Парацетамол, как и ремантадин, быстро и достаточно полно всасывается в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Обычно его назначают в качестве болеутоляющего, жаропонижающего и противовоспалительного средства. Он ингибирует синтез простогландины (ПГ) и снижает возбудимость центра терморегуляции гипоталамуса.
Парацетамол в композициях с ремантадином и используемыми по изобретению составляющими композицию препаратами ранее в ГЛС не применяли. Эффект от совместного использования был неожиданным.
Разовая доза парацетамола при приеме его в чистом виде (вне композиции) составляет для взрослых 200-400 мг, прием - 3 раза в сутки. Максимальная суточная доза составляет 1500 мг.
В предлагаемой композиции его суточная доза составляет 700-1100 мг, при приеме композиции 2-3 раза в сутки.
Известно, что грипп сопровождается мощной интоксикацией организма, осложнениями: воспаление придаточных полостей, воспаление среднего уха, катаральная пневмония аспирационно-ателектанического типа.
У парацетамола вне композиционного приема противоспалительная активность слабая, он значительно уступает салицилатам, производным пиразолона. Однако в сочетании с ремантадином, с глюконатом кальция (100 мг на разовый прием) с антигистаминным препаратом лоратадином (3 мг на разовый прием), аскорбиновой кислотой (300 мг на разовый прием) и рутином (рутозидом) (20 мг на разовый прием) противовоспалительная активность парацетамола увеличивается. Рутин является ангиопротектором, он уменьшает проницаемость капилляров, отечность, воспаление, укрепляет сосудистые стенки, тормозит агрегацию и увеличивает степень деформации эритроцитов. Именно он придает композиции зеленовато-желтоватый цвет. В заявляемую композицию его включили в минимальной из известных из литературы доз. Аскорбиновая кислота участвует в окислительно-восстановительных процессах, регулируя их. Она (витамин С) регулирует углеводный обмен, проницаемость капилляров, свертываемость крови, регенерацию тканей, активирует иммунные реакции.
При получении ГЛС наличие в композиции аскорбиновой кислоты и рутина не влияет на стабильность состава композиции, где содержатся лоратадин, ремантадин и глюконат кальция, но из-за химического строения парацетамола (N - (4-гидроксифенил) ацетамид, или пара-ацетаминофенол) возможно взаимное влияние компонентов, превращение парацетамола и иных составляющих композицию в другие химические соединения и, как следствие, потеря композицией биологической (противовирусной, противовоспалительной и т.д.) активности.
Химические реакции между составляющими, когда все 6 ингредиентов находятся в одной капсуле/таблетке, в процессе хранения нарушают общий состав лекформы, т.е. ГЛС теряет стабильность. Из-за этого состав разделили на 2 части по химической совместимости, т.о. ГЛС - это 2 капсулы или таблетки.
Характеристики остальных исходных составляющих композицию - лоратадина: выраженное антигистаминное действие, предупреждает развитие отека тканей, связанного с высвобождением гистамина, - и кальция глюконата: предотвращает развитие повышенной проницаемости и ломкости сосудов, обусловливающих геморрагические процессы при гриппе и острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ), а также восстанавливает капиллярное кровообращение, оказывает антиаллергическое действие. В композицию глюконат кальция включен в дозе 100 мг на разовый прием, что в 10 раз ниже минимальной дозы на прием в чистом виде.
Комбинируя препараты, усилили их положительное действие и понизили отрицателное. В результате изучения свойств композиции, количественных соотношений компонентов было подобрано оптимальное соотношение ингридиентов (в весовом соотношении):
| Парацетамол | 360 мг |
| Ремантадин | 50 мг |
| Аскорбиновая кислота | 300 мг |
| Рутин | 20 мг |
| Лоратадин | 3 мг |
| Кальция глюконат | 100 мг |
Действие предложенной композиции (в опытах означена ПП) проверяли на мышах и крысах. Оценивали острую и подострую токсичность, противовирусное и интерфероногенное действие предложенного по заявке состава. Острая токсичность ПП на мышах составила 1100 мг/кг при внутрибрюшинном введении. Исследование подострой (в течение 15 дней) токсичности препарата ПП в дозе 480 мг/кг (10-50-кратная терапевтическая доза) в сравнении с контролем при введении внутрь показало безопасность данного препарата.
Безопасность композиции подтверждена исследованиями общего состояния животных, их поведением, системы крови, сердечно-сосудистой, выделительной и пищеварительной систем, посмертными морфологическими исследованиями внутренних органов.
Двойное слепое сравнительное плацебоконтролируемое экспериментальное исследование противогриппозной активности композиции (ПП) показало, что она обладает выраженным защитным лечебно-профилактическим антигриппозным действием, которое было выявлено на модели летальной гриппозной инфекции у белых мышей.
Этот эффект проявляется по всем исследованным показателям: индексу защиты, длительности инкубационного периода, а также макроскопическим проявлениям типичного для мышей постгриппозного хронического бронхо-легочного процесса.
Механизм противовирусной активности композиции in vivo обусловлен индукцией сывороточного интерферона.
Введение ПП в дозе 100 мг/кг стимулировало выработку как альфа-, так и гамма-интерферона, суммарные титры при этом достигали к пятому дню показателей 73,6-120,6 ед/мл. Такие показатели выработки сывороточного интерферона при пероральном введении препарата свидетельствует о его потенциальной возможности использования в качестве индуктора интерферона в комплексном лечении вирусных заболеваний.
Благодаря этому оправдано применение композиции в лечении гриппа, острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), лихорадочных состояний с поражением бронхо-легочного дерева.
Исходя из того, что стабильность композиции сохраняется, когда она разделена по химической совместимости компонентов, испытание на больных проводили, назначая композицию в виде ГЛС. Больные принимали одновременно две капсулы/таблетки (взаимодополняющие) перорально. Суточный прием композиции по изобретению 2-3 раза. Срок лечения 3-5 дней, т.к. улучшение состояния больных отмечается в более короткий срок.
Высокая клиническая эффективность комплексного препарата по заявке представлена в табл.1.
Предлагаемые ГЛС оказывает действие и как средство симптоматической терапии и как средство, влияющее на репродукцию вирусов гриппа.
| Таблица 1 | |||
| Влияние антигриппозного средства на продолжительность фебрильной фазы заболевания | |||
| Группа (по 10 человек) | Тяжесть заболевания | ||
| Легкая (дни) | Средняя (дни) | Тяжелая (дни) | |
| Группа в опыте | 1 | 2-3 | 3-5 |
| Контрольная (без лечения) | 2-3 | 3-5 | 5-7 |
Испытания в клинике предлагаемой композиции на больных ОРВИ продемонстрировали влияние заявляемого ГЛС на показатели иммунной системы и на функциональное состояние макрофагов крови (табл.2, 3).
| Таблица 2 | |||||
| Влияние антигриппозной композиции по заявке на показатели иммунной системы у больных ОРВИ | |||||
| Показатель | Единицы измерения | Контрольная группа | Группа в опыте | ||
| Начало болезни | Конец болезни | В начале лечения | В конце лечения | ||
| Лизоцим | Мг/л | 8,4±0,4 | 12,1±0,5 | 10,4±2,1 | 11,3±1,4 |
| Комплемент | Ед | 52,0±2,7 | 52,5±5,3 | 47,9±4,6 | 48,8+ 6,2 |
| IgA | Мг/л | 1б3±13 | 172±28 | 155±23 | 174+21* |
| IgM | Мг/л | 135±8 | 134±8 | 120±12 | 154+17* |
| IgG | Мг/л | 194±8 | 200±15 | 189±14 | 205+7* |
| Таблица 3 | |||||
| Влияние антигриппозного средства на функциональное состояние макрофагов крови | |||||
| Группа больных | Процент фагоцитирующих мононуклеаров | Процент мононуклеарных фагоцитов, содержащих вирусные включения | |||
| До лечения | После лечения | До лечения | После лечения | ||
| Группа в опыте | 8,4+3,0 | 33,5+6,2* | 49,7+13,2 | 12,0+4,2 | |
| контрольная | 11,0+3,0 | 20,4+7,1 | 47,1+7,5 | 32,0+8,1 | |
| Примечание * - различия с показателями до лечения достоверны, р<0,01 |
Для промышленного производства композиции в виде ГЛС она должна быть стабильна, соответствовать требованиям Фармакопеи. Компоненты сгруппировали по их химическим свойствам, по совместимости, в две разные капсулы или таблетки.
Капсула (таблетка) 1, обозначена П в испытаниях - содержит парацетамол и вспомогательные вещества (для капсулирования или таблетирования).
Капсула (таблетка) 2, обозначена Р в испытаниях - содержит ремантадин, аскорбиновую кислоту, кальция глюконат, рутин, лоратадин и вспомогательные вещества (для капсулирования или таблетирования).
Одновременный прием предлагаемых двух разных капсул или таблеток дает лечебный эффект благодаря сохранению композиционного состава заявляемого лекарственного средства. Стабильность состава композиции сохраняется длительное время при хранении из-за раздельного хранения химически не совместимых компонентов.
Бинарный препарат готовят смешиванием сухих действующих (активных) и вспомогательных компонентов.
Количественный состав каждой из капсул: капсула 1(П): масса содержимого одной капсулы в среднем составляет 380 мг, при содержании в ней парацетамола 360 мг и вспомогательных веществ - 20 мг. В качестве вспомогательных веществ используют:
= крахмал (картофельный или крахмал желатинизированный) 9,0 мг
= сахар молочный (лактоза) 4,2 мг
= магния стеарат 3,8 мг,
кремния диоксид коллоидный 3,0 мг.
В процессе производства отклонения в массе содержимого капсулы составляют ±10%, т.е. масса содержимого равна 0,342 г - 0,418 г.
Капсула 2 (Р): масса содержимого одной капсулы в среднем составляет 480 мг, при содержании в ней активных компонентов и вспомогательных веществ: активные ингредиенты 473 мг, вспомогательные вещества 7 мг.
Активные составляющие композиции в данной капсуле:
| Ремантадин (римантадин) | 50 мг |
| Аскорбиновая кислота | 300 мг |
| Рутин (рутозид) | 20 мг |
| Лоратадин | 3 мг |
| Кальция глюконат | 100 мг |
В качестве вспомогательных веществ используют:
| Магния стеарат | 4,8 мг |
| Крахмал (картофельный) | 2,2 мг |
В процессе производства отклонения в массе содержимого капсулы составляют ±10%, т.е. масса содержимого равна 0,432 г - 0,528 г.
В промышленном производстве капсулы разного наполнения окрашены пищевыми красителями в разные цвета, что делает их удобным при приеме больными.
Аналогичный подход при выпуске таблеток - два разных цвета у каждого состава из общей композиции.
Разброс в массе входящих в композицию активных ингредиентов при полном сохранении активности (лекарственного эффекта) составляет ±10%. Таким образом, средняя масса каждого из входящих препаратов равна (в г):
= парацетамол 0,324-0,396
= ремантадин 0,045-0,055
= аскорбиновая кислота 0,270-0,330
= рутин 0,018-0,022
= лоратадин 0,0027-0,0033
кальция глюконат 0,090-0,110
Проверку стабильности композиции осуществляли через 12 месяцев и через 24 месяца содержимое каждой из капсул (таблеток) №1 и №2 проверяли на соответствие компонентного (качественного и количественного) состава в соответствии с требованиями фармакопеи ГФ XI., вып.1, 2. Испытаны по 10 капсул каждого состава 5 партий композиций. Все значения нормируемых показателей оказались в норме, т.е. соответствовали заявленному составу. В табл. 4 приведены средние значения. Капсулы (содержимое их) сохраняли первоначальный цвет (соответствие требованиям ГФ XI, вып.2, с.143):
Капсула 1 (П) - смесь порошка и/или гранул белого или белого с кремоватым или розовым оттенком;
Капсула 2 (Р) - смесь порошка и/или гранул желтого с зеленоватым оттенком и белого цвета.
| Таблица 4 | |||||
| Результаты проверки стабильности содержимого капсул №1 и №2, составляющих заявляемую композицию. | |||||
| № партии | Наименование показателей | Год изготовления, 2002 г. Средняя масса в г | Год проверки, 2003 г. Средняя масса в г | Год проверки, 2004 г. Средняя масса в г | Соответствие цветности |
| 1. | №1 | ||||
| парацетамол | 0,362 | 0,363 | 0,362 | соответствует | |
| №2 | |||||
| - аскорбиновая кислота | 0,301 | 0,302 | 0,302 | ||
| - кальция глюконат | 0,099 | 0,096 | 0,097 | ||
| - ремантадин | 0,050 | 0,051 | 0,049 | соответствует | |
| - рутин | 0,020 | 0,019 | 0,019 | ||
| - лоратадин | 0,0029 | 0,0029 | 0,0030 | ||
| 2. | №1 | ||||
| парацетамол | 0,357 | 0,356 | 0,358 | соответствует | |
| №2 | |||||
| - аскорбиновая кислота | 0,297 | 0,299 | 0,298 | соответствует | |
| - кальция глюконат | 0,101 | 0,100 | 0,102 | ||
| - ремантадин | 0,051 | 0,052 | 0,051 | ||
| - рутин | 0,021 | 0,020 | 0,021 | ||
| - лоратадин | 0,0031 | 0,0030 | 0,0031 | ||
| 3. | №1 | ||||
| парацетамол | 0,342 | 0,344 | 0,346 | соответствует | |
| №2 | 0,294 | 0,296 | 0,296 | ||
| - аскорбиновая кислота | 0,104 | 0,104 | 0,102 | соответствует | |
| - кальция глюконат | 0,053 | 0,052 | 0,051 | ||
| - ремантадин | 0,019 | 0,019 | 0,020 | ||
| - рутин | 0,0028 | 0,0029 | 0,0028 | ||
| - лоратадин | |||||
| 4 | №1 | ||||
| парацетамол | 0,348 | 0,349 | 0,350 | соответствует | |
| №2 | |||||
| - аскорбиновая кислота | 0,310 | 0,309 | 0,307 | соответствует | |
| - кальция глюконат | 0,092 | 0,094 | 0,096 | ||
| - ремантадин | 0,049 | 0,049 | 0,050 | ||
| - рутин | 0,019 | 0,020 | 0,019 | ||
| - лоратадин | 0,0031 | 0,0031 | 0,0030 | ||
| 5 | №1 | ||||
| парацетамол | 0,364 | 0,363 | 0,364 | ||
| №2 | |||||
| - аскорбиновая кислота | 0,295 | 0,297 | 0,297 | соответствует | |
| - кальция глюконат | 0,103 | 0,102 | 0,102 | ||
| - ремантадин | 0,052 | 0,050 | 0,049 | ||
| - рутин | 0,020 | 0,021 | 0,021 | ||
| - лоратадин | 0,0028 | 0,0028 | 0,0031 |
Проверка стабильности композиции, когда все входящие компоненты были соединены вместе в одну капсулу, показала, что нарушения в составе наблюдаются уже через 12 месяцев визуально. При хранении при температуре +30°С и относительной влажности 70% содержимое такой капсулы приобретает бурый цвет, порошок изменяет свой вид - слипается в комки.
Количественное определение аскорбиновой кислоты и парацетамола показало их уменьшение в композиции на 15% через 12 месяцев и на 20-25% через 24 месяца хранения.
Исходя из этого, выпуск композиции в виде ГЛС возможен только в виде двух разных капсул или таблеток, имеющих химически совместимый состав.
Методы испытания композиции в экспериментальных исследованиях, подтверждающие вышеуказанное о ее лечебном эффекте.
Испытуемые образцы. В экспериментальных исследованиях были изучены три образца препаратов. Противогриппозный препарат (ПП) представлял порошок желтоватого цвета, относительно плохо растворимый в воде. В качестве препаратов сравнения использовали известный противогриппозный препарат ремантадин и производное тиобензимидазола алмид.
Животные. Экспериментальные исследования проведены на белых беспородных мышах массой 18-22 г, полученных из питомника "Рапполово" РАМН. Мыши были разделены на 6 групп по сорок голов в каждой. Всего в данной работе использовано 270 животных.
Вирус. Использовали вирус гриппа А, штамм Aichi/2/68 (H3N2), полученный из музея НИИ гриппа РАМН и адаптированный к белым мышам.
Методика постановки экспериментальной гриппозной инфекции. Испытания проводили в соответствии с разработанными в НИИ гриппа РАМН методическими указаниями (Ильенко В.И. Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа (методические указания), Л., 1977). Для этого испытуемые образцы предварительно растворяли (или ресуспендировали) в 1%-ном растворе крахмала на кипяченой воде. Введение препаратов проводили в испытуемых дозах, которые указаны в табл.5, перорально (через зонд) в объеме 0,2 мл пятикратно по следующей схеме: за 24 ч и 1 ч до заражения, через 24, 48 и 72 ч после заражения. Мышам контрольной группы аналогично вводили 1%-ный раствор крахмала. Заражение мышей проводили интраназально патогенным вирусом гриппа A/Aichi/2/68 под легким эфирным наркозом в дозе 0,1 и 1 LD50 (летальная доза). Указанная схема предусматривает одновременное испытание профилактического и лечебного действия испытуемого соединения. Учет результатов проводили по следующим показателям:
а) сравнение летальности животных в группе леченых и контрольных мышей на 9-й день после заражения;
б) определение длительности инкубационного периода для всей группы животных, включенных в опыт, в течение всего периода наблюдения (14 дней после заражения). В этом расчете делается условный допуск, что длительность жизни выживших животных равна длительности опыта (срока наблюдения).
в) макроскопическое (визуальное) определение интенсивности вирусного поражения легких выживших мышей на 14-й день после заражения. Оценку проводили по наличию типичных очагов хронической гриппозной пневмонии и выражали в процентах: 0% - отсутствие видимых поражений, 25% - сегментарные поражения, 50% - поражения, состоящие из нескольких слившихся сегментов, но не занимающих всей доли легкого, 75% - поражение отдельных долей, 100% - тотальное поражение легких. Статистическую обработку результатов макроскопического исследования проводили путем сравнения доверительных интервалов средних арифметических величин при р=0,05.
Результаты исследования.
Выживаемость мышей во время экспериментальной гриппозной инфекции после перорального введения им испытуемых образцов по лечебно-профилактической схеме представлена в табл.5. В качестве показателя противовирусной активности при сравнении летальности опытных и контрольных групп животных использовали индекс защиты (ИЗ), который рассчитывали по следующей формуле:
Результаты показывают, что рассчитанная величина ИЗ для ПП и алмида при заражающей дозе 1 LD50 составляет от 52 до 62%, что позволяет оценить эти соединения, как обладающие достаточно выраженной противовирусной активностью. Следует отметить, что они уступают классическому противогриппозному средству ремантадину, у которого этот показатель равен 90,9%.
Оценка противовирусного действия испытуемых образцов по длительности инкубационного периода (табл.6) также подтверждает вывод о высокой противогриппозной активности исследуемых препаратов. У мышей, которым вводили ПП и алмид, при заражающей дозе 1 LD50, инкубационный период увеличился по сравнению с контролем на 1,8-2,2 дня. Однако наибольшее его увеличение (на 3,5 дня) наблюдалось при введении ремантадина.
| Таблица 5 | |||||
| Влияние испытуемых препаратов на течение экспериментальной гриппозной инфекции у мышей | |||||
| Образцы препарата, доза, мг/кг | Кол-во животных в группе | Доза вируса, LD50 | Количество погибших животных на 9-й день | Индекс защиты, % | Оценка активности препарата** |
| Алмид, 10 мг/кг | 20 | 0,1 | 1/5,0* | 50,0 | ++ |
| 19 | 1 | 5/26,3 | 52,3 | ++ | |
| ПП, 10 мг/кг | 20 | 0,1 | 1/5,0 | 50,0 | ++ |
| 20 | 1 | 4/20,0 | 62,9 | +++ | |
| ПП, 100 мг/кг | 19 | 0,1 | 2/10,5 | 0,0 | - |
| 20 | 1 | 5/25,0 | 54,5 | ++ | |
| Ремантадин, 50 мг/кг | 20 | 0,1 | 0 | 1000 | ++++ |
| 20 | 1 | 1/5,0 | 90,9 | ++++ | |
| Контроль, плацебо | 20 | 0,1 | 2/10,0 | ||
| - | |||||
| - | |||||
| 20 | 1 | 11/55,0 | - | - | |
| Примечание: * В числителе - абсолютное количество павших животных, в знаменателе - этот показатель, выраженный в процентах; ** Препарат не активен; +, ++, +++, ++++ - степень выраженности противовирусного эффекта. |
Исследованы легкие выживших мышей, зараженных 0,1 LД50. Характер патологического процесса свидетельствует о том, что интенсивность специфического для вируса гриппа поражения легочной ткани у мышей, которым вводили ПП и алмид, были достоверно ниже по сравнению с контрольной группой животных. Из двух испытуемых доз ПП наибольший защитный эффект по этому показателю проявился в дозе 10 мг/кг.
| Таблица 6 | |||||||||||||||
| Расчет длительности инкубационного периода для всей группы животных | |||||||||||||||
| Препарат, доза, мг/кг | Доза вируса, LD50 | Кол-во мышей | Из них пали в указанные дни опыта | Всего пало | Инкубационный период, дни | ||||||||||
| 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |||||
| Алмид, 10 мг/кг | 0,1 | 20 | - | - | 1 | - | - | - | 1 | - | - | - | - | 13,4 | |
| 1 | 19 | - | 2 | 1 | - | 2 | 1 | - | 1 | - | - | - | 6 | 12,3 | |
| ПП,10 мг/кг | 0,1 | 20 | - | - | - | - | 1 | - | - | - | - | - | 1 | 13,7 | |
| 1 | 20 | - | - | 1 | 2 | - | 1 | - | - | - | - | - | 4 | 12,6 | |
| ПП,100 мг/кг | 0,1 | 19 | - | - | - | - | 1 | 1 | - | - | - | 1 | - | 3 | 13,7 |
| 1 | 20 | - | - | 2 | 2 | - | 1 | - | - | - | - | - | 5 | 12,2 | |
| Ремантадин, 50 мг/кг | 0,1 | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 0 | 14,0 |
| 1 | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | 1 | - | - | 1 | 13,9 | |
| Контроль, плацебо | 0,1 | 20 | - | 1 | - | - | - | 1 | - | 1 | - | - | - | 3 | 13,1 |
| 1 | 20 | - | 1 | 2 | 2 | 3 | 3 | - | - | - | - | - | 11 | 10,4 |
В результате двойного слепого исследования установлено, что интенсивность макроскопических поражений легких, в %, на 14-й день гриппозной инфекции составляет: при введении алмида 30%, ПП (10 мг/кг) 20%, ПП (100 мг/кг) 35%, фитопрепарата (маргали) 63%, ремантадина 5%, в контроле 55% (р<0,5 по сравнению с контролем).
Заключение
На основании полученных экспериментальных данных установлено, что испытуемые образцы ПП обладают выраженным защитным лечебно-профилактическим противогриппозным действием, которое было выявлено на модели летальной гриппозной инфекции у белых мышей. Этот эффект проявлялся по всем трем показателям: индексу защиты, длительности инкубационного периода, а также макроскопических проявлений типичного для мышей постгриппозного хронического бронхо-легочного процесса. Механизм противовирусной активности этих соединений in vivo может быть обусловлен индукцией сывороточного интерферона, который был обнаружен у мышей после введения этих препаратов. Это согласуется с данными литературы о том, что препараты, способные стимулировать выработку в организме мышей гамма-интерферон, обеспечивают защиту от летальной гриппозной инфекции благодаря антидепрессивному действию на систему клеточного иммунитета. Поэтому препарат ПП применим для комплексной профилактики и лечения гриппозной и другой вирусной инфекции.
Изучение интерферогенного действия ПП
В данном исследовании была изучена продукция сывороточного альфа- и гамма-интерферона у мышей при введении им исследуемых соединений, предположительно обладающих интерфероногенной активностью. Работа проведена на базе лаборатории гриппозных вакцин НИИ гриппа РАМН и лаборатории этиологических методов диагностики НИИ детских инфекций МЗ РФ. Исследование проведено двойным слепым методом.
Материалы и методы
Испытуемые образцы. В экспериментальных исследованиях были изучены три образца препаратов. Противогриппозный препарат (ПП) представляет порошок желтоватого цвета, плохо растворимый в воде. В качестве препарата сравнения использовали производное тиобензимидазола алмид. Дозы препаратов составили 10 и 100 мг/кг для ПП и 10 мг/кг для алмида. Испытуемые образцы предварительно растворяли (или ресуспендировали) в 1%-ном растворе крахмала на дистиллированной воде. Введение препаратов проводили перорально (через зонд) в объеме 0,2 мл.
Животные. Экспериментальные исследования проведены на белых беспородных мышах массой 18-22 г, полученных из питомника "Рапполово" РАМН. Мыши были разделены на 5 групп по 25 голов в каждой. Всего в данной работе использовано 110 животных.
Метод тестирования интерферонов. Интерферон тестировали по методу Finter N.B. (1968) в модификации О.А.Аксенова с использованием индикаторного вируса Сендай (мышиный вариант) и культуры клеток L-929. В полистероловые панели засевали культуру L-929 в концентрации 200 тысяч клеток/мл по 100 мкл в каждую лунку. Через сутки на выросший пласт клеток вносили сыворотки мышей после введения им указанных препаратов - индукторов интерферона в разведении 1:20. Каждая сыворотка вводилась в двух видах ˜ нативной и после обработки с удалением гамма-интерферона.
Дозу тест-вируса Сендай определяли в специальном опыте его раститровкой на той же тканевой культуре в пределах 1:25-1:1600. Тестирование активности вируса проводили методом количественной гемадсорбции. Для этого через сутки после внесения указанных разведений вируса проводили отмывку тканевого пласта зараженных клеток, подсушивали и на пласт вносили 0,5% взвесь эритроцитов морской свинки. Через 30 минут проводили отмывку от неадсорбированных на пласт клеток 4-кратно фосфатно-буферным раствором, высушивали 10 минут в термостате при 37°С. После этого пласт зараженных клеток с адсорбированными эритроцитами заливали дистиллированной водой для лизирования эритроцитов по 100 мкл на лунку.
Далее в лизате эритроцитов тестировали активность оксидазных ферментов по принципу иммуноферментного анализа. Ферменты определяли с помощью окислительной системы, включающей перекись водорода и ортофенилендиамин. Принцип метода заключается в том, что степень окисления этого субстрата эритроцитарными оксидазными ферментами находится в линейной зависимости от величины лизиса адсорбированных вирусом эритроцитов, т.е. от активности вируса Сендай. Использование такой модификации позволяет выявлять вирус в цветовом количественном показателе при длине волны 495 нм с использованием иммуноферментных анализаторов различного типа.
Рабочей дозой тест вируса служило разведение, отражающее начало снижения активности тест-вируса (табл.7).
| Таблица 7 | ||||||||
| Расчет рабочей дозы тест-вируса Сендай | ||||||||
| Тест-вирус | Активность в иммуноферментном тесте вируса Сендай (ОП - 495 нм) при внесении его в культуру L-929 в разведении 1:25-1600 | |||||||
| 25 | 50 | 100 | 200 | 400 | 800 | 1600 | без вируса | |
| Сендай | 0,366 | 0,340 | 0,326 | 0,350 | 0,236 | 0,115 | 0,060 | 0,010 |
Таким образом, рабочей дозой тест-вируса в данном исследовании служило разведение 1:200. Это разведение вируса вносили в основной опыт с испытуемыми сыворотками на сутки при 37°С. Через сутки весь опыт отмывали так же, как и при определении рабочей дозы вируса, рассчитывали показатель в иммуноферментном тесте и по калибровочной кривой активности мышиного интерферона определяли титр интерферона в исследуемых сыворотках. Интерфероны определяли в сыворотке крови в нативном виде и после разрушения гамма-интерферона прогреванием при 56°С в течение 30 минут и 2-дневной обработкой 1 N-ной соляной кислотой.
Результаты исследования
Для изучения интерферонопродуцирующей активности исследуемые препараты вводили мышам перорально через зонд в объеме 0,2 мл в следующих дозах: алмид 10 мг/кг, ПП 10 и 100 мг/кг. Цикл введения препаратов составил 3 дня. Через 1, 2, 3, 4, 5 сутки после первого введения препарата брали кровь от 5 мышей каждой группы и получали сыворотку. Сыворотку контрольных животных получали до начала опыта.
Установлено, что при пероральном введении алмида интерферон начал появляться уже через сутки после первого введения - 28,2 единиц и на протяжении последующих 5 дней его уровень варьировал в пределах 30-44 единиц в 1 мл. Более высокие значения интерферона выявляли при введении ПП. Через 5 дней после первого введения ПП 10 мг/кг стимулировал выработку интерферона до концентрации 76,3 ед./мл, ПП 100 мг/кг - до 120,6 ед/мл (табл.8).
При оценке выработки альфа-интерферона (табл.9) установлено, что алмид 10 мг/кг стимулировал выработку альфа-интерферона на протяжении 3-х суток после перорального введения до 40,5 ед/мл, в дальнейшем его активность падала до 17,9 ед/мл. Максимальной активностью обладал ПП в дозе 100 мг/кг, когда величина альфа-интерферона возрастала на протяжении 5 дней с 36,8 до 80,6 ед/мл.
| Таблица 8 | |||||
| Концентрация общего интерферона в крови мышей после перорального введения препаратов-интерфероногенов | |||||
| Препараты, доза, мг/кг | Титр интерферона в крови мышей, дни после первого введения | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Алмид, 10 мг/кг | 28,2 | 44,3 | 40,5 | 31,1 | 30,2 |
| ПП, 10 мг/кг | 17,8 | 26,5 | 51,4 | 55,2 | 76,3 |
| ПП, 100 мг/кг | 36,8 | 46,1 | 96,0 | 116,4 | 120,6 |
| Таблица 9 | |||||
| Концентрация альфа-интерферона в крови мышей после перорального введения испытуемых препаратов | |||||
| Препарат, доза (мг/кг) | Титр альфа-интерферона в крови мышей, дни после первого введения | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Алмид, 10 мг/кг | 25,7 | 36,7 | 40,5 | 25,8 | 17,9 |
| ПП, 10 мг/кг | 17,8 | 26,5 | 38,9 | 40,6 | 35,8 |
| ПП, 100 мг/кг | 36,8 | 40,8 | 63,5 | 79,6 | 80,6 |
При расчете выработки гамма-интерферона (табл.10) оказалось, что минимальная активность этого типа интерферона наблюдалась у алмида. Титр интерферона практически обнаруживался после 5 введений препарата - 12,3 ед/мл. При введении ПП гамма-интерферон начинал появляться в крови мышей через 2-3 дня и к пятому дню составил при введении дозы 10 мг/кг - 30,5 ед/мл и другой дозы 100 мг/кг - 40,0 ед/мл.
| Таблица 10 | |||||
| Концентрация гамма-интерферона в крови мышей после перорального введения препаратов-интерфероногенов | |||||
| Препарат, доза (мг/кг) | Титр гамма-интерферона в крови мышей, дни после первого введения | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Алмид, 10 мг/кг | 2,5 | 7,6 | 0 | 5,3 | 12,3 |
| ПП, 10 мг/кг | 0 | 0 | 12,5 | 14,6 | 30,5 |
| ПП, 100 мг/кг | 0 | 15,3 | 32,5 | 36,8 | 40,0 |
Заключение
Из испытанных двух препаратов алмид 10 мг/кг стимулировал альфа-интерферон в течение первых трех дней после перорального введения. Гамма-интерферон при этом не вырабатывался. Наилучшие результаты по интерфероногенной активности были получены после введения ПП. Введение его в дозе 100 мг/кг стимулировало выработку как альфа-, так и гамма-интерферона, суммарные титры при этом достигали к пятому дню показателей 73,6-120,6 ед/мл. Такие показатели выработки сывороточного интерферона при пероральном введении препарата свидетельствуют о его потенциальной возможности использования в качестве индуктора интерферона в комплексном лечении вирусных заболеваний.
Антигриппозное лекарственное средство, характеризующееся тем, что оно выполнено в виде двух раздельных капсул или таблеток одна из которых содержит парацетамол и вспомогательные вещества, такие как крахмал, сахар молочный, магния стеарат, кремний диоксид коллоидный, а другая - ремантадин, аскорбиновую кислоту, рутин, лоратадин, кальция глюконат и вспомогательные вещества, такие как магния стеарат, крахмал при следующем соотношении компонентов на одну дозу, мг:
| капсула или таблетка 1: | |
| Парацетамол | 324-396 |
| Вспомогательные вещества | |
| Крахмал | 8,1-9,9 |
| Сахар молочный | 3,8-4,6 |
| Магния стеарат | 3,4-4,2 |
| Кремний диоксид коллоидный | 3,0 |
| Капсула или таблетка | 2 |
| Ремантадин | 45-55 |
| Аскорбиновая кислота | 270-330 |
| Рутин | 18-22 |
| Лоратадин | 2,7-3,3 |
| Кальция глюконат | 90-110 |
| Вспомогательные вещества: | |
| Магния стеарат | 4,3-5,3 |
| Крахмал | 2,0-2,4 |
