Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности производству вакцин. Описанная сибиреязвенная вакцина включает мутантный белок токсин Bacillus anthracis, выбранный из мутантного РА, или мутантного LF, или мутантного EF, или их комбинации, при этом токсины мутированы таким образом, чтобы при снижении уровня их токсичности сохранить иммуногенность. Для создания вакцины со сниженной реактогенностью предложена рекомбинантная ДНК-конструкция для экспрессии указанных белков-токсинов. ДНК-конструкция включает экспрессирующий вектор и ДНК-фрагмент, включающий в свою очередь гены, кодирующие соответствующий токсин-белок (PA, LF или EF). Описан способ получения мутантных белков с использованием трансформированного прокариотического хозяина. Полученный мутантный белок-токсин, обладающий иммуногенными свойствами и нетоксичностью, - используют для приготовления противосибирязвенной вакцины, включающей один или более мутантных белков-токсинов, а также в комбинации с белком-токсином PA, LF или EF дикого типа. Использование изобретения позволит создать безопасную и эффективную вакцину против сибирской язвы. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.
Изобретение относится к рекомбинантной ДНК-конструкции и к способу получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины.
ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Сибирская язва, зоонозное заболевание, вызывается грам-положительными спорулирующими микроорганизмами Bacillus anthracis. Люди становятся случайными хозяевами через пищу животного происхождения, продукты животноводства и заражаются через окружающую среду, содержащую микроорганизмы Bacillus anthracis (Brachman P.S., 1970, Annals. N.Y. Acad. Sci. 174, 577-582). Сибирская язва представляет собой одно из наиболее древних известных бактериальных заболеваний и встречается в большинстве районов мира, включая Индию. Основные вирулентные факторы B. anthracis включают капсулы поли-D-глутаминовой кислоты и трехкомпонентный токсиновый комплекс сибирской язвы. Сибиреязвенный токсин (Leppla S.H., 1991, In Source Book of Bacterial protein toxins, pp.277-302), включающий защищающий антиген РА(83 кДа), летальный фактор (LF-(90 кДа) и фактор отечности (EF-(89кДа), является основным вирулентным фактором B. anthracis. Каталитические составляющие этого комплекса, LF/EF, нуждаются в РА для проникновения в цитозоль клетки. РА в сочетании с LF (названный летальным токсином) является причиной смерти у экспериментальных животных (Smith H. and Keppie J., 1954, Nature, 173, 869-870). РА в сочетании с EF (названный отечным токсином) у экспериментальных животных вызывает отек на коже (Stanley J.L. and Smith H., 1961, J. Gen. Microbiol., 26, 49-66). РА представляет собой рецептор-связывающую составляющую, которая обеспечивает перемещение каталитических составляющих, LF и EF, в клетки-мишени. После перемещения в клетку LF, которая является металлопротеиназой, расщепляет некоторые митоген-активируемые протеинкиназные киназы (MAPKK), приводя к инактивации путей передачи сигнала (Duesbery N.S., и соавт., 1998, Science, 280, 734-737). С другой стороны, EF, при проникновении в клетки, активируется кальмодулином, что вызывает увеличение внутриклеточного уровня цАМФ (Leppla S.H., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3162-3166).
На первой стадии процесса интоксикации происходит связывание РА с поверхностными рецепторами клетки (Bradley K.A., и соавт., 2001, Nature, 414, 225-229). После связывания с рецепторами на клеточной поверхности РА расщепляется протеазами клеточной поверхности с образованием фрагмента размером 63-кДа (Klimpel R.K., и соавт., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10277-10281), который олигомеризуется и связывается с LF/EF (Milne J.C., и соавт., 1994, J. Biol. Chem., 269, 20607-20612). Связывание LF/EF является конкурентным. Затем весь комплекс подвергается рецептор-опосредованному эндоцитозу. Подкисление эндосомы (Friedlander A.M., 1986, J. Biol. Chem., 261, 7123-7126) приводит к встраиванию РА-олигомера в мембрану эндосомы с образованием пор (Milne J.C. and Collier R.J., 1993, Mol. Microbiol., 10, 647-653), через которые LF/EF перемещается в цитозоль клетки.
РА имеет четыре домена, которые изначально образуют антипараллельные бета-тяжи с несколькими короткими спиралями, состоящими менее чем из четырех витков (Petosa C., и соавт., 1997, Nature, 385, 833-838). Домен 1 отвечает за связывание с LF/EF во время интоксикации сибирской язвой. Домен 2 преимущественно представляет собой beta barrel (бета-бочка) и предназначен для встраивания в мембрану и перемещение. Домен 3 является самым маленьким доменом и важен для олигомеризации РА и, по-видимому, также для связывания РА с LF/EF. Домен 4 представляет собой рецептор-связывающий домен.
Установленная недавно кристаллическая структура LF свидетельствует, что LF имеет 4 домена (Pannifer A.D., и соавт., 2001, Nature, 414, 229-233). Домен 1 участвует в связывании с РА. Этот домен обладает существенной гомологией с N-концевыми 1-250 остатками EF. Фактически большинство остатков в этой области совершенно консервативны.
Из всех трех белков-токсинов РА является наиболее иммуногенным и представляет собой существенный компонент вакцины против сибирской язвы (Gladstone G.P., 1946, Br. J. Exp. Pathol., 27, 349-418). Отмечено, что защитная эффективность РА сильно увеличивается, если в эту вакцину включить небольшие количества LF или EF (Pezard и соавт., 1995, Infect. Immun., 63, 1369-1372). Вместе с тем это также является главной причиной токсикогенности и реактогенности таких вакцин. Токсин сибирской язвы (Leppla S.H., 1991, In Source Book of Bacterial protein toxins, pp.277-302), включающий защищающий антиген (РА), летальный фактор (LF) и фактор отечности (EF), является у B. anthracis основным вирулентным фактором.
Используемую в настоящее время противосибиреязвенную вакцину производят из некапсулированного авирулентного штамма микроорганизма, известного как штамм Штерна (Sterne M., 1939, J. Vet. Sci. Anim. Ind, 13, 307-312). В России и в Китае используют живую споровую вакцину, основанную на штамме Штерна. В Великобритании эта вакцина представляет собой фильтрат культуры штамма Штерна, осажденный квасцами, а в США вакцина состоит из адсорбированного на алгидрогеле фильтрата бесклеточной культуры некапсулированного, полученного без протеолиза, штамма V770, выделенного из пораженного сибирской язвой крупного рогатого скота (Turnbull P.C.B., 1991, Vaccine, 9, 533-539). Все эти используемые в настоящее время вакцины против сибирской язвы, не говоря уже о неочищенных вакцинах, обладают неопределенным составом. Они реактогенны и не обеспечивают защиты от всех природных штаммов B. anthracis.
В патенте США №2017606 описано получение сибиреязвенного антигена путем выращивания микроорганизмов в соответствующей культуральной среде и отделения выращенных микроорганизмов от этой культуральной среды.
В патенте США №2151364 описан способ получения противосибиреязвенной вакцины, который включает получение суспензии спор сибирской язвы и ее добавление к суспензионному стерильному раствору, содержащему квасцы.
В патенте России №2115433 описан способ получения противосибиреязвенной вакцины, которая включает живые споры некапсулированного штамма B. anthracis и защищающего антигена из B. anthracis.
В патенте WO №0002522 описан способ получения противосибиреязвенной вакцины с использованием нетоксичного защищающего антигена из B. anthracis, применяемого для индукции иммунного ответа, который защищает от сибирской язвы.
Недостатком всех вышеуказанных патентов является то, что все они используют культуры/споры Bacillus anthracis. Bacillus anthracis является инфекционным микроорганизмом и с ним нельзя работать, не соблюдая мер предосторожности. Получаемая вакцина содержит примеси других токсичных и нетоксичных белков Bacillus anthracis, что приводит к ряду побочных эффектов и к реактогенности.
Эти вакцины обладают также некоторой остаточной вирулентностью в отношении некоторых видов домашних и лабораторных животных. Штамм Штерна токсигенен и в высоких дозах является патогенным. Поэтому он считается небезопасным и не подходящим для использования человеком. Такая вакцина может вызывать нежелательные побочные эффекты, в том числе некроз на участке вакцинации.
По этой причине существует необходимость в создании противосибиреязвенной вакцины второго поколения, которая не вызывает побочных эффектов и обладает четко определенным составом.
Цель настоящего изобретения заключается в придании сибиреязвенному токсину нетоксичности без воздействия на его иммуногенность, для того чтобы создать безопасную и эффективную противосибиреязвенную вакцину.
Для достижения указанной цели в настоящем изобретении создана конструкция рекомбинантной ДНК, включающая экспрессионный вектор и фрагмент ДНК, включающий гены защищающего антигена (РА) дикого типа, летального фактора (LF) дикого типа, и фактора отечности (EF) дикого типа.
В настоящем изобретении создана также конструкция рекомбинантной ДНК, включающая:
экспрессионный вектор и фрагмент ДНК, включающий гены мутантного защищающего антигена (РА), мутантного летального фактора (LF) или мутантного отечного фактора (EF).
Указанный вектор представляет собой прокариотический вектор такой, например, как вектор PQE 30, причем указанный экспрессионный вектор содержит промотор Т5 и 6Х гистидиновую метку.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена c замещением аланином по остатку Phe202.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Leu203.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Pro205.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Ile207.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остаткам Pro205, Trp226 и Phe236.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe552.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe552 и Phe554.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Ile562 и Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Leu566 и Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe552 и Phe554, Ile562, Leu566 и Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe427.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с делецией по остатку Asp 425.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с делецией по остатку Phe 427.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Trp346.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Leu352.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Trp346, Met350 и Leu352.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Tyr148.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Tyr149.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Ile151.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Lys153.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Asp187.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Phe190.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Asp187, Leu188, Leu189 и Phe190.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Tyr137.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Tyr138.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Ile140.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Lys142.
Белок, кодируемый указанным фрагментом ДНК, экспрессируется в прокариотическом хозяине. Указанный прокариотический хозяин представляет собой штамм E. coli.
Белок, экспрессируемый генным ДНК-фрагментом, представляет собой РА дикого типа, LF дикого типа, EF дикого типа и их мутантные варианты.
Кроме того, в настоящем изобретении описан способ получения мутантного белка-токсина сибирской язвы, включающий:
- получение мутированных генов РА, LF и EF с использованием различных полученных с помощью мутагенных праймеров, таких, которые указаны здесь для ПЦР-реакции;
- обработку указанного мутантного ПЦР-продукта вместе с нативной матрицей с помощью фермента для расщепления этой нативной матрицы указанного ПЦР-продукта;
- трансформацию указанного мутантного продукта в штамме E. coli;
- выделение рекомбинантной конструкции из трансформируемого штамма E. coli и подтверждение требуемой мутации;
- трансформацию подтвержденной мутантной конструкции в соответствующем экспрессионном штамме E. coli для экспрессии мутантного белка и
- выделение очисткой указанного экспрессированного мутантного белка.
Эту очистку осуществляют с использованием Ni-NTA-хроматографии и/или других методов хроматографии.
Указанные гены клонируют в экспрессионном векторе PQE, содержащем промотор Т5 и 6Х гистидиновую метку.
Мутации затрагивают первый домен РА по остаткам 202, 203, 205. Мутации затрагивают третий домен РА по остаткам 552, 574, 552+554, 562+574, 566+574, 552+554+562+566+574, приводя к мутантным белкам, которые дефектны по олигомеризации. Мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 425 и 427 в петле 4 домена 2. Эти мутации нарушают способность РА к перемещению. Эти мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 346, 352 и 346+350+352 в петле 3 домена 2 так, что РА становится биологически неактивным. Эти мутации затрагивают 1-й домен LF по остаткам 148, 149, 151, 153, 187, 190 и 187+188+189+190, нарушая связывание LF с РА. Эти мутации затрагивают первые 250 остатков EF.
Противосибиреязвенная вакцина включает белок-токсин сибирской язвы, выбранный из РА дикого типа, или LF дикого типа, или EF дикого типа.
Противосибиреязвенная вакцина включает белок-токсин сибирской язвы, выбранный из мутантного РА или мутантного LF, или мутантного EF, или их сочетания.
Противосибиреязвенная вакцина включает белок-токсин сибирской язвы, выбранный из сочетания любого выбранного из РА дикого типа, LF дикого типа, или EF дикого типа с любым одним или несколькими факторами, выбранными из мутантного РА, мутантного LF, или мутантного EF.
Фармацевтическая композиция включает эффективное количество белка-токсина сибирской язвы, как заявлено в настоящем изобретении.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Идеальная вакцина против сибирской язвы должна содержать одновременно РА, LF, EF, но, вместе с тем, она должна быть нетоксичной и безопасной. Выделенные очисткой рекомбинантные белки определенного состава могут использоваться в вакцине для минимизации реактогенности вакцины. Кроме того, эти белки-токсины сибирской язвы могут оказаться нетоксичными при введении мутаций, которые влияют на биологическую активность указанных белков без воздействия на их структуру или иммуногенность. Эти нетоксичные мутантные белки-токсины сибирской язвы можно использовать совместно для создания безопасной, нереактогенной и эффективной рекомбинантной вакцины против сибирской язвы. Таким образом, первая цель настоящего изобретения заключается в создании способа получения безопасной и эффективной вакцины второго поколения против сибирской язвы, включающей нетоксичные белки-токсины сибирской язвы, которые получают с помощью сайт-направленного мутагенеза в разных функционально существенных доменах этих белков-токсинов.
Авторы настоящего изобретения подвергали ПЦР-амплификации гены РА, LF, EF. Они клонировали эти гены в экспрессионном векторе pQE30 (Gupta P., и соавт., 1998, Infect. Immun., 66, 862-865; Gupta P., и соавт., 1999, Protein Expr. Purif. 16, 369-376; Kumar P., и соавт., 2001, Infect. Immun., 69, 6532-6536). Этот вектор содержит промотор Т5 и 6х-гистидиновую метку, что позволяет легко очистить указанные рекомбинантные белки (Фиг.1).
Условия сверхэкспрессирования указанных генов с использованием вышеуказанных рекомбинантных плазмид из штаммов E. coli, были оптимизированы авторами настоящего изобретения (Chauhan V., и соавт., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283, 308-315).
Используя вышеуказанную рекомбинантную плазмиду, авторы настоящего способа вводили мутации в указанные гены для создания экспрессируемых рекомбинантных белков, дефектных по их биологической функции, делая их тем самым нетоксичными. Настоящее изобретение включает экспрессию и выделение очисткой указанных мутантных белков из штаммов E. coli. Кроме того, оно включает полную характеристику выделенных очисткой мутантных белков с точечным дефектом, который придает им нетоксичность.
МУТАЦИИ, ВВОДИМЫЕ В ЗАЩИЩАЮЩИЙ АНТИГЕН КАК ЧАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Мутации, которые делают РА дефектным для связывания с LF/EF. Авторы настоящего изобретения вводили ряд мутаций в 1-й домен РА. Среди введенных мутаций мутации по остаткам 202, 203, 205, 207 и 205+226+236 оказались дефектными для связывания с LF.
2. Мутации, которые делают РА дефектным для олигомеризации. Авторы настоящего изобретения вводили мутации в 3-й домен РА. Мутации по остаткам 552, 574, 552+554, 562+574, 566+574, 552+554+562+566+574 дают мутантные белки, которые оказались дефектными в олигомеризации.
3. Мутации, которые делают РА дефектным для перемещения. Авторы настоящего изобретения вводили мутации по остаткам 425 и 427 в петле 4 домена 2. Эти мутации нарушают способность РА к перемещению.
4. Мутации, которые делают РА дефектным для встраивания/транслокации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при введении мутаций по остаткам 346, 352 и 346+350+352 в петле 3 домена 2 РА становится биологически неактивным. Эти мутантные белки способны связываться с рецепторами клеточной поверхности, становясь протеолитически активными с образованием олигомеров и связываясь с LF. Биологическая инактивация этих мутантных белков может быть обусловлена дефектом по встраиванию/транслокации.
МУТАЦИИ, ВВОДИМЫЕ В ЛЕТАЛЬНЫЙ ФАКТОР, КАК ЧАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Мутации, которые делают LF дефектным для связывания с РА. Авторы способа вводили мутации в 1-й домен LF. Они обнаружили, что мутация по остаткам 148, 149, 151, 153, 187, 190 и 187+188+189+190 нарушает связывание LF с РА.
МУТАЦИИ, ВВОДИМЫЕ В ФАКТОР ОТЕЧНОСТИ, КАК ЧАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Мутации, которые делают EF дефектным для связывания с РА. Авторы способа вводили ряд мутаций в первые 250 остатков EF. Установлено, что мутация по остаткам 137, 138, 140 и 142 радикально нарушает связывание EF с РА.
После экспрессии и выделения очисткой мутантные белки оценивают по их биологической активности.
Авторы настоящего изобретения установили, что вышеуказанные мутанты РА при совместном добавлении с LF дикого типа оказываются нетоксичными для J774А.1-клеток. Также и мутанты LF, при совместном добавлении с РА дикого типа, оказываются нетоксичными для J774А.1-клеток. Аналогично при совместном добавлении с РА дикого типа мутанты EF неспособны производить цАМФ-токсичность в клетках СНО (Таблица 2).
Выделенный очисткой мутантный белок анализируют на предмет его биологической активности путем тестирования:
- Способности РА связываться с рецепторами клеточной поверхности,
- Способности РА связываться с LF или с EF,
- Способности РА к олигомеризации,
- Способности РА-олигомера встраиваться в мембрану,
- Способности РА перемещать LF или EF в цитозоль,
- Способности летального токсина уничтожать клеточные линии макрофагов, таких как RAW264.7 и J774A.1,
- Способности токсина отечности удлинять СНО-клетки.
ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ИММУНИЗАЦИИ
Защищающий антиген в соответствии со своим наименованием представляет собой высокоиммуногенный белок. Фактически он является необходимым компонентом вакцины против сибирской язвы. Иммунизация с помощью рекомбинантного РА дикого типа дает высокие титры антител к РА и обеспечивает защиту против летального заражения морских свинок сибирской язвой. Отмечено также, что мутантный РА оказывается столь же иммуногенным, как и РА дикого типа, и мог бы без труда заменить в вакцине РА дикого типа (Singh и соавт., 1998, Infect. Immun. 66, 3447-3448). Исследования по иммунизации свидетельствуют также о существенном вкладе LF/EF в иммунную защиту. На основании этих результатов авторы настоящего изобретения создали рекомбинантную вакцину против сибирской язвы, которая включает мутанты всех трех сибиреязвенных токсинов.
Рекомбинантная вакцина на основе сибиреязвенного токсина, созданная авторами настоящего изобретения, обладает следующими преимуществами:
1. Описанный здесь способ не предполагает использования культур B. anthracis (на любой стадии). Поэтому данный способ безопасен, рентабелен и не нуждается в использовании сложной аппаратуры.
2. Созданная авторами настоящего изобретения вакцина имеет четко определенный состав и поэтому не обладает какой-либо изменчивостью от партии к партии.
3. В описанном здесь изобретении используется выделенный очисткой сибиреязвенный белок-токсин. Вследствие этого сибиреязвенная вакцина второго поколения не является реактогенной и не может вызвать какой-либо побочный эффект в отличие от прежней вакцины.
4. Кроме того, настоящее изобретение включает нетоксичные мутантные белки, которые при введении (в отдельности или в сочетании) не вызывают какой-либо токсикогенности или патогенности, которые обусловлены использованием существующей вакцины.
5. Поэтому описанное здесь изобретение является безопасным и пригодным для использования на животном/человеке.
ПОДРОБНОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ
Сайт-направленный мутагенез белков-токсинов сибирской язвы
Для введения требуемых мутаций в белки-токсины сибирской язвы используют комплементарные мутагенные праймеры (ссылка на Таблицу 1) для амплификации генов дикого типа токсинов сибирской язвы (РА или LF, или EF). В ПЦР-реакции используют высокоточную ДНК-полимеразу Pfu. В течение нескольких циклов на амплификаторе амплифицируют обе полноразмерные цепи плазмидной ДНК, получая мутантную плазмиду со ступенчатыми разрывами на противоположных цепях (Фиг.2). Результаты амплификации контролируют с помощью агарозного гель электрофореза полученных ПЦР-продуктов. Продукт амплификации обрабатывают с помощью DpnI, которая специфически расщепляет полностью метилированные Gme6 АТС-последовательности. Эту реакцию расщепления осуществляют в 20 мкл реакционном объеме со 100 нг амплифицированного продукта, 2 мкл 10Х DnpI-реакционного буфера и 0,1 Ед. DpnI. После DpnI-обработки DpnI-резистентные молекулы, которые богаты требуемыми мутантами, собирают путем трансформации ДНК в соответствующий штамм E. coli. Мутации подтверждают секвенированием вышеуказанных конструкций с использованием набора для циклического секвенирования ДНК (Perkin Elmer).
Экспрессия и выделение очисткой мутантных белков-токсинов сибирской язвы
Подтвержденные конструкции трансформируют в экспрессионные штаммы E. coli, экспрессирующие Т5-РНК-полимеразу. Трансформированные клетки выращивают на среде Луриа (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, при 37°С, до ОП600 0,8. Затем осуществляют индукцию с помощью 0,5 мМ IPTG и продолжают инкубацию при 37°С в течение 3-4 часов. Клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут. Затем центрифугированные клетки лизируют. Белковый профиль анализируют с помощью SDS-электрофореза в ПААГ и вестерн-блоттинга. Мутантные РА белки выделяют очисткой с использованием металл-хелатной Ni-NTA-хроматографии по сродству и других хроматографических методов (Kumar P., и соавт., 2001, Infect. Immun., 69, 6532-6536; Gupta P., и соавт., 1998, Infect. Immun., 66, 862-865; Gupta P., и соавт., 1999, Protein Expr. Purif. 16, 369-376). Выделенные очисткой мутантные белки анализируют с помощью SDS-электрофореза в ПААГ и вестерн-блоттинга и оценивают с использованием метода Бредфорда. Для хранения выделенные очисткой белки диализуют против 50 мМ HEPES и хранят в виде аликвотов при -70°С.
Культура клеток
Макрофагоподобную клеточную линию J774A.1 поддерживают в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной нагреванием FCS, 25 мМ HEPES, 100 Ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина во влажной среде с 5% СО2 при 37°С.
СНО-клетки поддерживают в среде EMEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием FCS, 25 мМ HEPES, 100 Ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина во влажной среде с 5% СО2 при 37°С.
Для изучения биологической активности РА дикого типа или его мутантных белков различные концентрации этих белков добавляют вместе с LF (1мкг/мл) к клеткам J774A.1, помещенным в 96-луночные планшеты. Инкубируют в течение 3-х часов при 37°С, после чего определяют жизнеспособные клетки (Bhatnagar и соавт., 1989, Infect. Immun., 57, 2107-2114) с использованием красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтеразолийбромида (MTT) (Bhatnagar R., и соавт., 1999, Cell Signal., 11, 111-116). MTT, растворенный в RPMI, приливают в каждую лунку до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубируют в течение последующих 45 мин при 37°С для поглощения и окисления красителя жизнеспособными клетками. Эту среду меняют на 0,5% (масс./об.) натрийдодецилсульфат (SDS), 25 мМ HCl в 90% изопропиловом спирте и планшет встряхивают на приборе для встряхивания и перемешивания. Считывают поглощение при 540 нм с использованием спектрофотометра для микроплашек (BIORAD).
Подобным образом для исследования биологической активности LF дикого типа или его мутантных белков различные концентрации этих белков добавляют вместе с РА (1 мкг/мл) к клеткам J774A.1, помещенным в 96-луночные планшеты. Инкубируют в течение 3-х часов при 37°С, после чего определяют жизнеспособные клетки с использованием красителя MTT, как подробно описано выше.
Для исследования биологической активности EF дикого типа или его мутантных белков различные концентрации этих белков добавляют вместе с РА (1 мкг/мл) к СНО-клеткам, помещенным в 96-луночные планшеты. Инкубируют в течение 3-х часов при 37°С, после чего при помощи микроскопа определяют удлинение клетки. Определяют нарастание уровня цАМФ в клетках при обработке токсином (Kumar P., и соавт., 2001, Infect. Immun., 69, 6532-6536) с помощью cAMP-EIA-набора от Amersham Pharmacia.
В последующих экспериментах выясняют, каким образом мутации влияют на биологическую активность мутантных белков-токсинов сибирской язвы.
Связывание РА с рецепторами клеточной поверхности
Клетки J774A.1 выращивают в 24-луночных планшетах до слияния перед инкубацией с 1 мкг/мл РА дикого типа или его мутантным белком при 4°С в течение 2-х часов. Затем выращенные клетки промывают охлажденной средой RPMI, растворяют в SDS-лизирующем буфере и подвергают SDS-электроблоттированию в ПААГ. Полученный блот проявляют с помощью антител к РА для анализа связывания РА дикого типа или его мутантного белка с рецепторами клеточной поверхности.
Протеолитическое расщепление РА и мутантных белков в растворе
РА дикого типа и его мутантные белки тестируют на чувствительность к расщеплению трипсином. Белки (1,0 мг/мл) инкубируют с 1 мкг/мл трипсином в течение 30 минут при комнатной температуре в 25 мМ HERES, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ ЭДТА рН 7,5. Реакцию расщепления останавливают добавлением PMSF в концентрации 1 мМ. Для SDS-электрофореза в ПААГ полученные образцы кипятят в течение 5 минут в SDS-буфере для образцов и разделяют SDS-электрофорезом в 12%-м ПААГ.
Связывание РА с LF на поверхности клеток
Клетки J774A.1 дважды промывают RPMI и затем инкубируют с 1 мкг/мл РА дикого типа или его мутантного белка при 4°С в течение 3-х часов. После чего эти клетки промывают холодным RPMI для удаления несвязавшегося белка. Далее промытые клетки инкубируют с LF (1,0 мкг/мл) в течение 3-х часов и затем промывают холодным RPMI для удаления несвязавшегося LF. Эти клетки растворяют в SDS-лизирующем буфере и подвергают SDS-электрофорезу в ПААГ для электроблоттирования. Полученный блот проявляют с помощью антител к LF для анализа связывания РА дикого типа или его мутантного белка с LF.
Олигомеризация РА в растворе
При протеолитическом расщеплении РА олигомеризуется с образованием гептамеров. Для изучения способности РА дикого типа и его мутантных белков образовывать олигомеры указанные белки (1 мг/мл) расщепляют с помощью трипсина в течение 30 минут при 25°С. Расщепленные образцы переносят в рН 5,0 после добавления 1 М Трис рН 5,0 до конечной концентрации 100 мМ и кипятят в течение 5 минут в SDS-буфере для образцов (0,0625 М Трис-Cl, 1,25% SDS, 2,5% β-меркаптоэтанола и 5% глицерина, рН 6,8) перед загрузкой в 3-12%-й градиентный гель. Осуществляют окрашивание серебром для детекции образования олигомеров.
Связывание LF/EF с РА, связанным с клеточной поверхностью
Клетки J774A.1 промывают холодным RPMI после чего инкубируют с 1 мкг/мл РА дикого типа при 4°С в течение 3-х часов. Эти клетки вновь промывают холодным RPMI для удаления несвязавшегося белка. Затем добавляют LF/EF дикого типа или их мутантные белки (1,0 мкг/мл) и продолжают инкубацию в течение 3-х часов. Затем инкубированные клетки промывают холодным RPMI для удаления несвязавшихся LF/EF. Позже эти клетки растворяют в SDS-лизирующем буфере и подвергают SDS-электрофорезу в ПААГ для электроблоттирования. Полученный блот проявляют с помощью антител к LF/EF для исследования связывания LF/EF с РА, связавшегося с клеточной поверхностью.
ТАБЛИЦА 1
| ОСТАТОК | ЗАМЕНА | ПРАЙМЕРЫ | ДОМЕН | ДЕФЕКТ |
| РА-мутанты: | ||||
| Phe202 | На аланин | 5'CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGCTGAAAG | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Leu203 | На аланин | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAGCAAAAGT | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Pro205 | На аланин | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAAGAGCAGTTCT | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Ile207 | На аланин | TTTGGTTAACCCTTTCTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGT GAAAGAAAAGTTCTTTTATTTTTGACATCAACCGTATATCCTT CTACCTCTAATGAATCAGCGATTCC | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Pro205 +Trp226 +Phe236 | На аланин | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAAGAGCAGTTCT и GGATTTCTAATATTCATGAAAAGAAAGGATTAACCAAATATA AATCATCTCCTGAAAAAGCGAGCACGGCTTCTGATCCGTACA GTGATGCCGAAAAGGTT | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Phe552 | На аланин | CAAGGGAAAGATATCACCGAATTTGATGCTAATTTCGATC | III | Дефектная олигомеризация |
| Ile574 | На аланин | GAATTAAACGCGTCTAACGCATATACTG | III | Дефектная олигомеризация |
| Phe552 +Phe554 | На аланин | ATTTTGAGATGTTTGTTGATCGGCATTAGCATCAAATTC | III | Дефектная олигомеризация |
| Ile562 +Ile574 | На аланин | CAGTATATGCGTTAGACGCGTTTAATTCCGCTTAACTGATTCT TGGCATTTTGAGATG | III | Дефектная олигомеризация |
| Leu566+Ile574 | На аланин | ATCAGGCAGCGGAATTAAACGCGTCTAACGCATATACTG | III | Дефектная олигомеризация |
| Phe552 +Phe554 + Ile562+Leu566+ Ile574 | На аланин | CAGTATATGCGTTAGACGCGTTTAATTCCGCTGCCTGATTCTT GGCATTTTGAGATG и ATTTTGAGATGTTTGTTGATCGGCATTAGCATCAAATT | III | Дефектная олигомеризация |
| Phe427 | На аланин | GTAATTGGAGTAGAACTGGCATCGTCTTGTGC | II | Дефектная транслокация |
| Asp425 | Остаток делетирован | GTAATTGGAGTAGAACTGAAATCTTGTTCATTTAATGCG | II | Дефектная транслокация |
| Phe427 | Остаток делетирован | GCACAAGACGATAGTTCTACTCCAATTAC | II | Дефектная транслокация |
| Trp346 | На аланин | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAA С TGCGGCTGAAACAATG | II | Мембранная вставка/ транслокация дефектна |
| Leu 352 | На аланин | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAA CTTGGGCTGAAACAATGGGTGCAAATACCGCTGAT | II | Мембранная вставка/ транслокация дефектна |
| Trp 346, Met 350 и Leu 352 | На аланин | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAA CTGCGGCTGAAACAGCGGGTGCAAATACCGCTGAT | II | Мембранная вставка/ транслокация дефектна |
| LF-мутанты: | ||||
| Туr148 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTGCTTAT | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Туr149 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGCTGAA | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Ile151 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGAAGCAGGT | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Lys153 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGAAATAGGT GCAATA | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Asp 187 | На аланин | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAAATAAAAGAGCTTGT | I | Дефектное |
| TCATCTGA | связывание с защищающим антигеном | |||
| Phel90 | На аланин | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAGCTAAAAGATCTTG | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Asp187, Leu188, Leu189, Phe190 | На аланин | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAGCTGCAGCAGCTTGT TCATCTGA | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| EF-мутанты: | ||||
| Туr137 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC ТТТ СС ААТ ТТС AGC АТА ТАС ТТС ТТТ ACT TTG ТТС АС | Дефектное связывание с защищающим антигеном | |
| Туr138 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC ТТТ СС ААТ ТТС АТА A GCT АС ТТС ТТТ ACT TTG ТТС АС | Дефектное связывание с защищающим антигеном | |
| Ile140 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC ТТТ CCAGCTTC АТА AT AT AC ТТС ТТТ ACT TTG ТТС AC | Дефектное связывание с защищающим антигеном | |
| Lysl42 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC GCT СС ААТ ТТС АТА АТАТАС ТТС ТТТ ACT TTG ТТС АС | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
ТАБЛИЦА 2: ХАРАКТЕРИСТИКИ МУТАНТОВ
| МУТАЦИЯ В PA | СВЯЗЫВАНИЕ С РЕЦЕПТОРОМ | РАСЩЕПЛЕНИЕ ТРИПСИНОМ | ОБРАЗОВАНИЕ ОЛИГОМЕРА | СВЯЗЫВАНИЕ LF/EF | ТОКСИЧНОСТЬ |
| Phe202Ala | + | + | + | - | - |
| Leu203Ala | + | + | + | - | - |
| Pro205Ala | + | + | + | - | - |
| Ile207Ala | + | + | + | - | - |
| Pro205Ala + Trp226Ala + Phe236Ala | + | + | + | - | - |
| Phe552Ala | + | + | - | - | - |
| Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe552Ala + Phe554Ala | + | + | - | - | - |
| Ilе562А1а + Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Leu566Ala + Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe552Ala + Phe554Ala+ Ilе562А1а + Leu566Ala + Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe427Ala | + | + | + | + | - |
| Asp425del | - | + | + | + | - |
| Phe427del | + | + | + | + | - |
| Trp346Ala | + | + | + | + | - |
| Leu352Ala | + | + | + | - | |
| Trp346Ala+ Met350Ala+ Leu352Ala | + | + | + | + | - |
| МУТАЦИЯ B LF | СВЯЗЫВАНИЕ С PA | ТОКСИЧНОСТЬ | |||
| Tyr148Ala | - | - | |||
| Tyr149Ala | - | - | |||
| Ile151Ala | - | - | |||
| Lys153Ala | - | - | |||
| Asp187Ala | - | - | |||
| Phe190Ala | - | - | |||
| Asp187Ala+Leu188Ala+ Phe190Leu189Ala | - | - | |||
| МУТАЦИЯ В EF | СВЯЗЫВАНИЕ С PA | ТОКСИЧНОСТЬ | |||
| Tyr137Ala | - | - | |||
| Tyr138Ala | - | - | |||
| Ile140Ala | - | - | |||
| Lys142Ala | - | - |
1. Рекомбинантная ДНК-конструкция для экспрессии белка-токсина Bacillus anthracis, включающая:
a) экспрессирующий вектор,
b) ДНК-фрагмент, включающий гены, кодирующие мутантный защищающий антиген (РА) или мутантный летальный фактор (LF), или мутантный фактор отечности (EF), где
i) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe202 заменен на аланин,
ii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Leu203 заменен на аланин,
iii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Рго205 заменен на аланин,
iv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Ile207 заменен на аланин,
v) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Рrо205, Тrр226 и Phe236 заменены на аланин,
vi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe552 заменен на аланин,
vii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Ile574 заменен на аланин,
viii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe552 и Phe554 заменены на аланин,
ix) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Ile562 и Ile574 заменены на аланин,
х) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Leu566 и Ile574 заменены на аланин,
xi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe552 и Phe554, Ile562, Leu566 и Ile574 заменены на аланин,
xii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe427 заменен на аланин,
xiii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, с делецией по остатку Asp 425 в аминокислотной последовательности,
xiv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, с делецией по остатку Phe 427 в аминокислотной последовательности,
xv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Тrр346 заменен на аланин,
xvi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Leu352 заменен на аланин,
xvii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Trp346, Met350 и Leu352 заменены на аланин,
xviii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Tyr148 заменен на аланин,
xix) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Tyr 149 заменен на аланин,
хх) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Ile 151 заменен на аланин,
xxi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Lys 153 заменен на аланин,
xxii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Asp 187 заменен на аланин,
xxiii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Phe 190 заменен на аланин,
xxiv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Asp 187, Leu 188, Leu 189 и Phe 190 заменены на аланин,
xxv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Tyr 137 заменен на аланин,
xxvi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Tyr 138 заменен на аланин,
xxvii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Ile 140 заменен на аланин,
xxviii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Lys 142 заменен на аланин.
2. Рекомбинантная ДНК-конструкция по п.1, в которой указанный экспрессионный вектор представляет собой прокариотический вектор.
3. Рекомбинантная ДНК-конструкция по п.2, в которой указанный прокариотический вектор представляет собой PQE 30.
4. Рекомбинантная ДНК-конструкция по п.3, в которой указанный экспрессионный вектор содержит Т5-промотор и 6Х гистидиновую метку.
5. Способ получения мутагенизированных белков PA, LF и EF токсина сибирской язвы, где указанный способ включает следующие стадии:
a) получение мутантных генов, кодирующих мутантные белки-токсины PA, LF и EF, с использованием разных комплементарных мутагенных праймеров для ПЦР,
b) обработка указанного мутантного ПЦР-продукта вместе с нативной матрицей, полученной на стадии (а), ферментом, который расщепляет эту нативную матрицу указанного ПЦР- продукта,
c) трансформация указанного мутантного продукта в прокариотическом хозяине,
d) выделение рекомбинантной ДНК-конструкции, охарактеризованной в пп.1-4, из трансформированного прокариотического хозяина и подтверждение наличия требуемой мутации,
e) трансформация подтвержденной мутантной конструкции в соответствующем прокариотическом хозяине для экспрессии мутантного белка, и
f) очистка указанного экспрессируемого мутантного белка.
6. Способ по п.5, в котором прокариотическим хозяином является штамм Е. coli.
7. Способ по п.5, в котором указанный фермент представляет собой DpnI- фермент, который специфически расщепляет полностью метилированные Gme6 АТС-последовательности.
8. Способ по п.5, в котором указанные гены клонируют в экспрессионном векторе PQE, содержащем Т5-промоторы и 6Х гистидиновую метку.
9. Способ по п.5, в котором указанную очистку осуществляют с использованием Ni-NTA хроматографии и/или других хроматографических технологий.
10. Способ по п.5, в котором
a) мутации затрагивают первый домен РА по остаткам 202, 203 и 205,
b) мутации затрагивают третий домен РА по остаткам 552, 574, 552+554,562+574,566+574 и 552+554+562+566+574,
c) мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 425 и 427 петли 4 домена 2,
d) мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 346, 352 и 346+350+352 в петле 3 домена 2,
e) мутации затрагивают 1-й домен LF по остаткам 148, 149, 151, 153, 187,190 и 187+188+189+190,
f) мутации затрагивают 1-е 250 остатков EF.
11. Мутантный белок-токсин Bacillus anthracis, обладающий иммуногенными свойствами, экспрессируемый рекомбинантной ДНК-конструкцией по п.1 и полученный способом по п.5.
12. Противосибиреязвенная вакцина, включающая мутантный белок - токсин Bacillus anthracis, выбранный из мутантного РА, или мутантного LF, или мутантного EF, или их комбинации.
13. Противосибиреязвенная вакцина, включающая один или более мутантных белков-токсинов Bacillus anthracis, охарактеризованных в п.11, в комбинации с белком-токсином Bacillus anthracis PA, LF или EF дикого типа.
