Фармацевтические композиции, которые подавляют сосудистую пролиферацию, и способ их применения

Настоящее изобретение относится к способу лечения сосудистой пролиферации у пациента при его необходимости. Способ включает введение терапевтически эффективного количества агониста соматостатина типа 1 указанному пациенту, где указанный агонист рецептора соматостатина типа 1 имеет значение константы ингибирования (К1) меньше 5 нМ для рецептора соматостатина типа 1, и его значение Ki для рецептора соматостатина типа 1, по меньшей мере, в 10 раз ниже, чем его значение Ki для каждого из рецепторов соматостатина типа 2, типа 3, типа 4 и типа 5. Изобретение обеспечивает максимальное подавление нежелательной сосудистой пролиферации при минимальном проявлении побочных эффектов за счет селективного антиангиогенного действия агониста рецептора соматостатина типа 1. 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 16 ил.

 

Предпосылки изобретения

Ангиогенез, формирование новых капилляров уже имеющимися кровеносными сосудами, является важнейшим процессом при развитии солидных новообразований и при многих других патологических состояниях, таких как диабетическая ретинопатия и ревматоидный артрит (Folkman J., Nature Medicine 1995, 1:27-31). Различные стратегии воздействия на развитие сосудов и наличие надежных моделей in vitro в моделирующих системах при исследовании ангиогенеза является критическим для исследования специфических ингибиторов (Jain R.K., et al., Nature Medicine 1997, 3:1203-1208).

В настоящее время является общепризнанным, что способность опухоли индуцировать пролиферацию новых кровеносных сосудов у хозяина оказывает существенное воздействие на рост и метастазирование опухоли. Процесс опухолевого ангиогенеза опосредуется соотношением положительных и отрицательных регуляторов роста микрососудов, и формирование новых сосудов можно подразделить на три различные последовательные стадии: 1) опосредуемое клетками, протеолитическое разрушение базальной мембраны; 2) миграция эндотелиальных клеток и пророст сосуда в окружающий внеклеточный матрикс; 3) организация клеток в трубкоподобные структуры (Folkman J., Nature Medicine 1995, 1:27-31).

Соматостатин (угнетающий выделение соматотропина фактор, или SRIF) имеет изоформу из 14 аминокислот (соматостатин-14) и изоформу из 28 аминокислот (соматостатин-28). Смотри Wilson J. & Foster D., Williams Textbook of Endocrinology, p.510 (7^th ed., 1985). Соединение является ингибитором секреции гормона роста и впервые было выделено из гипоталамуса. Brazeau et al., Science 199:77 (1973). Нативный соматостатин имеет очень короткий период действия в условиях in vivo, поскольку он быстро инактивируется под действием эндо- и экзопептидазы. Было получено много новых аналогов (например, пептидов и непептидов) для повышения продолжительности действия, биологической активности и избирательности (например, в отношении конкретного рецептора соматостатина) данного гормона. В последующем подобные аналоги соматостатина будут называться "агонистами соматостатина".

Были выделены различные рецепторы соматостатина (SSTR), например SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 и SSTR-5. Так, агонист соматостатина может быть агонистом SSTR-1 и/или агонистом SSTR-2, и/или агонистом SSTR-3, и/или агонистом SSTR-4, и/или агонистом SSTR-5.

Ранее на экспериментальных моделях in vitro и in vivo была показана антиангиогенная активность аналогов соматостатина (Danesi R. et al., Clinical Cancer Research 1997, 3:265-272; Woltering E.A. et al., Investigational New Drug 1997, 15:77-86). В дополнение к этому, в результате длительного лечения октреотидом было возможным подавить развитие реваскуляризации, связанной с тяжелой пролиферативной ретинопатией у больных диабетом (Mallet et al., 1992).

Определение, какой подтип или подтипы соматостатина обладает(ют) антиангиогенной активностью соматостатина, позволит разработать терапевтические композиции с максимальной эффективностью и с минимальным проявлением побочных эффектов. Однако предшествующие исследования в данной области привели к противоречивым и/или неубедительным результатам относительно того, какую роль каждый из пяти подтипов рецепторов соматостатина может играть для антиангиогенной активности соматостатина.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим агонист рецептора соматостатина типа 1, которые пригодны для подавления сосудистой пролиферации у субъекта. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения сосудистой пролиферации, например ангиогенеза и повторного стеноза, у пациента (например, млекопитающего, такого как человек) при необходимости такого лечения. Способ включает стадию введения терапевтически эффективного количества агониста рецептора соматостатина типа 1 (SSTR-1) (например, избирательного агониста соматостатина типа 1) указанному пациенту.

Настоящее изобретение также относится к способу подавления пролиферации гладкой мускулатуры, пролиферации эндотелиальных клеток и прорастания новых кровеносных сосудов у пациента при необходимости такого подавления. Способ включает стадию введения терапевтически эффективного количества агониста рецептора соматостатина типа 1 (SSTR-1) (например, избирательного агониста соматостатина типа 1) указанному пациенту.

Примеры клинических показаний для лечения по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются аутоиммунными заболеваниями (например, артритом, склеродермией и т.д.), злокачественными опухолями, неоваскуляризацией трансплантата роговицы, диабетической ретинопатией, гемангиомой, гипертрофическими рубцами и псориазом. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования нежелательной сосудистой пролиферации, наблюдаемой после имплантации атриовентрикулярного шунта, равно как и избыточной сосудистой пролиферации, связанной с хирургическими операциями, например ангиопластикой и иными подобными хирургическими вмешательствами.

Дополнительными примерами болезненных состояний, которые поддаются лечению данной терапевтической композицией и способом по изобретению, являются в отношении кожи: бородавки, гранулемы, саркома Капоши, аллергический отек и тому подобное; в отношении матки и яичников: эндометриоз, маточное кровотечение, связанное с дисфункцией, фолликулярные кисты и тому подобное; в отношении глаз: ретинопатия недоношенных, нарушения сосудистой оболочки глаза и другие внутриглазные нарушения, дегенерация желтого пятна, старческая дегенерация желтого пятна и тому подобное.

Дополнительные примеры болезненных состояний, которые поддаются лечению данной терапевтической композицией и способом по изобретению, раскрыты в Folkman J., Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston, Vol.333, №26, pp.1757-1763.

Действительно, как это хорошо известно в данной области, имеется ряд известных заболеваний и состояний, при которых очень важно применение средства, способного подавлять ангиогенез, пролиферацию гладкой мускулатуры, пролиферацию эндотелиальных клеток и/или прорастание новых кровеносных сосудов, и они включают без ограничения: солидные опухоли, метастазы опухолей, доброкачественные опухоли, например акустические невриномы, нейрофибромы и трахомы, лейкоз, пиогенную гранулему, ангиогенез в миокарде, неоваскуляризацию бляшек, атеросклероз, коронарные коллатерали, церебральные коллатерали, артериовенозные дефекты развития, ангиогенез в ишемических конечностях, ангиогенные состояния глаза и роговицы, например отторжение трансплантата роговицы, синдром Ослера-Вебера, покраснение, неоваскулярную глаукому, ретролентальную фиброплазию и диабетическую ретинопатию, диабетическую неоваскуляризацию, заживление ран, переломы, васкулогенез, гемопоэз, овуляцию, менструацию, плацентацию, болезнь "кошачьих царапин" (Rochele minalia quintosa), язвы (пептическую; вызванную Helicobacter pylori), псориаз (включая телеангиэктазивный псориаз), ревматоидный артрит, болезнь Крона, образование спаек кишечника, рубцевание (т.е. образование ткани с высокой плотностью, включающей клетки и соединительную ткань), гипертрофические рубцы (т.е. келоиды), телеангиэктазию, суставы при гемофилии, ангиофиброму и грануляцию ран. Данные заболевания и состояния подробно обсуждаются в литературе, например в следующих патентах США и международных патентных публикациях:

Содержание каждого из выше приведенных патентов и патентных публикаций включено здесь в полном объеме для сведения.

Определения "агонист рецептора соматостатина типа 1" и "избирательный агонист рецептора соматостатина типа 1" приводятся ниже. Терапевтически эффективное количество зависит от состояния, которое подвергается лечению, выбранного пути введения и удельной активности используемого соединения и, в конечном счете, будет определяться лечащим врачом или ветеринаром (например, в пределах от 5 г/сутки до 5 мг/сутки). В одном воплощении агонист соматостатина вводят пациенту до тех пор, пока состояние, которое подвергается лечению, не приостанавливается. В другом воплощении агонист соматостатина вводят в течение всей жизни пациента.

Агонист соматостатина можно вводить парентерально, например внутривенно, в кровяное русло субъекта, который подвергается лечению. Однако специалистам в данной области, очевидно, понятно, что путь введения, такой как внутривенный, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, энтеральный, чрескожный, чресслизистый, с использованием полимерных композиций замедленного высвобождения (например, микрочастицы или имплантат из полимера на основе молочной кислоты или из сополимера на основе молочной кислоты и гликолевой кислоты), перфузионный, назальный, пероральный и т.д., будет варьировать в зависимости от состояния, которое подвергается лечению, активности и биодоступности применяемого агониста соматостатина.

Агонист соматостатин также может находиться в виде покрытия или компонента покрытия на поверхности устройства, имплантированного в организм. Например, для лечения повторного стеноза, который часто связан с имплантацией стента, агонист соматостатина может быть помещен внутрь или на сосудистый стент.

Агонист SSTR-1 можно при соответствующей необходимости вводить системно и/или локально или местно. Для профилактики спаек, как правило, агонист SSTR-1 следует применять во время операции, предпочтительно в виде композиции с контролируемым высвобождением и/или с использованием барьерной технологии.

Несмотря на то что агонист соматостатина возможно вводить в виде чистого или существенно чистого соединения, его также можно вводить в виде фармацевтической композиции или препарата. Композиции для использования по настоящему изобретению, предназначенные как для людей, так и животных, содержат любой из агонистов соматостатина, описанных ниже, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно с другими терапевтическими ингредиентами.

Носитель должен быть "приемлемым" в том смысле, что он совместим с активным ингредиентом(ами) композиции (например, способен стабилизировать пептиды) и не оказывать отрицательного влияния на субъект, который подвергается лечению. Желательно, чтобы композиция не содержала окислители или другие соединения, с которыми, как известно, пептиды не совместимы. Например, агонисты соматостатина в циклической форме (например, с внутренними дисульфидными связями цистеина) могут быть окислены; таким образом, присутствие восстановителей в качестве наполнителей может привести к размыканию дисульфидного мостика в цистеине. С другой стороны, сильно окисляющие условия могут привести к образованию сульфоксида цистеина и к окислению триптофана. Следовательно, важно тщательно выбирать наполнитель. Значение рН является другим ключевым фактором, и может быть необходимым забуферить продукт в слабо кислых условиях (рН 5-6).

Композиции могут находиться в удобной разовой дозированной форме и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармации. Все способы включают стадию смешивания активного ингредиента(ов) с носителем, который составляет один или более вспомогательных ингредиентов.

В основном композиции для таблеток или порошков получают однородным и тщательным смешиванием активного ингредиента с мелко измельченными твердыми носителями и затем, если необходимо, как в случае таблеток, приданием продукту желаемой формы и размера.

С другой стороны, композиции, подходящие для парентерального, например внутривенного) введения, соответственно, включают стерильные водные растворы активного ингредиента(ов).

Предпочтительно, чтобы растворы были изотоничными по отношению к крови субъекта, который подвергается лечению. Такие композиции, соответственно, можно получить растворением твердого активного ингредиента(ов) в воде с получением водного раствора и обеспечением стерильности указанного раствора. Композиция может находиться в разовых или многоразовых контейнерах, например в запаянных ампулах или пузырьках.

Также в данной области хорошо известны композиции, подходящие для парентерального введения с замедленным высвобождением (например, биодеградируемые полимерные композиции такие, как сложные полиэфиры, содержащие остатки молочной или гликолевой кислоты). Смотри, например, патенты США №3773919 и 4767628, а также РСТ публикацию № WO 94/15587.

Также в данной области хорошо известны способы и композиции для лечения и/или покрытия хирургических стентов, где указанное покрытие может содержать фармацевтически активное соединение. Смотри, например, патенты США №6214115, 6090901 и 6083257 и международные патентные публикации № WO 01/01957 и WO 00/02599.

Соматостатин или агонист соматостатина можно вводить с другим соединением, способным снижать содержание триглицеридов, холестерина или глицерина в крови, таким как фибраты (например, безафибрат, гемфиброзил и клофибрат), ингибиторами HMG-COA-редуктазы (например, правастатин, симвастатин и фторастатин, аторвастатин и ловастатин), полимерами, связывающими желчные кислоты (например, холестирамин и колестипол), соединениями на основе никотиновой кислоты (например, никотиновая кислота и ницеритрол) и рыбьим жиром. Смотри Workshop Treatment of Hyperlipidemia 1996-2 (Lakemedelsverket, Uppsala, Sweden, 1996). Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из последующего описания предпочтительных воплощений и формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

Полагается, что специалист в данной области, основываясь на данном описании, сможет использовать настоящее изобретение в его самом полном объеме. Следовательно, последующие конкретные воплощения предназначены только для иллюстрации и никоим образом не ограничивают раскрытие.

Если не указано иначе, все использованные здесь технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно известны специалистам в данной области, к которой относится данное изобретение. Кроме того, все упомянутые публикации, заявки на патент, патенты и другие источники включены здесь для сведения.

Под агонистом рецептора соматостатина типа 1 (т.е. агонистом SSTR-1) понимается соединение которое: 1) обладает высокой аффинностью связывания (например, Ki меньше 1000 нМ, или предпочтительно меньше 100 нМ, или меньше 10 нМ) для SSTR-1 (например, как определено в анализе связывания с рецептором, описанным ниже) и 2) снижает скорость или степень сосудистой пролиферации (например, как показано в биологическом тесте, описанном ниже).

Под избирательным агонистом рецептора соматостатина типа 1 понимается агонист соматостатина, который: 1) обладает более высокой аффинностью связывания для SSTR-1, чем для любого из SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 или SSTR-5 (т.е. агонист характеризуется меньшей константой связывания (Ki) по отношению к рецептору SSTR-1, чем его же константа связывания (Ki) по отношению к рецептору SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 или SSTR-5) (например, как определено в анализе связывания с рецептором, описанным ниже), и снижает скорость или степень сосудистой пролиферации, например, как показано в биологическом тесте, описанном ниже).

В одном воплощении избирательный агонист рецептора соматостатина типа 1 также представляет агонист SSTR-1.

Примеры агонистов соматостатина представляют таковые, определенные формулами, или таковые, конкретно перечисленные в публикациях, представленных ниже, которые все включены здесь для сведения.

Van Binst, G. et al. Peptide Research 5:8 (1992); Horvath, A. et al. Abstract, "Conformations of Somatostatin Analog Having Antitumor Activity", 22nd European peptide Symposium, September 13-19,1992, Interlaken, Switzerland; Curtis et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 278:H1815 (2000);

Nicolaou et al., Design and synthesis of a peptidomimetic employing β-D-glucose for scaffolding, In Peptides, Rivier and Marshall, eds., ESCOM (1990), Papageorgiou et al., "Design, synthesis, and binding affinity of a non peptide mimic of somatostatin" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol.2, pp.135-140, 1992; and R. Hirschmann et al. "De novo design and synthesis of somatostatin non-peptide peptidomimetics utilizing beta-D-glucose as a novel scaffolding, J. Am. Chem. Soc., vol.115, pp.12550-12568,1993.

PCT - заявка № WO 91/09056 (1991);

заявка на выдачу Европейского патента №0363589 А2 (1990);

заявка на выдачу Европейского патента №Р5 164 EU (Автор изобретения: G.Keri);

Патент США №6,262,229

Патент США №6,197,963

Патент США №6,159,941

Патент США №6,127,343

Патент США №6,083,960

Патент США №6,020,349

Патент США №5,552,534

Патент США №5,817,879

Патент США №5,811,512

Патент США №4,904,642 (1990);

Патент США №4,871,717 (1989);

Патент США №4,853,371 (1989);

Патент США №4,725,577 (1988);

Патент США №4,684,620 (1987);

Патент США №4,650,787 (1987);

Патент США №4,603,120 (1986);

Патент США №4,585,755 (1986);

Заявка на выдачу Европейского патента №0203031 А2 (1986);

Патент США №4,522,813 (1985);

Патент США №4,486,415 (1984);

Патент США №4,485,101 (1984);

Патент США №4,435,385 (1984);

Патент США №4,395,403 (1983);

Патент США №4,369,179 (1983);

Патент США №4,360,516 (1982);

Патент США №4,358,439 (1982);

Патент США №4,328,214 (1982);

Патент США №4,316,890 (1982);

Патент США №4,310,518 (1982);

Патент США №4,291,022 (1981);

Патент США №4,238,481 (1980);

Патент США №4,235,886 (1980);

Патент США №4,224,199 (1980);

Патент США №4,211,693 (1980);

Патент США №4,190,648 (1980);

Патент США №4,146,612 (1979);

Патент США №4,133,782 (1979);

Патент США №5,506,339 (1996);

Патент США №4,261,885 (1981);

Патент США №4,728,638 (1988);

Патент США №4,282,143 (1981);

Патент США №4,215,039 (1980);

Патент США №4,209,426 (1980);

Патент США №4,190,575 (1980);

Европейский патент №0 389 180 (1990);

Заявка на выдачу Европейского патента №0505680 (1982);

Заявка на выдачу Европейского патента №0083305 (1982);

Заявка на выдачу Европейского патента №0030920 (1980);

PCT - заявка № WO 88/05052 (1988);

РСТ - заявка № WO 90/12811 (1990);

PCT - заявка № WO 97/01579 (1997);

РСТ - заявка № WO 91/18016 (1991);

PCT - заявка № WO 00/75186 (2000);

Заявка на выдачу патента Великобритании №GB 2,095,261 (1981); и

Заявка на выдачу патента Франции №FR 2,522,655 (1983).

Примеры избирательных агонистов SSTR-1 включают, но не ограничиваются следующими аналогами соматостатина, которые раскрываются в вышецитированных источниках:

H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH₂;

H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂;

H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys-NH₂;

H-Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH₂;

H-Cys-Phe-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH₂;

и

Caeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr-(Bzl)-Tyr-NH₂,

которой структура "Caeg" представляет:

Необходимо отметить, что для всех агонистов соматостатина, описанных здесь, каждый остаток аминокислоты представляет структуру -NH-C(R)H-CO-, в которой R представляет боковую цепь (например, СН₃ для Ala). Линии между аминокислотными остатками представляют пептидные связи, которые связывают аминокислоты. Кроме того, там, где аминокислотный остаток является оптически активным, то подразумевается, что это конфигурация L-формы, если особо не обозначено, что это D-форма. Дисульфидные связи (например, дисульфидные мостики) находятся между двумя свободными тиолами остатков Cys; однако, они не указаны.

Синтез агонистов соматостатина

Способы синтеза агонистов соматостатина хорошо описаны и находятся в пределах возможностей обычного специалиста в данной области. Например, синтез, описанного выше H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH₂, можно провести, следуя методике, представленной в примере 1 заявки на выдачу Европейского патента 0395417 А1. Синтез агонистов соматостатина с замещенным N-концом можно провести, например, следуя методике, представленной в WO 88/02756, заявке на выдачу Европейского патента №0329295 и РСТ публикации № WO 94/04752.

Анализ связывания с рецептором соматостатина

Описаны клоны кДНК человеческих SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 и SSTR-5 (SSTR-1 и SSTR-2 у Yamada Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:251-255 (1992); SSTR-3 у Yamada et al., Mol. Endocrinol. 6:2136-2142 (1993) и SSTR-4 и SSTR-5 у Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 195:844-852 (1993), и также они доступны из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Rockville, MD) (АТСС Nos. 79044 (SSTR-1), 79046 (SSTR-2) и 79048 (SSTR-3)). Основываясь на картах рестрикции, можно вырезать полноразмерную кодирующую область каждой кДНК SSTR расщеплением подходящей рестриктазой (Maniatis Т., et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, CSHL, 1982). Рестриктазы доступны от New England Biolabs (Beverly, MA). Данный фрагмент кДНК вставляют в экспрессирующий вектор млекопитающих, функциональный в клетках млекопитающих, pCMV (Russell D., et al., J. Biol. Chem., 264:8222-8229 (1989)) с использованием стандартных методов молекулярной биологии (смотри Maniatis Т., et al., Molecular Cloning, - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) с получением экспрессирующей плазмиды от pCMV-человеческий SSTR-1 до pCMV-человеческий SSTR-5. Другие экспрессирующие факторы млекопитающих включают pcDNA1/Amp (Invitrogen, Sandlesy, СА). Экспрессирующие плазмиды вводили в подходящую бактерию-хозяина, E.coli HB101 (Stratagene, La Jolla, CA) и плазмидные ДНК для трансфекции получали в градиенте хлорида цезия.

Клетки СНО-К1 (яичника китайского хомяка) получали из АТСС (АТСС №CCL 61). Клетки культивировали и поддерживали в среде Ham's F12 (Gibco BRL, Grand Island, NY) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка в обычных условиях для культивирования тканей. Для трансфекции клетки высевали при плотности 1×10⁶/чашку диаметром 60 см (Baxter Scientific Products, McGraw Park, IL). Опосредуемую ДНК трансфекцию проводили с использованием метода сопреципитации с фосфатом кальция (Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987). Плазмиду pRSV-neo (АТСС; АТСС №37198) включали в качестве селективного маркера в концентрации 1/10 к экспрессирующей плазмиде. Отбирали клональные клеточные линии СНО-К1, которые стабильно наследовали трансфицированную ДНК, для культивирования в среде Ham's F12, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка и 0,5 мг/мл G418 (Sigma). Клетки клонировали с клонзапирающим кольцом и размножали в той же среде для анализа.

Экспрессию человеческих рецепторов SSTR-1-SSTR-5 в клетках СНО-К1 детектировали нозерн-блоттингом цельной РНК, полученной из клеток (Sambrook J.E., et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Ed. 2., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и связыванием с рецептором с использованием (¹²⁵I-Tyr¹¹)соматостатина-14 в качестве лиганда. Линии трансфицированных клеток, экспрессирующих человеческие SSTR-рецепторы, размножали клонами в культуре и затем использовали при анализе связывания SSTR.

Неочищенные мембраны готовили гомогенизацией трансфицированных клеток в 20 мл охлажденного на льду 50 мМ рс-HCl в гомогенизаторе POLYTRON (положение 6, 15 сек). Добавляли буфер для получения конечного объема, равного 40 мл, и гомогенат центрифугировали на роторе Sorval SS-34 при 39000 g в течение 10 мин при температуре 0-4°С. Полученный супернатант сливали и отбрасывали. Осадок после центрифугирования повторно гомогенизировали в охлажденном на льду буфере, разбавляли и центрифугировали, как описано ранее. Конечный осадок после центрифугирования повторно суспендировали в 10 мМ Трис-HCl и хранили на льду для проведения анализа связывания с рецептором.

Аликвотные порции препарата мембран инкубировали в течение 30 мин при 30°С с 0,05 нМ (¹²⁵I-Tyr¹¹) соматостатином-14 (2000 Ки/ммоль; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) в 50 мМ HEPES (рН 7,4), содержащем тестируемый агонист соматостатина в различных концентрациях (например, 10^-11-10^-6), 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (фракция V) (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО), MgCl₂ (5 мМ), трасилол (200 KIU мл), бацитрацин (0,02 мг/мл) и фенилметилсульфонилфторид (0,02 мг/мл). Конечный объем при анализе равнялся 0,3 мл. Инкубацию заканчивали быстрым фильтрованием через фильтры GF/C (предварительно пропитанные 0,3% полиэтиленимином в течение 30 мин) с использованием фильтрационного устройства Brandel. Затем каждую пробирку и фильтр промывали три раза порциями по 5 мл охлажденного на льду буфера. Специфическое связывание определяли, как связанный (¹²⁵I-Tyr¹¹)SRIF-14 в целом минус таковой, связанный в присутствии 1000 нМ SRIF-14. Значения Ki для агонистов соматостатина рассчитывали с использованием следующей формулы: Ki=IC₅₀/(1+(LC/LEC)), где IC₅₀ представляет концентрацию испытуемого агониста соматостатина, необходимую для 50% ингибирования специфического связывания меченого лиганда (¹²⁵I-Tyr¹¹) соматостатина-14, LC представляет концентрацию меченого лиганда (0,05 нМ) и LEC представляет константу равновесия диссоциации меченого лиганда (0,16 нМ).

Подавление пролиферации и формирования капиллярных трубок

Для исследования антипролиферативного действия на эндотелиальные клетки и подавления пролиферации и формирования капиллярных трубок эндотелиальных клеток, вызванных аналогами соматостатина, определяли заранее две различные человеческие модели в условиях in vitro. Данные модели позволяли исследовать воздействие аналогов соматостатина на двумерный слой эндотелиальных клеток и на трехмерный рост эндотелиальных клеток во внеклеточном матриксе, что имитирует формирование капилляров в условиях in vivo. Кроме того, данные тесты позволяли проводить длительную обработку (72 ч и 28 суток соответственно) человеческих тканей, напоминая тем самым возможное длительное применение антиангиогенной терапии в клинике.

Материалы и методы

Материалы

Рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (EGF) и рекомбинантный человеческий сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) получали от PeproTechEC LTD (London, UK). EGF и VEGF, следуя информации, представленной в инструкции, восстанавливали в стерильной дистиллированной воде в концентрации 100 мкг/мл.

Культуральную клеточную среду 199 и среду 199 без фенолового красного получали от Gibco BRL (Paisley, UK). Добавки желатина типа А из кожи свиней и все другие химические вещества, не перечисленные в данном разделе, получали от Sigma Chemical Co. (St. Louis, МО, USA). Пластиковое оборудование для культивирования клеток получали от Costar (Cambridge, MA, USA).

Соматостатин-14, BIM-23014C, BIM-23120C, BIM-23190C, BIM-23197С, BIM-23206C, BIM-23268C, BIM-23745C и BIM-23926C (Caeg-с(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH₂) (каждый получен от Biomeasure, Incorporated, Milford, MA, USA) растворяли в виде маточного раствора в 0,01 Н уксусной кислоте, содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина без жирных кислот (BSA) и хранили при -80°С. Значения относительной аффинности вышеперечисленных соединений для различных рецепторов соматостатина можно суммировать следующим образом (Таблица 1).

Таблица 1
Соединение	SSTR-1	SSTR-2	SSTR-3	SSTR-4	SSTR-5
Соматостатин-14	Очень высокая	Очень высокая	Очень высокая	Очень высокая	Очень высокая
BIM-23014C	Очень низкая	Очень высокая	Низкая	Очень низкая	Высокая
BIM-23120C	Очень низкая	Очень высокая	Очень низкая	Очень низкая	Низкая
BIM-23190C	Очень низкая	Очень высокая	Низкая	Очень низкая	Высокая

BIM-23197С	Очень низкая	Очень высокая	Средне-высокая	Очень низкая	Высокая
BIM-23206C	Очень низкая	Низкая	Очень низкая	Очень низкая	Очень высокая
BIM-23268С	Высокая	Средне-высокая	Высокая	Средне-высокая	Очень высокая
BIM-23745С	Средняя	Очень низкая	Очень низкая	Очень низкая	Очень низкая
BIM-23926C	Очень высокая	Очень низкая	Очень низкая	Очень низкая	Очень низкая

SU5416, 3-((2,4-диметилпиррол-5-ил)метилиденил)-2-индолинон был любезно предоставлен Sugen Inc. (San Francisco, CA, USA).

Условия культивирования клеток

Иммортализованные человеческие эндотелиальные клетки ососудов линии НМЕС-1, описанные Ades et al. (Journal of Irestigative Dermatology 1992, 99:683-690), поддерживали в среде 199 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FBS), пенициллина (50 МЕ/мл) и гидрокортизона (100 мкг/мл). Обычно клетки культивировали в покрытых желатином колбах для культивирования тканей и поддерживали во влажной атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Клетки собирали в раствор 0,25% трипсина-0,3% ЭДТА, когда они находились в фазе логарифмического роста, и во всех опытах поддерживали в вышеописанных условиях культивирования.

Реакция цитотоксичности

Анализ хемочувствительности в условиях in vitro проводили с суспензиями отдельных клеток НЕМС-1-клеток (5×10³ клеток/лунку), внесенных в 96-луночные покрытые желатином стерильные пластиковые планшеты и выдерживали в течение ночи для прикрепления. Обработку (фиг.1) спланировали таким образом, что через 24 ч добавляли 10^-10-10^-6 M соматостатина-14, аналогов соматостатина, 10^-6 M SU5416+10 нг/мл VEGF в качестве положительного контроля или растворитель, и планшеты инкубировали в течение 72 ч (подробнее смотри фиг.1). Схема обработки была таковой, что каждый пептид был представлен по меньшей мере 9 лунками. В конце опыта клетки отмывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), собирали смесь трипсин/ЭДТА и подсчитывали их число с использованием гемоцитометра. Результаты выражали в процентах пролиферации клеток по отношению к контролю, и они представляют среднее значение из трех отдельных опытов±стандартное отклонение, проведенных в трех параллелях.

Культивирование в условиях in vitro сосудов человеческой плаценты

Применение экспериментальной модели эксплантатов человеческой плаценты, детально описанной ниже, было санкционировано Комитетом по этике больницы университета в Пизе протокол №005567).

Следовали экспериментальной методике, описанной Brown et al. (Laboratory Investigation 1996, 75:539-555) в модификации в настоящем исследовании. Сразу же после естественных родов в стерильных условиях отбирали плаценту и иссекали поверхностные кровеносные сосуды примерно диаметром 1-1,5 мм и длиной 1-5 см. Эксплантаты сосудов помещали в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), содержащий 2,5 мг/мл амфотерицина В и 50 мкг/мл гентамицина и разрезали на фрагменты размером примерно 1 мм. Культивирование проводили в 24-луночных планшетах для культивирования; в каждую лунку добавляли из расчета 0,5 мл/лунку раствор фибриногена с концентрацией 3 мг/мл в среде 199 без фенолового красного с последующим быстрым внесением 15 мкл тромбина (50 NIH Е/мл в 0,15 М NaCl). После образования кровяного сгустка эксплантаты сосудов быстро помещали в центр лунок и покрывали раствором фибриногена из расчета 0,5 мл/лунку с добавлением еще 15 мкл тромбина для их суспендирования на одном уровне между двумя сгустками. После образования геля добавляли среду 199 без фенолового красного из расчета 1 мл/лунку с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS, 0,1% ε-аминокапроновой кислоты, L-глутамина (2 мМ) и антибиотиков (стрептомицин 50 мкг/мл, пенициллин 50 МЕ/мл и амфотерицин В 2,5 мг/мл). Сосуды культивировали и каждые два дня обрабатывали 10^-10-10^-6 М соматостатина-14, аналогов соматостатина и 10^-6 М SU5416 или растворителем при 37°С во влажной атмосфере 95% воздуха/5% CO₂ втечение 28 суток (фигура 2). Эксплантаты сосудов фотографировали на 28 сутки с использованием фазово-контрастного микроскопа Leitz MD IL (Leica, Heerbrugg, Switzerland) и проводили анализ изображений.

Анализ изображений

Для настоящего исследования использовали методику анализа изображений, описанную Bocci et al. (Cancer Chemotherapy Pharmacology 1999, 43:205-212). Кратко, фотографии фрагментов плаценты преобразовывали в цифровые данные на матрицу 512×512-пиксель с использованием цветной видеокамеры ТК-1280Е (JVC, Tokyo, Japan) и микрокомпьютерного процессора. Преобразованные в цифровые данные изображения визуализировали на цветном дисплее высокого разрешения. Применяли программное обеспечение KS 300 v.1.2 для анализа реальных цветных изображений (Kontron Elektronik GmbH, Eching, Germany) для согласованного управления, количественной оценки изображений и сбора данных. Проводили геометрическую калибровку с пробой с известными размерами и анализ по серой шкале для определения плотности снимка, которая находились в пределах 0-255, где 0 было черным (наличие проростов сосудов) и 255 было белым (отсутствие проростов сосудов). В фибриновой культуре эксплантатов сосудов плаценты определяли средний уровень серого площади прорастания и рассчитывали показатель прорастания (SI) как:

Показатель прорастания=

=((средняя площадь прорастания/средний уровень серого

площади прорастания)/периметр эксплантата)×100.

Данные выражали в виде процента показателя прорастания +/-стандартное отклонение по сравнению с контролем.

Результаты

Реакция цитотоксичности

Все результаты представлены в таблице 2. У всех аналогов соматостатина в исследованных концентрациях было выявлено антипролиферативное действие в отношении иммортализованных человеческих эндотелиальных клеток микрососудов НМЕС-1 с максимальным эффектом при концентрации 10^-7-10^-8 M. Положительный контроль SU5416 в концентрации 10^-6 M, специфический ингибитор VEGF-рецептора, приводил к блокированию роста клеток на 56,2%.

Культивирование сосудов человеческой плаценты в условиях in vitro

Для прорастания эксплантата внутри фибринового матрикса было характерно образование многочисленных микрососудов вокруг фрагмента плаценты. Сосудистые клетки располагались радиально с образованием микрососудов, которые подвергались постоянной реконструкции (фиг.3). Максимальный рост трехмерной микрососудистой сети имел место на 3-4 неделе и не изменялся к 27 суткам после эксплантации. Гистологически в фибриновом геле наблюдали тонкую структуру эндотелиальных клеток (фиг.5), которая не была иммунореактивной на фактор вон Виллебранда (фиг.4). В большинстве случаев в микрососудах наблюдали первичный просвет, в других случаях просвет отсутствовал, и только наблюдали эндотелиальные клетки (фиг.5).

Микроскопическая картина эксплантатов плаценты на первый день культивирования представлена на фиг.6А (мерная линия, 2 мм); видно появление пророста эндотелиальных клеток из культивируемого фрагмента сосуда плаценты примерно на 6 сутки культивирования (SI=0,055±0,004 (мм/среднее значение серого)×100; фиг.6D).

Данные опытов по действию аналогов соматостатина на пророст капилляров обобщены в таблице 3. Культуры, обработанные аналогами SMS и SU5416, представлены на фиг.7-16, где показаны максимальные эффекты. BIM-23926C и BIM-23745C проявляли высокую ингибирующую способность при длительной обработке, что в итоге приводило к значению SI, соответственно равному 17,18±11,8% при концентрации 10^-7 М и 42,84±5,6% при концентрации 10^-8 М по сравнению с необработанным контролем. Для SU5416, положительного контроля, значение SI составляло 32,92±9,7% при концентрации 10^-6 М.

Другие воплощения

Вышепредставленное описание ограничено конкретными воплощениями данного изобретения. Однако, очевидно, понятно, что в изобретение могут быть внесены различные вариации и модификации с достижением некоторых или всех преимуществ изобретения. Подобные воплощения также находятся в объеме последующей формулы изобретения.

ТАБЛИЦА 2 Пролиферация человеческих эндотелиальных клеток НЕМС-1 в условиях in vitro
Концентрация	BIM-23120С	BIM-23197С	BIM-23206С	BIM-23190С
0 М	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле
10-6 М			122.58±7.3	113.55±6.5
10-7 М	103.97±2.07	87.61±3.6	81.29±3.2	92.26±3.1
10-8 М	74.27±4.5	78.25±2.5	68.38±3.9	60,0±2.2
10-9 M	88.01±3.7	73.39±2.1	77.42±4.0	87.74±2.5
10-10 M	102.39±5.2	83.96±3.2
BIM-23268C	BIM-23745C	BIM-23014С	BIM-23926С	SMS-14
% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле
118.06±8.2	40.0±2.0	80.0±3.2	56.78±4.9	73.3±4.1
87.74±3.7 111.61±2.5	46.55±2.3 49.7±1.9	51.2±4.7 65.05±3.1	55.33±3.3 65.54±3.5	71.25±2.1 69.7±2.5
94.19±4.2	56.79±2.7	78.0±2.7	79.95±4.6	77.85±3.3
			88.10±5.3
Обработку проводили на 1 сутки, 24 ч после посева и повторяли через 48 ч; подсчет клеток проводили еще через 24 ч. Каждый день добавляли SMS-14. SU5416 добавляли в концентрации 10-6 М в культуральную среду отдельных лунок, и это привело к выживаемости, равной 43.85+3,02% по сравнению с необработанным контролем.
Таблица 3. Пролиферация эндотелиальных клеток из кровеносных сосудов, эксплантированных из человеческой плаценты
Концентрация	BIM-23120С	BIM-23197С	BIM-23206С	BIM-23190С
0 М	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле
10-6 М	106.6±10.2	98.99±8.7	93.08±7.8	107.98±8.5
10-7 М	94.78±8.4	62.72±7.9	83.77±10.2	102.39±7.3
10-8 M	88.18±11.3	71.54±8.2	72.07±8.5	95.12±10.7
10-9 M	78.76±7.6	114.23±7.6	97.87±10.9	91,75±10.9
10-10 M	86.57±9.8	126.65±11.2	105.32±11.3	103.98±12
BIM-23268С	BIM-23745C	BIM-23014C	BIM-23926С	SMS-14
% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле	% от 100 в контроле
98.14±10.7	70.75±7.5	73.66±8.7	38.39±10.6	73.25±7.5
81.12±11.6	62.99±8.2	79.01±8.2	17.18±11.8	44.03±5.2
84.31±12.1	42.84±5.6	80.24±10.1	41.54±7.9	68.72±5.4
86.97±8.4	63.41±6.8	90.53±11.3	55.94±13.6	84.77±7.1
76.33±7.6	82.43±8.5	90.94±12.6	62.32±12	99.18±7
Обработки проводили каждый день в течение 28 суток. SU5416 добавляли каждые два дня в концентрации 10-6 М в культуральную среду отдельных эксплантатов, и это привело к значению SI, равному 32,92±9,7% по сравнению с необработанным контролем.

1. Способ лечения нежелательной сосудистой пролиферации у пациента, где указанный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества агониста рецептора соматостатина типа 1 указанному пациенту, где указанный агонист рецептора соматостатина типа 1 имеет значение константы ингибирования (Ki) меньше 5 нМ для рецептора соматостатина типа 1, где его значение Ki для рецептора соматостатина типа 1, по меньшей мере, в 10 раз ниже, чем его значение Ki для каждого из рецепторов соматостатина типа 2, типа 3, типа 4 и типа 5.

2. Способ по п.1, где указанный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества соединения формулы

Caeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH₂

или его фармацевтически приемлемой соли.

3. Способ по п.1, где указанная сосудистая пролиферация включает ангиогенез, повторный стеноз, пролиферацию эндотелиальных клеток, пролиферацию гладкой мускулатуры или прорастание новых кровеносных сосудов.

4. Способ по п.1, где указанная сосудистая пролиферация имеет место при заболевании или состоянии, включающих аутоиммунное заболевание, артрит, склеродермию, злокачественные опухоли, неоваскуляризацию трансплантата роговицы, диабетическую ретинопатию, гемангиому, гипертрофическое рубцевание или псориаз.

5. Способ по п.1, где сосудистая пролиферация является случайной для или связанной с ангиопластикой или артериовенозным шунтированием.

6. Способ по п.1, где указанная сосудистая пролиферация имеет место при заболевании или состоянии, включающих бородавки, гранулемы, саркому Капоши или аллергический отек.

7. Способ по п.1, где указанная сосудистая пролиферация имеет место при заболевании или состоянии, включающих эндометриоз, маточное кровотечение, связанное с дисфункцией, или фолликулярные кисты.

8. Способ по п.1, где указанная сосудистая пролиферация имеет место при заболевании или состоянии, включающих ретинопатию недоношенных, хориоретинопатию, дегенерацию желтого пятна или старческую дегенерацию желтого пятна.

9. Способ по п.1, где указанная сосудистая пролиферация имеет место при заболевании или состоянии, включающих солидные опухоли, метастазы опухолей, доброкачественные опухоли, акустическую невриному, нейрофиброму, трахому, лейкоз, пиогенную гранулему, ангиогенез миокарда, неоваскуляризацию бляшек, атеросклероз, коронарные коллатерали, церебральные коллатерали, артериовенозные дефекты развития, ангиогенез при ишемии конечностей, отторжение трансплантата роговицы, синдром Ослера-Вебера, покраснение, неоваскулярную глаукому, ретролентальную фиброплазию, диабетическую ретинопатию, диабетическую неоваскуляризацию, переломы, васкулогенез, гемопоэз, овуляцию, менструацию, плацентацию, болезнь "кошачьих царапин" (Rochele minalia quintosa), псориаз, телеангиэктазивный псориаз, ревматоидный артрит, болезнь Крона, образование спаек кишечника, рубцевание, гипертрофические рубцы, келоиды, телеангиэктазию, суставы при гемофилии, ангиофиброму и грануляцию ран.

10. Способ по п.1, где указанный агонист рецептора соматостатина типа 1 располагается на сосудистом стенте или внутри него.

11. Способ по п.10, где агонист рецептора соматостатина типа 1 обеспечивается в виде компонента композиции с медленным высвобождением.

12. Способ по п.10, где указанный агонист рецептора соматостатина типа 1 обеспечивается в виде компонента полимерной композиции.

Приоритет по пунктам:

14.01.2002 по пп.9-12.