Способ получения l-аминокислот
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения L-аминокислоты включает воздействие фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, в присутствии аммиака, на производное акриловой кислоты, которое содержит ароматическое кольцо, которое содержит различные заместители и включает гетероатом, причем L-аминокислота представляет собой ароматическую L-аминокислоту. Заявленное изобретение позволяет получать ароматические L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 29 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 ил.
Перекрестные ссылки на другие заявки
Настоящая заявка подана в соответствии с 35 U.S.С.§111 (а) и имеет приоритет согласно 35 U.S.С.§119(е) (1) по датам подачи предварительных заявок 60/303,086 от 6 июля 2001 и 60/339,389 от 14 декабря 2001, согласно 35 U.S.С.§111 (b).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу получения оптически активных аминокислот, включающему присоединение аммиака к производному акриловой кислоты под действием растительного фермента с образованием соответствующей оптически активной аминокислоты. Оптически активные аминокислоты используются в качестве исходных веществ для получения лекарственных средств, агрохимикатов и других продуктов тонкого органического синтеза.
Было исследовано большое число способов получения оптически активных аминокислот, таких как методы органического синтеза с использованием асимметрических катализаторов и методы ферментативного производства с использованием специфических микроорганизмов.
Существует множество публикаций, таких как патент UK №1489468 и выложенный патент Японии №53-96388 (1978), в которых сообщается о способе получения оптически активного фенилаланина путем оптической селекции, в котором коричную кислоту подвергают воздействию фенилаланиновой аммиак-лиазы, выделенной из микроорганизма, или самого микроорганизма, обладающего ферментативной активностью. В данном способе используется реакция присоединения аминогруппы к α-углероду коричной кислоты под действием фермента при высокой концентрации аммиака, что позволяет получить L-фенилаланин с высокой степенью оптической чистоты.
В качестве способа получения оптически активного производного L-фенилаланина, содержащего заместитель в составе своей фенильной группы, можно рассматривать способы введения заместителя в фенильную группу с использованием разнообразных видов реакций модификации L-фенилаланина. Однако при использовании этих способов неизбежно уменьшение выхода из-за протекания побочных реакций в других частях молекулы помимо фенильной группы и снижение оптической чистоты вследствие рацемизации, происходящей под действием чрезвычайно жестких условий реакции. Кроме того, сложно обеспечить специфичность введения заместителя в определенное положение фенильной группы, что приводит к низким выходам или затрудняет выделение и очистку продукта. Таким образом, данный способ не подходит для практического применения.
В данной заявке рассматривается другой способ, в котором производное коричной кислоты, содержащее замещенную фенильную группу, в которую был предварительно введен требуемый заместитель, подвергают воздействию описанной выше фенилаланиновой аммиак-лиазы. Поскольку в данном способе ферментативная реакция протекает в мягких условиях, он обеспечивает отсутствие нежелательных эффектов, обусловленных побочными реакциями с участием фенильной группы и заместителей в ее составе, и поэтому следует ожидать, что данным способом можно получить оптически активное производное L-фенилаланина с высокой степенью чистоты.
Однако, поскольку субстратная специфичность фенилаланиновой аммиак-лиазы, выделенной из микроорганизма, как правило, является очень строгой, в большинстве случаев реакционная способность этого фермента по отношению к замещенной фенильной группе значительно снижена по сравнению с исходной реакционной способностью преобразования коричной кислоты в L-фенилаланин, или практически отсутствует. Описано лишь небольшое число подобных методов, таких как способ получения оптически активного фторированного фенилаланина под действием вышеназванного фермента с использованием в качестве исходного вещества производного коричной кислоты, содержащего фторированную фенильную группу (выложенный патент Японии №63-148992 (1988)), или способ получения производного фенилаланина с использованием специфичного микроорганизма Rhodotorula (патент US 5981239). В этих способах ограничено число используемых соединений и их производительность не подходит для промышленного производства.
В целом известно, что фенилаланиновые аммиак-лиазы широко распространены в живой природе, в том числе в животных, растениях и микроорганизмах. Следует отметить, что примеры микроорганизмов, содержащих данный фермент, включают Rhodotorula rubra (выложенный патент Японии №61-043993 (1986), GB 1489468), Rhodosporidium toruloides (выложенный патент Японии №60-227670 (1985)), Cladosporidium cladosporioides (выложенный патент Японии №62-111687 (1987)) и т.д., и помимо этих примеров сообщалось также о многих других микроорганизмах.
Примеры растений, содержащих фенилаланиновую аммиак-лиазу, включают кресс-салат (Arabidopsis thaliana), чай [Camellia sinensis), нут (Cicer arietinum), лимон (Citrus limonis}, огурец (Cucumis sativus L.), морковь (Daucus carota), мурасаки (Lithospermum erythrorhizon), томат (Lycopersicon esculentum), табак (Nicotiana tabacum), рис (Oryza sativa), петрушку (Petrosellnum crispum, Petroselinum hortense), корабельную сосну (Pinus taeda), тополь (Populus kitakamlensis и т.д.}, вишню {Prunus avium), ежевику (Rubus idaeus), баклажан {Solanum tuberosum), стило {Stylosanthes humills), луговой клевер (Trifolium subterrane), виноград (Vitis vinifera), кустовую фасоль (Phaseolus vulqaris) и т.д.
Было много сообщений, касающихся структурного гена фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, - pal (здесь и далее обозначаемого как "pal ген"). Так, примеры обнаруженных pal генов включают гены риса (Oryza sativa, Biochim. Biophys. Acta (1993), 1171(3), 321-322, Plant Mol. Biol. (1995), 29(3), 535-550), чая {Camellia sinensis, Theor. Appl. Genet. (1994), 89(6), 671-675), кресс-салата (Arabidopsis thaliana, Plant Mol. Biol. (1995), 27, 327-338), мурасаки (Lithospermum erythrorhizon, Biosci. Biotech. Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003), томата (Lycopersicon esculentum, J. Biol. Chem. (1992), 267, 11824-11830), лугового клевера (Trifolium subterraneum, Gene (1994), 138(1-2), 87-92), гороха (Pisum sativum, Plant Mol. Biol. (1992), 20(1), 167-170, выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №5-153978 (1993)), тополя (Populus trichocarpa, Plant Physiol. (1993), 102, 71-83), табака (Nicotiana tabacum, Plant Mol. Biol. (1996), 30, 711-722), сои (Glycinemax, DNASequence (1991), 1(5), 335-346), сладкого картофеля (Ipomoea batatas, Plant Physiol. (1989), 90(4), 1403-1407), пшеницы (Triticum aestivum), петрушки (Petroselinum crispurn), подсолнечника (Helianthus annuus), люцерны (Medicago saliva) и т.д., и число известных pal генов достигает более 40 видов, включая изомеры одного вида или частичные последовательности.
Фенилаланиновые аммиак-лиазы, происходящие из растений, имеют много взаимно консервативных последовательностей; их аминокислотные последовательности являются гомологичными по меньшей мере на 50% или более. Следовательно, можно предположить наличие большого сходства их функций и свойств.
Известно, что фенилаланиновая аммиак-лиаза, происходящая из растения, является первичным ферментом в пути синтеза фенилпропаноидов и изофлавоноидов в процессе вторичного метаболизма растения, а также ферментом, катализирующим реакцию на скорость определяющей стадии, т.е. реакцию дезаминирования фенилаланина. Поскольку считается, что этот фермент и его ген связаны с устойчивостью растений к стрессу, функции этого фермента были подробно изучены. Кроме этого, широко проводились как фундаментальные, так и прикладные исследования в области экспрессии pal гена в органах растений с целью обеспечения устойчивости растений к заболеваниям.
Несмотря на наличие множества исследовательских работ, указанных выше, что касается изучения данного фермента с точки зрения получения веществ, в отличие от таких же ферментов, выделенных из микроорганизмов, то попытки получать органические соединения, которые можно использовать как обычное промышленное сырье, не предпринимались, за исключением попытки увеличения содержания некоторых полезных веществ из ряда фенилпропаноидов или изофлавоноидов (Planta. (1979), 14(6), 369-376, Biochlm. Biophys. Ada. (1979), 563, 278-292). Излишне упоминать о том, что никогда не появлялись сообщения о попытках получения веществ с использованием обратной реакции, т.е. реакции аминирования. Прежде всего, не только данный фермент, но и другие ферменты, происходящие из растений, редко использовали для получения веществ, поскольку существует общепринятое мнение о том, что практическая применимость этих ферментов с точки зрения низкой стабильности, высокой субстратной специфичности и т.д. хуже, чем у ферментов, выделенных из микроорганизмов. Таким образом, если бы специалист в данной области стал разрабатывать способ получения производного L-фенилаланина, одного из органических соединений, аналогичных соединениям по настоящему изобретению, то наименее вероятно, что он стал бы использовать фермент, происходящий из растения, при условии, что существует фермент из других источников, обладающий такой же каталитической функцией.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одной из целей настоящего изобретения является предложение нового удобного и эффективного способа получения L-аминокислоты с высокой степенью оптической чистоты. Более конкретно, одной из целей настоящего изобретения является предложение нового простого и эффективного способа получения L-аминокислоты с высокой степенью оптической чистоты с использованием в качестве исходного вещества производного акриловой кислоты, такого как производное коричной кислоты, содержащее заместитель в составе фенильной группы.
Авторы настоящего изобретения сконцентрировали свое внимание на широкой субстратной специфичности фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, и исследовали активность данного фермента в отношении образования разнообразных аминокислот, которые используются в промышленности.
Сначала был проведен поиск аммиак-лиазы, обладающей высокой реакционной способностью по отношению к производному коричной кислоты, содержащему заместитель в составе фенильной группы, среди живой природы в целом, т.е. среди животных, растений и микроорганизмов.
В результате авторы настоящего изобретения обнаружили, что фенилаланиновые аммиак-лиазы, происходящие из растений, обладают намного более высокой активностью по образованию производных фенилаланина, чем такие же ферменты, выделенные из микроорганизмов, которые были известны ранее. Как указано выше, стадия образования фенилпропаноидов, изофлавоноидов или им подобных веществ в органах растений, в которой участвуют эти ферменты, была подробно исследована, но эти исследования касались образования производного коричной кислоты за счет реакции элиминирования, в процессе которой от фенилаланина отщепляется аминогруппа. Обратная реакция, т.е. возможность образования производного фенилаланина за счет присоединения аминогруппы к производному коричной кислоты под действием ферментов, происходящих из растений, не была изучена.
Кроме этого, авторы настоящего изобретения сконцентрировали свое внимание на широкой субстратной специфичности фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, и исследовали активность данного фермента в отношении образования разнообразных видов использующихся в промышленности аминокислот, а также производных фенилаланина. В результате авторы настоящего изобретения обнаружили, что под действием данного фермента, использующего в качестве субстрата производное акриловой кислоты, структура которого включает ароматическое кольцо, которое может содержать заместители и включать гетероатом, образуется соответствующая L-аминокислота.
В результате дальнейших интенсивных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что аминокислоту можно получать с чрезвычайно высокой эффективностью при использовании микроорганизма, проявляющего повышенную экспрессию pal гена, происходящего из растения, осуществив таким образом настоящее изобретение.
Способность фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, катализировать реакцию, которая приводит к получению аминокислоты, с использованием в качестве субстрата производного акриловой кислоты, имеющего структуру, соответствующую приведенной выше общей формуле (1), не была известна ранее и является открытием авторов настоящего изобретения.
Кроме этого, способность фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, катализировать реакцию, которая приводит к получению производного фенилаланина, с использованием в качестве субстрата производного коричной кислоты, содержащего различные заместители в составе фенильной группы, представленного приведенной выше общей формулой (3), также не была известна ранее и является открытием авторов настоящего изобретения.
Более того, способность фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, катализировать реакцию, которая приводит к получению L-аминокислоты, с использованием в качестве субстрата производного акриловой кислоты, содержащего гетероциклический заместитель, представленного приведенной выше общей формулой (4) или (5), также не была известна ранее и является открытием авторов настоящего изобретения.
Следует отметить, что настоящее изобретение включает следующие аспекты [1]-[30]:
[1] Способ получения L-аминокислоты, который включает воздействие фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, в присутствии аммиака на производное акриловой кислоты, представленное следующей общей формулой (1):
где
Z представляет собой ароматическое кольцо, которое может содержать гетероатом,
R представляет собой заместитель в составе указанного ароматического кольца, и
n представляет собой целое число, равное 0 или более, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными;
причем L-аминокислота представлена следующей общей формулой (2):
где
Z представляет собой ароматическое кольцо, которое может содержать гетероатом,
R представляет собой заместитель в составе указанного ароматического кольца,
n представляет собой целое число, равное 0 или более, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
[2] Способ получения L-аминокислоты согласно пункту
[1] выше, где Rn-Z- представлено следующей общей формулой (3):
где
R является заместителем в составе бензольного кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 5, и, предпочтительно, целое число, равное от 1 до 5. Если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
[3] Способ получения L-аминокислоты согласно пункту [1] выше, где Rn-Z- представлено следующей общей формулой (4):
где
Х представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 3, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
[4] Способ получения L-аминокислоты согласно пункту [1] выше, где Rn-Z- представлено следующей общей формулой (5):
где
Х представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 3, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
[5] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [1]-[4] выше, включающий использование композиции, полученной путем обработки тканей растения, содержащих фенилаланиновую аммиак-лиазу.
[6] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [1]-[4] выше, включающий использование культуры клеток растения, содержащих фенилаланиновую аммиак-лиазу, и/или композиции, полученной путем ее обработки.
[7] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [1]-[4] выше, включающий обеспечение экспрессии в растении гена фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящего из растения, и использование трансформированных культур растения или продукта обработки культур растения.
[8] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [1]-[4] выше, включающий обеспечение экспрессии в микроорганизме гена фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящего из растения, и использование трансформированной культуры микроорганизма, продукта ее обработки, или фермента, полученного из этой культуры.
[9] Способ получения L-аминокислоты согласно пункту [7] или [8] выше, где ген фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящий из растения, представляет собой ген, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую 70% или более гомологии с аминокислотной последовательностью, выведенной из нуклеотидной последовательности ра12 гена, выделенного из Lithospermum erythrorhizon.
[10] Способ получения L-аминокислоты согласно пункту [7] или [8] выше, где ген фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящий из растения, представляет собой ген, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более гомологии с аминокислотной последовательностью, выведенной из нуклеотидной последовательности раl2 гена, происходящего из Lithospermum erythrorhizon.
[11] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [1]-[8] выше, где растение, из которого происходит ген фенилаланиновой аммиак-лиазы, представляет собой Lithospermum и/или Camellia.
[12] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [8]-[11] выше, где микроорганизмом является бактерия, дрожжи и/или нитевидный грибок.
[13] Способ получения L-аминокислоты согласно пункту [12] выше, где бактерией является Escherichia coli.
[14] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой гидроксильную группу.
[15] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой цианогруппу.
[16] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой карбоксильную группу.
[17] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой амидную группу.
[18] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой галоген.
[19] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой аминогруппу.
[20] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой нитрогруппу.
[21] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой гидроксиметильную группу.
[22] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода.
[23] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [1]-[13] выше, где R является одной из цианогруппы, гидроксильной группы, нитрогруппы и карбоксильной группы, и n равно 1.
[24] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [2] и [5]-[13] выше, где L-аминокислота представляет собой L-фенилаланин.
[25] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [3] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (4) Х представляет собой О.
[26] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [3] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (4) Х представляет собой S.
[27] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [3] и [5]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (4) Х представляет собой NH.
[28] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [4]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (5) Х представляет собой О.
[29] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [4]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (5) Х представляет собой S.
[30] Способ получения L-аминокислоты согласно любому из пунктов [4]-[13] выше, где в приведенной выше общей формуле (5) Х представляет собой NH.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
На ФИГ.1 показана конструкция экспрессионной плазмиды PAL Lithospermum erythrorhizon с изображением LePAL1 и LePAL2.
На ФИГ.2 показана конструкция экспрессионной плазмиды PAL Camellia sinensis с изображением CAMPAL.
На ФИГ.3 показан пример гомологии аминокислотных последовательностей PAL.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
Настоящее изобретение будет далее описано подробно.
При помощи способа получения L-аминокислоты по настоящему изобретению можно просто получить оптически активную аминокислоту из производного акриловой кислоты, которое может содержать ароматическое кольцо, которое может содержать различные заместители и включать гетероатом, путем одностадийной ферментативной реакции.
Кроме этого, при помощи способа получения L-аминокислоты по настоящему изобретению можно просто получить оптически активную аминокислоту из производного акриловой кислоты, которое содержит бензольное кольцо, содержащее различные заместители, путем одностадийной ферментативной реакции.
Заблаговременно введенный в бензольное кольцо заместитель, например, цианогруппа, гидроксильная группа, карбоксильная группа, амидная группа, атом галогена, аминогруппа, нитрогруппа, гидроксиметильная группа или алкильная группа, содержащая от 1 до 6 атомов углерода, сохраняется до завершения реакции, не подвергаясь неблагоприятному воздействию в мягких условиях реакции, и соответствующее целевое производное L-фенилаланина может быть получено с хорошим выходом при степени превращения почти 100%.
Более того, при помощи способа получения L-аминокислоты по настоящему изобретению можно просто получить оптически активную аминокислоту, содержащую гетероциклическое кольцо в структуре боковой цепи, из производного акриловой кислоты, содержащего гетероциклическое кольцо в структуре боковой цепи, путем одностадийной ферментативной реакции.
Структура гетероциклического кольца, такого как фурильная группа, тиенильная группа, пиррольная группа или им подобные, в указанном выше производном акриловой кислоты сохраняется до завершения реакции, не подвергаясь неблагоприятному воздействию в мягких условиях реакции, и соответствующая целевая L-аминокислота может быть получена с хорошим выходом при степени превращения почти 100%.
Производное акриловой кислоты, содержащее различные заместители, используемое как исходное вещество для реакции по настоящему изобретению, можно легко получить способом, включающим так называемую реакцию Перкина, при которой альдегидную группу альдегидного производного, в которое вводят определенный заместитель, подвергают взаимодействию с уксусным ангидридом (см. Arch. Pharm. (Weinheim) (1994), 327 (10), 619-625 и т.д.); способом, включающим реакцию малоновой кислоты в присутствии пиперидина в пиридине в качестве растворителя (см. J. Chem. Soc. (1939), 357-360 и т.д.); и различных других усовершенствованных способов (см. Synth. Common. (1999), 29(4), 573-581 и т.д.).
Растения, обладающие активностью фенилаланиновой аммиак-лиазы, которые используются в настоящем изобретении, не ограничиваются каким-либо образом. Как упоминалось выше, конкретные примеры включают кресс-салат (Arabidopsis thaliana), чай (Camellia sinensis), нут (Cicer arietinum), лимон (Citrus limonis), огурец (Cucumis sativus L.), морковь (Daucus carota), мурасаки (Lithospermum erythrorhizon), томат (Lycopersicon esculentum), табак (Nicotiana tabacum), рис (Oryza sativa), петрушку (Petroselinum crispum, Petroselinum hortense), корабельную сосну (Pinus taeda], тополь (Populus kitakamiensis и т.д.), вишню (Prunus avium), ежевику (Rubus idaeus), баклажан (Solarium tuberosum), стило (Stylosanthes humilis), луговой клевер (Trifolium subterrane), виноград (Vitis vinifera), кустовую фасоль (Phaseolus vulgaris) и т.д., но данный фермент присутствует почти во всех растениях.
В одном воплощении настоящего изобретения используют фенилаланиновую аммиак-лиазу, происходящую из растения. Имеется ввиду, что в качестве катализатора реакции используют указанный выше фермент, который извлекают и очищают при помощи известных общепринятых способов извлечения ферментов из растений и их очистки, например, осаждения ацетоном, осаждения сульфатом аммония, различных разделительных колонок и т.д., используя экстракты тканей грунтовых растений. Что касается конкретных способов извлечения и очистки фенилаланиновой аммиак-лиазы из различных видов тканей растений, то можно сослаться на известные статьи J. Koukol et al. (J. Biol. Chem. (1961), 236(10), 2692-2698) и E.A.Havir et al. (Biochemistry (1973), 12, 1583-) и т.д.
В другом воплощении настоящего изобретения в реакции используют продукт обработки описанных выше тканей растения. Примеры продуктов обработки тканей растения, которые используют в реакции, включают продукт измельчения, продукт лиофилизации или экстракт тканей растения; продукт, полученный путем концентрации и экстракции ингредиента, катализирующего целевую реакцию, из экстракта; продукт, полученный путем иммобилизации продукта обработки, экстракта или экстрагированного ингредиента тканей растения на трудно растворимом носителе; и т.д.
Примеры подобных носителей для иммобилизации включают полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, полиакриламид, поливиниловый спирт, поли-N-винилформамид, полиаллиламин, полиэтиленимин, метилцеллюлозу, глюкоманнан, альгинат, каррагинан и (поперечно-сшитые) сополимеры этих соединений. Другими словами, можно отдельно или в форме смеси использовать соединение, из которого образуется не растворимое в воде твердое вещество, содержащее ингредиент экстракта растения.
В другом воплощении настоящего изобретения используют культуру клеток описанного выше растения. То есть клетки растений культивируют при помощи обычных способов получения культур клеток растений. Например, клетки растения культивируют в различных известных средах для культур клеток растений, таких как среда полного состава Murashige & Skoog, среда LS, среда М9 и среда Gamborg В-5, которые выбирают в зависимости от вида растения, в присутствии растительных гормонов, таких как индолуксусная кислота или кинетин, и затем полученную культуру клеток вводят в реакцию. В настоящее время также можно использовать среду и условия культивирования, которые были усовершенствованы с целью повышения активности фенилаланиновой аммиак-лиазы.
Например, известен ряд статей, таких как статья Yazaki et al., посвященных условиям культивирования и получения культур клеток, в которых индуцирована ферментативная активность Lithospermum erythrorhizon (Biosci. Biotech. Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003); статья Klaus et al., в которой раскрывается взаимосвязь между описанной выше ферментативной активностью и условиями культивирования клеток Petroselinum hortense (Archiv. Biochem. Biophis. (1975), 66, 54-62); и т.д. Кроме этого, продукт измельчения, продукт лиофилизации или экстракт полученной таким образом культуры клеток растения; продукт, полученный путем концентрации и экстракции ингредиента, катализирующего целевую реакцию, из экстракта; продукт, полученный путем иммобилизации экстракта или экстрагированного ингредиента культуры клеток растения на трудно растворимом носителе и т.д., можно также вводить в реакцию.
В другом воплощении настоящего изобретения, pal ген, происходящий из растения, вводят в микроорганизм или растение таким образом, чтобы обеспечить его экспрессию, а также используют полученный трансформированный микроорганизм или трансформированное растение. Выбор организма-хозяина, используемого для экспрессии гена, не ограничивается особым образом, а лишь в такой степени, чтобы о выбранном организме было известно, что он способен к принятию и экспрессии чужеродного гена. Примеры таких организмов включают; бактерии, такие как Escherichia, Pseudomonas или Bacillus, дрожжи, такие как Saccharomyces или Schizosaccharomyces, и нитевидные грибы, такие как Aspergillus.
Используемый в настоящем изобретении pal ген может являться не только природным pal геном, присутствующим в окружающей среде, это также могут быть гены, имеющие аналогичные функции (кодирующие мутантные ферменты с такой же активностью). Примеры таких генов включают ра12 ген, выделенный из Lithospermum erythrorhizon (Database Accession No. D83076); pal ген, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую 70% или более гомологии с аминокислотной последовательностью, выведенной из нуклеотидной последовательности ра12 гена, происходящего из Lithospermum erythrorhizon; или, предпочтительно, pal ген, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более гомологии с аминокислотной последовательностью, выведенной из нуклеотидной последовательности ра12 гена, происходящего из Lithospermum erythrorhizon. Как указано выше, фенилаланиновые аммиак-лиазы, происходящие из растений, имеют между собой много общих функций и свойств, таких как достаточно высокая степень гомологии последовательностей pal генов растений и их идентичные функции в тканях растения, и, таким образом, в настоящем способе получения от них можно ожидать получения эквивалентного эффекта.
Что касается способа выделения кДНК гена фермента из растения и получения трансформированного микроорганизма с использованием этого гена или способа отделения и сбора фермента из трансформированного микроорганизма, то на этот счет известно много сообщений, таких как статья Yazaki et al. относительно использования Lithospermum erythrorhizon (Biosci. Biotech. Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003), статья W. Schuiz et al. относительно использования Petroselinum crispum (FEBS Letter (1989), 258(2), 335-338) и т.д.
Далее следует конкретное описание способа получения pal гена, способа получения экспрессирующих плазмид, способа введения этих плазмид в различные типы организмов и их экспрессии в этих организмах.
<Способ получения pal гена>
Происходящий из растения pal ген можно получить из кДНК библиотеки, полученной известным способом, с использованием в качестве зонда частичного фрагмента, соответствующего консервативной последовательности фенилаланиновой аммиак-лиазы. После выделения и очистки стандартной мРНК требуемую кДНК можно получить с помощью обратной транскриптазы, используя полученную мРНК в качестве матрицы. Однако в настоящее время достаточное количество кДНК можно легко получить ПЦР методом при помощи термоустойчивой обратной транскриптазы, с использованием в качестве матрицы тотальной РНК или мРНК. Полученную таким образом кДНК лигируют с подходящим плазмидным вектором, таким как pBR322 или pUC18, чтобы трансформировать Escherichia coli, используемую в качестве организма-хозяина.
Чтобы получить требуемый pal ген из кДНК библиотеки, полученной как описано выше, используют метод гибридизации колоний, где в качестве зонда используют олигодезоксинуклеотид, кодирующий консервативную последовательность фенилаланиновой аммиак-лиазы. Поскольку, как указано выше, во всех последовательностях фенилаланиновых аммиак-лиаз, происходящих из растений, имеются высокогомологичные последовательности, которые, предположительно, являются консервативными последовательностями, используемые в качестве зондов олигодезоксинуклеотиды можно получать путем выбора позиции в зависимости от цели.
Плазмиду получают из предполагаемого положительного трансформанта, полученного путем гибридизации с колониями. Затем плазмиду подвергают ПЦР с комбинацией подходящих праймеров, таким образом, чтобы подтвердить позицию и направление pal гена, который был вставлен в плазмиду. Первичные структуры многих pal генов, происходящих из растений, представлены в таких базах данных, как GenBank или EMBL. Следовательно, поскольку существует информация о структуре генов, можно также подтвердить правильность получения плазмиды и направление гена путем получения рестриктной карты.
<Способ получения экспрессирующей плазмиды и способ получения рекомбинантного микроорганизма, используемого в способе по изобретению>
В составе подходящего вектора (конкретные примеры которых будут описаны ниже) pal ген вводят в такие бактерии, как Escherichia coli, или такие микроорганизмы, как дрожжи, включая Saccaromyces cerevisiae, и экспрессируют в них таким образом, чтобы можно было получить рекомбинанты, обладающие способностью к образованию требуемых производных фенилаланина. В данном случае предпочтительным организмом-хозяином является бактерия, такая как Escherichia coli. Как описано ниже, образовавшееся производное фенилаланина можно выделить и очистить с помощью стандартных способов отделения продукта реакции микроорганизма из реакционной смеси.
В качестве способа получения плазмиды, содержащей чужеродный ген, а также методики или способа введения и экспрессии плазмиды в таком микроорганизме, как Escherichia coli, можно использовать стандартные методы, обычно используемые в области генной инженерии (см., например, "Vectors for cloning genes". Methods in Enzymology, 216, pp.469-631, 1992, Academic Press, и "Other bacterial systems". Methods in Enzymology, 204, pp.305-636, 1991, Academic Press).
В качестве способа введения чужеродного гена (группы pal генов) в Escherichia coli уже было разработано несколько эффективных методов, таких как Hanahan-метод или рубидиевый метод, которые могут быть использованы для этих введения генов (см., например, Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., "Molecular cloning - A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Экспрессию чужеродного гена в Escherichia coli можно осуществить стандартным способом (см., например, упомянутый выше "Molecular cloning - A laboratory manual."), для Escherichia coli можно использовать вектор, содержащий lac промотор, или подобные векторы, такие как pUC, pBluescript и т.д. Используя вектор для Escherichia coli pBluescript II SK-, содержащий lac промотор, авторы настоящего изобретения вставили pal ген ниже последовательности lac промотора, а затем добились экспрессии гена в Escherichia coli.
В качестве способа введения pal гена в дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, уже было разработано несколько методов, таких как литиевый метод, с помощью которого можно осуществить введение гена в дрожжи (см., например, "Biotechnology of Yeast" под редакцией Yuichi Akiyama и Bioindustry Association, опубликованное в Igaku Syuppan Center). Используя такой промотор, как PGK или GPD (GAP), а также терминатор, экспрессию чужеродного гена в дрожжах можно осуществить путем конструирования экспрессирующей кассеты, в которой чужеродный ген вставлен между промотором и терминатором для осуществления транскрипционного контроля, и вставления этой экспрессирующей кассеты в вектор S. cerevisiae, например YRp (мультикопийный вектор для дрожжей, содержащий в качестве точки начала репликации, последовательность ARS дрожжевой хромосомы), YEp (мультикопийный вектор для дрожжей, содержащий в качестве точки начала репликации 2 мкм дрожжевой ДНК), Yip (вектор для инкорпорации в дрожжевую хромосому, который не содержит никаких дрожжевых точек начала репликации) и т.д. (см. вышеупомянутое "New Biotechnology of Yeast" Igaku Syuppan Center и "Genetic Engineering for Production of Substances", Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, ABC Series, опубликованное Asakura Shoten).
<Способ культивирования рекомбинантного микроорганизма>
Культивирование трансформанта по настоящему изобретению можно осуществить при помощи стандартного способа культивирования микроорганизма-хозяина.
Источником углерода для культивирования трансформированного микроорганизма может быть вещество, которое микроорганизм может использовать в качестве источника углерода, и примеры таких источников углерода включают сахариды, такие как глюкоза, сахароза, фруктоза, а также черная патока; органические вещества, такие как этанол, уксусная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, молочная кислота, бензойная кислота, а также жирные кислоты или соли щелочных металлов этих кислот; алифатические углеводороды, такие как н-парафин; и природные органические вещества, такие как пептон, мясной экстракт, рыбный экстракт, соевая мука, пшеничные отруби, солодовый и картофельный экстракты. Эти вещества можно использовать отдельно или в комбинации друг с другом, обычно в концентрации от 0.01% до 30%, а предпочтительно от 0.1% до 10%. При использовании в качестве трансформанта Escherichia coli в качестве источника углерода предпочтительно используют глюкозу, пептон, мясной экстракт, солодовый экстракт и т.д.
Источником азота для культивирования трансформированного микроорганизма может быть вещество, которое микроорганизм-хозяин может использовать в качестве источника азота, и примеры таких источников азота включают неорганические азотные соединения, такие как сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат натрия и нитрат кальция; азотсодержащие органические вещества, такие как мочевина и мочевая кислота; а также природные органические вещества, такие как пептон, мясной экстракт, рыбный экстракт, соевая мука, солодовый и картофельный экстракты. Эти вещества можно использовать отдельно или в комбинации друг с другом, обычно в концентрации от 0.01% до 30%, а предпочтительно от 0.1% до 10%. При использовании в качестве трансформанта Escherichia coli предпочтительно используют сульфат аммония, пептон, мясной экстракт, солодовый экстракт и т.д.
Далее, по необходимости, чтобы ускорить рост бактериальных клеток, добавляют фосфат, такой как дигидрофосфат калия, или соли металлов, такие как сульфат магния, сульфат железа, ацетат кальция, хлорид марганца, сульфат меди, сульфат цинка, сульфат кобальта или сульфат никеля. Концентрация добавляемых веществ зависит от условий культивирования, но, как правило, эта концентрация составляет от 0.01% до 5% для фосфата, от 10 м.д.(миллионных долей) до 1% для соли магния и от 0.1 м.д. до 1000 м.д. для других соединений. Кроме этого, в зависимости от того, какая выбрана среда, можно также добавить приблизительно от 1 м.д. до 100 м.д. дрожжевого экстракта, казаминовой кислоты, дрожжевых нуклеиновых кислот или им подобных в качестве источника витаминов, аминокислоты или нуклеиновые кислот, чтобы ускорить рост бактериальных клеток.
Более того, по необходимости, во время культивирования можно добавить соответствующий индуктор промотора экспрессирующего вектора, чтобы обеспечить высокую степень экспрессии гена фермента, взятого для трансформации, в микроорганизме-хозяине. В случае использования lac промотора добавляют от 0.01 мМ до 10 мМ ИПТГ (изопропил-1-тио-β-D-галактозид), а в случае использования промоторов генов устойчивости к таким лекарственным веществам, как ампициллин или канамицин, добавляют от 0.1 м.д. до 1000 м.д. соответствующего лекарственного вещества.
Во всех случаях, где использовали какую-либо композицию, при культивировании поддерживали значение рН от 5 до 9, предпочтительно от 5.5 до 8. Кроме того, используют процедуры, при которых клетки микроорганизма, предварительно культивированные в вышеописанной среде, отделяют и собирают из культурального раствора при помощи такого способа, как центрифугирование или мембранная фильтрация, а затем подвергают реакции с целью уменьшения количества примесей, привнесенных из культурального раствора, и для облегчения последующего отделения и сбора продукта.
Трансформированный микрорганизм, полученный с помощью культивирования, можно собрать с помощью известных способов, таких как центрифугирование или мембранная фильтрация, и затем использовать в требуемых реакциях, или же можно непосредственно ввести в реакцию культуральный раствор. Кроме того, можно также вводить в реакцию продукт измельчения или лиофилизации трансформированного микроорганизма; бесклеточный экстракт из клеток микрорганизма; продукт, полученный путем концентрации и экстракции ингредиента, катализирующего требуемую реакцию, из бесклеточного экстракта; продукт, полученный путем иммобилизации клеток этого трансформированного микроорганизма, а также продукт обработки, экстракт и экстрагированные из него ингредиенты, иммобилизованные на трудно растворимом носителе; и т.д.
Примеры носителей для иммобилизации, используемых для вышеописанной цели, включают полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, полиакриламид, поливиниловый спирт, поли-N-винилформамид, полиаллиламин, полиэтиленимин, метилцеллюлозу, глюкоманнан, альгинат, каррагинан и т.д., а также (поперечно-сшитые) сополимеры этих соединений. Другими словами, можно отдельно или в форме смеси использовать соединение, из которого образуется не растворимое в воде твердое вещество, содержащее микроорганизм или ингредиент его экстракта. Более того, трансформированный микроорганизм, его экстракт или ингредиенты этого экстракта можно локализовать перед использованием на твердой поверхности, такой как активированный уголь, пористая керамика, стекловолокно, пористый полимерный порошок или нитроцеллюлозная мембрана.
<Способ получения и культивирования рекомбинантных растений, используемых в способе по изобретению>
Как указано выше, растение, образующее производное фенилаланина, можно получить с помощью введения pal гена в клетку этого растения. Вот предпочтительный пример получения такого растения: получают плазмиду, содержащую pal ген, затем эту плазмиду вводят в клетки подходящего растения, такого как Nicotiana tabacum, и обеспечивают экспрессию, чтобы получить растение, образующее интересующее производное фенилаланина. Было опубликовано много результатов исследований относительно технологии введения и экспрессии различных типов генов в растениях, и с помощью этих известных способов можно получить растения, обладающие повышенной целевой активностью {Plant Mol. Biol. (1999), 39(4), 683-693, Plant Biotechnol. (Tokyo) (1998), 15(4), 189-193, Plant Physiol. (1996), 112(4), 1617-1624).
Примеры известных способов введения чужеродного гена в клетку растения включают способ с использованием фитопатогенных бактерий Agrobacterium tumefaciens, способ электропорации, способ с использованием бомбардировки частицами и т.д., и из этих способов можно выбрать подходящий в зависимости от типа растения, которое предназначено для введения гена. В качестве промотора можно использовать не только 35S промотор из вируса мозаики цветной капусты (CaMV), который является промотором для систематической высокой экспрессии генов, но также другие промоторы, специфически регулирующие экспрессию генов в различных тканях. Бинарный вектор рВI121, содержащий 35S промотор из CaMV, можно получить из Clontech, и этот вектор широко используют в качестве посредника для Agrobacterium tumefaciens. Уже было показано, что pal ген можно ввести в такое растение, как Nicotiana tabacum при использовании способа бомбардировки частицами, после чего введенный pal ген экспрессировался и функционировал (Shokubutsu Soshiki Baiyo (1995), 12(2), 165-171).
Примеры способов получения плазмиды, содержащей чужеродный ген, а также методик или способов введения плазмиды в растения (клетки листьев, стеблей, корней и т.д.) и ее экспрессии в этих клетках включают не только способы, проиллюстрированные в настоящем изобретении, но и другие способы, которые обычно используют в области генной инженерии, и таким образом получение, введение и экспрессию плазмиды можно осуществить при помощи этих приемов и методов (см., например, Isao Ishida, Norihiko Misawa, Saibo Kogaku Jikken Sosa Nyumon (Introduction to Experiments of Cell Technology), Kodansha, 1992). Рекомбинантные растения, полученные, как указано выше, можно использовать для выращивания культур клеток растений с использованием описанных выше способов.
Реакцию образования L-аминокислоты по настоящему изобретению осуществляют путем взаимодействия, в качестве реагентов, от 1 м.д. до 20%, предпочтительно от 10 м.д. до 10% производного акриловой кислоты, и аммиака в конечной концентрации от 2М до 12М; поддерживают значение рН от 8.5 до 11, предпочтительно от 9 до 10.5; и проводят реакцию в течение от около 1 до 200 часов в присутствии фенилаланиновой аммиак-лиазы происходящей из растения, которая получена при помощи различных известных способов, описанных выше, продукта обработки растения или культуры клеток, обладающих активностью данного фермента, этого же фермента, продуцированного микроорганизмом, трансформированным геном фермента, происходящим из растения, трансформированных клеток микроорганизма и продукта их обработки, этого же фермента, продуцированного растением, трансформированным геном фермента, или трансформированного растения и продукта его обработки.
Примеры кислот, используемых для корректировки значения рН, включают неорганические кислоты, такие как серная кислота, соляная кислота, фосфорная кислота, борная кислота или угольная кислота, органические кислоты, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота или пропионовая кислота, и их соли. Использование летучей кислоты в данном случае приводит к тому, что требуется только отделение и удаление клеток из реакционного раствора, и позволяет избежать стадии обессоливания и легко отделить и собрать продукт. Предпочтительно используют угольную кислоту. Примеры форм угольной кислоты в данном случае также включают угольную кислоту, растворенную в водном растворе путем пропускания через него газообразного диоксида углерода, и образовавшуюся путем диссоциации. Кроме того, эти кислоты и их аммонийные соли также можно использовать в качестве источника аммиака в реакционном растворе. По указанным выше причинам предпочтительным является использование в качестве источника аммиака, полностью или частично, карбоната или гидрокарбоната аммония.
Следует отметить, что не обязательно требуется растворение всего используемого количества производного акриловой кислоты, также можно добавить растворитель, поверхностно-активное вещество или им подобные вещества, улучшающие растворимость этого производного или его способность диспергироваться в реакционном растворе. По мере расходования данного соединения в процессе протекания реакции его можно добавлять, непрерывно или периодически. Концентрация соединения в реакционном растворе в данном случае не обязательно будет находиться в указанном выше интервале.
L-аминокислоту, образовавшуюся в реакционном растворе, отделяют и собирают при помощи известных способов, таких как центрифугирование, мембранная фильтрация, вакуумная сушка, дистилляция, экстракция растворителем, высаливание, ионообменная и другие виды хроматографии, в зависимости от свойств производного, находящегося в реакционном растворе. Можно привести следующий пример простого отделения и сбора L-аминокислоты. Фермент, продукт, обработанный ферментом, трансформированный микроорганизм или продукт его обработки и т.д. удаляют из реакционного раствора при помощи фильтрации, центрифугирования, диализа или им подобных методов, а затем проводят экстракцию растворителем или реакционный раствор подкисляют таким образом, чтобы не прореагировавшее исходное вещество, производное акриловой кислоты, выпало в осадок, который удаляют.
Значение рН полученного супернатанта снова доводят приблизительно до изоэлектрической точки L-аминокислоты и выпавшее в осадок производное собирают таким же методом, как описано выше. Таким образом продукт можно эффективно извлечь из реакционного раствора с высокой степенью чистоты. В дополнение полезно также предварительно отделить от реакционного раствора оставшийся аммиак путем дистилляции или другого аналогичного метода и повысить концентрацию путем удаления воды, чтобы увеличить выход продукта в изоэлектрической точке.
Более предпочтительно, значение рН реакционного раствора поддерживают при помощи летучей кислоты. При относительно высокой степени превращения продукт можно непосредственно выделить в виде аммониевой соли производного L-фенилаланина после отделения клеток от реакционного раствора. Если остается достаточно большое количество исходного вещества, после отделения микроорганизмов перед экстракцией растворителем реакционный раствор подкисляют, удаляя воду и анион кислоты, и выделяют продукт в виде аммониевой соли L-аминокислоты. Предпочтительные примеры летучих кислот, подходящих для использования в данном способе, включают угольную кислоту и ее аммониевую соль.
В некоторых случаях, в зависимости от свойств продукта реакции, этот продукт накапливается в реакционном растворе, и поэтому скорость реакции снижается. В этой ситуации предпочтительным выходом из положения является добавление в реакционный раствор водного аммиака, содержащего аммиак физиологического раствора или содержащего аммиак реакционного буфера, в зависимости от концентрации продукта с целью непрерывного разбавления реакционного раствора. Кроме этого, существует другой способ повышения скорости реакции, при котором при снижении скорости реакции клетки отделяют и собирают, собирают супернатант в качестве раствора, содержащего продукт, и собранные клетки вновь помещают в раствор, содержащий реагенты, или их суспензию. Эти операции можно повторять до тех пор, пока сохраняется аммиак-лиазная активность микроорганизма.
Соединение, используемое в настоящем изобретении в качестве исходного вещества, представляет собой производное акриловой кислоты, представленное описанной выше общей формулой (1):
где
Z представляет собой ароматическое кольцо, которое может содержать гетероатом,
R представляет собой заместитель в составе указанного ароматического кольца, и
n представляет собой целое число, равное 0 или более, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
Полученное соединение представлено общей формулой (2), упомянутой выше:
где
Z представляет собой ароматическое кольцо, которое может содержать гетероатом,
R представляет собой заместитель в составе указанного ароматического кольца,
n представляет собой целое число, равное 0 или более, и если n равно 2 или более, each R могут быть одинаковыми или различными.
В приведенных выше общих формулах примеры Z включают: группы, представленные следующими общими формулами (6)-(10):
группы, представленные следующими общими формулами (11)-(15):
группы, представленные следующими общими формулами (16)-(20):
группы, представленные следующими общими формулами (21)-(25):
группы, представленные следующими общими формулами (26)-(30):
группы, представленные следующими общими формулами (31)-(35):
группы, представленные следующими общими формулами (36)-(40):
группы, представленные следующими общими формулами (41)-(45):
группы, представленные следующими общими формулами (46)-(50):
группы, представленные следующими общими формулами (51)-(55):
Примеры R в приведенных выше общих формулах включают цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу, или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода.
В приведенных выше общих формулах n может быть целым числом, равным 0 или более, которое представляет собой число, полученное путем вычитания 1 из числа положений, по которым может быть замещено ароматическое кольцо, или менее. Если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
В соединении, используемом в настоящем изобретении в качестве исходного вещества, представленном описанной выше общей формулой (1), Rn-Z- является соединением следующей общей формулы (3):
где
R является заместителем в составе бензольного кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, n представляет собой целое число, равное от 0 до 5, и, предпочтительно, целое число, равное от 1 до 5. Если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
Полученное соединение является соединением, где в приведенной выше общей формуле (2) Rn-Z- представлен описанной выше общей формулой (4),
где R является заместителем в составе бензольного кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, n представляет собой целое число, равное от 0 до 5, и, предпочтительно, целое число, равное от 1 до 5. Если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
Конкретные примеры таких исходных соединений включают 2-цианокоричную кислоту, 3-цианокоричную кислоту, 4-цианокоричную кислоту, 2-гидроксикоричную кислоту, 3-гидроксикоричную кислоту, 4-гидроксикоричную кислоту, 3,4-дигидроксикоричную кислоту, 2-нитрокоричную кислоту, 3-нитрокоричную кислоту, 4-нитрокоричную кислоту, 2-карбоксикоричную кислоту, 3-карбоксикоричную кислоту, 4-карбоксикоричную кислоту, 2-аминокоричную кислоту, 3-аминокоричную кислоту, 4-аминокоричную кислоту, 2-хлоркоричную кислоту, 3-хлоркоричную кислоту, 4-хлоркоричную кислоту, 2-фторкоричную кислоту, 3-фторкоричную кислоту, 4-фторкоричную кислоту, 2-бромкоричную кислоту, 3-бромкоричную кислоту, 4-бромкоричную кислоту, 2-иодкоричную кислоту, 3-иодкоричную кислоту, 4-иодкоричную кислоту, 2-метилкоричную кислоту, 3-метилкоричную кислоту, 4-метилкоричную кислоту, 2-метоксикоричную кислоту, 3-метоксикоричную кислоту, 4-метоксикоричную кислоту, 4-изопропилкоричную кислоту, 4-третбутил коричную кислоту, 4-метокси-3-метилкоричную кислоту и т.д.
Если используют фермент, выделенный из Lithospermum erythrorhizon, предпочтительные исходные соединения представляют собой 2-цианокоричную кислоту, 4-цианокоричную кислоту, 3-гидроксикоричную кислоту, 4-гидроксикоричную кислоту и 3,4-дигидроксикоричную кислоту. Если используют эти исходные вещества, можно получить 2-циано-L-фенилаланин, 4-циано-L-фенилаланин, 3-гидрокси-L-фенилаланин (метатирозин), 4-гидрокси-L-фенилаланин (тирозин) и 3,4-дигидрокси-L-фенилаланин (DOPA) соответственно. В настоящем изобретении производные коричной кислоты также включают коричную кислоту, а соответствующие производные фенилаланина также включают фенилаланин.
В особенности, соединение, используемое в настоящем изобретении в качестве исходного вещества, представляет собой соединение, где в приведенной выше общей формуле (1) Rn-Z- представлено следующей общей формулой (4):
где
Х представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 3, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
Полученное соединение представляет собой соединение, где в приведенной выше общей формуле (2) Rn-Z- представлено описанной выше общей формулой (4), где
Х представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 3, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
В соединении, используемом в настоящем изобретении в качестве исходного вещества, представленном описанной выше общей формулой (1), Rn-Z представлено следующей общей формулой (5):
где
Х представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 3, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными, и полученное соединение является соединением, где в приведенной выше общей формуле (2), Rn-Z- представлено описанной выше общей формулой (5),
где
X представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 3, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
Конкретные примеры подобных исходных веществ включают 2-фуранакриловую кислоту, 3-фуранакриловую кислоту, 2-тиенилакриловую кислоту, 3-тиенилакриловую кислоту, 2-пирролилакриловую кислоту, 3-пирролилакриловую кислоту и т.д.
Если используют фермент, выделенный из Lithospermum erythrorhizon, предпочтительные используемые исходные вещества представляют собой 2-фуранакриловую кислоту, 3-фуранакриловую кислоту, 2-тиенилакриловую кислоту, 3-тиенилакриловую кислоту, 2-пирролилакриловую кислоту и 3-пирролилакриловую кислоту. Если используют эти исходные вещества, можно получить альфа-амино-2-фуранпропионовую кислоту, альфа-амино-3-фуранпропионовую кислоту, альфа-амино-2-тиенилпропионовую кислоту, альфа-амино-3-тиенилпропионовую кислоту, альфа-амино-2-пирролпропионовую кислоту, и альфа-амино-3-пирролпропионовую кислоту соответственно.
Способом по настоящему изобретению можно эффективно получать L-аминокислоты, обладающие высокой степенью оптической чистоты путем одностадийной реакции, используя в качестве субстрата производные акриловой кислоты, которые можно подходящим образом получить при помощи органического синтеза. Полученные таким образом L-аминокислоты используют в качестве промежуточных продуктов для синтеза тонких органических соединений, таких как лекарственные вещества и агрохимикаты, где требуется высокая степень оптической чистоты.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение далее будет описано более конкретно при помощи следующих примеров. Эти примеры приведены только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Следует отметить, что в следующих примерах и сравнительных примерах вместо свободных кислот в качестве исходных веществ могут использоваться их соли или сложные эфиры. А также "1 единица" определяется, как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль коричной кислоты в минуту при 30°С в присутствии 0.1М натрий-боратного буфера (рН 8.5) и 10мМ L-фенилаланина в качестве субстрата.
Количество ферментного белка определяют с использованием такого стандарта, как бычий сывороточный альбумин, при помощи биуретового метода, а специфическую активность фермента выражают в "единицах/мг белка". Идентификацию производных акриловой кислоты и аминокислот осуществляли при помощи 1H-ЯМР и 13С-ЯМР и путем анализа реакционного раствора при помощи ВЭЖХ, а также сравнения интенсивности УФ поглощения со стандартом.
Отделение и детекцию полученных производных акриловой кислоты проводили в следующих условиях анализа.
Условия проведения анализа обращенно-фазовой ВЭЖХ Колонка: Shodex (товарный знак, зарегистрированный Showa Denko К.К.), RSpak NN-614 (производитель Showa Denko К.К.)
Температура колонки: 40°С
Элюент: ацетонитрил/вода/50 мМ раствор Н2PO4-КН2PO4 (рН-3)=20/70/10
Скорость потока: 1.0 мл/мин
Детекция: УФ-поглощение при 210 нм
Анализ оптической чистоты полученной аминокислоты проводили при помощи ВЭЖХ с оптическим разрешением в следующих условиях.
Условия проведения анализа ВЭЖХ с оптическим разрешением
Колонка: Shodex (товарный знак, зарегистрированный Showa Denko К.К.), ORpak CRX-853 (производитель Showa Denko К.К.)
Температура колонки: комнатная температура (22°С)
Элюент: ацетонитрил/вода=15/85 2.5 мМ CuSO4
Скорость потока: 1.0 мл/мин
Детекция: УФ-поглощение при 256 нм
Пример 1: Реакция под действием культуры клеток (Petroselinum hortense)
Состав среды А показан в Таблице 1.
| [Таблица 1] | |
| Ингредиенты | мг/л |
| Гидрофосфат натрия | 150 |
| Нитрат калия | 3000 |
| Сульфат аммония | 134 |
| Гептагидрат сульфата магния | 500 |
| Дигидрат хлорида кальция | 150 |
| Гептагидрат сульфата железа (II) | 15 |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота | 15 |
| Никотиновая кислота | 1 |
| Гидрохлорид тиамина | 10 |
| Гидрохлорид пиридоксина | 1 |
| М-инозит | 100 |
| Гидрат сульфата марганца | 10 |
| Борная кислота | 3 |
| Гептагидрат сульфата цинка | 2 |
| Дигидрат молибдата натрия | 0.25 |
| Сульфат меди (II) | 0.025 |
| Гексагидрат хлорида кобальта | 0.025 |
| Иодид калия | 0.75 |
| Сахароза | 20000 |
| 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) | 2 |
| pH=5.5 |
Десять литров среды А, имеющей описанный выше состав, разлили порциями по колбам Эрленмейера, а затем инокулировали во все среды суспензию культуры клеток петрушки (Petroselinum hortense), которую предварительно культивировали в той же самой среде при 27°С в темноте с аэрацией (5-я генерация субкультуры), с последующим встряхиванием культуры при 27°С в темноте с аэрацией при 200 об./мин(оборотов в минуту) в течение 10 дней. Затем продолжали культивирование в течение 24 часов под воздействием света флуоресцентной лампы. Полученный культуральный раствор подвергли вакуумной фильтрации на стекловолоконном фильтре с получением около 1.6 кг культуры клеток, содержащих фенилаланиновую аммиак-лиазу. Активность составила 0.0051 единиц/г по массе свежих клеток.
Два грамма полученной культуры клеток суспендировали в 10 мл 2М раствора аммиака/карбоната аммония (рН 10) (который получали путем корректировки значения рН за счет смешивания 2М аммиачной воды и 2М раствора карбоната аммония), содержащего 0.1% различных производных акриловой кислоты, и проводили реакцию при перемешивании при 30°С в течение 24 часов. В Таблице 2 показаны продукты, которые были получены в результате каждой из реакций, их концентрация и оптическая чистота.
Сравнительный пример 1: Реакция под действием фермента, выделенного из микроорганизма
Реакцию проводили в тех же условиях, что и в Примере 1, за исключением того, что вместо культуры клеток, как в Примере 1, добавляли 0.025 мг коммерчески доступной фенилаланиновой аммиак-лиазы, выделенной из Rhodotorula glutinis (Sigma), обладающей специфической активностью 0.44 единиц/мг. Полученные продукты, их концентрация и оптическая чистота показаны в Таблице 2.
| [Таблица 2] | ||||||
| Субстраты | Коричная кислота | 3- гидрокси- коричная кислота | 3,4- дигидроксикоричная кислота | 2- цианокоричная кислота | 4-циано- коричная кислота | |
| Продукты | L- фенил-аланин | Метатирозин | L-DOPA | L-2-циано-фенил- аланин | L-4-циано-фенил- аланин | |
| Концентрация продукта (мг/л) | Пример 1 | 210 | 180 | 170 | 240 | 250 |
| Сравнительный пример 1 | 190 | 50 | 30 | 5 | Не определяли | |
| Оптическая чистота продукта (%) | Пример 1 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 |
| Сравнительный пример 1 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | - |
Пример 2: Реакция под действием продукта обработки культуры клеток (Petroselinum hortense)
Культуру клеток Petroselinum hortense (1.5 кг), полученную при помощи такой же методики культивирования, что и в Примере 1, суспендировали в 3 л 0.1М натрий-боратного буферного раствора (рН 8.8) и подвергали полученную суспензию ультразвуковой гомогенизации на льду в течение 20 минут. Нерастворимую фракцию отделяли от полученного продукта обработки при помощи центрифугирования при 10000 об./мин в течение 15 минут и собирали супернатант.
Постепенно добавили к полученному экстракту размельченный сульфат аммония на льду в течение 30 минут при перемешивании, таким образом, чтобы концентрация составила 40% насыщения, а затем раствор подвергли центрифугированию при 10000 об./мин в течение 15 минут с целью удаления осадка. Аналогично, добавили к полученному супернатанту сульфат аммония таким образом, чтобы концентрация составила 55% насыщения, а затем раствор подвергли центрифугированию при 10000 об./мин в течение 15 минут, чтобы собрать осадок. Полученный осадок растворили в 150 мл 0.05М Трис-HCl буферного раствора, а затем подвергли диализу при 4°С в течение 24 часов против 100-кратного объема того же самого буферного раствора. После диализа получили 170 мл раствора, представляющего собой раствор сырого ферментного экстракта фенилаланиновой аммиак-лиазы. Общее количество белка составило 620 мг, а специфическая активность составила 0.0205 ед./мг.
К смеси 1 мл полученного раствора сырого экстракта и 9 мл 2М раствора аммиака/карбоната аммония (рН 10) (который получали путем корректировки значения рН за счет смешивания 2М аммиачной воды и 2М раствора карбоната аммония) добавляли различные производные коричной кислоты таким образом, чтобы смешанный раствор содержал 0.5% указанного производного, а затем проводили реакцию при перемешивании при 30°С в течение 24 часов. В Таблице 3 показаны продукты, которые были получены в результате каждой из реакций, их концентрация и оптическая чистота.
Сравнительный пример 2: Реакция под действием фермента, выделенного из микроорганизма
Реакцию проводили в тех же условиях, что и в Примере 2, за исключением того, что вместо раствора сырого ферментного экстракта, как в Примере 2, добавляли 0.175 мг коммерчески доступной фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из Rhodotorula graminis (Sigma), обладающей специфической активностью 0.44 единиц/мг. Полученные продукты, их концентрация и оптическая чистота показаны в Таблице 3.
| [Таблица 3] | ||||||
| Субстраты | Коричная кислота | 3-гидрокси-коричная кислота | 3,4-дигид-рокси-корич-ная кислота | 2-циано-коричная кислота | 4-циано-коричная кислота | |
| Продукты | L-фенил-аланин | Метатирозин | L-DOPA | L-2-циано-фенил-аланин | L-4-циано-фенил-аланин | |
| Концентрация продукта (мг/л) | Пример 2 | 1920 | 1600 | 1500 | 2010 | 2040 |
| Сравнительный пример 2 | 1680 | 470 | 200 | 40 | Не определяли | |
| Оптическая чистота продукта (%) | Пример 2 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 |
| Сравнительный пример 2 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | - |
Пример 3: Реакция под действием продукта обработки тканей растения (Cucumis sativus L.; огурец)
Семена огурца (Cucumis sativus L.) оставили для прорастания на чашке Петри, на которую был помещен фильтр, смоченный водой, при 25°С в течение 72 часов. Затем их подвергли воздействию света флуоресцентной лампы в течение 4 часов, после чего собрали около 50 г гипокотилей.
Полученные гипокотильные ткани гомогенизировали в ступке на льду, а затем общее количество гомогенизированного продукта суспендировали в 100 мл 0.1М натрий-боратного буферного раствора (рН 8.8), содержащего 1 мМ глутатиона, с последующей ультразвуковой гомогенизацией в течение 20 минут. Нерастворимую фракцию отделяли от полученного продукта обработки при помощи центрифугирования при 10000 об./мин в течение 15 минут и собирали супернатант.
Постепенно добавили к полученному экстракту размельченный сульфат аммония на льду в течение 30 минут при перемешивании, таким образом, чтобы концентрация составила 30% насыщения, а затем раствор подвергли центрифугированию при 10000 об./мин в течение 15 минут с целью удаления осадка. Аналогично, добавили к полученному супернатанту сульфат аммония таким образом, чтобы концентрация составила 70% насыщения, а затем раствор подвергли центрифугированию при 10000 об./мин в течение 15 минут, чтобы собрать осадок. Полученный осадок растворили в 20 мл 0.05М Трис-HCl буферного раствора, а затем подвергли диализу при 4°С в течение 24 часов против 100-кратного объема того же самого буферного раствора. После диализа получили 2.2 мл раствора, представляющего собой раствор сырого ферментного экстракта. Общее количество белка составило 50.7 мг, а специфическая активность составила 0.0307 ед./мг.
К смеси 0.1 мл полученного раствора сырого экстракта и 9.9 мл 2М раствора аммиака/карбоната аммония (рН 10) (который получали путем корректировки значения рН за счет смешивания 2М аммиачной воды и 2М раствора карбоната аммония) добавляли различные производные коричной кислоты таким образом, чтобы смешанный раствор содержал 0.5% указанного производного, а затем проводили реакцию при перемешивании при 30°С в течение 24 часов. В Таблице 4 показаны продукты, которые были получены в результате каждой из реакций, их концентрация и оптическая чистота.
Сравнительный пример 3: Реакция под действием фермента, выделенного из микроорганизма
В качестве сравнительного примера реакцию проводили в тех же условиях, что и в Примере 3, за исключением того, что вместо раствора сырого ферментного экстракта, как в Примере 3, добавляли 0.16 мг коммерчески доступной фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из Rhodotorula graminis (Sigma), обладающей специфической активностью 0.44 единиц/мг. Полученные продукты, их концентрация и оптическая чистота показаны в Таблице 4.
| [Таблица 4] | ||||||
| Субстраты | Коричная кислота | 3- гидроксикоричная кислота | 3,4- дигидрокси коричная кислота | 2- цианокоричная кислота | 4-циано- коричная кислота | |
| Продукты | L- фенил- аланин | Метатирозин | L-DOPA | L-2- циано- фенил- аланин | L-4- циано- фенил- аланин | |
| Концентрация продукта (мг/л) | Пример 3 | 1480 | 1300 | 1280 | 1940 | 2040 |
| Сравнительный пример 3 | 1500 | 400 | 180 | 40 | Не опреде ляли | |
| Оптическая чистота продукта (%) | Пример 3 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 |
| Сравнительный пример 3 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | - |
Пример 4: Культивирование трансформанта и реакция с трансформантом
Клетки культивировали в течение 24 часов на чашках с агаром, приготовленных путем смешивания 2% агара с питательной средой L (1% полипептона, 0.5% NaCl, 0.5% дрожжевого экстракта, рН 7.0) и разравнивания смеси. После этого клетки в количестве микробиологической петли продолжали культивировать в от 5 мл до 100 мл питательной среды L при 30°С в течение 16 часов с получением трансформанта, используемого для реакции. После культивирования клетки собирали и промывали равными объемами физиологического солевого раствора и культурального раствора. Затем ткани клеток суспендировали в реакционном растворе, объем которого был равен половине объема культурального раствора (4М аммиака/карбоната аммония (рН 10.3)), после чего добавляли туда субстрат до конечной концентрации 0.2% (2000 мг/л) и далее проводили реакцию при 30°С при перемешивании. Отбирали аликвоту реакционного раствора через определенное число часов, отделяли клетки путем центрифугирования и анализировали супернатант при помощи ВЭЖХ, чтобы определить количество продукта.
Пример 5: Получение кДНК библиотеки и обнаружение pal гена
Культивирование клеток мурасаки (Lithospermum erythrorhizon), получение кДНК библиотеки и обнаружение pal гена подробно описаны в работе Yazaki et al. (Plant Cell Physiol. (1995), 36, 1319-1329; Biosci. Biotech. Blochem. (1997), 61(12), 1995-2003), а получение кДНК библиотеки чая (Camellia sinensis) и обнаружение pal гена подробно описаны в работе Matsumoto et al. (Theor. Appl. Genet. (1994), 89(6), 671-675). Используя известную информацию и внеся некоторые модификации в методику, авторы настоящего изобретения получили pal ген из каждого растения. Разработанный подход можно применить к получению pal генов всех растений, если установлена их нуклеотидная последовательность. Помимо культур клеток, в качестве материала для получения мРНК можно использовать ткани растения в условиях, в которых экспрессируется pal ген.
(Получение кДНК библиотеки Lithospermum erythrorhizon)
Клетки, полученные из тканей Lithospermum erythrorhizon, культивировали в среде LS (обычная культуральная среда, содержащая 10 мкМ индолуксусной кислоты и 0.1 мкМ кинетина) при 25°С в течение 1 недели. Затем полученную культуру клеток переносили в среду М9 (шиконинования культуральная среда, содержащая 10 мкМ индолуксусной кислоты и 0.1 мкМ кинетина), и далее культивировали в течение 2 дней. С использованием набора для очистки мРНК QuickPrep (Amersham Pharmacia Biotech) из полученной культуры клеток извлекали мРНК, следуя стандартному способу, описанному в инструкции к набору. После этого, используя набора для синтеза кДНК First-Strand (Amersham Pharmacia Biotech) и 12-18 олиго(дТ) праймеры, проводили RT-ПЦР с полученной мРНК в качестве матрицы. Образовавшаяся смесь фрагментов ДНК представляла собой кДНК библиотеку, которую использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации гена.
(Получение кДНК библиотеки Camellia sinensis)
Фрагменты ДНК были получены из замороженных молодых листьев Camellia sinensis (собранных после полудня в хороший солнечный день) при помощи RT-ПЦР тем же самым способом, который описан выше для Lithospermum erythrorhizon, и полученную смесь фрагментов ДНК, представлявшую собой кДНК библиотеку, использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации гена.
(Обнаружение pal гена)
В составе Lithospermum erythrorhizon присутствует два типа pal генов (здесь и далее обозначенных как "LePAL1" и "LePAL2"). Структура этих двух типов генов уже была опубликована Yazaki et al. в таких базах данных, как GenBank и EMBL, как SEQ ID NOS: D83075 и D83076 соответственно. Структура pal гена, присутствующего в Camellia sinensis (здесь и далее обозначенного как "CAMPAL") уже была опубликована Matsumoto et al. в указанных выше базах данных как SEQ ID NO: D26596. На основе последовательностей 5'-конца и 3'-конца этих pal генов были получены специфичные для них праймеры. В данном случае праймеры были сконструированы таким образом, чтобы они содержали на обоих концах подходящие сайты рестрикции, чтобы полученный фрагмент ДНК можно было лигировать в плазмидный вектор.
В результате поиска подходящих ферментов рестрикции (которые не имеют сайтов расщепления в последовательности pal гена) среди подобных ферментов, которые часто используют для сайтов мультиклонирования различных типов плазмидных векторов, было установлено, что для LePAL2 использовали сайт EcoRI на 5'-концевом участке и сайт SalI на 3'-концевом участке, а для CAMPAL использовали сайт Smal на 5'-концевом участке и сайт HindI II на 3'-концевом участке. Поскольку не было обнаружено подходящих сайтов для 5'-концевого участка LePAL1, на 5'-конце использовали сайт EcoRV и образующийся после расщепления тупой конец был сконструирован таким образом, чтобы его можно было лигировать с тупым концом сайта Smal вектора. Что касается 3'-концевого участка LePALl, то, как и в случае LePAL2, здесь использовали сайт Sall.
Последовательности праймеров:
(LePALl)
[Последовательность 1]
5'-конец (с сайтом EcoRV): Олигонуклеотидный 23 - мер, имеющий последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 1
[Последовательность 2]
3'-конец (с сайтом Sall): Олигонуклеотидный 23 - мер, имеющий последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 2
(LePAL2)
[Последовательность 3]
5'-конец (с сайтом EcoRI): Олигонуклеотидный 25 - мер, имеющий последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 3
[Последовательность 4]
3'-конец (с сайтом SalI): Олигонуклеотидный 23 - мер имеющий последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 4
(CAMPAL)
[Последовательность 5]
5'-конец (с сайтом SmaI): Олигонуклеотидный 23 - мер имеющий последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 5
[Последовательность 6]
3'-конец (с сайтом HindIII): Олигонуклеотидный 23 - мер имеющий последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 6
Состав реакционного раствора:
| кДНК матрица | от 0.5 до 2 мкг |
| праймеры | по 100 пмоль каждого |
| растворы дНТФ | по 1 мМ каждого |
| 10 × реакционный буфер | 10 мкл |
| ExTaq ДНК-полимераза | |
| (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) | 2.5 единицы |
Всего: 50 мкл
Условия реакции:
| Тепловая денатурация | 94°С 30 секунд |
| Отжиг | 55°С 60 секунд |
| Элонгация | 72°С 120 секунд |
| Число циклов | 24 цикла |
При проведении амплификации фрагментов генов в описанных выше условиях, в процессе которой несколько раз изменяли количество кДНК матрицы, с почти абсолютной специфичностью амплифицировался фрагмент длиной около 2.1 тысяч оснований каждого из LePAL1, LePAL2 и CAMPAL, что было рассчитано теоретически. Амплифицированные таким образом фрагменты каждого из LePAL1, LePAL2 и CAMPAL подвергли электрофорезу на агарозном геле, а затем экстрагировали, выделили и очистили. После этого, когда при помощи праймеров, использованных для амплификации, был проведен анализ нуклеотидной последовательности, было подтверждено, что полученная информация о нуклеотидной последовательности соответствовала последовательностям LePAL1, LePAL2 и CAMPAL.
Пример 6: Получение трансформанта, проявляющего активность PAL.
Полученные фрагменты генов подвергли электрофорезу на агарозном геле, а затем экстрагировали и выделили. Полученные таким образом фрагменты LePAL1, LePAL2 и CAMPAL с сайтами рестрикции были разрезаны при помощи ферментов рестрикции EcoRV и Sail, EcoRI и SalI, и SmaI и HindIII соответственно. После этого снова повторили операции электрофореза на агарозном геле, экстракции и выделения. Эти фрагменты лигировали в pUC18, которая была получена путем разрезания при помощи EcoRV и SalI, EcoRI и SalI, и Smal и HindIII, а затем подвергли электрофорезу на агарозном геле, экстрагировали и выделили (ФИГ.1 и 2).
Трансформанты, полученные путем трансформации Escherichia coli JM109 этими плазмидами, нанесли на L чашки с агаром, содержащими 0.1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и 0.1% X-Gal, а затем клультивировали при 37°С в течение 24 часов. Из образовавшихся колоний выбрали несколько колоний белого цвета и выделили из них плазмиды с целью исследования картины ферментативной рестрикции. В результате получили множество трансформантов, содержащих требуемые плазмиды pULePAL1, pULePAL2 и pUCAMPAL.
Из всех типов полученных трансформантов произвольно выбрали по три штамма. При помощи метода, описанного в Примере 4, реплики всех штаммов (2 вида × 3 штамма × 2 линии) культивировали в 5 мл питательной среды L. Через двенадцать часов после начала культивирования добавили к одной из 2 линий изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) таким образом, чтобы концентрация ИПТГ в культуральном растворе составила 0.1 мМ, а затем продолжали культивирование еще в течение 4 часов. Полученные растворы культур раздельно подвергли центрифугированию с целью сбора клеток и с полученными клетками провели реакцию согласно способу, описанному в Примере 4. Через 10 часов протекания реакции полученные продукты инентифицировали при помощи ВЭЖХ. Как показано в Таблице 5, независимо от того, присутствовал или отсутствовал изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ), все трансформанты проявляли активность фенилаланиновой аммиак-лиазы.
| [Таблица 5] | ||
| Активность в отсутствие индуктора, ИПТГ (мг/л) | Активность в присутствии индуктора, ИПТГ (мг/л) | |
| Escherichia coli JM109 | - | - |
| pULePAL1 трансформант | 1960 | 1470 |
| pULePAL2 трансформант | 1990 | 1830 |
| pUCAMPAL трансформант | 1860 | 1520 |
Пример 7: Получение производных фенилаланина с использованием трансформанта
По одному штамму каждого типа трансформантов, содержащих pULePAL1, pULePAL2 и pUCAMPAL, полученных в Примере 6, культивировали в 100 мл питательной среды L, содержащей 100 м.д. ампициллина, при помощи способа, описанного в Примере 4. Полученный культуральный раствор переносили в 5 л вибрирующий ферментер, который содержал 2 л питательной среды L, содержащей 100 м.д. ампициллина, а затем осуществляли перемешивание культуры при 30°С и 800 об./мин с аэрацией 1 мл/мин в течение от 10 до 12 часов.
Клетки, полученные путем центрифугирования культурального раствора от фазы позднего логарифмического роста до ранней стационарной фазы, ресуспендировали в 1 л 4М раствора аммиака/карбоната аммония (рН 10.3) и добавляли туда 20 г субстрата (см. Таблицу 6), после чего проводили реакцию при 30°С при перемешивании при 800 об./мин. Каждый час отбирали аликвоту реакционного раствора и идентифицировали продукт, образовавшийся в реакционном растворе (см. Таблицу 6), при помощи ВЭЖХ. Пока субстрат непрерывно добавляли таким образом, чтобы поддерживать его концентрацию, равной около 2%, реакция продолжалась. Спустя около 10 часов в реакционном растворе накопился продукт в концентрации от 1% до 3% (Таблица 6).
По окончании реакции реакционный раствор подвергли концентрации в вакууме с использованием роторного испарителя, чтобы удалить избыточное количество аммиака, а затем добавили в него концентрированную соляную кислоту, чтобы довести значение рН до 1 с целью осаждения оставшегося субстрата. Раствор отфильтровали, а затем сконцентрировали супернатант на роторном испарителе. Закристаллизовавшийся продукт собрали с помощью фильтрации и промыли разбавленной соляной кислотой (0.1 N) с последующей вакуумной сушкой.
Чистота этого высушенного образца составляла 99% или более. Определяемой примесью являлось производное коричной кислоты или производное акриловой кислоты, используемое с качестве субстрата в любой системе. Когда при помощи описанного выше метода определяли оптическую чистоту этих производных, для обеих производных обнаруживали только L-форму, а количество D формы было ниже пределов чувствительности метода.
| [Таблица 6] | |||||||
| Субстраты | Коричная кислота | 3-гидрокси-коричная кислота | 3,4-дигидрокси-коричная кислота | 2-циано-коричная кислота | 4-циано-коричная кислота | 2-фуран-акрило-вая кислота | |
| Продукты | L-фенил-аланин | Метатирозин | L-DOPA | L-2-циано-фенилаланин | L-4-циано-фенилаланин | α-амино-2-фуран-пропионовая кислота | |
| Концентрация продукта (мг/л) | pULePAL1 трансформант | 19200 | 12100 | 12000 | 20100 | 20400 | 11300 |
| pULePAL2 трансформант | 16800 | 13000 | 9800 | 21700 | 24900 | 11000 | |
| pUCAMPAL трансформант | 15800 | 14700 | 10500 | 18600 | 22600 | 12500 | |
| Оптическая чистота продукта (%) | pULePAL1 трансформант | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 |
| pULePAL2 трансформант | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | |
| pUCAMPAL трансформант | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 | >99.9 |
В настоящих примерах использовали множество фенилаланиновых аммиак-лиаз, имеющих различные аминокислотные последовательности, чтобы продемонстрировать, что фенилаланиновые аммиак-лиазы, выделенные из растений, как правило, эффективно действуют в способах по настоящему изобретению (аминокислотная последовательность Cucumis sativus L. неизвестна). Гомология аминокислотных последовательностей показана на ФИГ.3. Было обнаружено, что любой из этих ферментов достаточно эффективен в настоящем изобретении, хотя их аминокислотные последовательности отличаются друг от друга на 10-20%, таким образом эти ферменты обладают значительно большей способностью превращения субстратов с образованием производных фенилаланина, чем такие же ферменты, выделенные из микроорганизмов.
Согласно настоящему изобретению при использовании фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, из производного акриловой кислоты в качестве исходного вещества можно доступно и эффективно получить соответствующую аминокислоту. В частности, можно легко и эффективно получить производное L-фенилаланина, содержащее различные заместители в составе фенильной группы.
L-аминокислоты, полученные способом по настоящему изобретению, можно использовать в качестве хиральных строительных блоков для получения широкого ряда биологически активных органических соединений, таких как фармацевтические или агрохимические промежуточные продукты, а в основном их используют как фармацевтические промежуточные продукты.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> SHOWA DENKO К. К.
<120> Биологическое получение производных фенилаланина
<130> Праймеры для PAL
<140>
<141>
<160> 6
<170> Patentin Ver. 2. 1
<210> 1
<211> 23
<212> ДНК
<213> Lithospermum erythrorhizon
<400> 1
aagatatcat ggaaaccata gtg
<210> 2
<211> 23
<212> ДНК
<213> Lithospermum erythrorhizon
<400> 2
ttgtcgactt aacagattgg aag
<210> 3
<211> 25
<212> ДНК
<213> Lithospermum erythrorhizon
<400> 3
aagaattcat ggaaaatgga aatgg
<210> 4
<211> 23
<212> ДНК
<213> Lithospermum erythrorhizon
<400> 4
ttgtcgacta acatattgga aga
<210> 5
<211> 23
<212> ДНК
<213> Camellia sinensis
<400> 5
aacccgggat ggatagtacc acc
<210> 6
<211> 23
<212> ДНК
<213> Camellia sinensis
<400> 6
ttaagcttct aacagatagg aag
1. Способ получения L-аминокислоты, включающий воздействие фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящей из растения, в присутствии аммиака на производное акриловой кислоты, представленное следующей общей формулой (1):
где Z представляет собой ароматическое кольцо, которое может содержать гетероатом,
R представляет собой заместитель в составе указанного ароматического кольца и
n представляет собой целое число, равное 0 или более, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными;
причем указанная L-аминокислота представлена следующей общей формулой (2):
где Z представляет собой ароматическое кольцо, которое может содержать гетероатом,
R представляет собой заместитель в составе указанного ароматического кольца,
n представляет собой целое число, равное 0 или более, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
2. Способ получения L-аминокислоты по п.1, отличающийся тем, что Rn-Z- представлено следующей общей формулой (3):
где R является заместителем в составе бензольного кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число, равное от 0 до 5, и предпочтительно целое число от 1 до 5, если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
3. Способ получения L-аминокислоты по п.1, отличающийся тем, что Rn-Z-представлено следующей общей формулой (4):
где Х представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и n представляет собой целое число от 0 до 3 и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
4. Способ получения L-аминокислоты по п.1, отличающийся тем, что Rn-Z-представлено следующей общей формулой (5):
где Х представляет собой S, О, NH или NR1,
R1 представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
R является заместителем в составе гетероциклического кольца и представляет собой цианогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу, амидную группу, атом фтора, атом хлора, атом брома, аминогруппу, нитрогруппу, гидроксиметильную группу или алкильную или алкоксигруппу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и
n представляет собой целое число 0 до 3, и если n равно 2 или более, все R могут быть одинаковыми или различными.
5. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.1-4, включающий использование композиции, полученной путем обработки тканей растения, содержащих фенилаланиновую аммиак-лиазу.
6. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.1-4, включающий использование культуры клеток растения, содержащих фенилаланиновую аммиак-лиазу, и/или композиции, полученной путем ее обработки.
7. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.1-4, включающий обеспечение экспрессии в растении гена фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящего из растения, и использование трансформированных культур растения или продукта обработки культур растения.
8. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.1-4, включающий обеспечение экспрессии в микроорганизме гена фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящего из растения, и использование трансформированной культуры микроорганизма, продукта ее обработки или фермента, полученного из этой культуры.
9. Способ получения L-аминокислоты по п.8, отличающийся тем, что ген фенилаланиновой аммиак-лиазы, выделенный из растения, представляет собой ген, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую 70% или более гомологии с аминокислотной последовательностью, выведенной из нуклеотидной последовательности pa12 гена, выделенного из Lithospermum erythrorhizon.
10. Способ получения L-аминокислоты по п.8, отличающийся тем, что ген фенилаланиновой аммиак-лиазы, происходящий из растения, представляет собой ген, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более гомологии с аминокислотной последовательностью, выведенной из нуклеотидной последовательности pa12 гена, выделенного из Lithospermum erythrorhizon.
11. Способ получения L-аминокислоты по п.8, отличающийся тем, что растение, из которого происходит ген фенилаланиновой аммиак-лиазы, представляет собой Lithospermum и/или Camellia.
12. Способ получения L-аминокислоты по п.11, отличающийся тем, что микроорганизмом является бактерия, дрожжи и/или нитевидный грибок.
13. Способ получения L-аминокислоты по п.12, отличающийся тем, что бактерией является Escherichia coli.
14. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой гидроксильную группу.
15. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой цианогруппу.
16. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой карбоксильную группу.
17. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой амидную группу.
18. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой галоген.
19. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой аминогруппу.
20. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой нитрогруппу.
21. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой гидроксиметильную группу.
22. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (3) по меньшей мере один из заместителей R представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода.
23. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.1 и 13, отличающийся тем, что R является одной из цианогруппы, гидроксильной группы, нитрогруппы и карбоксильной группы, и n равно 1.
24. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.2-4 и 13, отличающийся тем, что L-аминокислота представляет собой L-фенилаланин.
25. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.3-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (4) Х представляет собой О.
26. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.3-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (4) Х представляет собой S.
27. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.3-4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (4) Х представляет собой NH.
28. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (5) Х представляет собой О.
29. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (5) Х представляет собой S.
30. Способ получения L-аминокислоты по любому из пп.4 и 13, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (5) Х представляет собой NH.
Приоритет:
Пп.2 и 5-15 имеют приоритет по обеим заявкам.
25.06.2001 - пп.2, 5-15, 18 в части, где галоген является фтором, п.23 в части цианогруппы и гидроксильной группы, п.24.
30.11.2001 - пп.1-22, п.23 в части цианогруппы и гидроксильной группы, пп.24-30.
