Использование активированного фактора vii свертывания крови для лечения обширных кровотечений, вызванных тромболитической терапией

Изобретение относится к использованию активированного фактора коагуляции VII (VIIa) в качестве терапевтического средства при лечении обширных кровотечений, вызванных тромболитической/фибринолитической терапией, включая внутричерепные кровоизлияния, и к соответствующему способу лечения. Изобретение обеспечивает результат при низкой частоте побочных явлений у больных с такими кровотечениями. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к активированному фактору VII (VIIa) свертывания крови и к его использованию для лечения обширных кровотечений, вызванных тромболитической/фибринолитической терапией.

Уровень техники

Гемостатическая система, включающая тромбоциты крови, свертывание крови и фибринолиз, играет решающую роль для поддержания кровотока и ограничения кровопотерь при сосудистых повреждениях. При повреждении кровеносного сосуда тромбоциты крови налипают на внутреннюю поверхность сосуда, скапливаются и формируются в сгусток-закупорку, которая уплотняется за счет нитей фибрина, образующихся при активировании процесса свертывания крови через активацию фактора VH,⁵ фактора Х и протромбина. После прекращения истечения крови начинается заживление пораженного участка сосуда, сопровождаемое рассасыванием тромба с помощью. фибринолитической системы путем образования (t-РА)-индуцированного плазмика - активатора тканевого плазминогена.

При патологических состояниях, таких как, например, сердечно-сосудистые заболевания, данная система может отказать и в результате нарушения нормальной физиологической регуляции может произойти полная закупорка кровеносного сосуда, как это наблюдается при отрыве атеросклеротической бляшки. Для лечения подобных случаев тромботической обструкции и для восстановления кровотока широко применяется тромболитическая терапия (Stassen JM, Nyström Å. A historical review on thrombosis and hemostasis. AnnPlast Surgery 1997; 39: 317-329).

Тромболитическая терапия включает комбинированное лечение с помощью антитромбоцитовых средств (например, ацетилсалициловой кислоты), противосвертывающих средств (например, гепарина) и фибринолитических средств (например, активатора тканевого плазминогена, стрептокиназы, стафилокиназы, урокиназы или их производных). Комбинирование этих средств, хотя и очень эффективно в терапевтическом отношении, влечет также за собой значительный риск последующих осложнений в виде кровотечений, например геморрагического шока (The GUSTO investigators. An international randomized trial comparing four thrombolytic strategies for acute myocardial infarction. N Engi J Med. 1993 Sep 2; 329(10): 673-82. Assent-2. Single-bolus tenecteplase compared with front-loaded alteplase in acute myocardial infarction: the ASSENT-2 double-blind randomised trial. Assessment of the Safety and Efficacy of a New Thrombolytic Investigators. Lancet 1999 Aug 28; 354(9180):71б-22). Сильное кровотечение имеет место у значительного числа больных, прошедших курс тромболитической терапии. Согласно самой последней из масштабных клинических апробаций тромболитической терапии, а именно согласно исследованию Assent-2, проведенному на 16949 пациентах, интракраниальное кровоизлияниение имело место, соответственно, в 0,93% случаев при использования тенектеплазы ((t-PA)-производное активатора тканевого плазминогена) и в 0,94% случаев при использовании альтеплазы (также (t-РА)-производное), а осложнения, связанные с нецеребральными кровотечениями, имели место в 26,43 и 28,95% случаев при использовании тенектеплазы и альтеплазы соответственно. Необходимость в переливании крови составила 4,25 и 5,49%. Уровень смертности или геморрагического шока без фатального исхода составил за 30 дней 7,11% для тенектеплазы и 7,04% для альтеплазы соответственно (Assent-2. Single-bolus tenecteplase compared with front-loaded alteplase in acute myocardial infarction: the ASSENT-2 double-blind randomised trial. Assessment of the Safety and Efficacy of a New Thrombolytic Investigators. Lancet 1999 Aug 28; 354(9180):716-22).

Таким образом, очевидна необходимость в лекарственном препарате, который явился бы антидотом, с помощью которого лечащий врач мог бы, вне зависимости от использованного тромболитического средства, нейтрализовывать подобные спровоцированные тромболитической терапией обширные кровотечения.

Сущность изобретения

Именно поэтому данное изобретение ставит своей целью создание композиции и способа для лечения обширных кровотечений в организме, вызванных тромболитической/фибринолитической терапией, например, у страдающих такими кровотечениями людей или животных.

Настоящее изобретение основывается на том открытии, что данная задача решаема путем использования в этих целях активированного фактора VII (VIIa) коагуляции.

Фактор VII представляет собой витамин-К-зависимый гликопротеин, который вырабатывается физиологически клетками печени и выделяется в кровь в виде одноцепочечных молекул, состоящих из 406 аминокислотных остатков. Активация фактора VII до фактора VIIa заключается в гидролизе простой пептидной связи между Arg-152 и IIe-153 до получения двухцепочечных молекул с одной легкой цепью из 152 аминокислотных остатков и одной тяжелой цепью из 254 аминокислотных остатков, удерживаемых вместе посредством простой дисульфидной связи. Будучи активирован, белок функционирует в качестве серинпротеазы, которая принимает участие во внешнем звене цепи процесса свертывания крови. При воздействии тканевого фактора (TF) на пораженную стенку сосуда формируется комплекс с фактором VII с превращением его в активированный фактор VII (фактор VIIa); комплекс из TF и фактора VIIa активирует фактор Х до фактора Ха, что в свою очередь ведет к превращению протромбина в тромбин. Тромбин играет главную роль в свертывании крови и заживлении пораженного места. На начальной стадии повреждения кровеносного сосуда он вызывает агрегацию тромбоцитов и образование фибрина, сопровождающееся стимуляцией клеточного роста, что способствует восстановлению поврежденного кровеносного сосуда (Stassen JM, Nyström A. A historical review on thrombosis and hemostasis. Ann Plast Surgery 1997; 39: 317-329).

Рекомбинантный фактор VII (rFVII) экспрессируется в клетках почки детеныша хомяка после их трансфекции человеческой ДНК, кодирующей фактор VII, и в ходе очистки превращается в активированный фактор VII (rFVIIa) (Thim L, Bjoern S, Christensen M, Nicolaisen EM, Lund-Hansen T, Pedersen AH, Hedner U. Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor VIIa from plasma and transfected baby hamster kidney cells. Biochemistry. 1988;27:7785-93). Рекомбинантный фактор VIIa в его товарной форме, NovoSeven® (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) все шире применяется при лечении случаев кровотечения при самых различных заболеваниях, сопровождаемых кровотечениями, в подавляющем числе случаев лечения больных гемофилией с помощью ингибиторов фактора VII или IX, когда терапия с помощью других средств оказывается неэффективной (Macik BG, Hohneker J, Roberts HR, Griffin AM. Use of recombinant activated factor VII for treatment of a retropharyngeal hemorrhage in a hemophilic patient with a high liter inhibitor. Am J Hematol. 1989,32:232-4. Kenet G, Walden R, Eldad A, Martinowitz U. Treatment of traumatic bleeding with recombinant factor VIIa. Lancet 1999;354:1879. White B, McHale J, Ravi N, Reynolds J, Stephens R, Moriarty J, Smith OP. Successful use of recombinant FVIIa (NovoSeven®) in the management of intractable post-surgical intra-abdominal haemorrhage. Br J Haematol 1999; 107:677-8. Al Douri M, Shan T, Al Khudairi D, Al Bokhari E, Black L, Akinwale N, Osman Musa M, Al Homaidhi A, Al Fagih M, Borum Andreasen R. Effect of the administration of recombinant activated factor VII (rFVIIa; NovoSeven®) in the management of severe uncontrolled bleeding in patients undergoing heart valve replacement surgery. Blood Coagul Fibrinolysis. 2000 Suppi 1:S121-7. Negrier C, Lienhart A, Overall experience with NovoSeven®. Blood Coagul Fibrinolysis 2000 Suppl 1:S19-24. Wong WY, Huang WC, Miller R, McGinty K, Whisnant JK Clinical efficacy and recovery levels of recombinant FVIIa (NovoSeven®) in the treatment of intracranial haemorrhage in severe neonatal FVII deficiency. Haemophilia 2000;6:50-4).

Однако, несмотря на почти 13-летний опыт использования данного лекарственного средства, никем до сих пор не было предложено применить фактор VIIa для нейтрализации последствий обширных кровотечений, вызванных тромболитической терапией, равно как никто до сих пор не исследовал эту возможность.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится, во-первых, к использованию активированного фактора коагуляции VII (VIIa) или его функционального производного для производства лекарственных средств для лечения обширных кровотечений, вызванных тромболитической/фибринолитической терапией, включая внутричерепные кровоизлияния.

Настоящее изобретение относится, во-вторых, к способу лечения обширных кровотечений, вызванных тромболитической/фибринолитической терапией, включая внутричерепные кровоизлияния, который состоит в том, что больному с такого рода кровотечением вводят эффективное количество активированного фактора VII (VIIa) или его функционального производного. Данный способ особенно успешен при лечении млекопитающих разных видов, в т.ч. человека.

Очищенный человеческий фактор VIIa, пригодный для использования согласно настоящему изобретению, может быть выделен из природных источников или, предпочтительней, получен методами рекомбинантной ДНК, например, в соответствии с описанием (Hagen et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 1986; 83:2412-2416). Фактор VIIa, полученный рекомбинантными методами, возможно, по существу является идентичным природному фактору VIIa, как, например, NovoSeven®, продукция Novo Nordisk. Термин «функциональное производное» относится к модифицированному производному фактора VIIa, обладающему по существу такой же биологической активностью, которая и необходима. Подобные функциональные производные фактора VIIa могут быть получены, например, путем сайтспецифичного мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор VIII, в результате чего получаются модифицированные рекомбинантные белки, содержащие одну аминокислотную последовательность, которая отличается от встречающихся природных аминокислотных последовательностей одним или более аминокислотным остатком. Такие модификации могут содержать, например, аминокислотные делеции, вставки, добавления, замещения, пополнения и инверсии. Кроме того, можно реализовать такие полезные посттрансляционные модификации, как, например, элиминация или изменения в схеме гликозиляции.

Тромболитический/фибринолитический лекарственный препарат, применяемый в тромболитической/фибринолитической терапии, может включать в свой состав природный или рекомбинантный активатор тканевого плазминогена в любой его форме, как-то альтеплаза или ретеплаза, дутеплаза, саруплаза, рекомбинантная DSPA альфа 1 (ВАТ РА), стрептокиназа, анистреплаза, стафилокиназа и мутанты стафилокиназы, не обладающие иммуногенностью или с редуцированной иммуногенностью, урокиназа, одноцепочечная урокиназа, любое тромболитическое средство третьего поколения из хорошо известных в данной области, например амедиплаза, тенектеплаза, монтеплаза, ланотеплаза, памитеплаза (The GUSTO investigators. An international randomized trial comparing four thrombolytic strategies for acute myocardial infarction. N Engi J Med. 1993 Sep 2; 329(10): 673-82. Assent-2. Single-bolus tenecteplase compared with front-loaded alteplase in acute myocardial infarction: the ASSENT-2 double-blind randomised trial. Assessment of the Safety and Efficacy of a New Thrombolytic Investigators. Lancet 1999 Aug 28; 354(9180):716-22. Gissi International Study Group. In-hospital mortality and clinical course of 20,891 patients with suspected acute myocardial infarction randomised between alteplase and streptokinase with or without heparin. The Lancet. 1990;336:71-5. The Global Use of Strategies to Open Occluded Coronary Arteries (GUSTO III) Investigators. A comparison of reteplase with alteplase for acute myocardial infarction. N Engi J Med. 1997;337:1118-2. Van de Werf F, Cannon CP, Luyten A, Hourbracken K, McCabe CH, Berioli S, Bluhmki E, Sarelin H, Wang-Clow F, Fox NL, Braunwald E. Safety assessment of single-bolus administration of TNK tissue-plasminogen activator in acute myocardial infarction: the ASSENT-1 trial. The ASSENT-1 Investigators. Am Heart J. 1999; 137:786-91. Collen D, Sinnaeve P, Demarsin E, Moreau H, De Maeyer M, Jespers L, Laroche Y, Van De Werf F. polyethylene glycol-derivatized cystein-substitution variants of recombinant staphylokinase for single-bolus treatment of acute myocardial infarction. Circulation. 2000,102:1766-72. Laroche Y, Heymans S, Capaert S, De Cock F, Demarsin E, Collen D. Recombinant staphylokinase variants with reduced antigenicity due to elimination of B-lymphocyte epitopes. Blood. 2000,96:1425-32. Verstraete M. Third-generation thrombolytic drugs. Am J Med. 2000,109:52-8) или их любое терапевтически приемлемое производное.

Введение лекарственного препарата или фармацевтической композиции, содержащей фактор VIIa, предпочтительно осуществлять путем внутривенной инъекции ударной дозы или внутривенного вливания. Удобно также сочетать разовую внутривенную инъекцию ударной дозы с последующим внутривенным вливанием фактора VIIa.

Подходящие для инъекции или вливания фармацевтические препараты включают стерильный водный раствор и стерильный порошок для не требующего предварительной подготовки приготовления стерильного раствора, который можно вводить путем инъекции или вливания. Обычно конечный раствор содержит также подходящие соли и другие вспомогательные реагенты, известные из данной области техники. Например, восстановленный водный раствор NovoSeven®, производимый и продаваемый фирмой Novo Nordisk, содержит 3 мг/мл хлорида натрия, 1,5 мг/мл дигидрат хлорида кальция, 1,3 мг/мл N-глицилглицина, 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 30 мг/мл маннитола.

Дозировка вводимого фактора VIIa варьирует, например, в зависимости от возраста и физического состояния каждого конкретного больного, от тяжести осложнения в виде кровотечения, которое предстоит лечить, и от того, какой способ избран для его введения. Соответствующая дозировка легко устанавливается специалистом.

Типичный диапазон подходящих дозировок фактора VIIa для внутривенных инъекций ударных доз начинается с 3000-6000 IU (International Units - Международные единицы; согласно первому международному стандарту по фактору VIIa 89/688), что соответствует приблизительно 60-120 мкг рекомбинантного фактора VIIa из расчета на кг массы тела. Диапазон предпочительных дозировок для внутривенного введения ударных доз начинается приблизительно с 4500-6000 IU из расчета на кг массы тела. Поскольку общий полупериод существования рекомбинантного фактора VIIa в организме обычно составляет всего около 2-3 час, то может возникнуть необходимость в повторных внутривенных введениях ударной дозы в относительно короткие промежутки времени, предпочтительно с интервалом в 2-3 час, более предпочительно - 2 час. Там, где это требуется, в ходе лечения допускается увеличение первичного интервала, например, до 4, 6, 8, 12 час.

Там, где это требуется в лечебных целях, внутривенное введение ударной дозы следует выполнять приблизительно в пределах 2-5 мин.

Для капельного вливания фактора VIIa может подойти следующая схема: введение около 4500-6000 IU на кг массы тела каждые 2-6 часа.

Для струйного вливания фактора VIIa может подойти следующая схема: введение около 500-1500 IU/кг/час, что соответствует около 10-30 мкг rFVIIa/кг/час. В тех случаях, где это требуется, струйному вливанию фактора VIIa может предшествовать разовая инъекция ударной дозы из расчета около 4500-6000 IU на кг массы тела. Как показывают результаты предшествующих исследований, связанных со струйным вливанием рекомбинантного фактора VIIa (Schulman S, Bech Jensen M, Varon D, Keller N, Gitel S, Horoszowski H, Heim M, Martinowitz U. Feasibility of using recombinant factor VIIa in continuous infusion. Thromb Haemost. 1996 Mar;75(3):432-6. Baudo F, Redaelli R, Caimi TM, Mostrada G, Somaini G, de Cataldo F. The continuous infusion of recombinant activated factor VIIa (rFVIIa) in patients with factor VIII inhibitors activates the coagulation and fibrinolytic systems without clinical complications. Thromb Res.2000; 99:21-4), лечение с помощью струйного вливания фактора VIIa оказывается эффективным при более низких - сравнительно с инъекциями ударных доз - сумарных дозировках данного лекарственного вещества.

Поскольку вплоть до настоящего времени частота побочных явлений в известных случаях применений фактора VIIa остается низкой, а признаки, которые указывали бы на тромбообразование или на коагулопатию потребления, не наблюдались, то можно рассчитывать, что активированный фактор VIIa окажется эффективным лекарственным средством для нейтрализации обширных кровотечений в связи с тромболитической терапией, не причиняя в то же время явного вреда больному

Дополнительные данные, подтверждающие осуществимость заявленного изобретения

Реверсирование с помощью фактора VIIa повышенного времени кровотечения, вызванного проведением на крысах стандартной тромболитической терапии

Методы

Животные: Крысы Chbb Thom ♂♀, 200-300 г

Анестезия: Narcoren 60 мг/кг внутрибрюшинно + непрерывное введение 0.6 мл/час внутрибрюшинно (Narcoren + солевой раствор, 1+5)

Составы:

rt-PA (рекомбинантный тканевой активатор плазмогена)

Применение rt-PA: 100 нМ/кг внутривенно (i.v.)

10% в виде болюса 10 нМ/кг (объем 1 мл/кг)

+90% с помощью инфузии: 90 нМ/кг/час (объем 3 мл/кг/час)

rt-PA является основой («носителем», vehicle) в болюсе.

Гепарин/Ratiopharm

применение гепарина:

50 Ед/кг i.v. в виде болюса с rt-PA

+инфузия: 40 Ед/кг/час

ASA - ацетилсалициловая кислота:

30 мг/кг i.v. в виде болюса с rt-PA

Фактор VIIa (на чертежах обозначен как Novoseven - коммерческое название рекомбинантного фактора VIIa):

Доза: 1 мг/кг (объем 1,667 мл/кг)

Экспериментальные группы:

1) контрольные группы (введение только солевого раствора)

2) rt-PA + гепарин + ASA+фактор VIIa 1 мг/кг i.v.

3) rt-PA + гепарин + ASA+солевой раствор

Схема исследования

В левую и правую яремные вены крыс были вставлены канюли для введения rt-PA и гепарина (или солевого раствора в качестве контроля), соответственно. Дополнительно крысам была вставлена трахеальная трубка для облегчения дыхания. Крысы были помещены в термостатированный на 37°С виварий.

Время кровотечения оценивалось с помощью стандартных разрезов, выполненных Surgicutt, полностью автоматизированным устройством для нанесения разрезов. Surgicutt - стерильное, стандартизированное, одноразовое устройство, которое позволяет делать однородные разрезы, имеющие 5 мм в длину и 1 мм в глубину. Разрез делали на 3 см дистальнее начала крысиного хвоста. Каждые 15 сек кровь собирали на расстоянии от места нанесения разреза, используя фильтровальную бумагу. Принимались предосторожности для того, чтобы фильтровальная бумага не коснулась разреза, чтобы не нарушить формирование бляшки тромба.

План процедуры эксперимента:

0 мин: определение времени кровотечения.

Введение болюса солевого раствора или rt-PA, гепарина и ASA; и начало инфузионного введения rt-PA и гепарина.

15 мин: определение времени кровотечения.

45 мин: определение времени кровотечения.

60 мин: остановка введения; промывание обоих катетеров солевым раствором и введение болюса солевого раствора (контроль - эксперименты №1 и 2) или фактора VIIa (эксперимент №3).

65 мин: определение времени кровотечения, через 5 мин после введения солевого раствора или фактора VIIa.

Статистика:

Все результаты даются как средние±стандартная ошибка (SE). Статистическое значение было определено с помощью ANOVA и Dunnett's теста для многократных сравнений.

Результаты.

1. Основная терапия животных

Время кровотечения у животных, получавших rt-PA без ASA и гепарина, было в пределах нормального диапазона в течение всего эксперимента и не отличалось от контрольного значения до введения (фиг.1).

2. Животные, подвергнутые тромболитическому режиму без фактора VIIa

Введение животным rt-PA в комбинации с ASA и гепарином значительно увеличило продолжительность кровотечения с 116±14 до 196±18 и 201±10 секунд, соответственно. Продолжительность кровотечения существенно не изменялась (188±12 секунд) после остановки введения rt-PA, ASA и гепарина (фиг.2).

3. Животные, подвергнутые тромболитическому режиму с применением фактора VIIa

Введение животным rt-PA в комбинации с ASA и гепарином увеличило продолжительность кровотечения с 123±4 до 231±10и 232±9 секунд, соответственно. В тоже время продолжительность кровотечения уменьшилась почти до нормального уровня (138±4 секунды) после остановки введения rt-PA, ASA и гепарина и введения фактора VIIa в количестве 1 мг/кг (фиг.3).

Обсуждение

Проведенное исследование демонстрирует, что использование при тромболитической терапии rt-PA в комбинации с ASA и гепарином приводит к значительному увеличению продолжительности кровотечения у крыс. Фактор VIIa, как гемостатический агент, активируя каскад коагуляции через побочный путь, который позволяет связать напрямую (шунтировать) участки каскада, «разорванные» rt-PA, способен быстро реверсировать увеличение времени кровотечения, вызванное применением тромболитической терапии. Таким образом, фактор VIIa может быть применен в качестве эффективного лекарственного средства, способного устранять осложнения, вызванные тромболизисом.

1. Применение активированного фактора коагуляции VII (VIIa) в получении лекарственного средства для лечения обширных кровотечений, спровоцированных тромболитической/фибринолитической терапией.

2. Применение по п.1, где кровотечения вызваны тромболитической/фибринолитической терапией с использованием природного или рекомбинантного активатора тканевого плазминогена в любой его форме, как то: альтеплаза или ретеплаза, дутеплаза, саруплаза, рекомбинантная DSPA альфа 1 (ВАТ РА), стрептокиназа, стафилокиназа, в том числе пегилированная стафилокиназа и не проявляющие иммуногенности или обладающие ею в редуцированном виде мутанты стафилокиназы, урокиназа, одноцепочечная урокиназа, тромболитические агенты третьего поколения или терапевтически приемлемые их производные.

3. Применение по п.1 или 2, где кровотечения - это внутричерепные кровоизлияния.

4. Применение по любому из пп.1-3, где лекарственное средство пригодно для введения эффективного количества фактора VIIa внутривенно путем инъекции ударной дозы или внутривенного вливания.

5. Применение по п.4, где эффективное количество фактора VIIa включает одну дозу или более доз для разовой внутривенной инъекции ударной дозы в 3000-6000 IU, соответствующих 60-120 мкг рекомбинантного фактора VIIa, из расчета на кг массы, и/или дозы для внутривенного вливания в 500-1500 IU, соответствующих 10-30 мкг рекомбинантного фактора VIIa, из расчета на кг массы в час.

6. Применение по п.4 или 5, где эффективное количество фактора VIIa вводится внутривенно путем повторных инъекций с интервалом приблизительно 2 ч.

7. Способ лечения обширных кровопотерь, вызванных тромболитической/фибринолитической терапией, включая интракраниальные кровотечения, который включает введение эффективного количества активированного фактора коагуляции VII (VIIa) больному, страдающему такими кровопотерями.

8. Способ по п.7, где кровопотери вызваны тромболитической/фибринолитической терапией с использованием природного или рекомбинантного активатора тканевого плазминогена в любой его форме, как то: альтеплаза или ретеплаза, дутеплаза, саруплаза, рекомбинантная DSPA альфа 1 (ВАТ РА), стрептокиназа, стафилокиназа, в том числе, пегилированная стафилокиназа и не проявляющие иммуногенности или обладающие ею в редуцированном виде мутанты стафилокиназы, урокиназа, одноцепочечная урокиназа, тромболитические агенты третьего поколения или терапевтически приемлемые их производные.

9. Способ по п.7 или 8, где эффективное количество фактора Vila вводится внутривенно путем повторных инъекций с интервалом приблизительно 2 ч.

10. Способ по п.9, где эффективное количество фактора Vila включает одну или более доз для разовой внутривенной инъекции ударной дозы и составляет 3000-6000 IU, соответствующих 60-120 мкг рекомбинантного фактора Vila, из расчета на кг массы, и/или дозу для внутривенного вливания в 500-1500 IU, соответствующих 10-30 мкг рекомбинантного фактора Vila, из расчета на кг массы в час.