Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)
Владельцы патента RU 2286798:
ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (RU)
Изобретение относится к области медицины и касается способа идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов) с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа). Сущность способа включает гибридизацию с олигонуклеотидным микрочипом химерного амплифицированного флуоресцентно меченного продукта, состоящего из последовательностей генов, участвующих в определенной хромосомной транслокации, ассоциированной с лейкозом. Метод включает обратную транскрипцию, двухстадийную "гнездовую" мультиплексную ПЦР; мечение химерного ПЦР-продукта во втором раунде ПЦР; гибридизацию на биочипе, содержащем оригинальный набор олигонуклеотидов. Преимущество изобретения заключается в ускорении и упрощении способа. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии и онкогематологии и обеспечивает способ диагностики острых и хронических лейкозов непосредственно в клиническом образце с использованием дифференцирующего олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа).
Уровень техники
Для анализа хромосомных транслокаций (аберраций) применяют следующие методы, использующие мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и/или гибридизацию:
1. Флуоресцентная гибридизация in situ
Kerney L. 1999. The impact of the new FISH technologies on the cytogenetics of haematological malignancies. Br. J. Haematol. 104: 648-658.
Флуоресцентная гибридизация in situ представляет собой гибридизацию флуоресцентно меченных специфичных зондов с ДНК метафазных хромосом или интерфазных ядер, фиксированных на предметном стекле. Метод является высокоспецифичным и достаточно чувствительным, однако трудоемким и требующим дорогостоящего микроскопического оборудования. Число одновременно анализируемых транслокаций ограничено.
2. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция с индивидуальными праймерами
Dongen van J.I.M., Macintyre E.A., Gabert J.A., Delabesse E., Rossi V., Saglio G., Gottardi E., Rimbaldi A., Dotti G., Griesinger F., Parreira A., Cameiro P., Gonzalez Diaz M., Malec M., Langerak A.W., San Miguel J.F., Biondi A. 1999. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia. 13: 1901-1928.
Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) с индивидуальными праймерами является наиболее широко распространенным методом диагностики транслокаций. На первом этапе проводят синтез кДНК на матрице РНК. Далее кДНК используют в полимеразной цепной реакции, где пара праймеров подобрана таким образом, что один праймер соответствует участку одного гена, а другой праймер - участку другого гена, вовлеченных в данную транслокацию. В результате реакции происходит амплификация фрагментов химерных последовательностей. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако при анализе большого числа транслокаций является трудоемким и требует больших затрат рабочего времени, расходуется много клинического материала.
3. Мультиплексная ПЦР с последующими индивидуальными ПЦР реакциями
Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.C., Pedersen В., Jorgensen P. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998; 92: 574-588.
Strehl S., König M., Mann G., Haas O.A. Multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction screening in childhood acute myeloblastic leukemia. Blood 2001; 97: 805-808.
Мультиплексная ПЦР отличается тем, что в реакции участвует одновременно несколько пар праймеров на разные транслокации. В результате реакции получают продукты амплификации, для идентификации которых необходимо проводить индивидуальные ПЦР. Метод является чувствительным и достаточно специфичным, однако высока вероятность контаминации и получения ложноположительных результатов. Также возможно получение ложноположительных результатов из-за неспецифического связывания праймеров с кДНК, особенно в мультиплексной реакции.
4. Мультиплексная ПЦР с анализом ПЦР-продуктов с помощью высокоразрешающего электрофореза на приборе GeneScan.
Viehmann S., Borkhardt A., Lampert F., Harbott J. 1999. Multiplex PCR - a rapid screening method for detection of gene rearrangements in childhood acute lymphoblastic leukemia. Ann. Hematol. 78: 157-162.
Мультиплексная ПЦР с анализом ПЦР-продуктов с помощью высокоразрешающего электрофореза на приборе GeneScan требует наличия дорогостоящего прибора и не отличается высокой чувствительностью и специфичностью.
5. Мультиплексная ПЦР с последующей дот-блот-гибридизацией
Scurto P., Rocha M.H., Kane J.R., Williams W.K., Haney D.M., Conn W.P., Shurtleff S.A., Downing J.R. 1998. A multiplex RT-PCR assay for the detection of chimeric transcripts encoded by the risk-stratifying translocations of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 12: 1994-2005.
В этом способе после проведения мультиплексной ПЦР с праймерами на несколько транслокаций проводят идентификацию амплифицированных последовательностей методом дот-блот гибридизации. Олигонуклеотидные зонды иммобилизуют на нейлоновом фильтре, для мечения гибридизуемой ДНК-мишени используют радиоактивную метку или биотиновую метку с последующим проявлением стрептавидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой. Данный способ представляет собой одноэтапную ПЦР и реакцию гибридизации в макрообъеме с визуальной оценкой результата, что делает его недостаточно чувствительным и технологичным.
6. Мультиплексная ПЦР с последующим анализом на олигонуклеотидном микрочипе
Nasedkina Т., Domer P., Zharinov V., Hoberg J., Lysov Yu., Mirzabekov A. 2002. Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Hematologica 87: 363-372.
Ранее авторами настоящего изобретения был предложен подход, сочетающий мультиплексную ОТ-ПЦР и гибридизацию на олигонуклеотидном микрочипе для обнаружения химерных транскриптов в клиническом образце. Метод был апробирован на ограниченном числе транслокаций, процедура подготовки пробы включала введение флуоресцентной метки как отдельный этап после прохождения ПЦР, для мультиплексной ПЦР использовали праймеры, разработанные авторами способа (3).
7. Мультиплексная ПЦР с универсальными праймерами и последующим анализом на олигонуклеотидном микрочипе
Shi R.Z., Morrisey J.M., Rowley J.D. 2003. Screening and quantification of multiple chromosome translocations in human leukemia. Clinical Chemistry 49: 1066-1073.
Метод включает проведение мультиплексной ПЦР со специфическими и универсальными праймерами, представляющими собой последовательности промотора Т7 и SP6 полимераз. Перед гибридизацией на микрочипе проводят реакцию in vitro транскрипции с включением биотиновой метки и проявление гибридизованного продукта с помощью стрептавидина, конъюгированного с флуорохромом. В данном способе подготовка пробы включает помимо ПЦР отдельную дополнительную реакцию in vitro транскрипции, также непосредственно в реакции гибридизации участвует амплифицированная РНК, которая легко подвергается деградации и из общих соображений является менее предпочтительной мишенью, чем ДНК.
8. Мультиплексная ПЦР с последующим анализом на микрошариках
Wallace J., Zhou Y., Usmani G.N., Reardon M., Newburger P., Woda В., Pihan G. 2003. BARCODE-ALL: accelerated and cost-effective genetic risk stratification in acute leukemia using spectrally addressable liquid bead microarrays. Leukemia 17: 1404-1410.
Описанный в этой работе метод включает мультиплексную ПЦР и последующую гибридизацию амплифицированного фрагмента с микрошариками, каждый из которых несет на своей поверхности иммобилизованные олигонуклеотидные зонды, специфичные в отношении химерных последовательностей. Каждый тип шарика, несущего определенный зонд, обладает также уникальными спектральными характеристиками, позволяющими проводить его однозначную идентификацию. Чувствительность метода такова, что позволяет определять химерный транскрипт при 100-кратном разведении исходного образца, что несколько ниже, чем для двухэтапной ПЦР. В данном способе использование одноэтапной мультиплексной ПЦР не позволяет достичь высокой чувствительности метода, кроме того, распознавание и декодирование микрошариков требует использования специального дорогостоящего оборудования типа проточного цитофлуориметра.
Ближайшим аналогом настоящего изобретения является способ, описанный в (6) и представляющий собой раннюю версию настоящего изобретения, которая включала мультиплексную ПЦР с использованием ранее описанных праймеров. К существенным недостаткам способа можно отнести то, что мечение амплифицированного продукта проводилось после реакции амплификации как отдельная двухстадийная реакция.
Таким образом, все имеющиеся в настоящее время способы страдают теми или иными недостатками, и существует потребность в создании быстрого, простого, недорогого, чувствительного и специфичного метода, который мог бы быть внедрен в стандартную клиническую лабораторию.
Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.
Раскрытие изобретения
Сущность изобретения заключается в обеспечении способа экспресс-анализа типа химерного транскрипта в клиническом образце при острых и хронических лейкозах, который включает верификацию последовательности в точке слияния двух генов, участвующих в транслокации. Способ основан на проведении обратной транскрипции - мультиплексной ПЦР с последующей гибридизацией полученного флуоресцентно меченного фрагмента ДНК на биочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов.
Комбинированное использование двухэтапной мультиплексной ПЦР и метода гибридизации на биочипах выгодно отличается от способов из уровня техники возможностью определения многих транслокаций с наименьшими затратами и наиболее специфичным и чувствительным способом за короткое время. Способ экономичен, не требует дорогостоящего оборудования и может быть введен в повсеместную клиническую практику. Данные, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы в клинической диагностике первичных лейкозов, а также при мониторинге минимальной резидуальной болезни, так как чувствительность метода позволяет определить 1 бластную клетку среди 1000-10000 нормальных клеток.
Важной особенностью изобретения является то, что флуоресцентное мечение фрагмента химерного гена осуществляют одновременно с амплификацией при проведении второго этапа ПЦР.
Следующей особенностью изобретения является то, что идентификацию амплифицированных последовательностей осуществляют путем гибридизации полученного флуоресцентно меченного продукта амплификации с набором олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биочипе.
Согласно первому аспекту, настоящее изобретение обеспечивает способ экспресс-анализа типа химерного транскрипта, включающий верификацию последовательности в точке слияния двух генов, участвующих в транслокации, в клиническом образце, полученном от больного лейкозом, предусматривающий следующие стадии:
(а) - выделение РНК и реакция обратной транскрипции;
(б) - мультиплексная "гнездовая" (nested) двухэтапная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием набора праймеров, охарактеризованных в п.1, для амплификации химерных транскриптов и мечение химерного ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР;
(в) - обеспечение биочипа, охарактеризованного в п.3, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов, охарактеризованных в п.2, для проведения гибридизации;
(г) - гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе;
(д) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации.
В одном из воплощений настоящего изобретения в качестве клинического образца используют костный мозг или кровь, полученные от обследуемого индивидуума.
В еще одном воплощении изобретения на стадии (а) при проведении реакции обратной транскрипции используют специфические праймеры, последовательность которых определена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1-8).
В другом воплощении изобретения на втором этапе ПЦР на стадии (б) для флуоресцентного мечения фрагмента химерного гена используют флуоресцентно меченные по 5'-концу праймеры.
В еще одном воплощении изобретения на втором этапе ПЦР на стадии (б) для флуоресцентного мечения фрагмента химерного гена используют модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты.
В другом воплощении изобретения для обеспечения биочипа настоящего изобретения, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов настоящего изобретения, на стадии (в) используют метод фотоиндуцируемой сополимеризации в акриламидном геле.
В еще одном воплощении настоящего изобретения для обеспечения биочипа настоящего изобретения, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов настоящего изобретения, на стадии (в) используют любой другой метод.
В одном из воплощений изобретения используют условия гибридизации на стадии (г), обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами.
В еще одном из воплощений регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой.
В другом воплощении изобретения регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС-камерой.
В следующем воплощении регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью любого устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции.
В другом воплощении изобретения интерпретацию результатов на стадии (д) проводят визуально.
В еще одном воплощении изобретения интерпретацию результатов на стадии (д) проводят с использованием программы автоматического анализа изображения.
Наконец, в еще одном воплощении интерпретированные результаты используют для целей медицинской диагностики, определения прогноза и выбора специфической терапии, используя в качестве маркера наличие той или иной транслокации.
Следующим важным аспектом изобретения является набор праймеров для амплификации фрагментов химерных генов, используемый в способе экспресс-анализа типа химерного транскрипта настоящего изобретения. Последовательность праймеров приведена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 9-47).
Еще одним важным аспектом изобретения является набор олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе, используемый в способе экспресс-анализа типа химерного транскрипта настоящего изобретения и позволяющий идентифицировать гены, вовлеченные в транслокации, и верифицировать последовательности в точке слияния генов. Последовательность олигонуклеотидов приведена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 48-94).
Наконец, еще одним важным аспектом изобретения является биочип, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидов настоящего изобретения и используемый в способе экспресс-анализа типа химерного транскрипта настоящего изобретения.
Перечень фигур:
Фигура 1. Схема биологического микрочипа.
Фигура 2. Гибридизационная картина образца, не несущего транслокаций.
Фигура 3. Гибридизационная картина образца, несущего транслокацию t(12; 21).
Фигура 4. Гибридизационная картина образца, несущего транслокацию t(15; 17).
Осуществление изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способа экспресс-анализа типа химерного транскрипта, включающего верификацию последовательности в точке слияния генов, вовлеченных в транслокации, в клинических образцах, полученных от больных острыми и хроническими лейкозами, с использованием олигонуклеотидного биочипа.
Из клинического образца выделяют лейкоциты, из лейкоцитов выделяют РНК и проводят реакцию обратной транскрипции. Полученный образец кДНК используют как матрицу в мультиплексной "гнездовой" двухэтапной ПЦР. На втором этапе ПЦР получают флуоресцентно меченный амплифицированный фрагмент. Меченый ПЦР-продукт используют для дальнейшей гибридизации на биочипе, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, представляющие собой участки последовательностей генов, вовлеченных в транслокации как из смысловой, так и из антисмысловой цепей. Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими полностью комплементарными ему олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы, стабильность которых существенно ниже стабильности совершенных дуплексов. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биочипа, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек биочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе, определяют, какие гены участвуют в транслокации, а также определяют последовательность в точке слияния этих генов.
В аспекте удобства клинического применения способа настоящего изобретения наличие транслокаций предпочтительно определяют, используя лейкоциты, выделенные непосредственно из клинического образца, полученного от пациента. Однако должно быть понятно, что для этого могут быть использованы также и культивированные клетки. В качестве клинического образца предпочтительно используют такие образцы, которые обычно получают от пациентов, страдающих лейкозами, или индивидуумов, относящихся к соответствующей группе риска, при проведении стандартных для такой ситуации медицинских обследований, т.е. образцы костного мозга или периферической крови.
Для получения лейкоцитов из образца костного мозга или крови может быть использован любой способ фракционирования клеток крови, известный специалисту в данной области (например, центрифугирование в градиенте плотности, получение лейкоцитарных пленок и т.д.), или гемолиз эритроцитов в гипотонических растворах.
Для выделения РНК может быть использован любой известный специалисту в данной области способ, такой как метод экстракции РНК кислым фенолом (Chomczynski P., Sacchi N. 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159) или любые коммерчески доступные наборы реагентов, предназначенные для выделения РНК ("RNAqueous" (Ambion, USA); "RNeasy" (Qiagen, USA); "Trizol" (Invitrogene), USA и т.д. без ограничения). Для уменьшения деградации РНК под действием повсеместно присутствующих РНКаз в среду для выделения РНК могут добавляться известные специалисту в данной области ингибиторы рибонуклеаз, например (без ограничения) Rnase inhibitor (Ambion, USA), RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega, USA) и т.д., который может быть как рекомбинантным, так и природным, например из плаценты человека.
Перед проведением обратной транскрипции выделенная РНК может быть обработана ДНКазой I. Этот этап необязателен, если выделенная РНК высокого качества и содержит крайне незначительные примеси ДНК.
В качестве праймеров в реакции обратной транскрипции могут быть использованы как специфичные для указанных транслокаций кДНК-праймеры, например, типа тех, что были использованы в работе Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.C., Pedersen B., Jorgensen P. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998; 92: 574-588, так и неспецифичные праймеры типа набора случайных гексамеров, или олиго(дТ)(12-18). В предпочтительном воплощении изобретения для проведения реакции обратной транскрипции используют разработанные авторами настоящего изобретения праймеры SEQ ID NO: 1-8, представленные в Перечне последовательностей, а также в таблице 1.
Для проведения реакции обратной транскрипции может быть использован любой фермент, способный создавать ДНК-копию с РНК-матрицы, в том числе обратная транскриптаза MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus), обратная транскриптаза AMV (Avian Myeloblastosis Virus), термостабильная полимераза Tth и т.п. Такие ферменты являются коммерчески доступными от большого числа производителей.
Полимеразная цепная реакция может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, фрагмент Стоффеля, Tth-полимераза, Tfl-полимераза, Pfu-полимераза, Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и т.п. без ограничения, которые коммерчески доступны от большого числа производителей), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, но вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты, за исключением праймеров.
В качестве праймеров для проведения мультиплексной "гнездовой" двухстадийной полимеразной цепной реакции используют праймеры SEQ ID NO: 9-47, приведенные в Перечне последовательностей, а также в таблице 2. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидных праймеров, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д. но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы Applied Biosystems (США).
В одном из воплощений мечение ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР проводят с помощью праймеров, несущих флуоресцентную метку на 5'-конце. В другом воплощении метку вводят с использованием флуоресцентно меченного дезоксинуклеозидтрифосфата. Специалисту в данной области понятно, что в последнем случае за счет включения в конечный продукт большого числа остатков флуорофора интенсивность флуоресценции будет существенно выше и соответственно будет достигаться более высокая чувствительность. Кроме того, возможно мечение каким-либо другим способом или мечение ПЦР-продукта уже после завершения ПЦР. В качестве примера можно привести включение по 3'-концу ПЦР-продукта флуоресцентно меченного дезоксинуклеозидтрифосфата с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы. Может быть проведена также дополнительная фрагментация ПЦР-продукта, например, при помощи фермента ДНКазы I, химического гидролиза (например, в присутствии ионов магния) или обработки ультразвуком.
В качестве флуоресцентной метки может быть использован любой флуорохром (например, без ограничения, FITC, Texas red, Су-3, Су-5 и т.д.), а также биотин.
На второй стадии мультиплексной "гнездовой" двухэтапной ПЦР праймеры, входящие в состав одной пары, могут использоваться в эквимолярных количествах. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет, по существу, двухцепочечным, и для его эффективной гибридизации с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, проводят предварительную денатурацию. Обычно денатурацию проводят непосредственно перед проведением гибридизации путем прогрева готовой гибридизационной смеси при 95°С в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением во льду. В предпочтительном воплощении изобретения вторую стадию мультиплексной "гнездовой" двухэтапной ПЦР проводят в асимметричном формате, т.е. флуоресцентно меченный праймер используют в молярном избытке по отношению к немеченому праймеру, например при молярном соотношении около 10:1 соответственно. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет представлен преимущественно одноцепочечной флуоресцентно меченной ДНК. С учетом возможности образования вторичных структур для эффективной гибридизации такого продукта с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, при необходимости также проводится его предварительная денатурация.
При подборе условий гибридизации создают условия, обеспечивающие наибольшую интенсивность флуоресценции совершенных дуплексов, специфичность взаимодействия и максимальную разницу в стабильности между совершенными и несовершенными дуплексами. Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, при необходимости содержащем реагенты, понижающие температуру плавления образуемых дуплексов и обеспечивающие специфичность взаимодействия между олигонуклеотидным зондом и ДНК-мишенью в диапазоне температур от 20 до 37°С. Это обеспечивает дополнительное удобство в использовании способа настоящего изобретения в случае клинической лаборатории, в комплект стандартного оборудования которой обычно входит термостат, установленный на температуру, например, 37°С. К таким реагентам относятся формамид, гуанидин гидрохлорид, гуанидин изотиоцианат и др. Гибридизация может проводиться и в отсутствии таких реагентов, но при более высоких температурах, соответствующих температурам плавления олигонуклеотидных зондов в используемом буфере. При подборе условий гибридизации и отмывки основное внимание должно быть обращено на специфичность прохождения гибридизации. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, но за более короткое время (J.F.Sambrook and D.W.Russell, 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер или портативный анализатор биочипов, доступные коммерчески от большого числа производителей, например портативный анализатор биочипов, производимый серийно ООО "Биочип-ИМБ", и снабженной регистрирующим устройством (ПЗС-камерой, видеокамерой, фотокамерой)). Анализ изображения может быть произведен как визуально, так и в автоматическом режиме с использованием специальной программы.
При изготовлении микрочипа могут быть использованы олигонуклеотиды, несущие по 5'- или 3'-концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидов, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез олигонуклеотидов осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы Applied Biosystems (США). Возможно использование широкого спектра групп для модификации иммобилизуемых олигонуклеотидов, таких как аминогруппа, тиол, гидразид, акриламидная группа, бензальдегид, тиофосфат и т.п. (Seliger H., Hinz М., Нарр Е. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395). Модификация олигонуклеотида, имеющая целью введение активной группы, пригодной для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе, может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра модификаторов, которые коммерчески доступны, например от Glen Research (USA), так и постсинтетически в ручном режиме.
Биочипы могут быть изготовлены путем создания на поверхности стеклянной подложки матрицы из ячеек полиакриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы (Mirzabekov А. & Kolchinsky A. MAGIChip: Properties and applications in genomic studies. (2002) In Genomic Technologies: Present and Future. Eds. Galas D.J., S.J.McCormack. Caister Academic Press, pp.163-196). Также биочипы могут быть изготовлены методом химически индуцируемой или фотоиндуцируемой сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Vasiliskov, V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev, A., Shick, V. & Mirzabekov, A. 1999. Fabrication ofmicroarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique, 27, 592-606; Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К Патент на изобретение N2175972 "Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа". Приоритет от 28.12.1999). Также биочипы могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами (Seliger H., Hinz M., Happ E. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395), а в качестве подложки, помимо стекла, может быть использован другой материал (пластик, металл, гибкие мембраны и т.д.). Также для изготовления микрочипов могут быть использованы активированные подложки, коммерчески доступные от различных производителей (см., например, Ramakrishnan R., Dorris D., Lublinsky A., Nguyen A., Domanus M., Prokhorova A., Gieser L., Touma E., Lockner R., Tata M., Zhu X., Patterson M., Shippy R., Sendera T.J., Mazumder A. 2002. An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res. 30: e30).
Для изготовления биочипа настоящего изобретения используют набор олигонуклеотидов SEQ ID NO: 48-93, приведенных в Перечне последовательностей, а также таблице 3. В качестве контроля прохождения гибридизации в настоящем изобретении используют фрагмент последовательности гена rpoB Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 93, 94). Однако специалисту понятно, что в качестве контроля прохождения гибридизации можно использовать любую последовательность, не содержащуюся в человеческом геноме. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьировать и определяется только удобством для интерпретации результатов гибридизации. Модификацией данного биочипа может быть вариант, когда иммобилизованы олигонуклеотидные зонды только одного знака, либо из смысловой цепи либо из антисмысловой цепи, причем для каждого варианта химерного транскрипта (каждой транслокации) это определяется тем, какой из праймеров второго этапа несет флуоресцентную метку. Если меченым является верхний праймер, в набор детектирующих олигонуклеотидов для данного химерного транскрипта входят последовательности из антисмысловой цепи и наоборот.
Выявление и идентификация химерных транскриптов, образующихся в результате хромосомных транслокаций, являются важным моментом в точной диагностике злокачественных заболеваний крови. В настоящее время известно более 50 различных транслокаций, которые, как было обнаружено, специфичны для определенных типов лейкозов и лимфом. Из них можно выделить несколько наиболее важных с прогностической точки зрения транслокаций, которые являются генетическими маркерами заболевания и используются для стратификации пациентов по группам риска. К таким транслокациям, в первую очередь, относятся t(9;22) BCR/ABL р190 и р210, t(4;11) MLL/AF4, t(12;21) TEL/AML1, t(1;19) E2A/PBX, t(15;17) PML/RARA, t(8;21) AML1/ETO, inv16 CBFB/MYH11. Одна из известнейших транслокаций - Филадельфийская (Ph) хромосома t(9;22) (q34;q11), химерный транскрипт BCR/ABL. Единственным шансом для таких больных до недавнего времени оставалась трансплантация костного мозга. Вместе с тем, в настоящее время разработана дифференцированная терапия с использованием ингибитора химерного белка BCR/ABL-тирозинкиназы, экспрессирующегося при этой транслокации, которая существенно улучшает показатели выживаемости у больных этой формой лейкоза. Транслокация t(15; 17) (q22; q21), химерный транскрипт PML/RARA встречается исключительно при остром промиелоцитарном лейкозе (М3 вариант ОНЛЛ) и является его генетическим маркером. Данная хромосомная перестройка затрагивает ген рецептора ретиноевой кислоты (RARA), что определяет хороший ответ на лечение производными транс ретиноевой кислоты (all-trans retinoic acid ATRA). Излечение при этой форме лейкоза возможно у 95% больных. Также в случае обнаружения определенного типа химерного транскрипта он может быть использован как маркер заболевания при отслеживании минимальной резидуальной болезни. Это дает возможность оценивать эффективность проводимой терапии и прогнозировать возникновение рецидива.
Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые показывают применение способа ДНК-дезоксиолигонуклеотид гибридизации для идентификации хромосомных транслокаций и верификации последовательности в точке слияния генов, участвующих в транслокации. Следует, однако, понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.
Пример 1. Подготовка образца для исследования и выделение РНК
1. В качестве материала для проведения исследования используют образцы костного мозга или крови больных лейкозом. Клинический образец (костный мозг или кровь), предварительно смешанный с антикоагулянтом (ЭДТА или цитратом натрия), подвергают гемолизу в растворе 0,8% NH4Cl и последующему центрифугированию в течение 20 мин при 3000 об/мин для выделения фракции лейкоцитов.
2. В качестве эталонных образцов используют клеточные линии, несущие специфические хромосомные транслокации: К-562, MV-4-11, NB4, REH, или не несущие каких-либо транслокаций, например HL-60. При использовании клеточных линий клетки выращивают на среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. За 18 часов перед выделением РНК клетки рассевают в концентрации 500000 клеток/мл. Клетки собирают центрифугированием, промывают фосфатно-солевым буфером и проводят выделение РНК.
3. Для выделения РНК используют метод экстракции кислым фенолом (Chomczynski Р., Sacchi N. 1987, Anal. Biochem. 162, 156-159).
Пример 2. Получение кДНК и амплификация химерных транскриптов методом двухэтапной "гнездовой" мультиплексной ПЦР с целью наработки флуоресцентно меченного фрагмента гибридного гена, специфичного для каждой транслокации
4. Перед проведением обратной транскрипции препарат РНК, полученный в п.3 Примера 1, обрабатывают ДНКазой I (Gibco, BRL) по стандартной методике для удаления примеси ДНК. РНК (2-4 мкг) инкубируют при 70°С в течение 5 мин со смесью специфических кДНК праймеров (SEQ ID NO: 1-8). Реакцию обратной транскрипции проводят с ферментом обратная транскриптаза MMLV в количестве 200 ед. на 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 ед. ингибитора РНКазы (Rnase inhibitor, Ambion, USA), по 1 mM каждого из дНТФ, 10 мМ дитиотрейтол, 50 мМ Трис-HCl, рН 8.3, 75 mM KCl и 3 мМ MgCl2 при 37°C-42°C в течение 1,5 ч с последующей инактивацией фермента при 70°С в течение 10 мин.
5. В 25 мкл ПЦР-смеси первого этапа вносят 1 мкл образца, полученного в п.4. Состав ПЦР-смеси: 67 мМ Трис-HCl, рН 8.6, 166 мМ (NH4)2SO4, 0.01% Тритон X-100, 1.5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дНТФ (Promega, USA), смесь праймеров первого раунда по 5 пмоль каждого (SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, 18-20, 26, 26, 29, 30, 33-35, 39-41, 45, 46) и 1,5 единицы фермента Taq-полимераза фирмы "Силекс" (Россия). Всю смесь нагревают при 94°С в течение 5 мин, затем проводят 25 циклов амплификации по следующей схеме: 94°С - 30 сек, 58°С - 30 сек, 72°С - 1 мин.
6. На втором этапе проводят асимметричную ПЦР с праймерами второго этапа (SEQ ID NO: 11-13, 16, 17, 21-24, 27, 28, 31, 32, 36-38, 42-44, 45, 47). В 25 мкл ПЦР-смеси второго этапа вносят 2 мкл продукта первого этапа ПЦР. Для каждого химерного транскрипта в реакции участвуют праймеры, меченные флуоресцентным красителем Су-3, по 50 пмоль каждого (SEQ ID NO: 11, 12, 16, 21-23, 27, 31, 36, 37, 42, 47) и немеченые праймеры по 5 пмоль каждого (SEQ ID NO: 13, 17, 24, 28, 32, 38, 43, 44, 45), подобранные так, чтобы в каждой паре "верхний и нижний праймеры" один был меченым, а другой немеченым. Последовательности праймеров первого и второго этапа приведены также в таблице 1. Условия реакции используют те же, что и в п.5, но после 25 циклов амплификации следует этап элонгации при 72°С в течение 10 мин. В результате реакции для каждого химерного транскрипта нарабатывают преимущественно цепь одного знака (смысловая или антисмысловая), содержащую на 5'-конце флуоресцентную метку. ПЦР-анализ на наличие химерного транскрипта проводят как несколько параллельных мультиплексных реакций.
Пример 3. Олигонуклеотидный биочип для идентификации хромосомных транслокаций при злокачественных заболеваниях крови
7. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5' или 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, USA). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя. Олигонуклеотиды, меченные цианиновым красителем Су-3, очищают ВЭЖХ от олигонуклеотидов, не включивших флуоресцентный краситель, на колонке "Hypersil ODS 5 мкм, 4,6×250 мм" ("Sypeico Int", США).
8. Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Патент на изобретение N 2175972 "Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа" Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Приоритет от 28.12.1999). Биочип содержит 45 типов иммобилизованных олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 48-93), список которых представлен также в таблице 3. На фиг.1. представлена структура биочипа для идентификации хромосомных транслокаций при злокачественных заболеваниях крови. В трех крайних ячейках биочипа расположены контрольные олигонуклеотиды (spike), которые используют в качестве положительного контроля прохождения гибридизации. В настоящем примере в качестве контрольного олигонуклеотида использован фрагмент последовательности гена rpoB Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 93). Олигонуклеотиды к гену ABL, который служит положительным контролем для определения качества препарата РНК, эффективности процедуры обратной транскрипции, мечения, расположены в нижних углах чипа. В вертикальных рядах ячеек (столбцах) располагаются олигонуклеотиды (каждая проба и соответственно каждый столбец были продублированы), представляющие собой участки последовательностей генов, вовлеченных в транслокации. Набор олигонуклеотидов в вертикальном ряду для каждой транслокации включает олигонуклеотид из участка гена, входящего во все варианты химерных транскриптов для данной транслокации. Далее расположены олигонуклеотиды, представляющие собой последовательности в точке слияния, причем часть нуклеотидов в данном олигонуклеотиде принадлежала одному гену, часть - другому гену, участвующим в транслокации.
Пример 4. Гибридизация меченого продукта на биочипе
9. Содержимое из каждой пробирки, полученной на стадии 6 Примера 2, отбирают, смешивают и добавляют контрольный олигонуклеотид (spike-hyb) (SEQ ID NO: 94), который комплементарен иммобилизованному на биочипе контрольному олигонуклеотиду (spike_imm) (SEQ ID NO: 93), в конечной концентрации 10-3-10-4 пмоль/мл. Эту смесь используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 20% формамид (Gibco BRL), 6×SSPE. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурируют при 95°С в течение 5 мин, охлаждают во льду и наносят на биочип под гибридизационную камеру объемом 30 мкл (Sigma, USA). Гибридизацию проводят в течение ночи (16-18 ч) при температуре 37°С. Отмывку проводят в буфере 1×SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин.
Пример 5. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации
10. Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО "Биочип-ИМБ". При визуальном анализе изображения интерпретацию результатов проводят следующим образом. Гибридизационный сигнал в трех угловых ячейках, где иммобилизованы контрольные олигонуклеотиды (spike_imm), должен присутствовать на всех гибридизационных картинах. Наличие сигнала с ячеек свидетельствует о расположении чипа. Гибридизационный сигнал в ячейках, где иммобилизованы олигонуклеотиды, относящиеся к гену ABL, должен присутствовать на всех гибридизационных картинах. Он свидетельствует о том, что такие этапы подготовки пробы как выделение РНК, обратная транскрипция, мечение и сама гибридизация прошли нормально. Отсутствие гибридизационного сигнала с ячеек, расположенных в вертикальных рядах (столбцах), свидетельствует об отсутствии в клиническом образце химерных транскриптов, принадлежащих вышеперечисленным транслокациям. Наличие сигнала с ячеек, расположенных в столбцах, свидетельствует о присутствии в образце химерного транскрипта, обусловленного наличием одной из перечисленных транслокаций. По расположению набора ячеек на чипе можно определить тип транслокации, а также определить вариант химерного транскрипта и таким образом верифицировать последовательность в точке слияния двух генов, участвующих в данной транслокации. Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы ImageWare™ выходит за рамки настоящего изобретения.
Пример 6. Определение в образце отсутствия вышеперечисленных транслокаций
РНК из культуры клеток HL-60 выделяют и получают флуоресцентно меченный амплифицированный продукт, как описано в пп.2-6 Примеров 1 и 2; полученный меченый ПЦР-продукт гибридизуют, как описано в п.9 Примера 4, на биочипе, изготовленном по п.8 Примера 3; анализ изображения проводят, как описано в п.10 Примера 5. На фиг.2 представлена картина гибридизации. Присутствуют гибридизационные сигналы только в контрольных ячейках биочипа. Это означает, что процедуры выделения РНК, обратной транскрипции и гибридизации, прошли нормально. Сигналы с ячеек, расположенных выше в вертикальных столбцах, отсутствуют. Делается заключение, что в образце отсутствуют клетки, содержащие вышеперечисленные транслокации.
Пример 7. Определение в клинических образцах костного мозга транслокации t(12; 21).
Клинический образец (костный мозг больного острым лимфобластным лейкозом) получают, как описано в п.1 Примера 1, дальнейшую обработку проводят, как описано в пп.3-6 Примеров 1 и 2. Полученный меченый ПЦР-продукт гибридизуют, как описано в п.9 Примера 4, на биочипе, изготовленном по п.8 Примера 3; анализ изображения проводят, как описано в п.10 Примера 5. На фиг.3. представлена картина гибридизации. Наличие гибридизационных сигналов в крайних ячейках свидетельствует о том, что все этапы приготовления образца прошли нормально. Появление сигналов с ячеек, расположенных в парных столбцах, свидетельствует о наличии транслокации. Ориентируясь по схеме микрочипа, определяют, что это транслокация (12; 21). В гибридизации участвуют иммобилизованные олигонуклеотиды из антисмысловой цепи.
Пример 8. Определение в клиническом образце костного мозга транслокации t(15; 17).
Клинический образец (костный мозг больного острым промиелоцитарным лейкозом) получают, как описано в п.1 Примера 1, дальнейшую обработку проводят, как описано в пп.3-6 Примеров 1 и 2. Полученный меченый ПЦР-продукт гибридизуют, как описано в п.9 Примера 4, на биочипе, изготовленном по п.8 Примера 3; анализ изображения проводят, как описано в п.10 Примера 5. На Фиг.4. представлены картины гибридизации амплифицированного продукта, полученного из клинического образца костного мозга. Наличие гибридизационных сигналов в крайних ячейках свидетельствует о том, что все этапы приготовления образца прошли нормально. Появление сигналов с ячеек, расположенных в парных столбцах, свидетельствует о наличии транслокации. Ориентируясь по схеме микрочипа, определяют, что это транслокация (15; 17). Появление сигналов с определенных ячеек вдоль столбца позволяет определить, что данная транслокация в этом образце представлена bcr 1 вариантом слияния между участвующими в транслокации генами PML и RARα. Следует отметить, что и в данном случае в гибридизации участвуют иммобилизованные олигонуклеотиды из антисмысловой цепи.
1. Набор праймеров для экспресс-анализа типа химерного транскрипта, последовательность которых определена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 9-33, 35, 37-47).
2. Набор олигонуклеотидов для экспресс-анализа типа химерного транскрипта, последовательность которых определена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 48-94).
3. Биочип для экспресс-анализа типа химерного транскрипта, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов, охарактеризованных в п.2.
4. Способ экспресс-анализа типа химерного транскрипта, включающий верификацию последовательности в точке слияния двух генов, участвующих в транслокации, в клиническом образце, полученном от больного лейкозом, предусматривающий следующие стадии:
(а) выделение РНК и реакция обратной транскрипции;
(б) мультиплексная "гнездовая" двухэтапная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием набора праймеров, охарактеризованных в п.1, для амплификации химерных транскриптов, при этом на первом этапе используют праймеры первого этапа (SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, 18-20, 26, 26, 29, 30, 33, 35, 39-41, 45, 46), а на втором - праймеры второго этапа (SEQ ID NO: 11-13, 16, 17, 21-24, 27, 28, 31, 32, 37, 38, 42-44, 45, 47) с одновременным мечением химерного ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР;
(в) обеспечение биочипа, охарактеризованного в п.3, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов, охарактеризованных в п.2, для проведения гибридизации;
(г) гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе с образованием совершенных и несовершенных дуплексов;
(д) регистрация и интерпретация результатов гибридизации.
5. Способ по п.4, в котором в качестве клинического образца используют костный мозг или кровь.
6. Способ по п.4, в котором на стадии (а) в реакции обратной транскрипции используют специфические праймеры, последовательность которых определена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1-8).
7. Способ по п.4, в котором на стадии (б) на втором этапе ПЦР для флуоресцентного мечения фрагмента химерного гена используют флуоресцентно меченные по 5'-концу праймеры.
8. Способ по п.4, в котором на стадии (б) на втором этапе ПЦР для флуоресцентного мечения фрагмента химерного гена используют модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты.
9. Способ по п.4, в котором на стадии (в) для обеспечения биочипа, охарактеризованного в п.3, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов, охарактеризованный в п.2, используют метод фотоиндуцируемой сополимеризации в акриламидном геле.
10. Способ по п.4, в котором на стадии (г) используют условия гибридизации, обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами.
11. Способ по п.4, в котором регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой.
12. Способ по п.4, в котором регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС-камерой.
13. Способ по п.4, в котором регистрацию результатов гибридизации на стадии (д) проводят с помощью любого устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции.
14. Способ по п.4, в котором интерпретацию результатов на стадии (д) проводят визуально.
15. Способ по п.4, в котором интерпретацию результатов на стадии (д) проводят с использованием программы автоматического анализа изображения.
16. Способ по п.4, в котором интерпретированные результаты используют для целей медицинской диагностики, определения прогноза и выбора специфической терапии, используя в качестве маркера наличие той или иной транслокации.
