Средство для лечения ишемических поражений мозга
Владельцы патента RU 2288714:
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова Российской Академии медицинских наук (RU)
Изобретение относится к медицине и касается средства для лечения ишемических поражений мозга. В качестве такового предложено анксиолитическое средство 5-этокси-2-[2-(морфолино)этилтио]бензилимидазола дигидрохродид (АФОБАЗОЛ), которое обладает выраженной нейропротекторной активностью и может быть рекомендовано в качестве средства для лечения ишемического инсульта и других ишемических поражений мозга. 3 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается средства, обладающего противоишемической и нейропротекторной активностью, которое может быть рекомендовано к применению в клинической практике для лечения ишемического инсульта и других ишемических состояний мозга. Ишемические поражения мозга в большинстве развитых стран занимают одно из ведущих мест среди основных причин смертности и инвалидизации населения. При ишемическом инсульте центральный инфаркт окружен ишемизированной, но живой зоной «ишемической полутени» или «пенумбры», где еще сохранен в целом энергетический метаболизм и имеют место лишь функциональные, но не структурные изменения. Эта область мозга и подлежит фармакологической коррекции, целью которой является восстановление кровоснабжения, метаболизма и функционального состояния поврежденной зоны. Церебральная ишемия характеризуется значительным высвобождением глутамата и других возбуждающих нейромедиаторных аминокислот, которые играют ключевую роль в развитии некротического поражения нервных клеток. Установлена взаимосвязь между нейротоксичностью глутамата и транспортом ионов кальция в нервной ткани.
Многочисленные исследования последних лет, посвященные изучению нейропротекторной активности блокаторов кальциевых каналов, позволили выявить препарат нимодипин (РЛС, Энциклопедия лекарств, 2004 г., 11), который в настоящее время применяется в неврологической практике при лечении больных с цереброваскулярными расстройствами. Однако литературные данные, посвященные изучению его эффективности при ишемическом поражении головного мозга, не отличаются однородностью, так как нимодипин понижает уровень артериального давления и это негативно влияет на кровоснабжение ишемизированной области мозга. Что касается антагонистов глутаматных рецепторов, то несмотря на положительные результаты экспериментального изучения соединения МК-801 (дизоцилпин) (Kemp et al., Trens Pharmacol. Sci., v.10, p.294-298, 1987), его клинические испытания были прекращены из-за серьезных побочных эффектов
Все это свидетельствует о необходимости поиска новых путей фармакологической коррекции ишемических поражений головного мозга. В соответствии с вышеизложенным, перспективным направлением исследований является изыскание средств, способных противодействовать постишемической активации возбуждающей нейротрансмиссии путем повышения активности тормозной ГАМК-ергической системы. Подобный подход к защите ишемизированного мозга основан еще и на том, что в избирательно уязвимых к ишемии регионах, наряду с высокой плотностью кальциевых каналов, контролируемых NMDA-рецепторами, обнаружено множество ГАМК-ергических нервных окончаний. Действительно, если в норме механизмы возбуждения и торможения находятся в состоянии устойчивого равновесия, то в условиях ишемии развивается дисбаланс между возбуждающими и тормозными нейромедиаторными системами. Указанный дисбаланс характерен не только для ишемического поражения мозга, но и для состояния патологической тревожности (Lydiard, J., Clin Psychiatry; v.64 (3), pp.21-27, 2003).
Необходимо также отметить, что инсульт довольно часто сопровождается повышенным чувством тревожности (Schultz S.K. et al., Am. J. Geriat. Psych.; 5, 229-237, 1997). Установлено, что у 25-50% больных с острыми цереброваскулярными нарушениями развиваются генерализованные тревожные расстройства, которые регистрируются даже через три года после перенесенного ишемического инсульта (Carota A. et al., Neurology, v.15, pp.57-69, 2002). Психоневрологические последствия цереброваскулярных нарушений охватывают довольно широкий спектр эмоциональных и когнитивных расстройств, проявление которых имеет исключительно важное значение для клинической оценки результатов лечения инсульта (Truelsen Т., Bonita R., Adv. Neurol, v.92, pp.1-12, 2003).
Сущность изобретения заключается в разработке лекарственного средства, которое обладает нейропротекторной активностью и может явиться средством для уменьшения ишемических повреждений мозга. С этой целью было изучено нейропротекторное действие афобазола - оригинального селективного анксиолитика, разработанного в НИИ фармакологии РАМН (Середенин С.Б. и соавт., Производные меркаптобензимидазола, обладающие селективной анксиолитической активностью. Патент Российской Федерации №2061686, Бюллетень изобретений, №16, 1996). Выбор афобазола был продиктован особенностями механизма его действия. Так, в экспериментальных исследованиях было показано, что препарат препятствует развитию мембранозависимых изменений в ГАМК-бензодиазепиновом рецепторном комплексе, приводящих к снижению доступности рецепторного участка для лиганда, т.е. афобазол повышает аффинность эндогенного лиганда к рецептору, способствуя тем самым усилению ГАМК-ергической передачи (Середенин С.Б. и соавт., Вестник РАМП, №11, с.3-9, 1998). Данные клинического изучения афобазола подтвердили наличие у препарата анксиолитического действия с активирующим компонентом при отсутствии седативного, миорелаксантного эффектов (Незнамов Г.Г. и соавт., Экспериментальная и клиническая фармакология, т.64, №2, с.15-19, 2001).
Фармакологическая активность афобазола оценивалась по тестам, принятым для оценки нейропротекторной активности («Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ», Москва, 2000). При этом исследовалось морфологическое состояние, активность сукцинатдегидрогеназы в ткани мозга и поведение животных, в условиях локального ишемического поражения мозга. В качестве модели локальной ишемии была избрана модель перевязки средней мозговой артерии Tamura et al. в модификации Топчяна А.В. и соавт.(Экспериментальная и клиническая фармакология, т.59, №5, с.62-64, 1996). Окклюзия средней мозговой артерии вызывает ишемические нарушения, типичные для большинства клинических проявлений цереброваскулярных расстройств ишемической природы.
Оценка состояния микроциркуляции в условиях перевязки средней мозговой артерии проводилась регистрацией локального кровотока в теменной области коры головного мозга крыс с помощью лазерного допплеровского флоуметра ALF - 21 фирмы «Transonic systems. Inc.» США. Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8 мм устанавливали с помощью микроманипулятора и коромысла в теменной области коры головного мозга на расстоянии 6-7 мм дистальнее основания средней мозговой артерии по направлению к ее центральной ветви. Одновременно проводили регистрацию уровня артериального давления электроманометром BPR-01 «Экспериметрия» (Венгрия). Напряжение углекислоты регистрировали с помощью накожного датчика ТСМ-20 «Radiometer» (Дания), который был установлен на мышцах грудной клетки животного.
Опыты показали, что сразу же после перевязки средней мозговой артерии в теменной области коры головного мозга локальный мозговой кровоток понижается на 85,0±9,0% и продолжает оставаться на низком уровне в течение всего эксперимента (60-120 минут). При этом, не наблюдалось существенных изменений уровня артериального давления и напряжения углекислоты в мышечной ткани.
Результаты гистологического исследования позволили заключить, что использованная модель ишемического инсульта, вызванная нарушением кровоснабжения в бассейне средней мозговой артерии, к 6 суткам после перевязки средней мозговой артерии (ОСМА) характеризуется формированием ишемического очага. В связи с этим все эффекты афобазола в условиях локальной ишемии были исследованы через 6 суток после окклюзии средней мозговой артерии, а также в отдаленные сроки ишемии - через 12 дней. Афобазол вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг сразу же после перевязки средней мозговой артерии, а затем дважды в день в той же дозе в течение 6 суток
При исследовании влияния афобазола на динамику морфологических изменений головного мозга крысы в условиях локальной ишемии мозга было установлено, что афобазол значительно уменьшает зону ишемии, которая ограничена небольшим участком (зона пирамидальной коры). Мягкая мозговая оболочка несколько отечная, сосуды ее полнокровные (в зоне повреждения). На этом же участке отмечается умеренная инфильтрация мозговой оболочки лимфоцитами со скудной примесью нейрофилов. Со стороны мягкой мозговой оболочки по направлению к зоне повреждения наблюдается наползание макрофагов в виде компактного тяжа. В самой зоне ишемии наблюдается выраженный глиоз. Здесь же наблюдаются пикноморфные нейроциты, у которых зачастую имеется хорошо сохранившееся ядро. В зоне формирующегося рубца обнаруживаются предсуществующие и новообразованные капилляры. Область CPu в обоих полушариях хорошо сохранена, без заметных патологических изменений (в отличие от нелеченных крыс, у которых зачастую развивался некроз CPu на стороне перевязки). Правое (противоположное) полушарие по всем полям не отличается от такового у интактных крыс. В левом полушарии (сторона перевязки) по всем слоям коры выявляются гиперхромные и пикнотичные нейроциты. В полях Par1 и Раr2 в V слое коры (слева) выявляются единичные пикнотичные нейроциты. Сосудистые сплетения боковых и III желудочка без патологических изменений.
При лечении животных афобазолом в течение 12 суток было установлено, что зона ишемии по сравнению с 6 сутками применения препарата еще более уменьшена в размерах в результате сформировавшегося глиального рубца. В обеих сериях опытов на фоне лечения афобазолом со стороны сосудов вещества мозга как ипси-, так и контралатерального полушарий явления вазодилатации, вазоконстрикции или дистонии не были обнаружены, в отличие от таковых у нелеченных крыс.
Результаты морфологического исследования по изучению влияния афобазола на структурные изменения, вызванные окклюзией средней мозговой артерии, свидетельствуют о выраженном защитном эффекте препарата. В первую очередь следует отметить хорошую сохранность CPu, т.е. стриопаллидарной системы, которая более всего страдала у ишемизипрованных крыс. После применения афобазола зона ишемического некроза коры оказывается четко ограниченной (пенумбра практически отсутствует) и характеризуется ранней реперфузией. При применении препарата отмечается и хорошая сохранность нейроцитов: афобазол оказывает выраженное протективное воздействие в отношении нейроцитов базальных и гипоталамических ядер.
Афобазол способствует также и хорошей сохранности нейроцитов коры контралатерального полушария. В симметричных полях коры ипсилатерального полушария в значительной степени уменьшается выраженность гипоксических повреждений нейроцитов.
Обращает на себя внимание тот факт, что афобазол способствует нормализации мозгового кровообращения в обоих полушариях, что указывает на то, что препарат, по всей вероятности, воздействует на нейромедиаторную систему, предотвращая расстройства мозгового кровообращения в виде дистонии, полнокровия и тромбоза мозговых сосудов.
Итак, в условиях локального ишемического повреждения проявляется выраженный защитный эффект препарата на все структурные компоненты головного мозга крыс.
Полученные данные послужили основанием для исследования влияния афобазола на активность одного из ферментов цикла трикарбоновых кислот - сукцинатдегидрогеназы (СДГ). В литературе имеются убедительные доказательства непосредственной связи между энергетическим состоянием нейронов и глутаматной нейротоксичностью (Zeevalk G.D. and Nicklas W.J., J. Neurochem., v.59, pp.1211-1220, 1992). Получены также данные об изменениях энергетического метаболизма организма при развитии тревожности.
В связи с вышеизложенным целью данной серии экспериментов явилось исследование эффектов афобазола на активность СДГ в условиях локальной ишемии, вызванной перевязкой средней мозговой артерии у крыс.
Эксперименты по изучению активности СДГ в обоих полушариях мозга в условиях локальной ишемии показали, что перевязка средней мозговой артерии сопровождается понижением активности фермента различной выраженности. При этом, наибольшее угнетение активности сукцинатдегидрогеназы отмечается через 24 часа после перевязки средней мозговой артерии, составляя 31% по сравнению с контрольной величиной. К 6 суткам окклюзии отмечается тенденция к восстановлению активности фермента, которая в дальнейшем продолжает снижаться и к 12 суткам ишемии оказывается ниже контрольного уровня более чем в 2 раза. Аналогичные изменения в активности СДГ, но меньшей выраженности, регистрируются и в контралатеральном полушарии мозга (табл.1).
Исследование эффектов афобазола на активность СДГ в условиях локального ишемического поражения мозга показало, что на фоне внутрибрюшинного введения афобазола (в дозе 1 мг/кг сразу же после перевязки, затем дважды в день) активность фермента в течение 24 часов не только сохраняется на контрольном уровне, но и несколько превосходит исходное значение. В дальнейшем отмечается падение активности СДГ, однако намного слабее, чем у нелеченных крыс после ОСМА. Важно отметить, что на противоположной стороне максимальный эффект препарата регистрируется не через 24 часа, а через 6 суток после введения афобазола.
| Таблица 1. | ||
| Влияние афобазола на изменение активности СДГ в условиях локальной ишемии, вызванной ОСМА. | ||
| Активность СДГ (нмоль сукцината/мин на 1 мг белка) | ||
| Сторона перевязки | Контралатеральная сторона | |
| Контроль | 4,5±0,34 | |
| ОСМА | ||
| 24 часа (n=9) | 3,08±0,3* | 3,51±0,22* |
| 6 суток (n=8) | 3,46±0,18* | 3,78±0,6 |
| 12 суток (n=8) | 1,64±0,14* | 1,86±0,22* |
| ОСМА + афобазол (1 мг/кг, внутрибрюшинно) | ||
| 24 часа (n=11) | 4,74±0,78** | 3,72±0,12 |
| 6 суток (n=12) | 3,78±0,24 | 4,36±0,22** |
| 12 суток n=8 | 2,56±0,22** | 2,72±0,26** |
| Примечание: * - Р<0,01 по сравнению с контролем. | ||
| ** - Р<0,01 по сравнению с ишемией. |
К 12 суткам после перевязки средней мозговой артерии и на фоне действия афобазола активность фермента выше показателей, которые наблюдаются при ОСМА без применения препарата.
Таким образом, полученные данные дают основание предположить, что в проявлении защитного эффекта афобазола, возможно, участвует и активация препаратом энергетического обмена мозговой ткани путем повышения активности сукцинатдегидрогеназы, угнетенной ишемическим поражением.
Для исследования влияния афобазола на тревожность, развиваемую ишемическим нарушением, сразу же после перевязки средней мозговой артерии животным внутрибрюшинно вводили афобазол в дозе 1 мг/кг, в которой препарат проявляет максимальный анксиолитический эффект. Далее введение препарата продолжали в той же дозе дважды в сутки. В первой серии экспериментов афобазол вводился в течение 6 дней после перевязки средней мозговой артерии, во второй серии - введение препарата продолжалось в течение 12 суток после ишемии.
Статистический анализ данных, представленных в таблицах 2 и 3, свидетельствует о выраженном анксиолитическом эффекте препарата в условиях ишемии. Препарат довольно эффективно предотвращает развитие тревожности, вызванное перевязкой средней мозговой артерии. При этом, было показано, что действие афобазола возрастает при его применении в течение 12 суток после перевязки средней мозговой артерии.
Таким образом, селективный анксиолитик афобазол оказывает выраженное нейропротекторное действие при моделировании in vivo ишемического инсульта. В условиях локального ишемического поражения, вызванного перевязкой средней мозговой артерии, препарат защищает головной мозг от морфологических нарушений и изменений активности сукцинатдегидрогеназы, а также препятствует развитию тревожности у крыс.
| Таблица 2. | |||
| Поведение крыс в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) через 6 дней после ОСМА и применения афобазола (M±SD). | |||
| Параметры ПКЛ | Контроль (n=23) | ОСМА 6 дней (n=8) | Афобазол (1 мг/кг, в/б, n=10) |
| Число заходов в открытые рукава | 2,57±0,95 | 0,95±0,53** | 3,30±0,82** (P1) |
| Время в открытых рукавах (сек) | 33,52±3,86 | 17,25±11,1* | 34,80±4,64** (P1) |
| % заходов в открытые рукава | 27,25±9,69 | 19,38±14,2 | 55,1±10,42** (P1) |
| % времени в открытых рукавах | 11,17±1,29 | 5,78±1,48** | 11,5±1,55** (Р1) |
| Число заходов в закрытые рукава | 6,91±1,38 | 3,93±0,92** | 2,70±0,82 (P1) |
| Время в закрытых рукавах (сек) | 186,78±10,32 | 229,5±11,7** | 199,40±13,71 (P1) |
| Время в центре лабиринта (сек) | 79,70±9,86 | 52,88±11,15** | 66,6±13,4 (P1) |
| Общее число заходов в рукава | 9,48±1,12 | 4,88±1,16** | 6,00±1,05* (P1) |
| Обозначения: Р - по сравнению с контролем; P1 - по сравнению с перевязкой; * - Р, P1<005; ** - Р, Р1<001. |
| Таблица 3. | |||
| Поведение крыс в тесте приподнятого крестообразного лабиринта через 12 дней после ОСМА и применения афобазола (М±m) | |||
| Параметры ПКЛ | Контроль (n=23) | ОСМА 12 дней (n=8) | Афобазол (1 мг/кг, в/б, n=8) |
| Число заходов в открытые рукава | 2,57±0,95 | 1,13±0,83 | 4,63±0,74** (P1) |
| Время в открытых рукавах (сек) | 33,52±3,86 | 20,25±12,89* (Р) | 40,50±8,54** (P1) |
| % заходов в открытые рукава | 27,25±9,69 | 25,42±16,87 (Р) | 46,25±5,97** (P1) |
| % времени в открытых рукавах | 17±1,29 | 6,75±4,30** (Р) | 13,5±2,85** (Р1) |
| Число заходов в закрытые рукава | 6,91±1,38 | 2,88±0,64 | 5,38±0,74 (P1) |
| Время в закрытых рукавах (сек) | 186,78±10,32 | 225,0±19,71 (Р) | 197,13±12,23 (P1) |
| Время в центре лабиринта (сек) | 79,70±9,86 | 54,75±7,70** (Р) | 62,75±17,89* (P1) |
| Общее число заходов в рукава | 9,48±1,12 | 4,00±1,07** (Р) | 10,00±0,93** (P1) |
| Обозначения: Р - по сравнению с контролем; P1 - по сравнению с перевязкой; * - Р, Р1<005; ** - Р, Р1<001. |
В отдельной серии опытов для изучения противоишемических нейропротекторных свойств афобазола была использована модель ишемии in vitro на культуре нейронов гиппокампа мыши линии НТ-22. Модель in vitro позволяет оценить изменения, происходящие на клеточном и молекулярном уровнях, выявить мишени действия нейропротекторов. К преимуществам клеточных моделей ишемии относится также возможность прямого наблюдения и контроля процессов, происходящих в клетке. В качестве ишемического стимула использовали культивирование клеток в среде с повышенным содержанием нейротоксичных аминокислот, в частности глутаминовой кислоты, поскольку повреждение нейронов по механизму глутаматной токсичности вносит основной вклад в гибель нейронов при ишемии. Культуру клеток инкубировали в присутствии высокой концентрации глутаминовой кислоты (10 мМ) в течение 8 часов, затем помещали клетки в нормальные условия (культуральная среда, содержащая факторы роста, 5% СО2, 37°С) и через 24 часа определяли количество погибших клеток с помощью МТТ-теста. МТТ(3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид) - водорастворимая соль тетразолия желтого цвета, легко проникающая в клетки. В живых клетках МТТ превращается в нерастворимые в воде кристаллы формазана фиолетового цвета. По окончании реакции их растворяли в диметилсульфооксиде и измеряли светопоглощение на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Афобазол растворяли в воде и вводили в культуральную среду в конечной концентрации 10-8 моль за 24 часа до моделирования глутаматной токсичности с целью выяснения профилактического нейропротекторного действия. Для того чтобы исследовать терапевтический эффект афобазола, его вводили через 1 час, через 16 часов, через 20 часов после обработки клеток глутаминовой кислотой. Было показано, что афобазол обладает статистически достоверным защитным эффектом при введении его за 24 часа до моделирования глутаматной нейротоксичности и через 16 и 20 часов после повреждения клеток.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что афобазол обладает защитным нейропротекторным действием и на культуре гиппокампальных нейронов при моделировании глутаматной нейротоксичности. Наибольшим защитным действием препарат обладает в том случае, если его вводили после повреждения нейронов. Защитное действие афобазола до повреждения клеток может быть обусловлено синтезом цитопротекторных белков под воздействием препарата. Нейропротекторный эффект афобазола после повреждающего действия глутамата может быть связан с влиянием его на развитие процесса апоптоза.
Применение Афобазола (5-этокси-2-[2-(морфолино)этилтио]бензилимидазола дигидрохродида) в качестве средства для лечения ишемических поражений мозга.
