Комбинированная вакцина на основе поверхностного антигена вируса гепатита в, способ ее получения и способ предупреждения инфекции гепатита в у человека
Группа изобретений относится к медицине, а именно к созданию и применению комбинированных вакцин для профилактики и лечения инфекций, в первую очередь, гепатита В. Комбинированная вакцина содержит адсорбированный на фосфате алюминия поверхностный антиген вируса гепатита В, смешанный с адсорбированными на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия антигенами других патогенов в количестве n=3-4, выбранными из дифтерии, столбняка, коклюша и Haemophilus influenzae b. Причем по крайней мере один из n антигенов других патогенов адсорбирован на гидроокиси алюминия. Фосфат алюминия придает устойчивость поверхностному антигену гепатита В в поливалентных составах вакцин. Поливалентные вакцины стабильны и имеют высокие иммунологические характеристики при введении детям. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 16 табл.
Изобретение касается новых вакцин, способов их получения и их использования для лечения. В частности, настоящее изобретение касается новых комбинированных вакцин, включающих противовирусный компонент гепатита В для лечения инфекций гепатита В. Известно, что инфекции, вызванные вирусом гепатита В, представляют собой весьма серьезную проблему. Существуют вакцины, используемые для массовой иммунизации, например вакцина типа Engerix-B' /Смитклайн Бичам Байолоджикалс/. Engerix-B' содержит в качестве антигенного компонента гепатита В поверхностный антиген гепатита В (HBSAg=НВ=ГВ), получаемый в соответствии с методами генной инженерии.
Однако в ряде случаев возникает необходимость вводить вакцину гепатита В одновременно с другими вакцинами, что может носить форму многократных инъекций. Проблемы, связанные с многократными инъекциями, влекут за собой усложнение процедуры введения лекарственного средства и большой общий объем инъекций.
Поэтому возникает необходимость в комбинированной вакцине, включающей антиген гепатита В в сочетании с другими антигенами. Другие антигены, в частности, представляют собой антигены, способные в составах вакцин предотвращать или предупреждать гепатит А /ГА=НА/, дифтерию /Д=D/, столбняк /С=Т/, цельноклеточный коклюш /Кц=Pw/, бесклеточный коклюш /Кб=Ка=kb=Pa/, Haemophilus influenzae b /Гэ=Hib/ и полиомиелит (polio) /П/.
При получении вакцины в качестве адъюванта широко используется гидроокись алюминия /АН=ГА=ОА/. Например, в вакцине типа Engerix-В' поверхностный антиген гепатита В адсорбирован на гидроокиси алюминия. Используют также гидроокись алюминия при получении вакцины гепатита А, а также комбинированных вакцин ДС, ДСКц и ДСКв. Однако при сочетании адсорбированного на гидроокиси алюминия поверхностного антигена гепатита В с другими вакцинами в комбинированных составах происходит существенное снижение иммунной реакции на поверхностный антиген гепатита В, вследствие чего отмечается низкая или несущественная серозащита после вакцинации. Кроме того, устойчивость компонента поверхностного антигена в комбинированных вакцинах невелика.
Для приготовления моновалентной вакцины /HEPACCINE/, выпускаемой Korean Cheil Sugar Co. Ltd. и имеющейся на мировом рынке, используют фосфат алюминия /АР=ФА=ОФ/, адсорбирующий поверхностный антиген гепатита В. Однако нет существенной разницы в отношении иммуногенных характеристик между моновалентной вакциной /Engerix-B'/, содержащей адсорбированный на гидроокиси алюминия поверхностный антиген гепатита В, и моновалентной вакциной, имеющей в своем составе тот же антиген, адсорбированный на фосфате алюминия.
В Европейской патентной заявке ЕР №0339667 предложена бивалентная вакцина, содержащая поверхностный антиген гепатита В и гепатита А, в которой в качестве адъюванта используют гидроокись алюминия или фосфат алюминия. Не существует конкретного указания о необходимости избегать использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта при приготовлении мультивалентной /многофункциональной/ вакцины, включающей поверхностный антиген гепатита В. Более того, ни в описании данной публикации, ни где-либо еще нет данных о бивалентной или мультивалентной вакцине гепатита В, в которой, по меньшей мере, один антиген, но не антиген гепатита В /HbsAg/, адсорбируется на гидроокиси алюминия, а поверхностный антиген гепатита В адсорбируется на фосфате алюминия.
До сих пор не известна стабильная и эффективная многовалентная вакцина, содержащая поверхностный антиген гепатита В.
Целью настоящего изобретения является создание новой эффективной комбинированной вакцины и способ ее получения.
Поставленная цель достигается предложенной комбинированной вакциной, которая содержит адсорбированный на фосфате алюминия поверхностный антиген вируса гепатита В, смешанный с адсорбированными на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия антигенами других патогенов в количестве n=3-4, выбранными из дифтерии, столбняка, коклюша и Haemophilus influenzae b, причем по крайней мере один из n антигенов других патогенов адсорбирован на гидроокиси алюминия.
Преимущество изобретения состоит в том, что не происходит существенного снижения иммуногенности HbsAg, что имеет место в известных комбинированных вакцинах. Избегая использования гидроокиси алюминия для адсорбции компонента поверхностного антигена гепатита В в составах вакцин, можно также придать продукту заметно более высокую стабильность. Другое преимущество изобретения состоит в том, что упомянутые выше проблемы, связанные с множеством инъекций, удается решить или, по крайней мере, значительно смягчить. Представляемые изобретением составы приемлемы для практического введения детям.
Важно, чтобы поверхностный антиген гепатита В адсорбировался на фосфате алюминия. В частности, при клинических исследованиях установлено, что поверхностный антиген гепатита В, адсорбированный на фосфате алюминия, в сочетании с одним или несколькими антигенами, адсорбированными на гидроокиси или фосфате алюминия, в комбинированной вакцине не дает существенного снижения иммуногенных характеристик. К тому же устойчивость адсорбированного на фосфате алюминия поверхностного антигена гепатита В выше, чем при адсорбции указанного антигена на гидроокиси алюминия.
Настоящее изобретение представляет собой комбинированную вакцину, включающую поверхностный антиген гепатита В, адсорбированный на фосфате алюминия, и антигены других патогенов, адсорбированные на фосфате алюминия или гидроокиси алюминия и выбранные из числа антигенов, обеспечивающих иммунитет против одного или более следующих вирусов, а именно: дифтерии, столбняка и коклюша, а также Haemophilus influenzae b.
В составы вакцин, используемых в педиатрии, могут быть включены также другие совместимые антигены.
Используемый здесь термин "бивалентный" относится к вакцинам, включающим комбинацию двух антигенов /в том числе поверхностного антигена гепатита В/. Термин "мультивалентный" относится к вакцинам, содержащая более двух антигенов, например три, четыре или пять антигенов.
Значения терминов "фосфат алюминия" или "гидроокись алюминия", используемые здесь, включают все формы гидроокиси алюминия или фосфата алюминия, приемлемые для использования в вакцинах, содержащих адъюванты.
Например, фосфат алюминия может представлять собой осадок нерастворимого фосфата алюминия /аморфного, полукристаллического или кристаллического/, который можно, но необязательно, получать путем смешивания растворимых солей алюминия и солей фосфорной кислоты. "Гидроокись алюминия" может представлять собой осадок нерастворимой /аморфной, полукристаллической или кристаллической/ гидроокиси алюминия, которую возможно, но не обязательно, получать путем нейтрализации раствора солей алюминия. Практически приемлемыми можно считать различные формы гидроокиси алюминия или алюминийфосфатные гели, доступные коммерчески, например алгидрогель /гидроокись алюминия, 3% суспензии в воде/ и фосфат алюминия, 2% суспензии в соляном растворе, производимые фирмой Суперфос /Ведбек, 2950 Дания/.
Впервые представлена стабильная и эффективная мультивалентная вакцина, включающая поверхностный антиген гепатита В. Кроме того, представлена согласно изобретению стабильная и эффективная вакцина для предупреждения более двух заболеваний, включающая поверхностный антиген гепатита В и, по меньшей мере, три других антигена.
При выборе адъюванта наилучшие результаты получены в случае, когда поверхностный антиген гепатита В адсорбирован на фосфате алюминия и, по меньшей мере, один из других антигенов, но не HBsAg, адсорбирован на гидроокиси алюминия. Однако допускается использование и других приемлемых адъювантов. Например, один из других антигенов, но не HBsAg, может быть адсорбирован на фосфате алюминия.
Предпочтительными устойчивыми комбинациями вакцин по изобретению являются вакцины, содержащие противоинфекционные компоненты:
дифтерии - столбняка - коклюша - гепатита В,
дифтерии - столбняка - гепатита В,
дифтерии - столбняка - коклюша - Haemophilus influenzae b - гепатита В.
Установлено, что для вакцины, содержащей компонент Haemophilus influenzae b, соответствующий антиген можно использовать для немедленного приема при приготовлении вакцины непосредственно перед введением. Таким образом можно приготовить следующие комбинированные вакцины в объеме изобретения, например:
Haemophilus influenzae b - гепатит В,
дифтерия - столбняк - коклюш - Haemophilus influenzae b - гепатит В.
Более специфические виды вакцин согласно изобретению, в частности, представляют собой вакцины, содержащие компоненты дифтерии - столбняка - коклюша /адсорбированных на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия/ - гепатита В /поверхностного антигена гепатита В, адсорбированного на фосфате алюминия/; дифтерии - столбняка /адсорбированных на фосфате или гидроокиси алюминия/ - гепатита В /поверхностного антигена, адсорбированного на фосфате алюминия/.
Под термином "стабильные" вакцины следует понимать в соответствии с предметом изобретения вакцины, которые можно хранить при 37°С в течение одной недели без сколько-нибудь существенного снижения иммуногенности компонента поверхностного антигена гепатита В.
Под термином "эффективные вакцины" имеются ввиду составы вакцин, в которых иммуногенность поверхностного антигена гепатита В в комбинированных вакцинах такова, что средний геометрический титр составляет, по меньшей мере, 200 мМЕ, (предпочтительно 300 мМЕ или более), как установлено на примере детей через месяц после введения третьей дозы вакцины при вакцинировании по соответствующему плану с введением вакцины с интервалом в один месяц.
Кроме того, в настоящем изобретении предложена мультивалентная вакцина, содержащая поверхностный антиген гепатита В и стабилизирующий адъювант, выбранный из числа таких адъювантов, которые обеспечивают хранение вакцины в течение недели при 37°С без сколько-нибудь существенного изменения или снижения иммуногенности компонентов HBsAg.
Предпочтительный вариант мультивалентной вакцины характеризуется, кроме того, повышением значения среднего геометрического титра до 200 мМЕ /через месяц после введения третьей дозы/, предпочтительно 300 мМЕ и более при вакцинировании детей с интервалом в один месяц по соответствующему плану вакцинации.
Используемый здесь термин "соответствующий план вакцинации" подразумевает план, известный каждому специалисту по проведению курса вакцинирования, особенно педиатрических доз. Используется, например, план, рассчитанный на 3, 4 и 5 месяцев. Это, в частности, соответствует, например, комбинированному составу DCK - HBsAg, представляющему собой вакцину в соответствии с предметом изобретения.
HBsAg может быть адсорбирован на соли алюминия, но не на гидроокиси алюминия. В настоящем изобретении для адсорбции HBsAg используется фосфат алюминия. Другие антигены в мультивалентной вакцине могут быть адсорбированы на фосфате алюминия или гидроокиси алюминия /или на том и другом/, причем более перспективной считается адсорбция на гидроокиси алюминия, как показано в примерах, приведенных ниже.
Предпочтителен вариант, когда представляемая изобретением вакцина содержит противококлюшевый компонент.
Приемлемыми являются цельноклеточный коклюшевый компонент, а также бесклеточный компонент вакцины, содержащий частично или высокоочищенный антиген.
Предпочтительно, если комбинированная вакцина гепатита В используется как педиатрическая вакцина.
Получение антигенов и методика адсорбции на адъювантах хорошо известны специалистам и представлены в примерах, приведенных ниже.
Получение поверхностного антигена гепатита В или HBsAg описано в целом ряде публикаций. См., например Harford и сотр. /1983/ в Develop.Biol. Standard, 54, стр.125; Gregg и сотр. /1987/ в Biotechnology, 5, стр.479; ЕР А-0226846, ЕР А-0299108 и соответствующие ссылки.
Используемый здесь термин "поверхностный антиген гепатита В" или HBsAg включает любые антигены поверхностного гепатита В или их фрагменты, проявляющие антигенность поверхностного антигена гепатита В. Понятно, что в дополнение к 226 аминокислотной последовательности HBsAg S антиген /см. Tiollais и сотр. Nature, 317, 489 /1985/ и ссылки к указанной публикации/ описываемый здесь HBsAg может содержать, по желанию, целую или часть пред-S-последовательности, как указано в приведенных выше ссылках и ЕР-А-0-278940. В частности, HBsAg может содержать полипептиды, включающие аминокислотный ряд, в том числе остатки 12-52, за которым следуют остатки 133-145 и далее 175-400 L-протеина HBsAg, относящегося к открытому остову на вирусе гепатита В серологического типа /этот полипептид упоминается как L*, см. ЕР 04143 74/. Поверхностный антиген гепатита В в объеме изобретения может включать также пре-S1- пре-S2-S-полипептид, описанный в ЕР 0198474 /Эндотроникс/ или его аналоги, такие как описаны в ЕР 0304578 /Мс. Cormick u Jones/. Описанный здесь поверхностный антиген гепатита В может относиться также к мутантам, например, таким как "ускользающий" мутант, описанный в WO 91/14703 или Европейской патентной заявке №0511855 А1, особенно поверхностный антиген гепатита В, в котором аминокислотное замещение в положении 145 проходит от глицина к аргинину.
Обычно HBsAg имеет форму частиц. Частицы могут включать, например, один S-протеин или в виде состава частиц, например, /L*, S/, где L* имеет указанные выше значения, S представляет собой S-протеин поверхностного антигена гепатита В. Указанные частицы предпочтительны в форме, в которой они проявляются в дрожжах.
Антигены, приемлемые для использования в предложенных в изобретении вакцинах, обычно имеются в продаже и, в частности, могут быть получены из фондов Всемирной организации здравоохранения. Например, компонент инактивированной убитой поливакцины представляет собой инактивированную Солком поливакцину. Противококлюшевая вакцина может включать цельноклеточный продукт, бесклеточный продукт или продукт рекомбинации. В частности, противококшлюшевый компонент может представлять собой токсины коклюша или его фракции, филаментный гемаглютинин, агглютиногены /фимбриальные/ и поверхностные мембранные белки, в том числе 69 кДа-протеин /пертактин, не фимбриальный агглютиноген/. Ссылки: А.Robinson, L.I.Jrons и А.Е.Ashworth, 3, 1985, 11-22 и H.J.Brennan, S.M.Cowell, M.E.Bishen, A.C.Steven, A.C.Novotny, C.R.Manclarck, Infection and Immunity, 56, 1988, 3189-3196.
Вакцинные составы традиционно описаны в New Trends and Developments in Vaccines /1978/, издаваемых Voller'ом и сотр. Юниверсити Парк Пресс, Балтимор, Мериленд, США.
Количество антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, вызывающее иммунозащитную реакцию без значительных вредных побочных явлений в типовых вакцинах. Такие количества могут быть очень различными в зависимости от того, какие специфические иммуногены рекомендуются в том или ином случае. Обычно предполагают, что каждая такая доза содержит 1-1000 мкг всего иммуногена, предпочтительно 2-100 мкг, более предпочтительно 1-40 мкг, особенно предпочтительно 1-5 мкг. Оптимальное количество конкретной вакцины может быть установлено в ходе стандартных исследований, включающих наблюдение за титрами антител и контроль других реакций у пациента. Курс первичной вакцинации может включать 2-3 дозы вакцины, вводимые с перерывом в один-два месяца, в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения для иммунизации ДСК.
Настоящее изобретение относится также к способу предупреждения гепатита В и других инфекций у человека, особенно у детей, включающему введение человеку, нуждающемуся в подобном лечении, иммунологически эффективной дозой вакцины по любому из вариантов изобретения, описанных выше.
Таким образом, настоящее изобретение относится к вакцине, используемой в медицине.
Изобретение относится также к использованию поверхностного антигена гепатита В для получения комбинированной вакцины в соответствии с изобретением для профилактики вирусной инфекции гепатита В.
Кроме того, изобретение касается применения фосфата алюминия, используемого в качестве стабилизатора и/или для поддержания эффективности HBsAg в мультивалентной вакцине согласно изобретению.
В частности, фосфат алюминия используют для получения стабильной комбинированной вакцины, содержащей HBsAg, и антигены других патогенов в количестве n=3-4, в силу чего устойчивость и/или иммуногенность компонента поверхностного антигена гепатита В становится выше, чем в соответствующей комбинированной вакцине, где указанный компонент адсорбируется на гидроокиси алюминия.
Более конкретно изобретение относится к использованию указанных компонентов, позволяющих хранить вакцину при 37°С в течение недели без существенного снижения иммуногенных характеристик поверхностного антигена гепатита В.
Кроме того, среднегеометрические титры составляют более 200, предпочтительно более 300 мМЕ/мл, через месяц после введения третьей дозы, являющейся заключительной в курсе вакцинации, проводимом по соответствующему плану вакцинации детей.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ получения комбинированной мультивалентной вакцины, эффективной для предупреждения гепатита В, иллюстрируемый примерами настоящего изобретения, приведенными ниже.
В предпочтительном варианте все антигены, но не поверхностный антиген гепатита В, адсорбируются на гидроокиси алюминия. Таким способом, например, получают очень эффективную вакцину ДСКа - гепатит В.
Обычно комбинированные вакцины согласно изобретению получают по описанному ниже способу.
Желаемые компоненты ДС, ДСКц, ДСКа и другие адсорбируют на подходящих адъювантах, особенно на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия. HBsAg адсорбируют на подходящем стабилизирующем адъюванте, а именно фосфате алюминия. После полной и устойчивой адсорбции соответствующих компонентов осуществляют объединение различных компонентов, соблюдая при этом необходимые условия.
Установлено, что некоторые компоненты, например ДС, ДСК в двух вариантах, можно соединять отдельно до добавления адсорбированного компонента HBsAg. Аналогичным способом можно готовить мультивалентные вакцины, включающие HBsAg и другие дополнительные антигены, указываемые выше.
В предпочтительном варианте способ получения комбинированных вакцин по изобретению включает смешивание фосфата алюминия с адсорбированным на нем поверхностным антигеном гепатита В с одной или более гидроокисью алюминия или фосфатом алюминия с адсорбированными на них антигенами.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют данное изобретение.
Примеры 1-5
Составы
В соответствии с представленным ниже описанием получены конкретные составы согласно изобретению.
Пример 1
Адсорбция поверхностного антигена на AlO4 как концентрат для приготовления комбинированных вакцин.
Суспензию фосфата алюминия, содержащую 0,03-0,3 г алюминия /в виде фосфата алюминия/ в изотоническом растворе соли, смешивают с концентратом поверхностного антигена гепатита В, содержащим 10 мг протеина HBsAg в конечном объеме 10-100 мл. После установления рН на уровне 5-6,5 смесь выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 10-24 часов. После этого, при необходимости, добавляют антисептик /например, мертиолат, 1:20,000 до 1:10,000 или 2-феноксиэтанол, от 3 до 6 мг/мл/ и доводят объем до 50 мл, используя для этой цели изотонический раствор соли.
Пример 2
Состав комбинированной вакцины, против дифтерии - столбняка - гепатита В.
Концентрат, содержащий 25,000 Lf токсоида дифтерии и 10,000 Lf токсоида столбняка, адсорбированных на 0,35 г алюминия /в виде гидроокиси или фосфата алюминия/, получают в конечном объеме 0,15 л изотонического соляного раствора и устанавливают значение рН в пределах 6-7 в соответствии с нормами ВОЗ для ДС и ДСК-вакцин. Концентрат соединяют с 0,05 л концентрата гепатита В из примера 1.
Смесь доводят до конечного объема 0,5 л с помощью изотонического соляного раствора. В образовавшуюся смесь можно, но необязательно добавить антисептик /антисептическую среду/ /например, мертиолат 1:20,000 до 0:10,000 или 2-феноксиэтанол, 3-6 мг/мл/. Конечное значение рН поддерживают на уровне 6-7 по нормам ВОЗ для ДС- и ДСК-вакцин.
Одна 0,5 мл доза пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: Д-токсоид - 25 Lf(ед.); Т - токсоид - 10 Lf(ед.); HBs Ag - 10 мкг протеина; Lf - единица флокуляции (количество токсина, которое быстрее всего флокулирует с одной антитоксической единицей лошадиной сыворотки).
Методику можно изменить при использовании более высоких или более низких количеств активных ингредиентов.
Пример 3.
Состав комбинированной вакцины против дифтерии - столбняка - коклюша /цельноклеточный вариант/ - гепатита В.
Концентрат ex Behringwerke, содержащий 7,500 Lf токсоида дифтерии и 3,250 Lf (ед.) токсоида столбняка, и 15,000 единиц антигена коклюша В, адсорбированных на 0,45 мг алюминия /в виде гидроокиси или фосфата алюминия/, получают в конечном объеме 0,4 л изотонического соляного раствора и устанавливают значение рН на уровне 6-7 в соответствии с нормами ВОЗ для ДСК-вакцин. Концентрат соединяют с 0,05 л концентрата гепатита В из примера 1.
При использовании изотонического соляного раствора смесь доводят до конечного объема 0,5 л. Необязательно, но возможно добавление антисептической среды /например, мертиолата 1:20,000 до 0:10,000 или 2-феноксиэтанола, 3-6 мг/мл/. Конечное значение рН составляет между 6 и 7 в соответствии с нормами ВОЗ для ДС- и ДСК-вакцин.
Одна 0,5 мл доза этого пузырька содержит в качестве активных ингредиентов: Д-токсоид - 7,5 Lf; С-токсоид - 3,25 Lf; Кц-антиген - 15; HBsAg - 10 мкг протеина.
Методику получения можно изменить, используя более высокие или более низкие количества активных ингредиентов.
Пример 4
Состав комбинированной вакцины, содержащий компоненты дифтерии - столбняка - коклюша /бесклеточный вариант/.
Концентрат, содержащий 25,000 Lf (ед) токсоида дифтерии и 10,000 Lf столбняка, адсорбированных на 0,35 л алюминия /в виде геля гидроокиси или фосфата алюминия/, получают в конечном объеме 0,15 л изотонического раствора соли и устанавливают значение рН между 6 и 7 в соответствии с нормами ВОЗ для ДСК-вакцин. Добавляют 25 мг инактивированного токсина коклюша /ДСКа/, 25 мг филаментного гемагглютинина /FHA/ и необязательно 8 мг 69 кДа внешнего оболочкового протеина /пертактин/, каждый из которых соединен с 0,05 г Al /в виде гидроокиси алюминия или фосфата алюминия/. Антигены В.pertussis коклюша, филаментного гемагглютинина, пертактина можно получать в соответствии с методиками, известными каждому специалисту, например методиками, описанными в Европейской патентной заявке 427462 и WO 91/12020 или другими методиками, дающими физиологически приемлемые и активные антигены В.pertussis.
С помощью изотонического раствора соли смесь доводят до конечного объема 0,5 л. Можно, но не обязательно, добавлять антисептические среды /например, мертиолат 1:20,000 до 0:10,000 или 2-феноксиэтанол, ОМР 3-6 мг/мл/. Конечное значение рН раствора составляет между 6 и 7 в соответствии с нормами ВОЗ для ДС- и ДСК-вакцин.
Одна 0,5 мл доза такого пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиенов: Д-токсоид - 25 Lf (ед); С-токсоид - 10 Lf (ед); ДС-токсоид - 25 мкг; токсоид филаментного гемагглютинина - 25 мкг; 69 кДА ОМР - 8 мкг /необязательно/.
Методику можно изменить, используя более высокие или более низкие количества активных ингредиентов.
Пример 5
Составы комбинированной вакцины против дифтерии - столбняка - коклюша /бесклеточный вариант/ - гепатита В.
Используют методику примера 4, за исключением того, что вводят дополнительно 50 мл адсорбированного HBsAg концентрата из примера 1. Полученную смесь доводят до конечного объема 0,5 л, используя для этой цели изотонический раствор соли. Возможно, но не обязательно добавление антисептической среды /например, мертиолата от 1:20,000 до 0:10,000 или 2-феноксиэтанола, 3-6 мг/мл/. Конечное значение рН устанавливают между 6 и 7 в соответствии с нормами ВОЗ для ДС- и ДСК-вакцин.
Одна 0,5 мл доза пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: Д-токсоид - 25 Lf(ед.); С-токсоид - 10 Lf(ед.); КС-токсоид - 25 мкг; токсоид филаментного гемагглютинина - 25 мкг; 60 кДа ОМР - 8 мкг /необязательно/.
Методику можно изменить в случае использования более высоких или более низких дозовых количеств активных ингредиентов.
Примеры 6-10
Исследования на животных и людях.
Пример 6
Состав комбинированных вакцин, содержащих компонент гепатита А и гепатита В.
По аналогии с примером 1 концентрат инактивированного вируса гепатита А /460,000 единиц, Elisa твердофазный иммуноферментный анализ/, адсорбированный на 0,02 до 0,2 г, предпочтительно 0,04-0,1 г алюминия /в виде гидроокиси алюминия/, в конечной концентрации до около 125 мл соединяют с 50 мл концентрата, содержащего 10 мг поверхностного антигена гепатита В, адсорбированного на фосфате алюминия.
Полученную смесь разбавляют изотоническим раствором соли и концентратом аминокислот /Тревазол, Бакстер-Травенол Инк/, получая конечный объем 0,5 л, содержащий 1,5 г аминокислот. Значение рН в полученном составе составляет между 6 и 7.
Одна 1 мл доза такой вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: антиген вируса гепатита А - 800 едElisa твердофазный иммуноферментный анализ/; HBsAg - 20 мкг протеина.
Методику можно изменить, используя более высокие или более низкие количества активных ингредиентов.
Результаты.
Сравнительные клинические исследования активности поверхностного антигена гепатита В, адсорбированного на гидроокиси (АН) и фосфате алюминия (АР) /моновалентная вакцина/.
Имеющим на начальном этапе сероотрицательную реакцию здоровым взрослым добровольцам вводят 3 дозы по 20 мкг поверхностного антигена гепатита В с интервалом в один месяц. Определяют уровни антител в сыворотке после введения второй и третьей дозы, используя для этой цели тест Эббота. Определяют реакции для добровольцев со значениями титров значительно выше основного. Данные титров выражают в мМЕ/мл.
Результаты представляют собой среднегеометрические титры в мМЕ/мл и отражены в табл.1 и 2.
Пример 7
Тесты на иммуногенность на мышах и результаты исследования повышенной устойчивости комбинированных вакцин, включающих поверхностный антиген гепатита В на гидроокиси алюминия (АН) или фосфате алюминия (АР) в качестве адъюванта.
Группам из 10 мышей OF1 вводят подкожно 2 дозы по 2,5 мкг HBsAg /одного компонента или в комбинации с другими/ в дни 0 и 14. На 21 день отбирают кровь и титруют на анти- HBsAg, используя тест Эббота. Количество реагирующих животных определяют как количество животных с уровнем антител, значительно более высокими, чем основные значения, приведенные выше. Рассчитывают также средний геометрический титр. Результаты отражены в табл.3.
Результаты, полученные для ДС-ГВ, ДСКц-ГВ, ДСКа-ГВ, показывают, что HBsAg, адсорбированный на фосфате алюминия, значительно лучше, чем HBsAg, адсорбированный на гидроокиси алюминия, как в отношении реакции животных, так и среднегеометрических титров. Реакция на HBsAg, адсорбированный на фосфате алюминия в комбинированном составе, сравнима с реакцией на введение моновалентной вакцины HBsAg.
Пример 8
Иммуногенность HBsAg в комбинации с ДСКц-компонентом в опытах на обезьянах.
Результаты для антигенов, адсорбированных на гидроокиси алюминия /АН/ и фосфате алюминия (АР).
Обезьянам Cercopithenus aethiops вводят две инъекции по 10 мкг HBsAg /одного или комбинации/ в дни 0 и 30. На 30 и 57 день производят отбор сыворотки и титруют по Эбботу на анти-HBsAg. Животных с уровнем антител значительно выше основного /содержание в сыворотке до вакцинации/ рассматривают как респондентов. Рассчитывают средние геометрические титры в мМЕ/мл (табл.4).
Полученные результаты показывают, что HBsAg, адсорбированный на фосфате алюминия, значительно лучше, чем HBsAg, адсорбированный на гидроокиси алюминия. Реакция сравнима с соответствующей реакцией, имеющей место при введении моновалентной вакцины HBsAg.
Пример 9
Клинические исследования с комбинированными вакцинами, содержащими HBsAg, адсорбированный на гидроокиси алюминия (АН) и фосфате алюминия (АР).
Добровольцам вводят 3 дозы по 0,5 мл вакцины, содержащей компонент ДСКц и компонент протеина HBsAg в течение 3, 4 и 5 месяцев. На 6 месяц отбирают кровь и сыворотку крови титруют, используя тест Эббота.
Процент респондентов /сероконверсии/ соответствует пациентам с уровнем антител значительно выше описанного основного уровня. Процент защиты (предупреждения) охватывает пациентов с титрами, эквивалентными или выше 10 мМЕ/мл. Значения среднегеометрического титра даются в мМЕ/мл (табл.5).
Результаты, полученные для ДСКц, показывают, что HBsAg, адсорбированный на фосфате алюминия, дает более хорошую реакцию в сравнении с HBsAg, адсорбированным на гидроокиси алюминия. Степень сероконверсии и среднегеометрический титр сравнимы с соответствующими данными, полученными при введении моновалентной вакцины HBsAg /Engerix-B'/.
Пример 10
Иммуногенность и устойчивость HBsAg, адсорбированного на гидроокиси алюминия (АН) или фосфате алюминия (АР) в комбинированной вакцине, содержащей компоненты гепатита А и гепатита В.
Группам из 10 мышей OF1 вводят подкожно 2 дозы по 2,5 мкг HBsAg /одного или в комбинации/ в дни 0 и 14. На 21 день производят отбор крови и титруют на анти-HBsAg по аналогии с примером 7.
Результаты, полученные для иммуногенности и устойчивости комбинированного состава ГА-ГВ, показывают, что HBsAg, адсорбированный ФА, дает более высокий уровень антител и обеспечивает более устойчивую форму. Результаты отражены в табл.6.
Пример 11
Дальнейшие клинические исследования.
1. Иммуногенность вакцины ДСКц - гепатита В для детей.
Эксперимент А.
Исследования, проводимые в Словакии: План 3-4-5 месяцев 10 мкг HBsAg, ДСКц от Берингверке /ДС на ГА, Кц на смеси ГА и ФА/. Результаты отражены в табл.7 и 8.
В этом и других примерах Post II обозначает - "после второй дозы" и post III - соответственно "после третьей дозы". Среднегеометрические титры всегда измеряют через месяц после инъекции по соответствующему плану. SP обозначает степень серозащиты.
Титры для дифтерии - столбняка - бесклеточного коклюша приведены в табл.8.
Эксперимент В
Исследования, проводимые в Греции: План вакцинации 2-4-6 месяцев /5 мкг HBsAg, на фосфате алюминия /ФА/, ДСКц от Берингверке /ДС на ГА, Кц на смеси ГА и ФА/, как и в примере А/. Титры для анти-HBsAg /предварительные результаты/ приведены в табл.9.
Эксперимент С
Исследования, проводимые в Словакии: План вакцинации 3-4-5 месяцев /10 мкг HBsAg, на фосфате алюминия /ФА/, ДСКц от Берингверке /ДС на ГА, Кц на смеси ГА и ФА/, как и в примере А/. Титры анти-HBsAg отражены в табл.10.
Эксперимент D
Исследования, проводимые в Словакии: план вакцинации 3-4-5 месяцев /10 мкг HBsAg, на фосфате алюминия /ФА/, ДСКц от Берингверке /ДС на ГА, Кц на смеси ГА и ФО/, как и в примере А/. Титры анти-HBsAg антител отражены в табл.11. Титры антидифтерийных антител отражены в табл.12. Титры противостолбнячных антител отражены в табл.13. (Сокращения указаны в табл.1). Титры противококлюшевых антител отражены в табл.14. (Сокращения указаны в табл.1).
2. Иммуногенность ДСКб - гепатит В - содержащих вакцин для детей.
Исследования, проводимые в Турции. HBsAg=10 мкг на фосфате алюминия, ДСК /бесклеточный/ на гидроокиси алюминия. Предварительные результаты представлены в табл.15 и 16.
| Таблица 1 | ||||||
| HBsAg Lot | Адъювант | № добровольца | Через 2 месяца | Через 3 месяца | ||
| ср.г. титр | респондент, % | ср.г. титр. | респондент, % | |||
| 100 | AH | 43 | 32 | 86 | 141 | 100 |
| 101 | AH | 45 | 26 | 93 | 198 | 98 |
| 102 | АН | 46 | 30 | 84 | 147 | 93 |
| 105/P | АР | 7 | 43 | 83 | 380 | 100 |
Таблица 2
| HBsAg Lot | Адъювант | № добровольца | Через 2 месяца | Через 3 месяца | ||
| ср.геом. титр. | %, респондент | ср.г. титр | %, респондент | |||
| 102 | AH | 51 | 14 | 82 | 126 | 98 |
| 103 | АН | 50 | 15 | 83 | 110 | 98 |
| 102 | АН | 54 | 17 | 83 | 133 | 96 |
| 104/P | АР | 54 | 18 | 96 | 270 | 98 |
| 105/Р | АР | 51 | 14 | 90 | 156 | 96 |
| Таблица 3 | ||||||
| Вакцина | 4°С | 7 дней 37°С | 7 дней 45°С | |||
| № респондента | ср.г.титр | № респондента | ср.г.титр | № респондента | ср. г. титр | |
| Engerix В(НВ+АН) | 7/10 9/10 9/10 | 30 54 45 | 9/10 8/10 10/10 | 17 13 55 | 6/10 5/10 9/10 | 2,7 6 32 |
| Engerix B(HB+AH) | ||||||
| НВ (AH) ГВ/ОА/ | ||||||
| НВ (АР) ГВ /ФА/ | 9/10 | 54 | 10/10 | 50 | 7/10 | 6,9 |
| ДСКц/ОА ДТРw(АН) АВ (АН) | 4/10 | 1,4 | nd | nd | nd | nd |
| ДТРw(АН)(НВ)(AP) | ||||||
| далее см. сокращения в тексте | 9/10 | 52 | 8/10 | 16 | 8/10 | 26 |
| ДТ (AH) HB(AH) | 6/10 | 1,7 | nd | nd | nd | nd |
| ДТ (AH) HB(AP) | 8/10 | 44 | 9/10 | 21 | 10/10 | 36 |
| ДТРа (AH)HB(AH) | 5/10 | 1,7 | ||||
| ДТРа(АН)НВ(AP) | 10/10 | 18 | 8/10 | 8 | 9/10 | 24 |
| ДТ/AH/HB/AH/ - ДС/ОА/- ГВ/CA/, ДТ/AH/Г″В″/ОФ/, ДТРа/АН/АН/Г″В″ /АН/ - ДСКа /ОА/. |
nd - не исследовались
| Таблица 4 | ||||
| Вакцина | Через 30 дней | Через 57 дней | ||
| респонд. | ср.г.титр | респонд. | ср.р.титр. | |
| Engerix B (HB)(AH) | 4/5 | 10 | 5/5 | 666 |
| ДСКУ (ГА)Г″В″ (ГА) ДТРw (АН)НВ (АН) | 4/5 | 20 | 5/5 | 31 |
| ДСКУ (ГА) Г″В″ (ОФ) ДТРw (АН) НВ (АР) | 5/5 | 12 | 5/5 | 414 |
| Таблица 5 | |||||
| Вакцина | № добровольца | время отбора крови | Респондент | ||
| %, респондент | % защиты | ср.г.титр | |||
| ДТРw(АН) НВ(AH) ДСКц /ГА/Г"В"/ГА/ | 32 | 2 | nd | nd | nd |
| 3 | 94 | 84 | 38,5 | ||
| ДТРw(АН) НВ(AP) ДСКц /ГА"В"/ОФ/ | 29 17 | 9 | 97 | 97 100 | 63 469 |
| 3 | 100 |
| Таблица 6 | |||
| Вакцина | Выдерживание | Респондент | Среднегеом. титр. |
| HA(AH) HB(АН) | 4°C | 9/10 | 41 |
| ГА (ГА) ГВ (ГА) | I месяц | ||
| 37°С | 6/10 | 5,6 | |
| 45°С | 5/10 | 6,4 | |
| ГА/ГА/ГВ/ОФ/ | 4°С | 10/10 | 80 |
| НА(AH) НВ (АР) | I месяц | ||
| 37°С | 9/10 | 45 | |
| 45°С | 8/10 | 18 | |
| Engerix B HB (AH) | 4°С | 8/10 | 58 |
| Примечание: Эта таблица для примера 10 |
| Таблица 7 | ||||
| HBsAg Адъювант | Время | № | ср.геом. титр | SP(%) |
| Hydroxide | Post II (5 months) | 44 | 45 | 79,5 |
| гидроокиси | Post III (6 months) | 13 | 34 | 69,2 |
| фосфат | Post II (5 months) | 32 | 80 | 97,0 |
| Phosphate | Post III (6 months) | 32 | 396 | 100 |
| Таблица 8 | ||||
| Результаты после III Post III | № | ср. геом. титр | %>0.1 IU/ml | ср. геом. титр. Post/Pre |
| Anti-Diphtheria | 38 | 2,302 3,281 61 | 100 100 - | 37,4 38,4 7,7 |
| Anti-Tetanus | 38 | |||
| Anti-B pertussis | 38 |
А-Д - противодифтерийный
А-С - противостолбнячный
А-К - противококлюшевый
| Таблица 9 | ||||
| Адъювант HBs Ag | Время | № | Среднегеом. титр. | Степень сероконверсии, SP(%) |
| гидроокись | месяц 7 | 22 | 284 | 90,5 |
| -″- | месяц 7 | 17 | 193 | 94,4 |
| фосфат | месяц 7 | 23 | 1794 | 92,0 |
| Таблица 10 Титры анти-HBs | ||||
| Время | № | Ср.г.титр. | Степень сероконверсии SP(%) | |
| Post II | 21 | 94 | 90,5 | |
| Post III | 18 | 311 | 100 | |
| Таблица 11 Титры анти-HBs | ||||
| Время | № | Ср.г.титр. | Степень сероконверсии SP(%) | |
| Пост | 24 | 0 | 0 | |
| Post II Месяц (5) | 13 | 259 | 92,3 | |
| Post III -″- (6) | 10 | 592 | 100,0 | |
| Таблица 12 | ||||
| Антидифтерийные антитела | ||||
| Время | № | Ср.геом. титр. | Степень серокон. SP(%) | Ср.г.титр. Post/Pre |
| Pre | 32 | 0,054 | 6,3 | 1,0 |
| Post II | 16 | 1,094 | 93,8 | 20,4 |
| Post III | 11 | 2,314 | 100,0 | 43,1 |
| Таблица 13 Противостолбнячные антитела | ||||
| Сокращения указаны в таблице 1 | ||||
| Время | № | ср. геом. титр | SP(%) | ср. геом. титр Post/Pre |
| Pre | 32 | 0,083 | 34,4 | 1,0 |
| Post II | 16 | 3,146 | 100,0 | 37,9 |
| Post III | 11 | 7,989 | 100,0 | 96,4 |
Таблица 14
| Противококлюшевые антитела | |||
| Сокращения указаны в таблице 1 | |||
| Время | № | ср. геом. титр | ср. геом. титр Post/Pre |
| Pre | 32 | 8 | 1,0 |
| Post II | 16 | 20 | 2,7 |
| Post III | 11 | 50 | 6,6 |
| Таблица 15 Группа I /ДСКа - Engerix B в комбинированном составе/ | ||||
| Время | № | S+ | % | Среднегеом. титр |
| Pre | 19 | 0 | 0 | 0 |
| Post I | 19 | 4 | 21,1 | 24 |
| Post II | 19 | 18 | 94,7 | 146 |
| Post III | 19 | 19 | 100,0 | 345 |
| Таблица 16 | ||||
| Группа 2 /ДСКа плюс Engerix В, отдельные одновременные инъекции/ | ||||
| Сокращения см. выше | ||||
| Время | № | S+ | % | среднегеом. титр |
| Pre | 8 | 0 | 0 | 0 |
| Post I | 8 | 2 | 25,0 | 37 |
| Post II | 8 | 5 | 62,5 | 33 |
| Post III | 7 | 6 | 83,7 | 385 |
Ключ: № - количество исследуемых добровольцев, S+ - количество добровольцев, имевших сероположительную реакцию в момент отбора проба крови, % = степень сероконверсии и GMT = серосреднегеометрический титр антител у субъектов с сероконверсией.
1. Комбинированная вакцина для профилактики по крайней мере гепатита В, отличающаяся тем, что содержит адсорбированный на фосфате алюминия поверхностный антиген вируса гепатита В, смешанный с адсорбированными на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия антигенами других патогенов в количестве n=3-4, выбранными из дифтерии, столбняка, коклюша и Haemophilus influenzae b, причем по крайней мере один из n антигенов других патогенов адсорбирован на гидроокиси алюминия.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что содержит по крайней мере один из n антигенов других патогенов, адсорбированный на фосфате алюминия.
3. Вакцина по пп.1 и 2, отличающаяся тем, что из антигенов коклюшного патогена она содержит цельноклеточную коклюшную вакцину или очищенную бесклеточную вакцину.
4. Способ получения комбинированной вакцины по пп.1-3, в котором поверхностный антиген вируса гепатита В адсорбируют на фосфате алюминия, отличающийся тем, что включает смешивание адсорбированного на фосфате алюминия поверхностного антигена вируса гепатита В с антигенами других патогенов адсорбированными на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия.
5. Способ предупреждения инфекции гепатита В у человека путем вакцинации, отличающийся тем, что включает введение нуждающемуся в этом пациенту эффективной дозы вакцины по любому из пп.1-4.
