Штамм мицелиального гриба trichoderma longibrachiatum - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, маннаназы и пектиназы

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в различных отраслях спиртовой и пищевой промышленности, в кормопроизводстве, в сельском хозяйстве. Штамм Trichoderma longibrachiatum BKM F-3865D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) обладает способностью продуцировать комплекс карбогидраз, включающий целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, маннаназы и пектиназы, содержащий ферменты высокого уровня активности. Изобретение обеспечивает возможность получения полного комплекса ферментов для гидролиза полисахаридов растительного сырья, а также при необходимости - отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса. Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, в различных отраслях спиртовой и пищевой промышленности, в кормопроизводстве, в сельском хозяйстве.

Мультиферментные комплексы карбогидраз, содержащие целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, маннаназы, пектиназы и сопутствующие ферменты, могут применяться для обработки целлюлозе- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе для осахаривания и переработки отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений и микроорганизмов, в целлюлозно-бумажной промышленности, в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве кормовых добавок, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Известно много штаммов-продуцентов карбогидраз, главным образом целлюлаз, и способы их культивирования в аэробных условиях. Как правило, микроорганизмы, в частности мицелиальные грибы, образуют комплекс ферментов, разрушающих растительные субстраты. Обычно такой комплекс включает преимущественно целлюлазы, а также ксиланазы и пектиназы. Выбор штамма-продуцента определяется его способностью обеспечить высокие уровни активности карбогидраз в ферментационной среде, скоростью образования этих ферментов, выходом ферментов с единицы массы используемых для ферментации субстратов, а также стоимостью этих субстратов.

Известны штаммы гриба Aspergillus niger, при глубинном культивировании которых на средах с индукторами целлюлолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, бета-глюканазу и ламинариназу (Патент РФ № 2057179, кл. C 12 N/42, 1996 г.). Активности ферментов в культуральной жидкости составляют соответственно: целлюлаза - 5,0 Е/мл; ксиланаза - 125,0 Е/мл; бета-глюкозидаза - 20,0 Е/мл; бета-ксилозидаза - 36,0; бета-глюканаза - 0,95 Е/мл и ламинариназа - 1,25 Е/мл.

Как известно, наиболее активными продуцентами целлюлаз являются штаммы мицелиальных грибов рода Trichoderma. С целью повышения их способности к продукции ферментов и адаптации к более дешевым ферментационным средам были получены различные мутантные и рекомбинантные штаммы Tr.longibrachiatum (син. Tr.reesei). Мутант Tr.reesei MCG80 при глубинном культивировании на питательной среде с 8%-ной целлюлозой и биотином обеспечивает активность целлюлаз 17,2 ед/мл FPA (Патент США № 4472504, кл. C 12 N 9/42, 1984 г.). FPA - активность целлюлазного комплекса, определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации IUPAC (T.K.Ghose, Pure and Appl. Chem., 1987, vol.59, № 2, p.257-268).

Известен мутант Tr.reesei IMET 43803, который вследствие частичного уменьшения катаболитной репрессии биосинтеза ферментов обеспечивает высокую продуктивность целлюлаз и высокий (до 10 ед/мл FPA) уровень активности целлюлаз при культивировании на среде с лактозой (Патент ГДР № 291673, кл. C 12 N 9/42, 1991 г.).

Известен мутант Tr.reesei ВСМ 18.2/КК (ВГНКИ-28), полученный с помощью парасексульных процессов из исходной культуры Tr.reesei IMET 43803, который обладает повышенной продуктивностью и позволяет обеспечить высокий выход активности ферментов (целлюлаз) с единицы массы используемого субстрата (Патент РФ № 2001949, C 12 N 9/42, 1993 г.).

Штамм Tr.reesei BCM 18.2/КК имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При глубинном культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома в колбах на качалке достигается уровень активности в 3,5-4,2 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании в ферментере на среде с лактозой - 18.2 ед/мл FPA (81 ч), при культивировании в ферментере на молочной сыворотке - 12-14 ед/мл FPA (100-110 ч).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутант Tr.longibrachiatum TW-1 (F-3634D), полученный с помощью многоступенчатого классического мутагенеза из исходной культуры Tr.reesei var longibrachiatum QM6a (F-2047) с применением ультрафиолетового облучения (Патент РФ № 2195490, 7 C 12 N 1/14, 9/42, 2001 г.). Штамм обладает способностью продуцировать комплекс карбогидраз, что создает возможность получения полного комплекса ферментов для обработки растительного сырья, а также при необходимости - индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса. Для получения высокой продуктивности штамма не требуется применение сложных и дорогих питательных сред. Штамм Tr.longibrachiatum TW-1 имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При глубинном культивировании в колбах на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ в 6,5; 25,0; 20,0; 7,0 и 0,5 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч). При культивировании в ферментере на среде с ферментативном гидролизатом крахмала, пшеничными отрубями и микрокристаллической целлюлозой (МКЦ) и с непрерывным внесением лактозы (во второй фазе) уровень активности целлюлаз (FPA), бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 25, 510, 108, 40 и 35 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).

Однако, как следует из имеющихся в нашем распоряжении сведений, полученных в результате научных исследований (O.F.Castellanos, A.P.Sinitsyn, E.Yu.Vlasenko. Comparative evaluation of hydrolytic efficiency toward microcrystalline cellulose of Penicillium and Trichoderma cellulases. Bioresource Technology, 1995, 52, 119-124), грибы рода Trichoderma, как правило, обладают высокой продуктивностью, преимущественно в отношении целлюлаз, но в гораздо меньшей степени - в отношении других карбогидраз (бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ), необходимых для гидролиза различных растительных полисахаридов, входящих (помимо целлюлозы) в состав растительного сырья. Штамм Tr.longibrachiatum TW-1 (F-3634D) не является в данном случае исключением и имеет тот же недостаток, что и другие штаммы Trichodrema - а именно, он имеет относительно низкую продуктивность по карбогидразам, не являющимися целлюлазами (бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы, маннаназы).

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов - продуцента мультиферментного комплекса, содержащего спектр карбогидраз.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности как целлюлаз, так и других компонентов комплекса - бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ в ферментационной среде при культивировании на простой и недорогой среде в присутствии высоких концентраций Сахаров.

Сущность объекта изобретения - специально селекционированный штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-307 - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.

Штамм гриба Tr.longibrachiatum TW-307 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-3865D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr.reesei var longibrachioatum QM6a (BKM F-2047). Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28°С в течение 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма.

При росте на Мальц-агаре диаметр колонии достигает 80-90 мм на 7 сутки при росте при 25°С. Мицелий развит преимущественно субстратный, гиалиновый; воздушный скудный, белый.

Конидиальная зона сформирована многочисленными компактными подушечками диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом - зеленого. Обратная сторона - светло-зеленовато-желтая. Конидиеносцы неокрашенные, гладкостенные, формируются преимущественно на субстратном мицелии, главные ветви длинные и прямые, иногда извитые, до 5 мм шириной у основания, постепенно сужающиеся к вершине до 2 мкм ширины; боковые ветви образуются через неравные интервалы, обычно короткие, формируются под углом к вершине конидиеносцев. Фиалиды одиночные, булавовидные или широко бутыловидные, часто искривленные, размер - 5-10 ч 2-3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидальные, 4-7 ч 2,5-4 мкм, собраны в небольшие головки на вершинах фиалид.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,3 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу, трегалозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу.

Не ассимилирует: L-рамнозу, D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу.

Использует аммонийный и органический азот, очень плохо ассимулирует нитратную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, галактоманнане, пектине и хитине. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, аморфную целлюлозу, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита).

Полученный мутант Tr.longibrachiatum BKM F-3865D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозокартофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Tr.reesei var longibrachiatum QM6a сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (зеленовато-желтые) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах, более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз и других, кроме целлюлазы, карбогидраз - бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Культивирование штамма Tr.longibrachiatum BKM F-3865D проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или лактозы, секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - карбогидраз (целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.

Активность целлюлаз определяют по FPA (согласно рекомендации IUPAC, T.K.Ghose, Pure and Appl. Chem.,1987, vol.59, № 2, p.257-268), активность бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять бета-глюкан, ксилан, галактоманнан и полигалактуроновую кислоту, соответственно. За единицу δ-глюканазной, ксиланазной, маннаназной и пектиназной активностей принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Tr.longibrachiatum BKM F-3865D выращивают на сусло- или СМ-агаре при 29°С в течение 7 суток и далее - при комнатной температуре на свету с течение 5 суток.

Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина-80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л: свекловичный жом - 40,0; солодовые ростки - 14,0; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; КН₂PO₄ - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 8, 28, 25, 8 и 1 ед/мл соответственно.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: МКЦ - 4,0; лактоза - 20,0; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; КН₂PO₄ - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 8, 35, 30, 10 и 2 ед/мл соответственно.

Пример 3. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера на среде как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: МКЦ - 20; глюкоза - 20,0; кукурузный экстракт - 60; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; KH₂PO₄ - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 14, 80, 95, 11 и 2 ед/мл соответственно.

Пример 4. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера на среде состава, приведенного в примере 3, но с исходными значениями рН 6,0.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 8, 105, 250, 9 и 1 ед/мл соответственно.

Пример 5. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (по примеру 1).

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 24-36 ч при 32°С и рН 4,2 на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: МКЦ - 5,0; глюкоза - 50,0; кукурузный экстракт - 60,0; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; KH₂PO₄ - 3,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6. Через 24-36 ч начинают вторую фазу культивирования (на протяжении которой происходит накопление ферментов в среде роста). На второй фазе ферментации (фаза биосинтеза внеклеточных ферментов) в ферментер непрерывно добавляют лактозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 28°С, а рН - 4,2. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора лактозы на 50% и составляет 9-9,5 л.

Активности целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляют на 110-120 ч культивирования 32, 620, 580, 25 и 28 ед/мл соответственно.

Пример 6. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (по примеру 3).

Первую фазу культивирования (накопление биомассы гриба) осуществляют в течение 24-36 ч при 32°С при рН 6,0 на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: глюкоза - 20,0; кукурузный экстракт - 120; ферментативный гидролизат крахмала амилосубтилином (600 мл на 6 л среды, начальная концентрация восстанавливающих сахаров в среде 4,9-5,5%) (NH₄)₂SO₄ - 6,0; KH₂PO₄ - 3,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6. На второй фазе в ферментер непрерывно добавляют лактозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 32°С, а рН - 6,0. В процессе ферментации через 60 ч после ее начала в среду вносят минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале процесса культивирования. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора лактозы на 50% и составляет 9-9,5 л.

Через 120 ч ферментации активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 30,0; 810, 2500, 33 и 30 ед/мл соответственно.

Таким образом, предлагаемый штамм Tr.longibrachiatum BKM F-3865D обладает способностью продуцировать комплекс, содержащий ферменты высокого уровня активности и состоящий из карбогидраз - целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ. Это создает возможность получения полного комплекса ферментов для гидролиза полисахаридов растительного сырья, а также при необходимости - отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и, особенно, в качестве кормовых добавок.

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum BKM F-3865D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, маннаназы и пектиназы.