Композиции, содержащие комплексы включения

Изобретение относится к композициям и способам, применяемым для доставки терапевтических агентов. Предложена композиция, содержащая порошкообразный композит полимера, терапевтического агента и комплексообразующего агента, при этом полимер содержит один или более фрагментов циклодекстрина. Полимер взаимодействует с комплексообразующим агентом по способу хозяин/гость или гость/хозяин, образуя комплекс включения. Как полимер порошкообразного композита, так и комплексообразующий агент можно применять для введения функциональности в терапевтическую композицию. Изобретение также относится к способу получения композиции и к способу доставки терапевтического агента. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, 1 табл., 31 ил.

 

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к композициям и способам, применяемым для доставки терапевтических агентов. Более конкретно, данное изобретение относится к композиции, содержащей полимер, терапевтический агент и комплексообразующий агент, в которой наблюдается взаимодействие "хозяин-гость" или "гость-хозяин" полимера с комплексообразующим агентом с образованием комплекса включения. Композицию по изобретению можно применять для доставки терапевтического агента при лечении различных нарушений.

Предпосылки создания изобретения

Циклодекстрины представляют собой циклические полисахариды, содержащие остатки природной D(+)-глюкопиранозы, соединенные α-(1,4)-мостиком. Наиболее широко распространены альфа (α)-циклодекстрины, бета (β)-циклодекстрины и гамма (γ)-циклодекстрины, которые содержат, соответственно, шесть, семь или восемь глюкопиранозных остатков. Структурно циклическая природа циклодекстрина выражается в виде очертаний тора или тороида с внутренней неполярной или гидрофобной полостью, вторичными гидроксильными группами, находящимися на одной стороне циклодекстринового тора, и первичными гидроксильными группами, находящимися на другой стороне тора. Так, на приведенном ниже примере (β)-циклодекстрина показано схематическое изображение циклодекстрина:

Сторона, на которой расположены вторичные гидроксильные группы, имеет больший диаметр, чем сторона, на которой расположены первичные гидроксильные группы. Гидрофобная природа внутренней полости циклодекстрина делает возможным включение множества соединений (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press (1996); Т. Cserhati, Analytical Biochemistry, 225:328-332 (1995); Husain et al., Applied Spectroscopy, 46:652-658 (1992); Французский патент 2665169).

Циклодекстрины использовались в качестве носителей различных терапевтических соединений благодаря своей способности образовывать комплексы включения с различными лекарственными веществами, которые могут прилегать к гидрофобной полости циклодекстрина, или благодаря образованию нековалентно ассоциированных комплексов с другими биологически активными молекулами, такими как олигонуклеотиды и их производные. Например, в патенте США 4727064 описаны фармацевтические препараты, состоящие из лекарственного вещества с очень низкой растворимостью в воде и аморфной растворимой в воде смеси на основе циклодекстрина. Лекарственное вещество образует комплекс включения с циклодекстрином из этой смеси. В патенте США 5691316 описана клеточная система доставки олигонуклеотидов на основе циклодекстринов. В такой системе олигонуклеотид связывается с циклодекстрином нековалентной связью, образуя комплекс, или же олигонуклеотид может ковалентной связью связываться с адамантаном, который, в свою очередь, нековалентно ассоциируется с циклодекстрином.

Различные циклодекстринсодержащие полимеры и методы их получения также известны в технике (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press (1996)). Способ получения полимеров, содержащих иммобилизованный циклодекстрин, описан в патенте США 5608015. В соответствии с этим способом производное циклодекстрина реагирует либо с мономерным галоидангидридом α,β-ненасыщенной кислоты или его производным, либо с α,β-ненасыщенной кислотой или ее производным, содержащим концевую изоцианатную группу или ее производное. Производное циклодекстрина получают реакцией циклодекстрина с такими соединениями, как галоидангидриды или ангидриды кислоты. Образующийся полимер содержит циклодекстриновые фрагменты (остатки) в виде боковых цепей, вне основной линейной полимерной цепи.

В патенте США 5276088 описывается метод синтеза циклодекстриновых полимеров либо по реакции поливинилового спирта или целлюлозы или их производных с производными циклодекстрина, либо сополимеризацией производного циклодекстрина с винилацетатом или метилметакрилатом. Полученный в результате циклодекстрин содержащий полимер также содержит циклодекстриновый фрагмент в качестве дополнительного фрагмента, расположенного вне главной полимерной цепи.

Ансамбль (сборка) биодеструктируемого полимера медицинского назначения с надмолекулярной структурой описан в Международной заявке WO 96/09073A1 и в патенте США 5855900. Ансамбль содержит ряд циклических соединений, несущих лекарственное вещество, полученных связыванием лекарственного вещества с α, β или γ-циклодекстрином с последующей укладкой нитей соединений лекарственное вещество/циклодекстрин вдоль линейного полимера с биодеструктируемыми фрагментами, связанными с обоими концами полимера. Как сообщают, такой ансамбль способен высвобождать лекарственное вещество в ответ на специфическую биодеструкцию в процессе заболевания. Такие ансамбли (самосборки) обычно называют "молекулярными ожерельями" на основе циклодекстриновых полимеров.

Однако в технике существует потребность в более эффективных невирусных системах доставки, проявляющих, например, такие свойства как повышенная стабильность (например, в физиологических условиях) и эффективные способности нацеливания (тагетирования). Данное изобретение решает эти задачи ("отвечает таким потребностям").

Сущность изобретения

Данное изобретение прежде всего включает в себя соединение формулы

где

J обозначает -NH-, -С(=O)NH-(CH₂)_d-, -NH-C(=O)-(CH₂)_d-, -CH₂SS-, -С(=O)O-(СН₂)_е-O-Р(=O)(O-(СН₂)_е-Y)O-,

пептидный или полипептидный остаток, или

-NH-(C=O)-CH(R¹)-NH-(C=O)-CH(R¹)-NH-;

Y обозначает дополнительную функциональность хозяин/гость;

R¹ обозначает -(СН₂)_а-CO₂Н, ее эфир или соль; или -(CH₂)_a-CONH₂;

PEG (ПЭГ) обозначает -O(CH₂CH₂O)_z-, где z варьируется от 2 до 500;

L обозначает Н, -NH₂, -NH-(C=O)-(CH₂)_e-(C=O)-CH₂-, -S(=O)₂-HC=CH₂-, - SS-, -С(=O)O- или углеводный остаток;

хозяин-гость выбирается из адамантила, нафтила, холестерола, циклодекстрина или любой их комбинации;

а обозначает 0 или 1;

b обозначает 0 или 1;

d имеет значение в интервале от 0 до 6;

е имеет значение в интервале от 1 до 6;

n имеет значение в интервале от 0 до 6;

q имеет значение в интервале от 1 до 5;

w имеет значение в интервале от 1 до 5;

y обозначает 1;

х обозначает 1; и

z имеет значение в интервале от 1 до 5.

Изобретение включает в себя также композицию, содержащую порошкообразный композит полимера и терапевтического агента, и комплекс включения указанного полимера и комплексообразующего агента, причем комплексообразующий агент содержит функциональную группу, а полимер содержит один или более фрагментов циклодекстрина.

Данное изобретение также относится к способам приготовления терапевтической композиции. Согласно изобретению по этому способу объединяют терапевтический агент, полимер с функциональностью хозяина или гостя и комплексообразующий агент с функциональностью гостя или хозяина с образованием терапевтической композиции. Комплексообразующий агент образует комплекс включения с полимером.

Данное изобретение также относится к способу доставки терапевтического агента. Согласно этому способу, терапевтически эффективное количество композиции по изобретению вводят млекопитающему (например, человеку или животному), признанному нуждающимся в терапевтическом агенте. Таким образом, изобретение охватывает лечение заболевания с применением композиции по изобретению для доставки соответствующего терапевтического агента.

Краткое описание Фигур

На Фигурах, отображающих различные варианты изобретения, соединение 12 также обозначено как βCDP6. Композиты, содержащие нуклеиновую кислоту и катионный полимер в конкретном композите, определяются как полиплексы. Ниже дано краткое описание фигур.

Фигура 1. Структуры различных молекул адамантан - ПЭГ

Фигура 2 Гидродинамический диаметр GALA и GALA-Ad модифицированных композиций. Пример 30.

Фигура 3. Дзета-потенциал композиций, модифицированных при использовании GALA и GALA-Ad, Пример 32.

Фигура 4. Всасывание клетками ВНК-21 композиций, модифицированных при использовании GALA и GALA-Ad, Пример 31.

Фигура 5. Всасывание клетками HUH-7 полиплекс-полиплексных композиций, модифицированных при использовании GALA и GALA-Ad, Пример 33.

Фигура 6. Трансфицирование клеток ВЕК-21 с помощью люциферазы при участии композиций на основе β-циклодекстрин-DMS сополимера 12, модифицированных при участии GALA и GALA-Ad, Пример 34.

Фигура 7. Токсичность полиплексов, модифицированных при участии GALA и GALA-Ad, в отношении клеток ВНК-21, Пример 35.

Фигура 8. Схема ПЭГирования с помощью привитой сополимеризации после образования комплекса с ДНК, Пример 39.

Фигура 9. Размеры частиц конкретных композитов PEI и 12 и полиплекс-полиплексных композиций в процессе пост-ДНК-комплексообразования, Пример 39.

Фигура 10. Стабилизация полиплексных композиций с помощью ПЭГирования, Пример 40.

Фигура 11. Совместная доставка 12 с помощью PEG₃₄₀₀-FITC, Пример 42.

Фигура 12. Структура соединения Лактоза-12, Пример 37.

Фигура 13. Трансфекция 12 и полиплексов LAC-CDP6 в клетки HUH-7, Пример 43.

Фигура 14. Схематическое изображение экспериментального протокола, Пример 43.

Фигура 15. Диаметры частиц, Пример 47.

Фигура 16. Утрата ДНК вследствие осаждения комплекса. Пример 47.

Фигура 17. Комплексы включения для модификации композита 12/ДНК, Пример 48.

Фигура 18 Трансфекция модифицированных полиплексов в клетки HepG2, Пример 49.

Фигура 19. Эксперименты по конкурентному замещению. Пример 52.

Фигура 20. Синтез Адамантан-ПЭГ-трансферрина (Ad-PEG-Tf), Пример 55.

Фигура 21. Нагрузка железа на трансферрин, Пример 55.

Фигура 22. Аффинность связывания трансферрин-ПЭГ-Ad, Пример 55.

Фигура 23. Связывание трансферрина через группы лизина, Пример 56.

Фигура 24. Аффинность связывания трансферрин-ПЭГ-Ad с рецепторами трансферрина на клетках РСЗ, Пример 57.

Фигура 25. Изменение дзета-потенциала и размера частиц как функция модификации частиц в полиплексах, модифицированных с помощью трансферрина и ПЭГ, Пример 58.

Фигура 26. Измерения дзета-потенциала, Ad-анионный-ПЭГ, Пример 62.

Фигура 27. Измерения стабильности, Пример 62.

Фигура 28. Присоединение увеличивающегося комплексообразователя для трансферрина, Пример 62.

Фигура 29. Синтез гистидилированного 12.

Фигура 30. рН-чувствительные полимеры для эндосомного выделения (Синтез полимеров, содержащих вторичные амины).

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к композиции, в которой используются комплексы включения для доставки терапевтических агентов. Комплексы включения представляют собой молекулярные соединения, имеющие характерную структуру аддукта, в котором молекула одного из соединений (молекула-"хозяин") пространственно ограничивает, по меньшей мере, часть молекулы другого соединения. Заключенная в этот объем молекула соединения (молекула-"гость") расположена в полости молекулы-хозяина таким образом, что она не влияет на остовную структуру хозяина. Характерной особенностью комплекса включения является то, что размер и конфигурация соответствующей полости чаще всего остаются неизменными, не считая легкой деформации, "хозяином" может являться любое соединение-хозяин или любая молекула-хозяин, известные в технике. Примеры подходящих "хозяев" включают, но без ограничения, циклодекстрины, карцеранды, кавитанды, краун-эфиры, криптанды, кукурбитурилы, каликсарены, сферанды и т.п. Примеры "гостей", пригодных в качестве комплексообразующих агентов, включают такие соединения, как адамантан, диадамантан, нафталин и холестерин (холестерол).

Циклодекстрины являются предпочтительными хозяевами, способными взаимодействовать со многими ионными и молекулярными соединениями и дающими в результате соединения включения, относящиеся к классу комплексов "гость-хозяин". Для того, чтобы реализовалось взаимодействие "хозяин-гость", соединения должны отвечать нескольким требованиям: одно из них - это то, что сайты связывания молекул хозяина и гостя должны быть комплементарными с точки зрения стереоэлектронных эффектов. Циклодекстрины способны образовывать комплексы включения с соединениями, размеры молекул которых сравнимы с размерами полости. Однако степень образования комплекса зависит также от полярности молекулы-"гостя". Образование комплекса с молекулами, значительно большими по объему, чем полость, также возможно при условии, что только некоторые группы или боковые цепи проникают в канал углевода. См. J. Szejtly, Akademiai Kiado, Cyclodextrins and their inclusion complexes, Budapest, 1982.

Композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, один полимер и, по меньшей мере, один терапевтический агент, главным образом, в виде порошкообразного композита, состоящего из полимера и терапевтического агента. Терапевтическая композиция также содержит один или более комплексообразующих агентов. По меньшей мере, один полимер порошкообразного композита взаимодействует с комплексообразующим агентом по схеме "хозяин-гость" или "гость-хозяин" с образованием комплекса включения, состоящего из полимера и комплексообразующего агента. Полимер и в особенности комплексообразующий агент можно использовать для введения функциональных групп в композицию по изобретению. В одном варианте изобретения, по меньшей мере, один полимер порошкообразного композита несет функциональность хозяина и образует комплекс включения с комплексообразующим агентом с функциональностью гостя. В другом варианте данного изобретения, по меньшей мере, один полимер порошкообразного композита имеет функциональность гостя и образует комплекс включения с комплексообразующим агентом с функциональностью хозяина. Еще в одном варианте изобретения полимер порошкообразного композита может содержать как функциональность хозяина, так и гостя и может образовывать комплексы включения с комплексообразующими агентами как в роли "гостя", так и в роли "хозяина".

1. Порошкообразный композит

Порошкообразный композит терапевтического агента и полимера представляет собой комбинацию или интеграцию терапевтического агента и полимера. Порошкообразный композит является ассоциированной структурой, содержащей один или более терапевтический агент внутри многомерной полимерной сетки. Можно использовать единственный полимер или смесь полимеров. Помимо способности образовывать полимерную многомерную сетку порошкообразного композита, как обсуждается ниже, носители функциональности гость и/или хозяин могут образовывать комплексы включения с одним или более комплексообразующих агентов.

А. Полимер

Любой тип полимера, способный образовывать порошкообразный композит с терапевтическим агентом и имеющий функциональность хозяин и/или гость, можно применять в композиции по изобретению. Полимер может быть линейным или разветвленным. Полимер может быть гомополимером или сополимером. Если используется сополимер, этот сополимер может быть статистическим сополимером или разветвленным сополимером. Предпочтительно, полимер диспергируется в воде, и более предпочтительно, полимер является водорастворимым. Например, подходящие полимеры включают, но без ограничения, полисахариды, сложные полиэфиры, полиамиды, простые полиэфиры, поликарбонаты, полиакрилаты и т.д. Для терапевтических фармацевтических целей полимер должен быть низкотоксичным и, предпочтительно, он должен быть нетоксичным или цитотоксичным. Как обсуждается ниже, предпочтительным полимером для применения в композиции по изобретению является полимер на основе циклодекстрина. Предпочтительными являются водорастворимые линейные сополимеры циклодекстринов, описанные ниже, имеющие молекулярные массы в интервале 3000-100000, а особенно предпочтительны такие сополимеры с молекулярной массой 3000-50000.

В соответствии с изобретением полимер в порошкообразном композите может быть единственным полимером или смесью двух или более полимеров, которые могут быть одинаковыми или различными полимерами. Каждый полимер порошкообразного композита может дополнительно содержать или может быть модифицирован таким образом, чтобы содержать сшивающую группу, с помощью которой можно осуществить ассоциацию полимеров с образованием порошкообразного композита.

По меньшей мере, один полимер порошкообразного композита представляет собой полимер, способный образовывать комплекс включения. "Полимер, способный образовывать комплекс включения", может представлять собой любой полимер, способный образовывать один или более ассоциатов типа "гость-хозяин" за счет несвязывающего взаимодействия (например, за счет сил Ван-дер-Ваальса, водородных связей, диполь-дипольных взаимодействий, взаимодействий по типу ионных пар, "солюофобных" взаимодействий) с другим соединением (комплексообразующим агентом) или заместителем в этом соединении. Другими словами, по меньшей мере, один полимер имеет функциональность гостя или хозяина при образовании комплекса включения с комплексообразующим агентом или с заместителем в комплексообразующем агенте. Функциональность хозяина или гостя может быть частью основной цепи полимера или может присутствовать в качестве заместителя либо в боковой, либо в разветвленной цепи. Примером полимера с функциональностью хозяина в основной цепи является линейный полимер циклодекстрина, описанный ниже. Примером полимера, у которого функциональность гостя не является частью основной цепи полимера, служит полимер с адамантановыми группами в боковой цепи. Другие примеры подходящих "хозяев", которые можно применять с полимером включают, но без ограничения, карцеранды, кавитанды, краун-эфиры, криптанды, кукурбитурилы, каликсарены, сферанды и т.п. Примеры "гостей" для комплексов включения, пригодных в качестве комплексообразующих агентов для таких хозяев, включают, но без ограничения, такие известные в технике соединения, как адамантан, диадамантан, нафталин и холестерин (холестерол).

В предпочтительном варианте изобретения полимер может содержать различные типы функциональностей хозяина или гостя или полимер может содержать функциональность как гостя, так и хозяина. Это делает возможным получение более разнообразных комплексов включения на основе данного полимера. Наличие множества функциональностей хозяина, множества функциональностей гостя, или функциональностей как хозяина, так и гостя у одного и того же полимера увеличивает разнообразие функциональности, которую можно ввести в терапевтическую композицию по изобретению с помощью комплекса включения.

Вследствие ассоциации хозяин-гость полимер взаимодействует с комплексообразующим агентом с образованием комплекса включения. Предпочтительно, когда константы связывания образующегося в результате несвязывающего взаимодействия или ассоциации комплекса включения составляют, примерно, >10², предпочтительно, около >10³, и более предпочтительно, около >10⁴. Как правило, константы связывания находятся в пределах, примерно, 10²-10⁶.

Полимер порошкообразного композита можно модифицировать с помощью одного или более лигандов. Лиганд можно вводить в ходе или после образования порошкообразного композита с помощью модификации лиганда терапевтического агента и/или полимера порошкообразного композита. Лиганд может представлять собой любой лиганд, который делает возможным нацеливание на заданную клетку и/или связывание с ней. Специалисту в данной области понятно, что нацеливание и связывание с клеткой может включать присоединение к клеточному рецептору, что, в свою очередь, может привести к опосредуемому рецептором эндоцитозу. Если присоединяются два или более лигандов, лиганды могут быть одинаковыми или различными. Примеры соответствующих лигандов включают, но без ограничения, витамины (например, фолиевую кислоту), белки (например, трансферрин и моноклональные антитела), моносахариды (например, галактозу), пептиды и полисахариды. Выбор лиганда, как понимает рядовой специалист в данной области, может варьироваться в зависимости от заданного вида доставки. В качестве другого примера, лиганд может представлять собой мембранопермеабилизующим или мембранопроницаемым агентом, таким как белок ТАТ ВИЧ-1. Белок ТАТ является вирусным белком активации транскрипции, который активно импортирован в клеточное ядро. Torchilin, V.P. et al, PNAS. 98, 8786-8791 (2001).

В предпочтительном варианте изобретения, по меньшей мере, один из полимеров порошкообразного композита представляет собой практически линейный полимер, который имеет функциональность хозяина и/или гостя, способный образовывать комплекс включения. Практически линейный полимер можно получать любым известным в технике методом. Полимер можно получать из соответствующего мономера, способного образовывать комплекс включения, или из смеси мономеров, из которых, по меньшей мере, один имеет функциональность хозяина или гостя. Функциональность хозяина или гостя может находиться внутри полимерной цепи, в боковой (или разветвленной) цепи по отношению к полимерной цепи или присутствовать в виде концевой группы. Или же, после того, как полимер получен, его можно дополнительно модифицировать, присоединяя (добавляя) функциональность гостя или хозяина, как обсуждается выше, с образованием практически линейного полимера, способного образовывать комплекс включения. Практически линейный полимер может быть блоксополимером, в котором блоки вводят такие свойства, как функциональность хозяина, диспергируемость в воде и/или растворимость в воде. Примеры таких блоков включают, например, линейный полиэтиленимин (PEI), линейный циклодекстринсодержащий полимер, бис(2-аминоэтил)-1,3-пропандиамин (AEPD) и N₂,N₂,N₃,N₃-(3'-PEG₅₀₀₀аминопропан)-бис(2-аминоэтил)-1,3-пропандиаммоний дифторацетат (AEPD-PEG).

В другом предпочтительном варианте изобретения полимер, применяемый для получения порошкообразного композита, представляет собой циклодекстринсодержащий полимер, более предпочтительно, практически линейный полимер циклодекстрина, как описано ниже. Полимер может также представлять собой полиэтиленимин (PEI) или полимер, содержащий боковые циклодекстриновые цепи. Линейный полимер циклодекстрина представляет собой полимер, содержащий циклодекстриновые фрагменты как неотъемлемую часть полимерной цепи. Полимеры, содержащие боковые циклодекстриновые фрагменты скорее не как часть основной полимерной цепи, а как фрагменты, присоединенные вне полимерной цепи, также могут использоваться в композициях по изобретению. Линейный циклодекстринсодержащий полимер может быть любым линейным полимером, содержащим, по меньшей мере, один циклодекстриновый фрагмент как часть основной полимерной цепи. Циклодекстринсодержащий полимер, предпочтительно, является водорастворимым. Более предпочтительно, линейный циклодекстринсодержащий полимер представляет собой линейный сополимер циклодекстрина или линейный сополимер окисленного циклодекстрина, каждый из которых описан ниже. Циклодекстриновые группы внутри полимера придают полимеру функциональность хозяина, позволяющую ему образовывать комплексы включения. Практически линейный полимер, способный образовывать комплекс включения, может дополнительно содержать, или его можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы он содержал дополнительную функциональную группу (например, тиольную группу).

Линейные циклодекстринсодержащие полимеры

Линейный сополимер циклодекстрина, который можно использовать для образования порошкообразного композита, содержит замещенные или незамещенные циклодекстриновые фрагменты, бифункционально связанные в основную линейную цепь сополимера за счет связи в 2, 3 или 6 положении, по меньшей мере, одного цикла глюкопиранозы циклодекстрина с двухвалентными фрагментами, связывающими молекулы циклодекстрина линейного полимера циклодекстрина. Как описывается в Международной патентной заявке WO 00/01734, такой линейный полимер циклодекстрина содержит повторяющийся элемент формулы Ia, Ib (см. ниже) или их комбинацию. Линейные сополимеры циклодекстрина, их получение и свойства также описаны в Gonzalez, H., Hwang, S. and Davis, M (1999) New class of polymers for the delivery of macromolecular therapeutics. Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074 и Hwang, S., Bellock, N. and Davis, M (2001) Effects of Structure of Beta-Cyclodextrin-Containing Polymers on Gene Delivery. Bioconjugate Chem., 12(2), 280-290.

В формулах Ia и Ib С обозначает замещенный или незамещенный мономер циклодекстрин, а А обозначает сомономер связан, т.е. ковалентно связан, с циклодекстрином С. Полимеризация предшественника мономера циклодекстрина С с предшественником сомономера А дает линейный сополимер циклодекстрина. В отдельном линейном сополимере циклодекстрина мономерный элемент циклодекстрина С может быть одинаковым или различным и, аналогично, сомономер А может быть одинаковым или различным.

Предшественник мономера циклодекстрина может представлять собой любой известный в технике циклодекстрин или любое известное в технике его производное. Как обсуждается выше, циклодекстрин определяется как циклический полисахарид, обычно содержащий от шести до восьми остатков (элементов) природной D(+)-глюкопиранозы, соединенных α-(1,4)-связью. Предпочтительно, предшественник мономера циклодекстрина представляет собой циклодекстрин, содержащий шесть, семь и восемь фрагментов глюкозы, т.е., соответственно, альфа (α)-циклодекстрин, бета (β)-циклодекстрин и гамма (γ)-циклодекстрин. Производное циклодекстрина может быть любым замещенным циклодекстрином, известным в технике, в котором заместитель не препятствует сополимеризации с предшественником сомономера А, как описано ниже. Производное циклодекстрина может быть нейтральным, катионным или анионным. Примеры соответствующих заместителей включают, но без ограничения, гидроксиалкильные группы, такие, например, как гидроксипропильная, гидроксиэтильная; простые эфирные группы, такие, например, как дигидроксипропиловые эфиры, метилгидроксиэтиловые эфиры, этилгидроксиэтиловые эфиры и этилгидроксипропиловые эфиры; алкильные группы, такие, например, как гликозил и мальтозил; кислотные группы, например, карбоновые кислоты, фосфорные кислоты, тиофосфоновые кислоты и сульфокислоты; имидазольные группы; сульфатные группы; и защищенные тиольные группы.

Предшественник мономера циклодекстрина можно дополнительно химически модифицировать (например, галоидировать, аминировать), чтобы облегчить сополимеризацию предшественника мономера циклодекстрина с предшественником сомономера А или повлиять на эту сополимеризацию, как описано ниже. Химическая модификация предшественника мономера циклодекстрина делает возможной полимеризацию только в двух положениях каждого циклодекстринового фрагмента, т.е. в результате модификации образуется бифункциональный фрагмент циклодекстрина. Ниже представлена нумерация для положений С1-С6 каждого кольца глюкопиранозы:

В предпочтительном варианте изобретения полимеризация идет по любым двум положениям С2, С3 и С6, включая их комбинации, циклодекстринового фрагмента. Например, один предшественник мономера циклодекстрина может полимеризоваться по двум С6-положениям, тогда как другой предшественник мономера циклодекстрина может полимеризоваться по положениям С2 и С6 фрагмента циклодекстрина. Ниже на примере β -циклодекстрина схематически показаны буквенные обозначения относительного положения каждого цикла глюкопиранозы в циклодекстрине

В предпочтительном варианте изобретения мономер циклодекстрина С линейного сополимера циклодекстрина по изобретению имеет приведенную ниже общую формулу (II):

В формуле (II) n и m обозначают целые числа, которые, вместе с двумя другими циклами глюкопиранозы, определяют общее число глюкопиранозных элементов в мономере циклодекстрина. Формула (II) показывает мономер циклодекстрина, который способен полимеризоваться по двум положениям С6 элемента циклодекстрина. Примеры мономеров циклодекстрина формулы (II) включают, но без ограничения, 6^A,6^B дидезокси-α-циклодекстрин (n=0, m=4), 6^A,6^C-дидезокси-α-циклодекстрин (n=1, m=3), 6^A,6^D-дидезокси-α-циклодекстрин (n=2, m=2), 6^A,6^B-дидезокси-β-циклодекстрин (n=0, m=5), 6^A,6^C дидезокси-β-циклодекстрин (n=1, m=4), 6^A,6^Dдидезокси-β-циклодекстрин (n=2, m=3), 6^A,6^B-дидезокси-γ-циклодекстрин (n=0, m=6), 6,6 -дидезокси-γ-циклодекстрин (n=1, m=5), 6^A,6^D-дидезокси-γ-циклодекстрин (n=2, m=4) и 6^A,6^E-дидезокси-γ-циклодекстрин (n=3, m=3).

В другом предпочтительном варианте линейный сополимер циклодекстрина по изобретению может содержать элемент С мономерного циклодекстрина с раскрытым циклом глюкозы, где глюкопиранозные циклы циклодекстрина раскрываются при сохранении циклической системы циклодекстрина. Общая формула (III) показывает циклодекстрин с раскрытым глюкопиранозным циклом, раскрывающимся в положениях С2 и С3.

В формуле (III) р варьируется от 5 до 7. В формуле (III), по меньшей мере, в одном из элементов D(+)-глюкопиранозы мономера циклодекстрина раскрывается цикл, что делает возможным полимеризацию по положению С2 и С3 циклодекстринового элемента. Мономеры циклодекстрина формулы (III), такие, например, как 2^A,3^A-диамино-2^A,3^A-дидезокси-β-циклодекстрин и 2^A,3^A-диальдегид-2^A,3^A-дидезокси-β-циклодекстрин выпускает фирма Carbomer в Westborough, МА. Примеры мономеров циклодекстрина формулы (III) включают, но без ограничения, 2^A,3^A-дидезокси-2^A,3^A-дигидро-α-циклодекстрин, 2^A,3^A-дидезокси-2^A,3^A-дигидро-β-циклодекстрин, 2^A,3^A-дидезокси-2^A,3^A-дигидро-γ-циклодекстрин, обычно называемые, соответственно, 2,3-дидезокси-α-циклодекстрин, 2,3-дидезокси-β-циклодекстрин и 2,3-дидезокси-β-циклодекстрин.

Предшественник сомономера А может быть линейным или разветвленным, симметричным или асимметричным соединением, которое в процессе реакции с предшественником мономера циклодекстрина, описанного выше, связывает вместе два мономера. Предпочтительно, предшественник сомономера А представляет собой соединение, содержащее, по меньшей мере, две сшивающие группы, за счет которых можно осуществить реакцию и, следовательно, соединить мономеры циклодекстрина. Примерами возможных связывающих групп, которые могут быть одинаковыми или различными, концевыми или внутренними, каждого предшественника сомономера А включают, но без ограничения, аминогруппу, кислотную группу, сложноэфирную группу, имидазольную группу и хлорангидридную группу и их производные. В предпочтительном варианте две сшивающие группы одинаковы и являются концевыми. При сополимеризации предшественника сомономера А с предшественником мономера циклодекстрина две молекулы циклодекстрина могут связываться за счет соединения стороны с первичными гидроксильными группами одного мономера циклодекстрина со стороной с первичными гидроксильными группами другого мономера циклодекстрина, за счет соединения стороны со вторичными гидроксильными группами одного мономера циклодекстрина со стороной со вторичными гидроксильными группами другого мономера циклодекстрина или за счет соединения стороны с первичными гидроксильными группами одного мономера циклодекстрина со стороной со вторичными гидроксильными группами другого мономера циклодекстрина. Таким образом, в полученном сополимере могут быть все комбинации, образующиеся в результате таких связей.

Как предшественник сомономера А, так и сомономер А в конечном сополимере могут быть нейтральными, катионными (например, за счет присутствия протонированных групп, таких, например, как четвертичные аммониевые группы) или анионными (например, за счет наличия депротонированных групп, таких, например, как сульфатная, фосфатная или карбоксильная анионная группа). Противоионом имеющего заряд предшественника сомономера А или сомономера А может быть любой подходящий противоанион или противокатион (например, противоионом катионного предшественника сомономера А может быть анион галоида (например, анион хлора). Заряд сомономера А сополимера можно корректировать, корректируя рН.

Примеры подходящих предшественников сомономера А включают, но без ограничения, цистамин, 1,6-диаминогексан, диимидазол, дитиоимидазол, спермин, дитиоспермин, дигистидин, дитиогистидин, сукцинимид (например, дитиобис (сукцинимидилпропионат) DSP) и дисукцинимидилсуберат (DSS)) и имидаты (например, диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP)).

Сополимеризация предшественника сомономера А с мономером циклодекстрина ведет к образованию линейного полимера циклодекстрина, содержащего мостики (связи) сомономера А, имеющие представленные ниже общие формулы:

-HNC(O)(CH₂)_xC(O)NH-, -HNC(O)(CH₂)_xSS(CH₂)_xC(O)NH-, -⁺H₂N(CH₂)_xSS(CH₂)_xNH₂ ⁺-, -HNC(O)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂C(O)NH-, =NNHC(O)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂C(O)NH=, -⁺H₂NCH₂(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂CH₂, NH₂ ⁺-, -HNC(O)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂SS(CH₂CH₂O)_x CH₂CH₂ C(O) NH-, -HNC(NH₂ ⁺)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂C(NH₂ ⁺)NH-, -SCH₂CH₂NHC(NH₂ ⁺)(CH₂)_xC(NH₂ ⁺)NHCH₂CH₂S-, -SCH₂CH₂NHC(NH₂ ⁺)(CH₂)_xSS(CH₂)_xC(NH₂ ⁺)NHCH₂CH₂S-, -SCH₂CH₂NHC(NH₂ ⁺)CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xC(NH₂ ⁺)NHCH₂CH₂S-,

и

В вышеприведенных формулах х=1-50, a y+z=x. Предпочтительно, х=1-30. Более предпочтительно, х=1-20. В предпочтительном варианте сомономер А содержит биологически разлагаемый мостик (связь). Сомономер А может также включать неустойчивую в кислой среде функциональную группу, такую как сложноэфирные группы и другие неустойчивые при действии кислот группы, известные специалистам в данной области техники.

В другом предпочтительном варианте изобретения предшественник сомономера А и, следовательно, сомономер А могут селективно выбираться, чтобы соответствовать заданному применению. Например, для того, чтобы доставлять низкомолекулярный терапевтический агент, заряженный полимер может не потребоваться, а сомономер А может представлять собой или может содержать гидрофильную группу, такую как полиэтиленгликоль, дополнительно повышающий растворимость в воде. В случае полипептидных терапевтических агентов, таких как ДНК или белки, сомономер А, предпочтительно, несет заряд катиона (плюс), повышая способность линейного полимера циклодекстрина образовывать порошкообразный композит с полипептидным терапевтическим агентом. Понятно также, что линейный полимер циклодекстрина может содержать смесь сомономерных групп А.

Линейный сополимер циклодекстрина можно получать сополимеризацией предшественника мономера циклодекстрина, содержащего в качестве заместителей две уходящие группы, с предшественником сомономера А, способным замещать уходящие группы. Уходящие группы, которые могут быть одинаковыми или различными, могут представлять собой любые уходящие группы, известные в технике, которые могут быть замещены в процессе сополимеризации на предшественник сомономера А.

Линейный полимер циклодекстрина можно получать йодированием предшественника мономера циклодекстрина с образованием дийодзамещенного предшественника мономера циклодекстрина и сополимеризацией дийодзамещенного предшественника мономера циклодекстрина с предшественником сомономера А с образованием сополимера, содержащего повторяющийся элемент формула Ia, Ib или их комбинацию, каждый из этих элементов описан выше.

Другой способ получения: линейный циклодекстрин йодирует предшественника мономера циклодекстрина, описанного выше, с образованием дийодзамещенного предшественника мономерного циклодекстрина формулы IVa, IVb, IVc или их смеси:

Дийодированный циклодекстрин можно получать любым известным в технике методом (см., например, Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 5267-5270 (1984); Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 4580-4584 (1984)). Например, β-циклодекстрин может реагировать с бифенил-4,4'-дисульфонилхлоридом в присутствии безводного пиридина с образованием β-циклодекстрина, "накрытого" бифенил-4,4'-дисульфонилхлоридом, который может реагировать с иодидом калия с образованием дийод-β-циклодекстрина. Предшественник мономера циклодекстрина йодируется только в два положения. При сополимеризации дииодированного предшественника мономера циклодекстрина с предшественником сомономера А, как описано выше, можно получать линейный полимер циклодекстрина, содержащий повторяющийся элемент формулы Ia, Ib или их комбинацию. Если требуется, иод или иодсодержащие группы можно заменить другими известными уходящими группами.

Иодсодержащие группы или другие подходящие уходящие группы можно заменить группой, которая допускает реакцию с предшественником сомономера А, как описано выше. Например, дииодзамещенный предшественник мономера циклодекстрина формулы IVa, IVb, IVc или их смесь можно аминировать с образованием диаминозамещенного предшественника мономера циклодекстрина формулы Va, Vb, Vc или их смеси:

Диаминозамещенный предшественник мономера циклодекстрина можно получать любыми известными в технике методами (см., например, Tabushi et al., Tetrahedron Lett. 18:1527-1530 (1977); Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662 (1975)). Например, дийод-β-циклодекстрин может реагировать с азидом натрия, а затем продукт можно восстановить с образованием диамино-β-циклодекстрина. Предшественник мономерного циклодекстрина аминируется только по двум положениям. Диаминированный предшественник мономера циклодекстрина может затем вступать в реакцию сополимеризации с предшественником сомономера А, описанным выше, давая линейный сополимер циклодекстрина, содержащий повторяющийся элемент формулы Ia, Ib или их комбинацию, также описанные выше. Однако, функциональная аминогруппа диаминозамещенного предшественника мономера циклодекстрина не обязательно должна быть непосредственно соединена с циклодекстриновым фрагментом. Или же функциональную аминогруппу можно вводить, замещая иод или другую подходящую уходящую группу предшественника мономера циклодекстрина на аминосодержащие фрагменты, такие, например, как ^-SCH₂CH₂NH₂, с образованием диаминозамещенного предшественника мономера циклодекстрина формулы Vd, Ve, Vf, Vg, Vh и Vi или их смеси:

Линейный сополимер циклодекстрина можно также получать восстановлением линейного сополимера окисленного циклодекстрина, как описано ниже. Этот метод можно осуществлять, если сомономер А не содержит фрагмента, способного восстанавливаться, например, дисульфидного мостика.

Линейный полимер циклодекстрина можно окислять таким образом, чтобы включить в полимер, по меньшей мере один окисленный мономер циклодекстрина так, чтобы окисленный мономер циклодекстрина был частью линейной полимерной цепи. Линейный сополимер циклодекстрина, который содержит, по меньшей мере, один окисленный мономер циклодекстрина, определяют как линейный окисленный сополимер циклодекстрина. Линейный окисленный циклодекстрин, следовательно, содержит замещенные и незамещенные циклодекстриновые фрагменты, бифункционально связанные в линейную основную цепь сополимера за счет связей заместителей в положении 2, 3 или 6, по меньшей мере, одного глюкопиранозного цикла циклодекстрина, с бифункциональными фрагментами, фрагментами сомономера А, связывающими циклодекстрин линейного сополимера циклодекстрина, и при этом глюкопиранозный цикл циклодекстринового фрагмента является окисленным. Мономер циклодекстрина может окисляться либо по первичным, либо по вторичным гидроксильным группам циклодекстринового фрагмента. Если в линейном окисленном сополимере циклодекстрина присутствует более одного окисленного мономера циклодекстрина, то эти окисленные мономеры циклодекстрина могут быть окислены либо по первичным, либо по вторичным гидроксильным группам, либо и по тем и по другим. В качестве иллюстрации приведен линейный сополимер циклодекстрина с окисленными вторичными гидроксильными группами, который содержит, например, по меньшей мере, один элемент (звено) формулы VIa или VIb.

В формулах VIa и VIb С обозначает замещенный или незамещенный окисленный мономер циклодекстрина, а А обозначает сомономер, связанный, т.е. ковалентно связанный, с окисленным циклодекстрином С. Также в формулах VIa и VIb окисление вторичных гидроксильных групп приводит к раскрытию цикла циклодекстринового фрагмента и образованию альдегидной группы.

Линейный окисленный сополимер циклодекстрина можно получать окислением линейного сополимера циклодекстрина, как обсуждается выше. Окисление линейного сополимера циклодекстрина можно осуществлять методами окисления, известными в технике (Hisamatsu et al., Starch 44:188-191 (1992)). Предпочтительно, применяют такой окислитель, как, например, периодат натрия. Специалисты в данной области техники понимают, что в стандартных условиях окисления степень окисления может изменяться в полимере или в зависимости от полимера. Так, в одном варианте изобретения линейный окисленный сополимер может содержать один окисленный мономер циклодекстрина. В другом варианте окисленными являются практически все мономеры циклодекстрина в сополимере.

Другой способ получения линейного окисленного сополимера циклодекстрина включает окисление дийодзамещенного или диаминозамещенного предшественника мономера циклодекстрина, описанных выше, с образованием окисленного дийодзамещенного или диаминозамещенного предшественника мономера циклодекстрина и сополимеризацию окисленного дийодзамещенного или диаминозамещенного предшественника мономера циклодекстрина с предшественником сомономера А. Предпочтительный вариант изобретения охватывает окисленный дийодзамещенный предшественник мономера циклодекстрина формулы VIIa, VIIb, VIIc или их смесь:

Окисленный мономер циклодекстрина можно получать окислением дийодзамещенного предшественника мономера циклодекстрина формулы IVa, IVb, IVc или их смеси, как описано выше. В другом варианте изобретения предшественник окисленного диаминозамещенного мономера циклодекстрина формулы VIIIa, VIIIb, VIIIc или их смесь

можно получать аминированием окисленного дийодзамещенного предшественника мономера циклодекстрина формул VIIa, VIIb, VIIc или их смеси, как описано выше.

Еще в одном варианте изобретения окисленный диаминосодержащий предшественник мономера циклодекстрина формулы IXa, IXb, IXc, IXd, IXe, IXf или их смесь

можно получать замещением иода или других соответствующих уходящих групп дизамещенного окисленного предшественника мономера циклодекстрина, имеющего в качестве заместителей иод или другую соответствующую уходящую группу, на аминогруппу, содержащую фрагмент ^-SCH₂CH₂NH₂.

Или же окисленный дийодированный, дикарбоксилированный или диаминированный предшественник мономера циклодекстрина, описанный выше, можно получать окислением предшественника мономера циклодекстрина с образованием окисленного предшественника мономера, а затем дийодированием и/или диаминированием окисленного мономера циклодекстрина, как описано выше. Аминогруппы любых диаминированных окисленных мономеров циклодекстрина могут иметь защитные группы, чтобы избежать нежелательных побочных реакций. Как обсуждается выше, циклодекстриновый фрагмент может быть модифицирован с помощью других уходящих групп, иных, нежели йод и другие аминогруппы, содержащие функциональные группы. Окисленный дийодированный или диаминированный предшественник мономера циклодекстрина можно затем сополимеризовать с предшественником сомономера А с образованием линейного окисленного сополимера циклодекстрина.

Линейный сополимер циклодекстрина или линейный окисленный сополимер циклодекстрина оканчивается, по меньшей мере, одним предшественником сомономера А или продуктом гидролиза предшественника сомономера А. Вследствие того, что на конце сополимера циклодекстрина находится, по меньшей мере, один предшественник сомономера А, на линейный сополимер циклодекстрина или на линейный окисленный сополимер циклодекстрина приходится свободная дериватизирующая группа, описанная выше. Например, дериватизирующая группа, которую можно гидролизовать до кислотной группы. Согласно изобретению, дериватизирующую группу можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы улучшить свойства сополимера циклодекстрина, такие, например, как устойчивость в коллоидном состоянии и эффективность трансфекции. Например, дериватизирующую группу можно дериватизировать реакцией с ПЭГ с целью получения сополимера циклодекстрина с ПЭГ на конце, чтобы повысить устойчивость коллоидной системы, или реакцией с гистидин- или имидазолуксусной кислотой с целью получения сополимера циклодекстрина с имидазолильной группой на конце, чтобы повысить внутриклеточную активность (например, эндосомное выделение) и активность трансфекции. См. Фигуры 29 и 30.

Дальнейшие химические превращения сополимера циклодекстрина можно осуществлять при участии модифицированной дериватизирующей группы. Например, модифицированную дериватизирующую группу можно использовать для увеличения полимерной цепи путем связывания линейного сополимера циклодекстрина или линейного окисленного сополимера циклодекстрина с тем же самым или с другим сополимером циклодекстрина или нециклодекстриновым полимером. Полимер, который следует присоединить, может быть тем же самым или иным линейным сополимером циклодекстрина или линейным окисленным сополимером циклодекстрина, который также может иметь на конце предшественник сомономера А для дальнейшей модификации.

Или же, по меньшей мере, два одинаковых или различных линейных сополимера циклодекстрина или линейных окисленных сополимера циклодекстрина, содержащих концевую дериватизирующую группу или концевую модифицированную дериватизирующую группу, описанную выше, могут вступать в реакцию и связываться вместе за счет фнкциональной или модифицированной дериватизирующей группы. Предпочтительно, когда в ходе реакции функциональной или модифицированной дериватизирующей группы образуется расщепляемый фрагмент, такой, например, как дисульфидный мостик. Например, модификация концевой дериватизирующей группы цистеином может использоваться для получения линейного сополимера циклодекстрина или линейного окисленного сополимера циклодекстрина, содержащих свободную тиольную группу. Реакция с тем же самым или с другим сополимером циклодекстрина, также содержащим тиольную группу, приводит к образованию дисульфидной связи между двумя сополимерами. Функциональные или модифицированные дериватизирующие группы можно выбирать так, чтобы образовывались связи с различными скоростями расщепления (например, ферментативного расщепления), и тем самым обеспечивать, если необходимо, систему пролонгированного действия для терапевтического агента. Образующийся полимер может быть сшитым, как представлено в данном описании. Терапевтический агент по данному описанию можно добавлять до или после сшивания полимера. Лиганд может быть также связан с сополимером циклодекстрина за счет модифицированной дериватизирующей группы. Например, линейный сополимер циклодекстрина или линейный окисленный сополимер циклодекстрина можно модифицировать с помощью лиганда, прилегающего к сополимеру циклодекстрина. Лиганд может быть присоединен к сополимеру циклодекстрина за счет мономера С циклодекстрина или за счет сомономера А. Предпочтительно, лиганд присоединен к циклодекстриновому фрагменту сополимера циклодекстрина. См. Международную заявку WO 00/01734, вводимую в данное описание в качестве ссылки.

Разветвленные циклодекстринсодержащие полимеры

Полимер порошкообразного композита, имеющий функциональность хозяина и/или гостя, может также быть практически разветвленным полимером, таким, например, как разветвленный полиэтиленимин (PEI) или разветвленный циклодекстринсодержащий полимер, предпочтительно, разветвленный циклодекстринсодержащий полимер. Разветвленный циклодекстринсодержащий полимер может быть любым водорастворимым полимером, содержащим, по меньшей мере, один циклодекстриновый фрагмент, который может быть частью основной полимерной цепи и/или разветвлением от основной полимерной цепи. Разветвленный циклодекстринсодержащий полимер представляет собой разветвленный сополимер циклодекстрина или разветвленный окисленный сополимер циклодекстрина. Разветвленный сополимер циклодекстрина или разветвленный окисленный сополимер циклодекстрина представляет собой, соответственно, линейный сополимер циклодекстрина или линейный окисленный сополимер циклодекстрина, описанные выше, от которых отходит боковая цепь. Ответвленная боковая цепь может быть любой насыщенной или ненасыщенной, линейной или разветвленной углеводородной цепью. Ответвленная боковая цепь может дополнительно содержать различные дериватизирующие группы или заместители, такие, например, как гидроксил, амино, кислотная, сложноэфирная, амидная, кето, формильная и нитрогруппа. Ответвленная боковая цепь может также содержать циклодекстриновый или другой фрагмент с функциональностью гостя и/или хозяина. Ответвленная боковая цепь может также модифицироваться с помощью лиганда. Такая модификация при участии лиганда включает, но без ограничения, присоединение лиганда к циклодекстриновому фрагменту в ответвленной боковой цепи.

Предпочтительно, разветвленный циклодекстринсодержащий полимер представляет собой разветвленный сополимер циклодекстрина или разветвленный окисленный сополимер циклодекстрина, в котором ответвленная боковая цепь содержит циклодекстриновый фрагмент. Если ответвленная боковая цепь содержит циклодекстриновый фрагмент, циклодекстриновый фрагмент может облегчить образование комплекса включения, а также инкапсулирование терапевтического агента. Предпочтительно, циклодекстриновый фрагмент ответвленной боковой цепи облегчает образование комплекса включения и инкапсулирование терапевтического агента в сочетании с циклодекстриновым фрагментом в полимерной основной цепи. Разветвленный циклодекстринсодержащий полимер можно получать любыми способами, известными в технике, включая, но без ограничения, дериватизацию (например, замещение) полимера (например, линейного или разветвленного PEI) с помощью предшественника мономера циклодекстрина. Примеры полимеров, содержащих циклодекстрины в боковой цепи, описаны в Tojima, et al., J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 36, 1965 (1998), Crini, et al., Eur. Polym. J. 33, 1143, (1997), Weickenmeier et al., Maromol. Rapid Commun. 17, 731 (1996), и Bachmann, et al., J. Carbohydrate Chemistry 17, 1359 (1998); каждый из этих источников вводится в данное описание в качестве ссылки. (В статье Weickenmeier описаны сложные полиэфиры с циклодекстрином в боковой цепи, их синтез и внедрение (включение) производных адамантана). Разветвленный циклодекстринсодержащий полимер может быть сшитым, как обсуждалось выше.

Поли(этиленимин) (PEI) для применения по изобретению имеет среднюю молекулярную массу между 800 и 800000 дальтон, предпочтительно, между 2000 и 100000 дальтон, более предпочтительно, между 2000 и, примерно, 25000 дальтон. PEI может быть линейным или разветвленным. Подходящие соединения PEI выпускаются в промышленности многими фирмами, включая полиэтиленимин от Aldrich Chemical Company, полиэтиленимин от Polysciences и POLYMIN поли(этиленимин) и LUPASOL™ поли(этиленимин) от BASF Corporation.

Другие полимеры с функциональностью хозяина

Как обсуждается выше, по меньше мере, один полимер порошкообразного композита является полимером, способным образовывать комплексы включения. Полимеры, в которых циклодекстрин имеет предпочтительную фунциональность хозяина, описаны выше. Таким же образом любой полимер, линейный или разветвленный, имеющий функциональность хозяина, может применяться в практическом использовании данного изобретения. Другие примеры подходящих "хозяев", которые могут применяться с полимеров, включают, но без ограничения, кавитанды, краун-эфиры, криптанды, кукурбитурилы, каликсарены, сферанды и т.п. Полимеры этих других хозяев можно получать так же, как описано выше для циклодекстринсодержащих полимеров. Представляющий интерес хозяин может быть дериватизирован за счет функциональной группы, такой, например, как гидроксильная группа, путем присоединения уходящей группы, такой как йод, тозилат и т.д., и может реагировать с соответствующим сомономером А, замещающим уходящую группу и образующим сополимер-"хозяин". Или же хозяин может содержать или может быть дериватизирован таким образом, чтобы содержать функциональную группу, такую как амино-или карбоксигруппа, которая делает возможной реакцию хозяина с сомономером А с образованием сополимера-"хозяина". Сополимеры-"хозяева", следовательно, можно получать, имея смесь функциональностей хозяина в полимерной основной цепи, а также, если полимер разветвлен, в боковых цепях.

Полимеры с функциональностью гостя

Полимером с функциональностью гостя может быть любой полимер, способный образовывать комплекс включения с комплексообразующим агентом с функциональностью хозяина. Как правило, функциональность гостя присутствует в боковой цепи или в концевой группе. Примером полимера, имеющего функциональность гостя не в качестве части основной цепи полимера, является полимер, имеющий боковые адамантановые группы. Примеры функциональности "включения", которую можно встроить в полимер, включают функциональности, известные в технике, например, но без ограничения, адамантан, диадамантан, нафталин и холестерол.

В. Терапевтический агент

Согласно изобретению, по меньшей мере, один терапевтический агент инкапсулируется в полимере с образованием порошкообразного композита, как описано выше. Предполагается, что термин "терапевтический агент" охватывает любой активный агент, который имеет фармакологическое или терапевтическое применение, как обсуждается ниже, в качестве активных соединений или агентов, обладающих микробицидным действием. Примеры таких терапевтических агентов (или активных агентов) обсуждаются ниже. Инкапсулирование определяется как любой способ ассоциации терапевтического агента (например, электростатическое взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, действительное инкапсулирование) с полимером. Степень ассоциации можно определить методами, известными в технике, включая, например, исследование флуоресценции, исследование подвижности ДНК, рассеяние света, электронную микроскопию; и степень ассоциации очень меняется в зависимости от терапевтического агента. В качестве способа доставки, например, терапевтическую композицию, содержащую многомерную полимерную сетку, созданную из полимера порошкообразного композита, как описано выше, и ДНК можно использовать для содействия трансфекции, т.е. попаданию ДНК в клетку животного (например, человека) (Boussif, О. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92:7297-7301 (1995); Zanta et al. Bioconjugate Chemistry, 8:839-844 (1997); Gosselin et al. "Efficient Gene Transfer Using Reversibly Cross-Linked Low Molecular Weight Polyethilenimine ", College of Pharmacy, The Ohio Statue University, опубликовано в Интернете (web), проверенная рукопись 5 июля 2001 года). Когда терапевтическим агентом является полимер на основе нуклеиновой кислоты (например, ДНК), терапевтический агент, образующий композит, может быть в виде "полиплекса". Полиплекс представляет собой композит нуклеиновой кислоты и "подотчетных" полимеров. См. Felgner, et al. "Nomenclature for Synthetic Gene Delivery Systems". Hum. Gene Ther. 8, 511-512 (1997).

Любую смесь терапевтических агентов можно использовать с композицией по изобретению. При образовании порошкообразного композита терапевтический агент может сохранить или не сохранить свою биологическую или терапевтическую активность. При высвобождении из терапевтической композиции, а именно, из полимера порошкообразного композита, активность терапевтического агента восстанавливается. Или порошкообразный композит благоприятно влияет на защищенность терапевтического агента от утраты активности вследствие, например, разрушения и обеспечивает повышенную биодоступность. Следовательно, композицию по изобретению можно применять для обеспечения устойчивости, в частности, при хранении и в растворе, терапевтического агента или любого активного химического соединения. Инкапсулирование липофильного терапевтического агента обеспечивает повышенную, если не полную, растворимость липофильного терапевтического агента. Терапевтический агент можно дополнительно модифицировать с помощью лиганда перед образованием порошкообразного композита или терапевтической композиции или после их образования.

Терапевтический агент может быть любым липофильным или гидрофильным, синтетическим или природным биологически активным терапевтическим агентом, включая агенты, известные в технике. The Merck Index, An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, 13^th Edition, 2001, Merck and Co., Inc., Whitehouse Station, NJ. Примеры таких терапевтических агентов включают, но без ограничения, низкомолекулярные фармацевтические препараты, антибиотики, стероиды, полинуклеотиды (например, геномная ДНК, кДНК, мРНК, антисмысловые полинуклеотиды, вирусы и химерные полинуклеотиды), плазмиды, пептиды, пептидные фрагменты, малые молекулы (например, доксорубицин), хелатирующие агенты (например, дефороксамин (DESFERAL), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), природные продукты (например, Taxol, Amphotericin) и другие биологически активные макромолекулы, например, такие как белки и ферменты. См. также Патент США 6048736, в котором перечисляются активные агенты (терапевтические агенты), применяемые в качестве гостя для получения соединений включения с полимерами циклодекстрина. Патент США 6048736 вводится в данное описание в качестве ссылки. Низкомолекулярные терапевтические агенты могут быть не только терапевтическими агентами в частице (составляющей) композита, но, в дополнительном варианте изобретения, могут быть ковалентно связаны с полимером в композите. Предпочтительно, ковалентная связь "обратима" (например, пролекарственная форма или биоразрушаемая связь, такая, как дисульфидный мостик) и создает другой путь доставки терапевтического агента.

2. Комплексообразующий агент

Согласно изобретению комплексообразующий агент представляет собой соединение, имеющее функциональность хозяина или гостя, которое способно образовывать комплекс включения с полимером в порошкообразном композите, имеющем, соответственно, функциональность гостя или хозяина. Как описывается выше, комлексообразователь-гость можно применять для модификации полимера порошкообразного композита, имеющего функциональность хозяина, или мономера полимера, имеющего функциональность хозяина, с целью получения комплекса включения. Так же, как описано выше, комлексообразователь-гость может образовывать комплекс включения, по меньшей мере, с одним полимером порошкообразного композита, выступая в качестве гостя по отношению к полимеру с функциональностью хозяина. Комплексообразующий агент может иметь две или более функциональности включения. Например, комплексообразующий агент, имеющий две функциональности включения, может представлять собой комплексообразователь-гость, гость; хозяин, хозяин; хозяин, гость. Комплексообразующий агент может также содержать смесь или несколько функциональностей хозяин и/или гость. Комплексообразующий агент также содержит функциональную группу, которая придает благоприятные свойства композиции по изобретению. Эта функциональная группа может, например, быть лигандом, гидрофильной или гидрофобной группой, дополнительным терапевтическим агентом и т.д. Комплексообразующий агент может включать спейсер между гостем или хозяином включения и функциональной группой.

Предпочтительно, константы связывания комплексообразующего агента составляют около >10², предпочтительно, около >10³, и более предпочтительно, около >10⁴. Как правило, значения константы связывания лежит в примерном интервале 1²-10⁶. Примеры гостей включения, пригодных в качестве комплексообразующих агентов, включают комплексообразующие агенты, известные в технике, например, но без ограничения, такие, как адамантан, диадамантан, нафталин, холестерин(-ол). и их производные. Предпочтительно, применяют адамантан или диадамантан. Amiel et al., Int. J. Polymer Analysis & Characterization, Vol.1, 289-300 (1995); Amiel et a Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry, 25:61-67 (1996); Amiel et al., Advances in Colloid and Interface Science 105-122 (1999); and Sandier et al., Langmuir, 16, 1634-1642 (2000).

Комплексообразующий агент содержит функциональную группу, которая оказывает благотворное воздействие на композицию по изобретению. Простое присоединение гидроксильной или аминофункциональной группы - это один способ введения функциональности. В предпочтительном варианте изобретения комплексообразующий агент может образовывать комплекс включения с полимером порошкообразного композита, а также изменять композит, например, облегчать клеточный контакт, межклеточную направленную миграцию и/или входные ворота клетки и высвобождение из клетки. Можно использовать любую такую группу, известную в технике. Примеры подходящих "функциональных" групп включают, но без ограничения, лиганды, сигналы ядерной локализации (см. Zanta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, pp.91-96 (1999), пептиды эндосомного высвобождения, полимеры эндосомного высвобождения, агенты пермеабилизации мембран или их смеси. Сигналом ядерной локализации (NLS) может быть любой известный в технике сигнал ядерной локализации. Пептидом или полимером эндосомного высвобождения может быть любой пептид или полимер эндосомного высвобождения, известный в технике (например, НА-2 и GALA). См. "Gene delivery by negatively charged ternary complexes of DNA, cationic liposomes and transferrin or fusigenic peptides" Simoes S, Slepushkin V, Gaspar R, de Lima MCP, Duzgunes N, GENE THERAPY 5: (7) 955-964 JUL 1998. Примером агента пермеабилизации клеточной мембраны (или агента проницаемости клеточной мембраны)является белок ТАТ ВИЧ-1. Белок ТАТ представляет собой вирусный активатор транскрипции, активно импортируемый в клеточное ядро. Torchilin, V. Р. et al, PNAS. 98, 8786-8791, (2001).

Комплексообразующий агент может также быть функционализован при использовании полимера, который повышает растворимость и/или устойчивость к воздействиям, в частности, в биологических условиях. Стабилизации композиции можно достичь или повысить ее, используя комплексообразующие агенты, имеющие гидрофильные группы или липофильные группы. Предпочтительными гидрофильными группами является полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-содержащий сополимер (PEG). Предпочтительные полиэтиленгликоли имеют формулу OH(CH₂CH₂O)_zH, где z изменяется от 2 до 500, предпочтительно, 10-300. PEG 600, PEG 34000 и PEG 5000 являются представителями полиэтиленгликолей, которые можно использовать по изобретению. В целом, чем выше молекулярная масса ПЭГ в комплексообразующем агенте, тем выше стабилизация композиции. Как правило, предпочтительным является более высокий молекулярный вес. Предпочтительным комплексообразующим агентом является пэгированный адамантан или пэгированный диадамантан. Структуры некоторых молекул Адамантан-ПЭГ, пригодных в качестве комплексообразующих агентов, показаны на Фигуре 1. Чтобы повысить липофильность (гидрофобность), комплексообразующий агент может содержать липофильные группы, такие как алкилы с длинной цепью, жирные кислоты и т.д. Выбор липофильной группы зависит от нужной степени липофильности. Как можно видеть из этого обсуждения, комплексообразующий агент можно модифицировать с помощью любого типа функциональности, чтобы ввести заданное свойство в композицию. Комплексообразующий агент можно получать обычными методами органической химии. Применение смесей различных комплексообразующих агентов позволяет получать большее разнообразие и большую специфичность нужных свойств композиции.

Для соединения функциональной группы с комплексообразующим агентом можно использовать спейсерную группу. Спейсерная группа может быть любой спейсерной группой, известной в технике, которая не оказывает вредного воздействия на свойства гостя-комплексообразователя или функциональной группы. Например, спейсерная группа может быть простой связью, так что функциональная группа непосредственно связана с комплексообразующим агентом. Или же спейсерная группа может быть фрагментом, который растворим в воде, является анионом с высоким зарядом при физиологических рН или обладает фузогенными свойствами в кислой среде. Предпочтительно, спейсерная группа повышает аффинность связывания комплексообразующего агента с полимером в комплексе включения (например, анионная спейсерная группа может также содержать восстанавливаемую связь (например, дисульфидный мостик), восстановление которого высвобождает функциональную группу комплексообразующего агента. Примеры подходящих спейсерных групп включают, но без ограничения, простую связь, полиглутаминовую кислоту, GALA и полиэтиленгликоли (ПЭГ).

Функциональная группа может также являться дополнительным терапевтическим агентом. Терапевтический агент может быть обратимо связан с комплексообразующим агентом (например, за счет пролекарственной формы или биоразрушаемых связей). Это дает способ доставки дополнительных терапевтических агентов с помощью комплексообразующего агента.

Как можно понять из вышеприведенной дискуссии, комплексообразующий агент, применяемый в композиции по изобретению, представляет собой соединение формулы:

где

J обозначает NH-, -С(=O)NH-(CH₂)_d-, -NH-C(=O)-(CH₂)_d-, -CH₂SS-, -С(=O)O-(СН₂)_е-O-Р(=O)(O-(СН₂)_е-Y)O-,

пептидный или полипептидный остаток или

-NH-(C=O)-CH(R¹)-NH-(C=O)-CH(R¹)-NH-;

Y обозначает дополнительную функциональность хозяин/гость;

R¹ обозначает -(CH₂)_a-CO₂H, ее эфир или соль; или -(CH₂)_a-CONH₂;

PEG (ПЭГ) обозначает -O(CH₂CH₂O)_z-, где z варьируется от 2 до 500;

L обозначает Н, -NH₂, -NH-(C=O)-(CH₂)_e-(C=O)-CH₂-, -S(=O)₂-HC-CH₂-,-SS-, С(=O)O-или углеводный остаток;

а обозначает 0 или 1;

b обозначает 0 или 1;

d имеет значение в интервале от 0 до 6;

е имеет значение в интервале от 1 до 6;

n имеет значение в интервале от 0 до 6;

y обозначает 0 или 1; и

х обозначает 0 или 1.

Комплексообразующий агент может также являться соединением формулы:

где переменные имеют то же значение, которое указано выше, при этом z имеет значения в интервале от 1 до 5, q имеет значения в интервале от 1 до 5 и w имеет значения в интервале от 1 до 5.

Как обсуждалось выше, примеры функциональности гостя включают, но без ограничения, адамантил, нафтил, холестерин, а предпочтительной функциональностью гостя является циклодекстрин. Смеси функциональностей хозяина и гостя, как указано в формуле, могут присутствовать в комплексообразующем агенте.

Предпочтительный класс комплексообразующих агентов, имеющих функциональность гостя адамантана, представляют собой соединения формулы:

J обозначает NH-, -С(=O)NH-(CH₂)_d-, -NH-C(=O)-(CH₂)_d-, -CH₂SS-, -С(=O)O -(СН₂)_е-O-Р(=O)(O-(СН₂)_е-Ad)O-,

пептидный или полипептидный остаток или

-NH-(C=O)-CH(R¹)-NH-(C=O)-CH(R¹)-NH-;

Ad обозначает адамантил;

R¹ обозначает -(СН₂)_а-CO₂Н, ее эфир или соль; или -(CH₂)-CONH₂;

ПЭГ обозначает -O(CH₂CH₂O)_z-, где z варьируется от 2 до 500;

L обозначает Н, -NH₂, -NH-(C=O)-(CH₂)_e-(C=O)-CH₂-, -S(=O)₂-HC=CH₂ -,-SS-, С(=O)O-или углеводный остаток;

а обозначает 0 или 1;

b обозначает 0 или 1;

d имеет значение в интервале от 0 до 6;

е имеет значение в интервале от 1 до 6;

y обозначает 0 или 1; и

х обозначает 0 или 1.

При использовании функционализованных комплексообразующих агентов терапевтическая композиция по изобретению может быть модифицирована или функционализована таким образом, чтобы облегчить клеточный контакт и/или входные ворота клетки. Чтобы получить несколько функций и/или преимуществ, композиция может образовывать два или три типа комплексов включения при использовании комплексообразующего агента, имеющего различные функциональности. Как описано выше, для модификации полимера порошкообразного композита или комплексообразующего агента может применяться лиганд. Таким образом, в соответствии с изобретением композиция по изобретению может, через посредство комплекса включения, содержать более чем один лиганд и, следовательно, нести более одного сайта для нацеливания на клетку и/или доставки. Порошкообразный композит, содержащий сложные, функционализованные с помощью лиганда или иным способом комплексообразующие агенты, может быть стабилизирован добавлением комплексообразующих агентов с функциональностью стабилизации или растворимости, например, таких как пэгированные комплексообразующие агенты.

Так как полимер может образовывать несколько комплексов включения со смесью различных функционализованных комплексообразующих агентов, терапевтическая композиция по изобретению может содержать, например, несколько терапевтических агентов, различные лиганды и/или разные полимеры для стабилизации. Если комплексообразующий агент функционализован с помощью терапевтического агента или пролекарства, то образование комплексов включения позволяет доставлять многие терапевтические средства, используя одну и ту же терапевтическую композицию. Если присутствует лиганд, вся комбинация (коктейль) терапевтических агентов может быть направлена на конкретный тип клеток, конкретное заболевание или на другое терапевтическое применение.

Функционализованный гость - комплексообразующий агент можно получать любым известным в технике способом. См. Amiel et al., Int. J. Polymer Analysis & Characterization, Vol.1, 289-300 (1995); Amiel et al., Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry, 25, 61-67 (1996); Sandier et al., Langmuir, 16, 1634-1642 (2000).

3. Получение композиции по изобретению

Изобретение также относится к способу получения композиции. Способ включает объединение терапевтического агента, полимера, имеющего функциональность "хозяин" или "гость", и комплексообразующего агента с целью получения терапевтической композиции. Комплексообразующий агент, играющий роль гостя или хозяина, образует комплекс включения с полимером. В другом варианте изобретения сначала объединяют полимер и терапевтический агент с целью получения порошкообразного композита. Затем порошкообразный композит объединяют с комплексообразующим агентом для образования комплекса включения терапевтической композиции. Композицию можно также получать, сначала смешивая полимер с комплексообразующим агентом, а затем объединяя смесь с терапевтическим агентом с образованием композита и, соответственно, композиции по изобретению.

А. Получение порошкообразного композита полимер - агент

Порошкообразный композит терапевтического агента и полимера можно получать любым известным в технике подходящим способом. Например, порошкообразный композит можно получать простым контактированием, смешением или диспергированием терапевтического агента с полимером. Например, полимер и терапевтический агент можно смешивать в растворителе, в котором они оба растворимы, в котором полимер растворим, а терапевтический агент диспергирован, или в растворителе, в котором полимер и терапевтический агент диспергируются, но в котором солюбилизируется порошкообразный композит. Для применения в фармации растворитель может быть любым физиологически приемлемым водным раствором. Порошкообразный композит может образовываться путем ассоциации полимера и терапевтического агента, путем самоассоциации полимера или химическими способами. До образования порошкообразного композита полимер порошкообразного композита, как правило, не существует как практически ассоциированная структура, например, гель полимера. Однако, полимер как часть порошкообразного композита, в зависимости от природы полимеров и терапевтического агента, может образовывать практически ассоциированную структуру, такую как гель. Порошкообразный композит можно также получать полимеризацией мономеров, которые могут быть одинаковыми или различными, в присутствии терапевтического агента, с образованием линейного или разветвленного полимера. Порошкообразный композит можно также получать полимеризацией мономеров, которые могут быть одинаковыми или различными, способных образовывать линейный или разветвленный полимер, в присутствии терапевтического агента, при условии, что агент ведет себя как матрица для полимеризации. Troubetskoy et al., Nucleic Acids Research, Vol.26, No. 18, pp.4178-4185 (1998).

Количество используемого полимера и терапевтического агента может представлять собой любое количество, которое делает возможной "сборку" композита. Как правило, полимер берут в избытке по отношению к терапевтическому агенту. Когда применяемый полимер несет заряд катиона или аниона, например, такой как в случае положительно ("катионно") заряженного сомономера А или в случае полиалкиленимина, например, такого как PEI, и когда терапевтический агент несет такой заряд, как, например, в анионном полинуклеотиде, соотношение полимера и терапевтического агента можно выразить соотношением зарядов. Соотношение зарядов есть выражение соотношения заряда полимера к заряду терапевтического агента. Как показано в примерах, порошкообразные композиты катионных полимеров циклодекстрина и анионной ДНК, как правило, готовят в соотношении зарядов 5+/-, то есть пять катионных зарядов полимера циклодекстрина на один анионный заряд ДНК. Соотношение зарядов может представлять собой любое соотношение, которое делает возможным образование композита и которое может превышать минимальное необходимое соотношение. Если полимер и/или терапевтический агент не заряжены, количество или соотношение полимера к терапевтическому агенту можно выражать в весовых единицах, в молях или в виде концентрации, как известно в технике.

Согласно изобретению, полимер порошкообразного композита можно также обрабатывать в условиях, достаточных для образования порошкообразного композита, содержащего терапевтический агент и многомерную полимерную сетку. Такие многомерные полимерные сетки описаны в Международной заявке WO 00/33885, которая вводится в данное описание в качестве ссылки. Как описывается в Международной заявке WO 00/33885, обработка полимера порошкообразного композита в условиях, достаточных для образования многомерной полимерной сетки, может быть осуществлена в любых подходящих условиях реакции, включая прибавление дополнительных агентов или реагентов, которые промотируют ассоциацию полимера и терапевтического агента порошкообразного композита. Полимер может ассоциироваться за счет межполимерных ковалентных связей, нековалентных связей (например, ионных связей) или нековалентных взаимодействий (например, взаимодействий Ван-дер-Ваальса). Ассоциация за счет внутриполимерного ковалентного связывания, нековалентного связывания или нековалентных взаимодействий полимера также может иметь место. В результате такой ассоциации полимер порошкообразного композита взаимодействует с образованием многомерной полимерной сетки.

В одном варианте изобретения образование порошкообразного композита, содержащего терапевтический агент и многомерную полимерную сетку, включает реакции сшивания (перекрестного связывания). Например, если полимер порошкообразного композита представляет собой отдельную полимерную молекулу, полимер может реагировать с молекулой(-ами), олигомером(-ами) или другим(-и) полимером(-ами), которые промотируют сшивание или образуют перекрестные связи (сшивки), такие как сшивание внутри молекулы полимера (внутримолекулярное) или настоящее сшивание с отдельной полимерной молекулой порошкообразного композита. Аналогично, если полимер порошкообразного композита представляет собой смесь двух или более полимеров, полимер или полимеры могут реагировать с молекулой(-ами), олигомером(-ами) или другим(-и) полимером(-ами), которые промотируют сшивание или образуют перекрестные связи (сшивки). Образующиеся сшивки могут быть внутри молекулы полимера (внутримолекулярными) и/или между полимерными молекулами (межмолекулярными), предпочтительно, они представляют собой межмолекулярное сшивание полимера или полимеров порошкообразного композита.

Сшивающий агент может быть любым известным в технике сшивающим агентом. Сшивающий агент может быть любым олигомером или полимером (например, полимером полиэтиленгликолем (ПЭГ), полиэтиленом), способным инициировать сшивание внутри или действительное сшивание с полимером порошкообразного композита. Сшивающий олигомер или полимер может быть тем же самым, что и полимер порошкообразного композита, или отличным от него. Аналогично, сшивающий агент может быть любой подходящей молекулой, способной сшивать полимер порошкообразного композита. Сшивающий агент сам может иметь лиганд.

Как описано в Международной заявке WO 00/33885, степень ассоциации полимера порошкообразного композита, образующего многомерную полимерную сетку, может меняться от частичной ассоциации до полной ассоциации. Изменяя степень ассоциации полимера, можно полимеру с короткой цепью придать характеристики полимера с длинной цепью, при этом при диссоциации сохраняются желательные характеристики полимера с короткой цепью. Например, длинноцепной полимер промотирует общую стабильность, т.е. устойчивость к разрушению, до тех пор, пока не достигнута клетка-мишень, тогда как особенностью короткоцепного полимера является промотирование высвобождения ДНК внутри клетки-мишени. Эта двойственность придает терапевтической композиции, содержащей терапевтический агент и многомерную полимерную сетку, повышенную стабильность как в нефизиологических, так и в физиологических условиях и обеспечивает устойчивость при более длительном хранении. Изменение степени ассоциации полимера терапевтической композиции также позволяет регулировать высвобождение терапевтического агента.

Размер частиц порошкообразного композита зависит от полимера и терапевтического агента, применяемых для образования композиции по изобретению. Как показано в нижеприведенных примерах, размеры частиц могут меняться в интервале 50-1000 нм, предпочтительно, 50-500 нм. Обычно при образовании комплекса включения размер частиц увеличивается незначительно. Композиции остаются в виде дискретных частиц. Как обсуждается ниже, композиции, содержащие пэгированные комплексообразующие агенты, обладают прекрасной устойчивостью в растворах солей. Преимуществом является то, что композиции устойчивы в физиологических условиях, что делает возможным их применение в качестве носителей для доставки терапевтических агентов и при лечении различных заболеваний и нарушений.

В. Получение комплекса включения

Комплекс включения можно получать любым известным в технике способом. Например, комплекс включения может образовываться при простом контактировании, смешении или диспергировании порошкообразного композита и комплексообразующего агента. Например, порошкообразный композит и комплексообразующий агент можно смешивать в растворителе, в котором они оба растворимы, в котором растворим порошкообразный композит или комплексообразующий агент, а другой компонент диспергирован, или в растворителе, в котором диспергированы порошкообразный композит и комплексообразующий агент, но комплекс включения солюбилизирован. Предпочтительно, комплекс включения получают, добавляя комплексообразующий агент к порошкообразному композиту в том же сосуде, который применяется для смешения полимера и терапевтического агента, с образованием комплекса включения. Для применения в фармации растворитель может быть любым физиологически приемлемым водным раствором.

Комплексообразующий агент можно добавлять к фракции композита в любом молярном отношении к количеству молей функциональности хозяина и/или гостя (в молях) в полимере композита, который образует комплекс включения. Как правило, комплексообразующий агент добавляют в молярном соотношении 1:1 к числу молей функциональности хозяина и/или гостя. Более низкие молярные соотношения (избыток функциональности хозяина и/или гостя в полимере) можно применять в случае, когда композиция содержит, по меньшей мере, один комплексообразующий агент и, по меньшей мере, одну функциональность хозяина и/или гостя в полимере для получения комплекса включения. Можно также применять избыток комплексообразователя. Таким образом, как правило, интервал молярного соотношения комплексообразующего агента и функциональности хозяина и/или гостя (в молях) в полимере составляет от 0,01:1 до 1:0,01, предпочтительно, составляет от 0,5:1 до 1:0,5. Когда применяют несколько комплексообразующих агентов, молярное соотношение индивидуальных комплексообразующих агентов можно выбирать исходя из функциональности, которую следует ввести в композицию. Например, в данной композиции может сложиться так, что пэгированный стабилизирующий комплексообразующий агент присутствует в соотношении 0,9:1, а комплексообразующий агент, содержащий лиганд, присутствует лишь в минорных количествах, например, 1-2% от комплексообразующего агента. Общее количество комплексообразующего агента в такой композиции, как правило, находится в указанных выше пределах.

4. Композиции и способы лечения

Терапевтическую композицию по изобретению можно приготовить в сухом виде, в виде жидкости, суспензии или эмульсии. Предпочтительно, терапевтическая композиция по изобретению находится в форме для внутривенных инъекций. Другие способы введения терапевтической композиции по изобретению включают способы, известные в технике, например, но без ограничения, такие как пероральное введение, ингаляция, местное введение, парентеральная, внутривенная, интраназальная, внутриглазная, внутричерепная или внутрибрюшинная инъекция и введение в легкие. Способ введения часто зависит от рецептуры терапевтической композиции. Перед введением терапевтическую композицию можно выделить и очистить любыми известными в технике способами, включая, например, центрифугирование, диализ и/или лиофилизацию.

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат эффективное количество терапевтической композиции по изобретению и фармацевтически и физиологически приемлемый носитель. Подходящими сухими или жидкими галеновыми препаратами являются, например, гранулы, порошки, таблетки, покрытые оболочкой, микрокапсулы, суппозитории, сиропы, эликсиры, суспензии, эмульсии, капли или инъецируемые растворы. Общеупотребительные добавки в фармацевтических композициях включают, но без ограничения, эксципиенты, вещества, способствующие измельчению, связующие, агенты для покрытия, вещества, способствующие набуханию, проглатыванию, или смазки, ароматизаторы, подсластители или вещества, способствующие солюбилизации. Более конкретно, часто используются добавки, как например, карбонат магния, диоксид титана, маннит и другие сахара, тальк, лактальбумин, желатин, крахмал, целлюлоза и ее производные, животные и растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители. Растворители включают стерильную воду и одноатомные или многоатомные спирты, такие как глицерин.

В зависимости от типа применяемого терапевтического агента терапевтическую композицию по изобретению можно применять в различных терапевтических методах (например, вакцины ДНК, антибиотики, антивирусные агенты) для лечения врожденных или приобретенных нарушений, таких как муковисцидоз, болезнь Гоше, мышечная дистрофия, СПИД, различные виды рака (например, множественная миелома, лейкоз, меланома и рак яичников), сердечно-сосудистые расстройства (например, прогрессивная сердечная недостаточность, рестеноз и гемофилия) и неврологические нарушения (например, травма головы). Согласно изобретению способ лечения предусматривает введение человеку или млекопитающему, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества терапевтической композиции по изобретению. Терапевтически эффективное количество, как признано специалистами в данной области техники, определяют опытным путем. Факторы, которые следует принять во внимание, включают, но без ограничения, нарушение, которое нужно лечить, и физические особенности страдающего этим нарушением.

6. Другие области применения (полезность)

Комплексы включения по изобретению могут также найти применение при доставке химических веществ в сельскохозяйственном производстве. В другом варианте изобретения "терапевтический агент" представляет собой биологически активное соединение с бактерицидной и сельскохозяйственной полезностью. Эти биологически активные соединения включают соединения, известные в технике. Например, подходящие для сельского хозяйства биологически активные соединения включают, но без ограничения, удобрения, фунгициды, гербициды, инсектициды и средства против ложной мучнистой росы. Бактерицидные соединения также применяют для очистки воды при обработке муниципальных систем водоснабжения и систем промышленного водоснабжения, например, систем подачи охлаждающей воды, системы аэрированного потока в целлюлозно-бумажной промышленности. Водные системы, чувствительные к микробиологическому воздействию или к микробиологическому разрушению, имеются также в кожевенной промышленности, текстильной промышленности и при нанесении покрытий или в производстве красок. Примеры таких бактерицидных соединений и их применение, индивидуальное или в комбинациях, описаны в Патентах США 5693631, 6034081 и 6060466. Композиции, содержащие, например, обсуждавшиеся выше активные агенты, можно применять способом, известным для самого ингредиента. Следует отметить, так как эти области применения не относятся к фармакологии, полимер композита не обязательно должен отвечать профилю токсичности, требуемому для фармацевтического применения.

7. Примеры

Ниже для иллюстрации данного изобретения приводятся примеры. Следует понимать, однако, что данное изобретение не следует ограничивать конкретными условиями и подробностями, описанными в этих примерах.

Материалы, β-циклодекстрин (Cerestar USA, Inc. of Hammond, IN) перед употреблением сушат в вакууме (<0.1 мТорр) при 120°С в течение 12 час. Бифенил-4,4'-дисульфонилхлорид (Aldrich Chemical Company, Inc. of Milwaukee, WI) перекристаллизовывают из смеси хлороформ/смесь гексанов. Йодистый калий измельчают пестиком в ступке и сушат в сушильном шкафу при 200°С. Все другие исходные являются промышленными реагентами и их используют без дополнительной очистки. Полимерные образцы анализируют с помощью системы ВЭЖХ Hitachi, снабженной детектором Anspec RI detector, детектором Precision Detectors DLS и колонкой Progel-TSK G3000_HWXLс 0,3 М NaCI или водой в качестве элюента при скорости потока 1.0 мл мин^-1.

Пример 1: β-Циклодекстрин, соединенный по A,D (capped) с бифенил-4,4'-дисульфонилом, 1 (Tabushi et al. J. Am. Chem. Soc. 106, 5267-5270 (1984))

В круглодонную колбу на 500 мл, снабженную магнитной мешалкой, насадкой Шленка и мембраной помещают 7,92 г (6,98 ммол) сухого β-циклодекстрина в 250 мл безводного пиридина (Aldrich Chemical Company, Inc.). Образующийся раствор перемешивают под азотом при 50°С в то время, как четырьмя равными порциями с 15-минутными интервалами прибавляют 2,204 г (6,28 ммол) бифенил-4,4'-дисульфонилхлорида. После перемешивания при 50°С еще в течение 3 час растворитель отгоняют в вакууме, а остаток подвергают обращенно-фазовой хроматографии, элюируя в градиенте 0-40% ацетонитрилом в воде. Фракции анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и соответствующие фракции объединяют. После удаления основного объема ацетонитрила на роторном испарителе образующуюся водную суспензию лиофилизируют досуха. Получают 3,39 г (38%) 1 в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 2: 6^A,6^D Дийод-6^A,6^D-дидезокси-β-циклодекстрин, 2 (Tabushi et al. J. Am. Chem. 106, 4580-4584 (1984))

В центрифужную пробирку на 40 мл, снабженную магнитной мешалкой, насадкой Шленка и мембраной, помещают 1,02 г (7,2 ммол) 1, 3,54 г (21,3 ммол) сухого порошкообразного йодистого калия (Aldrich) и 15 мл безводного N,N-диметилформамида (ДМФА) (Aldrich). Образующуюся суспензию перемешивают под азотом при 80°С в течение 2 час. По охлаждении до комнатной температуры твердый осадок отфильтровывают, а супернатант собирают. Твердый осадок промывают второй порцией безводного ДМФА и надосадочные жидкости объединяют и упаривают в вакууме. Затем остаток растворяют в 14 мл воды, охлаждают в бане со льдом и при интенсивном перемешивании прибавляют 0,75 мл (7,3 ммол) тетрахлорэтилена (Aldrich). Выпавший продукт отфильтровывают через стеклянный фильтр и промывают малой порцией ацетона и сушат в вакууме над P₂O₅ в течение 14 час. Получают 0,90 г (92%) 2 в виде белого твердого вещества.

Пример 3: 6^A,6^D-Диазидо-6^A,6^D-дидезокси-β-циклодекстрин, 3 (Tabushi et al. Tetrahedron Lett. 18, 1527-1530 (1977))

В круглодонную колбу на 100 мл, снабженную магнитной мешалкой, насадкой Шленка и мембраной, помещают дийодида β-циклодекстрина 1,704 г (1,25 ммол); 0,49 г (7,53 ммол) азида натрия (ЕМ Science of Gibbstown, NJ) и 10 мл безводного N,N-диметилформамида. Образующуюся суспензию перемешивают при 60°С под азотом в течение 14 час. Затем растворитель отгоняют в вакууме. Образующийся остаток растворяют в количестве воды, достаточном для получения 0,2 М раствора в соли, а затем пропускают через 11,3 г смолы Biorad AG501-X8(D) для удаления остатка солей. Элюат затем лиофилизируют досуха, получают 1,232 г (83%) 3 в виде белого аморфного вещества, которое вводят в следующую стадию без дополнительной очистки.

Пример 4: 6^A,6^D-Диамино-6A,6^D-дидезокси-β-циклодекстрин, 4 (Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662(1975)).

В круглодонную колбу на 250 мл, снабженную магнитной мешалкой и мембраной, помещают 1,232 г (1,04 ммол) биазида β-циклодекстрина и 50 мл безводного пиридина (Aldrich). К этой суспензии при перемешивании прибавляют 0,898 г (3,42 ммол) трифенилфосфина. Образующуюся суспензию перемешивают в течение 1 час при комнатной температуре и добавляют 10 мл концентрированного водного раствора аммиака. Прибавление аммиака сопровождается энергичным выделением газа, и раствор становится гомогенным. Через 14 час растворитель удаляют в вакууме и к остатку добавляют 50 мл воды. Твердый осадок отфильтровывают, фильтрат подкисляют (рН<4), добавляя 10% HCl и переносят на колонку с ионообменной смолой Toyopearl SP-650M (NH₄ ⁺ форма). Продукт 4 элюируют в градиенте 0-0.5 М бикарбонатом аммония. Соответствующие фракции объединяют и лиофилизируют, получают 0,832 г (71%) продукта 4 в виде соли бис(бикарбоната).

Пример 5: Сополимер β-циклодекстрин-DSP, 5

В пробирку для сцинтилляционного счетчика объемом 20 мл помещают раствор 92,6 мг (7,65×10^-5 мол) бис(бикарбоната) соединения 4 в 1мл воды. рН раствора доводят до 10 с помощью 1М NaOH и добавляют раствор 30,9 мг (7,65×10^-5 мол) дитиобис (сукцинимидилпропионата) (DSP, Pierce Chemical Co. of Rockford, IL) в 1 мл хлороформа. Образующуюся двухфазную смесь перемешивают в вибрационном смесителе в течение 0,5 час. Затем водный слой декантируют и экстрагируют 3×1 мл свежего хлороформа. Затем водный раствор полимера подвергают гель-проникающей хроматографии (GLP) на смоле Toyopearl HW-40F с водой в качестве элюента. Фракции анализируют с помощью GLP и соответствующие фракции лиофилизируют, получая 85 мг (85%) в виде бесцветного аморфного порошка.

Пример 6: Сополимер β-циклодекстрин-DSS, 6

Сополимер β-циклодекстрин-DSS, 6, синтезируют аналогично полимеру DSP, 5, за исключением того, что вместо реагента DSP используют дисукцидинимидилсуберат (DSS, Pierce Chemical Co. of Rockford, IL). Соединение 6 получают с выходом 67%.

Пример 7: Сополимер β-циклодекстрин-DTBP, 7

В пробирку для сцинтилляционного счетчика объемом 20 мл помещают раствор 91,2 мг (7,26×10^-5 мол) бис(бикарбоната) соединения 4 в 1мл воды. рН раствора доводят до 10 с помощью 1М NaOH и добавляют раствор 22,4 мг (7,26×10^-5 мол) диметил-3,3'-дитиобис(пропионимидата)•2HCl (DTBP, Pierce Chemical Co. of Rockfbrd, IL). Образующийся гомогенный раствор перемешивают в вибрационном смесителе в течение 0,5 час. Затем водный раствор полимера подвергают гель-проникающей хроматографии (GLP) на смоле Toyopearl HW-40F с водой в качестве элюента. Фракции анализируют с помощью GLP и соответствующие фракции лиофилизируют, получая 67 мг (67%) в виде бесцветного аморфного порошка.

Пример 8: Хлорангидрид полиэтиленгликоль(ПЭГ)-600 -дикарбоновой кислоты

В круглодонную колбу на 50 мл, снабженную магнитной мешалкой и обратным холодильником, помещают 5,07 г (около 8,4 ммол) полиэтиленгликоль-600-дикарбоновой кислоты (Fluka Chemical Corp. of Milwaukee, WI) и 10 мл безводного хлороформа (Aldrich). К этому раствору при перемешивании прибавляют 3,9 мл (53,4 ммол) тионилхлорида (Aldrich) и образовавшийся раствор кипятят 1 час, при этом наблюдается выделение газа. Образующийся раствор охлаждают до комнатной температуры и отгоняют в вакууме растворитель и избыток хлористого тионила. Полученный раствор хранят в эксикаторе и используют без дополнительной очистки.

Пример 9: Сополимер β-циклодекстрин-ПЭГ 600, 9

В пробирку для сцинтилляционного счетчика объемом 20 мл помещают раствор 112,5 мг (8,95×10^-5 мол) бис(бикарбоната) 6^A,6^Dдиамино-6^A,6^Dдидезокси-β-циклодекстрина (4), 50 мкл (3,6×10^-4 мол) триэтиламина (Aldrich) и 15 мл безводного N,N-диметилацетамида (ДМАА, Aldrich). Образующуюся суспензию обрабатывают 58 мг (9,1×10^-5 мол) хлорангидрида полиэтиленгликоль 600-дикарбоновой кислоты, 8. Образующийся раствор перемешивают в вибрационном смесителе в течение 5 мин, а затем оставляют на 1 час при 25°С, за это время раствор становится гомогенным. Растворитель удаляют в вакууме, а остаток подвергают гель-фильтрации (гель-проникающей хроматографии) на смоле Toyopearl HW-40F с водой в качестве элюента. Фракции анализируют с помощью GPC и нужные фракции лиофилизируют досуха, получая 115 мг (75%) бесцветного аморфного порошка.

Пример 10: 6^A,6^D-Бис-(2-аминоэтилтио)-6^A,6^D-дидезокси-β-циклодекстрин, 10 (Tabushi, I; Shimokawa, K; Fugita, К. Tetrahedron Lett. 1977,1527-1530)

В колбу Шлейка на 25 мл, снабженную магнитной мешалкой и мембраной, помещают 0,91 мл (7,37 ммол) 0,81 М раствора 1-аминоэтилтиолата натрия в этаноле (Fieser, L.F.; Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis; Wiley: New York, 1967; Vol. 3, pp. 265-266). Раствор упаривают досуха и твердый остаток снова растворяют в 5 мл безводного ДМФА (Aldrich). Прибавляют 6^A,6^D-дийод-6^A,6^Dдидезокси-β-циклодекстрин (2) (100 мг; 7,38×10^-5 мол) и образующуюся суспензию перемешивают при 60°С под азотом в течение 2 час. По охлаждении до комнатной температуры раствор упаривают и остаток снова растворяют в воде. После подкисления 0,1 N HCl раствор переносят на колонку с ионообменной смолой Toyopearl SP-650M (NH₄ ⁺ форма) и продукт элюируют бикарбонатом аммония в градиенте 0-0,4 М. Нужные фракции объединяют и лиофилизируют досуха. Получают 80 мг (79%) соединения 10 в виде белого порошка.

Альтернативный синтез дицистеамина β-CD 10

К раствору 4,69 г (3,17 ммол) соединения 2 в 100 мл дегазированной воды добавляют 0,489 г (6,34 ммол) свежевозогнанного цистеамина. Раствор перемешивают при кипении в течение 2 час. После охлаждения до комнатной температуры и подкисления 1 N HCl раствор переносят на колонку с ионообменной смолой Toyopearl SP-650M (NH₄ ⁺ форма) и продукт элюируют бикарбонатом аммония в градиенте 0-0,2 М. Нужные фракции объединяют и лиофилизируют досуха. При этом получают 1,87 г (выход 39%) белого твердого вещества. Это твердое вещество характеризуют с помощью ТСХ (силикагель, н-PrOH-AcOEt-H₂О-NH₃водн. 5/3/3/1, обнаружение нингидрином), имеется основное пятно, соответствующее 10. Время пролета (TOF), получаемое MS с лазерной системой десорбции/ионизации (MALDI), регистрируют на 2-метровом приборе ELITE, выпускаемом PerSeptive Biosystems, Inc. MALDI-TOF m/z вычислено для соединения 3: 1252, найдено: 1253,5 [М+Н]⁺, 1275, [M+Na]⁺, 1291,4 [М+К]⁺. ¹³С ЯМР (Bruker 500 мГц, D₂O) δ м.д.: 32,1 (S-CH₂) и 38,8 (CH₂-NH₂), 32,9 (С6, прилегающий к S), 60,2 (С6, прилегающий к ОН), 70,8; 71,4; 72,5 (С2, С3, С5), 81,8 (С4), 101.7 (С1).

Пример 11: Сополимер β-циклодекстрин (цистамин)-DTBP, 11

В пробирку на 4 мл помещают раствор 19,6 мг (1,42×10^-5 мол) бис(бикарбоната) соединения 10 в 0,5 мл 0,1 М NaHCO₃. Раствор охлаждают в бане со льдом и прибавляют 4,4 мг (1,4×10^-5 мол) диметил-3,3'-дитиобиспропионимидата-2 HCl (DTBP, Pierce Chemical Co. of Rockford, IL). Образующийся раствор перемешивают в вибрационном смесителе и оставляют при 0°С на 1 час. Реакцию прекращают, добавляя 1М Tris-HCl, а затем подкисляют 0,1 N HCl до рН 4. Водный раствор полимера подвергают гель-фильтрации (гель-проникающей хроматографии) на смоле Toyopearl HW-40F. Фракции анализируют с помощью GPC и нужные фракции лиофилизируют досуха. Получают 21,3 мг (100%) соединения 11 в виде белого порошка.

Пример 12: Сополимер β-циклодекстрин (цистамин)-DMS, 12

В колбу Шленка на 10 мл, снабженную магнитной мешалкой и мембраной, помещают 200 мг (1,60×10^-4 мол) соединения 10, 44 мкл (3,2×10^-4 мол) триэтиламина (Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI), 43,6 мг (1,60×10^-4 мол) диметилсуберимидата · 2 HCl (DMS, Pierce Chemical Co. of Rockford, IL) и 3 мл безводного ДМФА (Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI). Образующуюся суспензию нагревают при 80°С в течение 18 час при постоянном токе азота в течение всего времени, пока почти весь растворитель не испарится. Остаток снова растворяют в 10 мл воды и затем образовавшийся раствор подкисляют 10% HCl до рН 4. Этот раствор пропускают через фильтр для центрифуг Amicon Centricon. Plus-20 5000 NMWL. После промывания водой (порции 2×10 мл) раствор полимера лиофилизируют досуха, получают 41,4 мг (18%) желтовато-белого аморфного твердого вещества.

Альтернативный синтез: Сополимер β-циклодекстрин (цистамин)-DMS синтезируют, как описано выше (Gonzalez, et al. 1999). В типичном опыте в пробирку на 25 мл помещают раствор бис(бикарбоната) дицистеамина β-CD 10 (399,6 мг; 0,269 ммол), растворенного в 500 мкл 0,5 М Na₂CO₃. Добавляют диметилсуберимидат · 2 HCl (DMS, Pierce Chemical Co. of Rockford, Illinois, 73,5 мг, 0,269 ммол) и раствор быстро центрифугируют для растворения компонентов. Образующуюся смесь перемешивают при 25°С в течение 15 час. Затем смесь разбавляют 10 мл воды и, прибавляя 0,1 N HCl, получают рН раствора менее 4. Затем этот раствор подвергают диализу против мембраны для диализа Spectra/Por 7 MWCO3500 (Spectrum) в dH₂O в течение 24 час. Диализованный раствор лиофилизируют досуха. ¹³С ЯМР (Broker 500 мГц, D₂O) δ м.д.:25,8; 26,0; 27,0; 28,7; 29,9; 32,2; 37,5; 38,1; 41,1; 60,0; 71,6; 72,3; 72,6; 80,8; 101,4; 167,9.

Пример 13: Образование комплекса с фиксированным постоянным зарядом сополимера с плазмидой.

Как правило, равные объемы раствора CD-полимера и плазмиды ДНК с фиксированным зарядом смешивают в соответствующих соотношениях заряда полимер/плазмида. Затем при комнатной температуре происходит процесс уравновешивания и самосборки смеси. За ходом комплексообразования следят, перенося аликвоту смеси на 0,6% агарозный гель и проверяя подвижность ДНК. Свободная ДНК движется при приложенном напряжении, тогда как ДНК в составе комплекса задерживается в ячейке.

Раствор 1 мкг ДНК в дистиллированной воде с концентрацией 0,1 мкг/мкл смешивают с 10 мкл сополимера 12 при соотношении заряда полимерный амин: ДНК фосфат составляет 2, 4, 6, 12, 24, 36, 60 и 120. В каждый раствор добавляют 1 мкг/мкл буфера для нанесения (40% сахарозы; 0,25% бромфенолового синего и 200мМ Tris-ацетатного буфера, содержащего 5 мМ EDTA (Gao et al., Biochemistry 35:1027-1036 (1996)). Каждый образец ДНК/полимер наносят на 0,6% агарозный электрофоретический гель, содержащий 6 мкг EtBr/100 мл в 1 × ТАЕ буфере (40 мМ трис-ацетата/1 мМ EDTA), и на гель подают напряжение 40 В в течение 1 часа. Степень образования комплекса ДНК/полимер определяют по задержке миграции ДНК в геле. Сополимер (12) удерживает ДНК при соотношении зарядов 2 и выше, что указывает на образование комплекса в этих условиях.

Пример 14: Исследования трансфекции при использовании плазмид, кодирующих ген люциферазы (контроль):

За 24 часа до трансфекции клетки ВНК-21 помещают в 24-луночные планшеты при плотности клеток 60000 клеток/лунка. Плазмиды, кодирующие ген люциферазы, смешивают с CD-полимером, как в Примере 13. Раствор для среды, содержащий комплексы ДНК/полимер, добавляют к культивируемым клеткам и заменяют свежей средой через 24 часа инкубации при 37°С. Клетки лизируют через 48 часов после трансфекции. К клеточному лизату добавляют соответствующие субстраты для люциферазного биотестирования. Люциферазную активность, измеряемую в единицах освещенности, количественно определяют люминометром. Комплексы ДНК/полимер успешно трансфицируют клетки ВНК-21 при соотношении зарядов, примерно, 3 и максимальной трансфекцией при соотношении зарядов полимерный амин/ДНК фосфат, равном 40. Клеточный лизат также используют для определения жизнеспособности клеток методом анализа белков по Лоури (Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.193, 265-275 (1951)). До соотношения зарядов 40 не наблюдается токсичности.

Пример 15: Синтез сополимера β-циклодекстрин (цистамин)-DMA, 13

В пробирку для сцинтилляционного счетчика объемом 20 мл, снабженную магнитной мешалкой, помещают 180 мг (0,131 ммол) соединения 10 и 32 мг диметиладипимида (ДМА, Pierce Chemical Co. of Rockford, Illinois). Прибавляют 500 мкл 0,5 M Na₂CO₃. Образующийся раствор закрывают фольгой и перемешивают в течение ночи. Смесь подкисляют 0,1 N HCl, подвергают диализу с мембраной Spectrapor MWCO 3500 в течение 2 часов и лиофилизируют, получают 41 мг белого твердого аморфного вещества с молекулярной массой 6 кДа, как определено методом рассеяния света.

Пример 16: Синтез сополимера β-циклодекстрин (цистамин)-DMP, 14

В пробирку для сцинтилляционного счетчика объемом 20 мл, снабженную магнитной мешалкой, помещают 160 мг (0,116 ммол) соединения 10 и 30,1 мг диметилпемилимидата (ДМА, Pierce Chemical Co. of Rockford, Illinois). Прибавляют 500 мкл 0,5 M Na₂CO₃. Образующийся раствор закрывают фольгой и перемешивают в течение ночи. Смесь подкисляют 0,1 N HCl, подвергают диализу с мембраной Spectrapor MWCO 3500 в течение 2 часов и лиофилизируют, получают 22 мг белого твердого аморфного вещества с молекулярной массой 6 кДа, как определено методом рассеяния света.

Пример 17: Сополимер β-циклодекстрин (цистамин)-ПЭГ600, 15

В круглодонную колбу на 100 мл, снабженную магнитной мешалкой, насадкой Шленка и мембранной пробкой, помещают 1,564 г (1,25 ммол) соединения 10 и 25 мл свежеперегнанного диметилацетамида (ДМАА, Aldrich). К суспензии прибавляют 0,7 мл (4 экв.) триэтиламина и раствор 8 (2,39 г; 3,75 экв.) в 5 мл ДМАА. Образующийся раствор перемешивают в вибрационном смесителе в течение 5 мин, а затем оставляют на 1 час при 25°С, за это время раствор становится гомогенным. Затем растворитель отгоняют в вакууме и остаток подвергают гель-проникающей хроматографии на смоле Toyopearl HW-40F. Фракции анализируют с помощью GPC и нужные фракции лиофилизируют досуха. Получают бесцветный аморфный порошок.

Пример 18: Синтез β-циклодекстринтозилата, 16 (Melton, L.D., and Slessor, K.N., Carbohydrate Research, 18, p.29 (1971))

В круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой и мембранной пробкой, подсоединенную к вакуумному насосу, помещают раствор сухого β-циклодекстрина (8,530 г; 7,51 ммол) и 200 мл сухого пиридина. Раствор охлаждают до 0°С и добавляют 1,29 г (6,76 ммол) тозилхлорида. Образующийся раствор оставляют на ночь при комнатной температуре. Пиридин, насколько это возможно, удаляют в вакууме. Остаток дважды перекристаллизовывают из 40 мл горячей воды, получают 7,54 г (88%) белого кристаллического вещества.

Пример 19: Синтез β-циклодекстриниодида, 17

В круглодонную колбу с магнитной мешалкой и насадкой Шленка помещают соединение 16, 15 эквивалентов йодистого калия и ДМФА. Образующуюся смесь нагревают в течение 3 часов при 80°С, после чего реакционная смесь охлаждается при комнатной температуре. Затем смесь фильтруют, осадок отбрасывают, а фильтрат упаривают досуха и снова растворяют в воде при 0°С. Добавляют тетрахлорэтилен и образующуюся суспензию интенсивно перемешивают при 0°С в течение 20 мин. Осадок собирают на стеклянной фритте (стеклянный фильтр), промывают ацетоном и хранят над P₂O₅.

Пример 20: Синтез β-циклодекстринтиол-ПЭГ-присоединенного полимера, 18

Стадия 1: Синтез β-циклодекстринтиола (К.Fujita, et al., Bioorg. Chem., Vol.11, p.72 (1982) и К.Fujita, et al., Bioorg. Chem., Vol.11, p.108 (1982))

В круглодонную колбу на 50 мл с магнитной мешалкой и насадкой Шленка помещают 1,00 г (0,776 ммол) соединения 16, 0,59 г (7,75 ммол) тиомочевины (Aldrich) и 7,8 мл 0,1 N NaOH. Образующуюся смесь нагревают при 80°С в течение 6 часов в атмосфере азота. Затем добавляют 0,62 г (15,5 ммол) гидроксида натрия и реакционную смесь нагревают при 80°С в атмосфере азота еще один час. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, затем с помощью 10% HCl доводят рН до 4. Общий объем раствора доводят до 20 мл, охлаждают в бане со льдом и прибавляют 0,8 мл тетрахлорэтилена. Реакционную смесь энергично перемешивают при 0°С в течение 0,5 час, затем выпавший осадок собирают на стеклянном фильтре. Твердый осадок выдерживают в вакууме в течение ночи, получают 0,60 г (67%) белого аморфного твердого вещества.

Стадия 2: В круглодонную колбу на 100 мл, снабженную магнитной мешалкой и обратным холодильником, помещают 2,33 г (2,11 ммол) β-циклодекстринтиола, полученного на Стадии 1, 0,650 г функционализованного ПЭГ (ПЭГ с олефинами в боковой цепи, получен от Yoshiyuki Koyama из Otsuma Women's University, Tokyo, Japan) и 50 мл dH₂О. Образующуюся смесь кипятят в течение 12 час, за это время β-циклодекстринтиол растворяется. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выпавший осадок отделяют центрифугированием. Супернатант подвергают диализу против воды на мембране Spectra/Por 7 MWCO 1000. Раствор лиофилизируют, получая аморфное твердое вещество белого цвета.

Пример 21: Синтез разветвленного полимера PEI-циклодекстрин, 19

В пробирку для сцинтилляционного счетчика объемом 20 мл, снабженную магнитной мешалкой, помещают разветвленный PEI (25 кДа, Aldrich) и соединение 17. Затем прибавляют дегазированный натрий-карбонатный буфер. Образующийся раствор перемешивают при 80°С в течение 4 час. Смесь подкисляют 0,1N NaCl, диализуют с использованием мембраны Spectra/Por 7 MWCO 3500 в течение 2 дней и лиофилизируют.

Пример 21В: Синтез сшитого полимера PEI-циклодекстрин

Разветвленный PEI (М.в. 1200, Aldrich) и дифункционализованный мономер циклодекстрина 2 (1 экв.) смешивают в сухом ДМСО. Смесь перемешивают при 80°С в течение 4 дней, а затем в течение двух дней подвергают диализу против воды, применяя мембрану Spectra/Por 7 MWCO, и лиофилизируют.

Пример 22: Синтез Ad-PEG₃₄₀₀-Ad

240 мг 1-аминоадамантана (1,6 ммол, Aldrich) и 288 мг PEG₃₄₀₀(SPA)₂ (0,085 ммол, Shearwater Polymers) помещают в стеклянную пробирку (колбу ) с магнитной мешалкой. Прибавляют 5 мл хлористого метилена и раствор перемешивают в течение ночи. На следующий день раствор фильтруют, удаляя побочный н-гидроксисукцинимид, и хлористый метилен отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в воде и центрифугируют для удаления избытка 1-аминоадамантана. Супернатант затем диализуют в течение ночи в приборе Slide-A-Lyzer фирмы Pierce с MWCO=3500. Затем раствор лиофилизируют, получают 248 мг Ad-PEG₃₄₀₀-Ad в виде белого пушистого вещества.

Пример 23: Синтез Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂

347 мг FMOC-PEG₃₄₀₀-NH₂ (0,110 ммол, Shearwater Polymers) и 155 мг 1-аминоадамантана (1,0 ммол, Aldrich) помещают в стеклянную пробирку (колбу) с магнитной мешалкой. Прибавляют 5 мл хлористого метилена и образующийся раствор перемешивают в течение ночи. На следующий день раствор фильтруют, удаляя побочный н-гидроксисукцинимид, и хлористый метилен отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в воде и фильтруют, удаляя непрореагировавший 1-аминоадамантан. Затем раствор лиофилизируют для удаления воды. Группу FMOC удаляют, растворяя образовавшееся твердое вещество в 20% растворе пиперидина в ДМФА в течение 20 мин. Растворитель отгоняют в вакууме и остаток снова растворяют в воде. Затем раствор центрифугируют, удаляя нерастворившийся FMOC, а затем диализуют в течение ночи в приборе Slide-A-Lyzer фирмы Pierce с MWCO 3500. Затем раствор лиофилизируют, получают 219 мг Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂ в виде белого пушистого вещества.

Пример 24: Адамантан-PEG₃₄₀₀-NH₂ (Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂).

266 мг FMOC-PEG₃₄₀₀-NHS (78,2 мкмол, Shearwater Polymers, Huntsville, AL) помещают в стеклянную пробирку (колбу ) с магнитной мешалкой. Затем прибавляют 10 экв. 1-адамантилметиламина (1,5 ммол, Aldrich), растворенного в 3 мл хлористого метилена, и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель удаляют в вакууме и в оставшийся раствор добавляют воду для растворения ПЭГ-продукта. Раствор центрифугируют при rcf 20K (10³) в течение 10 минут, при этом фаза адамантилметиламина отделяется как жидкость с более высокой плотностью. Водную фазу собирают и воду отгоняют в вакууме. Оставшуюся вязкую жидкость снова растворяют в 20% растворе пиперидина в ДМФА для снятия защиты FMOC и перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре. Растворитель удаляют в вакууме, несколько раз промывают ДМФА, снова растворяют в воде и пропускают через ионообменную колонку для удаления непрореагировавшего ПЭГ. Первые фракции собирают и лиофилизируют, получая 222 мг белого пушистого порошка (выход 76%) нужного продукта, строение которого подтверждено анализом MALDI-TOF.

Пример 25: Адамантан-PEG₃₄₀₀-лактоза (Ad-PEG₃₄₀₀-Lac).

60 мг Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂ (16,8 мкмол), полученного в Примере 24, и 5,0 экв лактозы-моносукцинимидила (50 мг, Pierce, Rockford, IL) помещают в стеклянную пробирку (колбу) с магнитной мешалкой. Добавляют 2 мл 50 мМ NaHCO₃ и образующийся раствор перемешивают в течение ночи. За реакцией амина следят с помощью анализа TNBS (с тринитробензолсульфонатом), который позволяет определять концентрации амина. По окончании реакции амина (прореагировало 99% амина), раствор переносят в трубку для диализа (Slide-A-Lyzer, MWCO=3500, Pierce), диализуют в течение 24 час против воды и лиофилизируют, получают 65,1 мг пушистого белого порошка (выход 93%).

Пример 26: Синтез Ad-PEG₅₀₀₀

279 мг PEG₅₀₀₀-NHS (0,053 ммол, Shearwater Polymers) помещают в стеклянную пробирку (колбу ) с магнитной мешалкой. Затем прибавляют 46 мкл 1-адамантилметиламина (0,42 ммол, Aldrich), растворенного в 3 мл хлористого метилена, и раствор перемешивают в течение ночи. На следующий день раствор фильтруют, удаляя побочный н-гидроксисукцинимид, и хлористый метилен отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в воде и центрифугируют. Избыток 1-адамантилметиламина отделяют и верхний водный слой удаляют и диализуют в течение ночи в приборе фирмы Pierce Slide-A-Lyzer, MWCO=3500. Затем раствор лиофилизируют и получают 253 мг белого пушистого твердого вещества Ad-PEG₅₀₀₀. По данным анализа (продукт анализируют методом ВЭЖХ с помощью системы Beckman Gold с детектором Richards Scientific ELS и колонкой С 18) продукт является чистым (время удерживания PEG₅₀₀₀-NHS: 10,7 мин; время удерживания продукта: 12,0 мин; градиент ацетонитрил/вода).

Альтернативный синтез Адамантан-PEG₅₀₀₀(Ad-PEG₅₀₀₀)

674 мг PEG₅₀₀₀-NHS (135 мкмол, Shearwater Polymers) помещают в стеклянную пробирку (колбу ) с магнитной мешалкой. Затем прибавляют 5 экв. 1-адамантилметиламина (675 мкмол, Aldrich), растворенного в 10 мл хлористого метилена, и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель упаривают в вакууме и к оставшемуся раствору прибавляют воду. Раствор центрифугируют при rcf 20K в течение 10 мин, за это время слой адамантилметиламина отделяется как жидкость, имеющая более высокую плотность. Водную фазу собирают и диализуют в течение 24 час (Slide-A-Lyzer, MWCO=3500) против воды. Раствор лиофилизируют и получают 350 мг белого пушистого порошка (выход 75%, продукт схематически показан ниже). По данным анализа (продукт анализируют методом ВЭЖХ с помощью системы Beckman Gold с детектором Richards Scientific ELS и колонкой С 18) продукт является чистым (время удерживания PEG₅₀₀₀-NHS: 10,7 мин; время удерживания продукта: 12,0 мин; градиент ацетонитрил/вода). Ad-PEG₃₄₀₀ получают по аналогичной методике (выход 56%; строение продукта подтверждают анализом MALDI-TOF.

Пример 27: Адамантан-(PEG₅₀₀₀)₂ (Ad-(PEG₅₀₀₀)₂).

315 мг (PEG₅₀₀₀)₂-NHS (30 мкмол, Shearwater Polymers) помещают в стеклянную пробирку (колбу) с магнитной мешалкой. Затем прибавляют 10 экв. 1-адамантилметиламина (300 мкмол, Aldrich), растворенного в 3 мл хлористого метилена (DCM), и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель упаривают в вакууме и к оставшемуся раствору прибавляют воду для растворения ПЭГ-продукта. Раствор центрифугируют в течение 10 мин при rfc 20K, за это время слой адамантилметиламина отделяется как жидкость, имеющая более высокую плотность. Водную фазу собирают и диализуют в течение 24 час (Slide-A-Lyzer, MWCO=3500) против воды. Раствор лиофилизируют и получают 286 мг белого пушистого порошка (выход 91%).

Пример 28: Адамантан-PEG₃₄₀₀-флуоресцеин (Ad-PEG₃₄₀₀-FITC).

20 мг Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂ растворяют в 3 мл 0,1 М Na₂CO₃ растворяют в 3 мл 0,1 М Na₂CO₃ в стеклянной пробирке с магнитной мешалкой. К этому раствору прибавляют 3 экв. флуоресцеинизоцианата (FITC, Sigma) в ДМСО (4 мг/мл, 1,6 мл), образовавшийся раствор перемешивают в темноте в течение ночи, переносят в трубку для диализа (MWCO=3500) и диализуют в темноте в течение 48 час против воды. Раствор собирают и лиофилизируют, получают23 мг желтого пушистого твердого вещества. PEG₃₄₀₀-FITC синтезируют в качестве контрольного полимера из PEG₃₄₀₀-NH₂ (Shearwater Polymers) по аналогичной методике, получают 23 мг.

Пример 29: Синтез пептида GALA

Пептид GALA (последовательность: W-E-A-A-L-A-E-A-L-A-E-A-L-A-E-H-L-А-E-A-bL-A-E-A-L-E-A-L-A-A, М.в. 3032) синтезируют на установке для синтеза биополимеров (Biopolymer Synthesis Facility, Beckman Institute, California Institute of Technology) с помощью автоматического синтезатора. Перед отщеплением пептида от полимера одну треть полимера отбирают для конъюгации адамантана. Анализ пептида методом ВЭЖХ показывает чистоту более 95%. 1-Адамантилкарбоновая кислота (Aldrich) образует конъюгат по N-концу пептида GALA с помощью DCC конденсации. Образующийся пептид (GALA-Ad, М.в. 3194) отщепляют от полимера. Анализ пептида методом ВЭЖХ показывает чистоту более 90%. Идентичность пептидов подтверждают методом MALDI-TOF (Biopolymer Analysis Facility (установка для анализа биополимеров), Beckman Institute, California Institute of Technology).

Пример 30: Получение композиции по изобретению с применением пептида GALA

Плазмиды и олигонуклеотиды. Плазмиду pGL3-CV (Promega, Madison, WI), содержащую ген люциферазы под контролем промотора SV40, амплифицируют при использовании Esherichia Coli и очищают с помощью не содержащего эндотоксинов набора Qiagen's Endotoxin-free Megaprep kit (Valencia, CA). Олигонуклеотиды, меченые флуоресцеином, (FITC-oligos, 25-мер, 5'-FITC-ACT GCT TAC CAG GGA TTTCAG TGC A-3') синтезируют с помощью устройства для синтеза биополимеров (California Institute of Technology).

Образование и характеристика частиц. Композиции по изобретению получают, смешивая равный объем соединения 12 (растворенного в dH₂O) с ДНК (0.1 мг/мл в dH₂O) при соответствующем соотношении зарядов. Затем к комплексам добавляют одинаковый объем GALA или GALA-Ad, растворенного в 50 мМ забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, рН 7.2). Например, при изучении характеристики частиц получают комплекс из 2 мкг плазмидной ДНК (20 мкл) с 12 (20 мкл) при соотношении зарядов 5+/-. Затем к комплексам добавляют 20 мкл раствора GALA, раствора GALA-Ad или 50 мМ PBS (для контрольных образцов). Затем растворы разбавляют, прибавляя 1,2 мл dH₂O. Размер и заряд частиц определяют, используя измерения динамического рассеяния света и дзета-потенциала с помощью детектора динамического рассеяния света ZetaPals (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY). Результаты, выражаемые как среднее ± стандартное отклонение для данных измерений, показаны на Фигуре 2. Гидродинамический диаметр композиций соединение 12/pGL3-CV, полученных при соотношении зарядов 5+/-, определяемый с помощью динамического рассеяния света, равен 260 нм. 2 мкг плазмидной ДНК в 20 мкл смешивают с равным объемом соединения 12 при соотношении зарядов 5+/-. Затем к частицам прибавляют различные соотношения GALA или GALA-Ad. Гидродинамический диаметр определяют, измеряя динамическое рассеяние света. Результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение по трем измерениям. Пептид GALA претерпевает переход из водорастворимой конформации статистического клубка при рН 7.5 в нерастворимую в воде спираль при рН 5. Пептид GALA и пептид GALA, модифицированный адамантаном (GALA-Ad), растворяют в 50 мМ PBS (рН 7.2) и добавляют к терапевтической композиции при различных соотношениях пептид/циклодекстрин. Смесь разбавляют dH₂O и размер частиц определяют, измеряя динамическое рассеяние света (Фиг.2). На Фигуре 2 показан гидродинамический диаметр GALA (пунктирная линия) и GALA-Ad (сплошная линия) модифицированных полиплексов.

Результаты. Так как скорость счета частиц остается одинаковой при всех концентрациях добавляемого пептида, добавление пептида, по-видимому, не разрушает композиции. Кривые зависимости размера частиц от добавления GALA и GALA-Ad очень похожи. Гидродинамический диаметр увеличивается от 250 нм (1% GALA или GALA-Ad) до 400 нм (10% GALA или GALA-Ad). По мере прибавления большего количества пептида размер частиц снова уменьшается до размера частиц немодифицированной терапевтической композиции. Диаметр возвращается, примерно, к 200 нм при добавлении 30% или более GALA-Ad и 50% или более GALA. См. Фигура 2.

Пример 31: Включение GALA-модифицированных композиций в клетки ВНК-21.

Клеточная культура. Клетки ВНК-21 получают из АТСС (Rockville, MD), а клетки HUH-7 любезно предоставлены Valigen (Newtown, PA). Обе клеточные линии культивируют в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 100 Единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина в инкубаторе с увлажнением (атмосферы) при 37°С и 5% СО₂, и пересевают через каждые 4-5 дней. Среды и дополнения получают от Gibco BRL (Gaithersburg, MD).

Поглощение терапевтической композиции культуральными клетками. Клетки ВНК-21 помещают в 6-луночные планшеты при плотности 150,000 клеток/лунка и инкубируют 24 часа при 37°С. Получают комплекс из 5 мкг FITC-oligo с 12 при соотношении зарядов 5+/-. Через 5 мин после начала комплексообразования к комплексам добавляют 50 мкл GALA или GALA-Ad в 50 мМ PBS (рН 7.2). Среды удаляют из клеток и клетки отмывают PBS. Для трансфекции в раствор каждой терапевтической композиции добавляют 900 мкл Optimem и весь раствор переносят в клеточные культуры. Клетки инкубируют со смесью для трансфекции в течение 5 часов, удаляют среду и дважды отмывают клетки PBS. Клетки собирают трипсинизацией и готовят для FACS анализа. Клетки дважды отмывают буфером для отмывания (уравновешенный раствор солей Хэнкса, содержащий ДНК-азу и MgCl₂) и снова суспендируют в 500 мкл буфера FACS (равновесный раствор соли Хэнкса, 2.5 мг/мл альбумина бычьей сыворотки, 10 мкг/мл пропидия йодида). Анализ FACS осуществляют, используя проточный цитометр FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) и программное обеспечение CellQuest. Результаты показаны на Фигуре 4. Как показано на Фиг.4a-d, клетки ВНК-21 (4а) трансфицированы при использовании 12/FITC-Oligo (4b), 12/FITC -Oligo/50% GALA (4c), 12/FITC-Oligo/50%GALA-Ad (4d). Поглощение определяют проточной цитометрией. Данные представлены в виде кривых флуоресценции, при этом по оси у откладывают количество клеток, а по оси х - интенсивность флуоресценции флуоресцеина.

Пример 32: Дзета-потенциал модифицированных комплексов.

2 мкг плазмидной ДНК в 20 мкл смешивают с равным объемом соединения 12 при соотношении зарядов 5+/-. Затем к частицам прибавляют различные соотношения GALA или GALA-Ad при различных соотношениях пептид/CD и разбавляют dH₂O. Заряд частиц определяют, измеряя электрофоретическую подвижность, и представляют как дзета-потенциал частицы в мВ. Как найдено с помощью измерения дзета-потенциала, заряд частиц композиций 12/pGL3-CV при соотношении зарядов 5+/-, равен +13 мВ. Определяют дзета-потенциал частиц в присутствии пептидов, значения его представлены на Фигуре 3 как среднее ± стандартное отклонение, полученное в результате трех измерений.

Результаты. Так как пептид GALA является анионным пептидом при рН 7.2 (содержит несколько остатков глутаминовой кислоты), то ассоциация GALA и GALA-Ad с композициями понижает их дзета-потенциал. Композиции становятся отрицательно заряженными при 30% GALA (-11 мВ) или GALA-Ad (-23 мВ). Дзета-потенциал GALA + терапевтическая композиция в этой точке представляет собой плато; добавление большего количества GALA лишь слегка увеличивает дзета-потенциал (-15 мВ при 150% GALA). Однако отрицательный заряд частиц становится больше при более высоких концентрациях GALA-Ad. Композиции, в которых 150% GALA-Ad, имеют значение дзета-потенциала -42 мВ. См. Фиг.3.

Пример 33: Эффективность композиций по доставке ДНК.

Клетки HUH-7: Клеточную линию гепатомы, HUH-7, также трансфицируют с помощью 12/FITC-Oligo/50% при соотношении зарядов 5+/- и 12/FITC-Oligo/50% GALA-Ad. За поглощением ДНК следят так же, как описано для клеток ВНК-21. Профиль флуоресценции для нетрансфицированных клеток HUH-7 лежит в первом дециле (Фиг.5а). FITC-Oligo успешно доставляются к 95% клеток HUH-7 при использовании соединения 12 (Фиг.5b). Добавление к композициям 50% GALA-Ad ингибирует поглощение FITC-Oligo на два порядка, как это наблюдается для клеток ВНК-21 (Фиг.5с).

Пример 34: Эффективность композиций по изобретению при трансфекции гена люциферазы.

Трансфицирующая способность композиций, модифицированных GALA и GALA-Ad, определяют, используя доставку контрольного гена люциферазы к культивируемым клеткам. Клетки ВНК-21 помещают в 24-луночные планшеты и трансфицируют при использовании 1 мкг pGL-CV3 (плазмида, которая содержит ген люциферазы), закомплексованной с соединением 12 при соотношении зарядов 5+/-с образованием порошкообразного композита. Эти порошкообразные композиты модифицируют, добавляя GALA или GALA-Ad при различных соотношениях пептид/циклодекстрин. Клетки лизируют в течение 48 часов после трансфекции и анализируют на люциферазную активность. Результаты, показанные на Фигуре 6, выражаются в относительных единицах освещенности (RLU). Данные представляют собой среднее ± SD для трех измерений. Фоновое значение = 300 RLU.

Клетки успешно трансфицируют при использовании композиций 12/pGL-CV3 с RLU˜1×10⁵. Добавление GALA не оказывает значительного влияния на эффективность трансфекции. Однако модификация композиции с помощью GALA-Ad в значительной степени ингибирует трансфекцию. Добавление 1% GALA в два раза увеличивает трансфекцию до 2×10⁵ RLU, и 12/ pGL-CV3/10% GALA также приводит к незначительному повышению трансфекции (1,5×10⁵ RLU). Добавление 100% GALA понижает трансфекцию на 50% до 5×10⁴ RLU.

Пример 35: Токсичность композиций GALA и GALA-Ad.

Токсичность композиций, модифицированных GALA и GALA-Ad, определяют, измеряя концентрации белка в клеточных лизатах, получаемых в экспериментах по трансфекции. Клетки ВНК-21 трансфицируют при использовании 1 мкг pGL-CV3, закомплексованной с соединением 12 при соотношении зарядов 5+/-. Перед трансфекцией к комплексам добавляют различные соотношения GALA и GALA-Ad. Жизнеспособность клеток при трансфекции в присутствии GALA (заштрихованные столбцы) и GALA-Ad (незаштрихованные столбцы) определяют, проверяя общую концентрацию белка через 48 часов после трансфекции и нормализуя каждый образец по уровню белка для нетрансфицированных клеток. Концентрации белка, выражаемые как среднее ± SD в тройном повторе, усредняют и делят на среднюю концентрацию белка клеток, трансфицированных при использовании только композиций 12/pGL-CV3, и выражают как частичную жизнеспособность клеток (Фигура 7). Добавление GALA и GALA-Ad к раствору для трансфекции не придает клеткам ВНК-21 заметной токсичности.

Пример 36: Сополимер лактоза-β-циклодекстрин-DMS 20 (сополимер Lac-β-циклодекстрин-DMS 20).

Соединение 12 (20,5 мг, 3 мкмол), 10 экв. α-лактозы (21 мг, 60 мкмол, Sigma) и 18,6 натрия цианоборгидрида (300 мкмол) помещают в стеклянную колбу. К твердым веществам добавляют 1 мл боратного буфера, рН 8,5, и образующийся раствор быстро встряхивают, а затем выдерживают (инкубируют) при 37°С на водяной бане в течение 30 час. Раствор подкисляют до рН 6,0, добавляя 1М HCl и диализуют против воды в течение 24 час. Анализ TNBS на полимерные амины показывает, что степень конъюгации составляет 87%. Структура соединения 20.

Пример 37: Сополимер лактоза-(СН₂)₆-β-циклодекстрин-DMS 21 (сополимер Lac-С6-β-циклодекстрин-DMS 21).

Соединение 12 (43,2 мг, 7,4 мкмол) и 5,6 экв. моно(лактозиламидо)-моно(сукцинимидил)суберат (50 мг, 84 мкмол, Pierce) помещают в стеклянную колбу, снабженную магнитной мешалкой, и растворяют в 2 мл 50 мМ NaHCO₃. Образующийся раствор перемешивают в течение ночи. За ходом реакции следят по исчезновению концевых групп полимерного амина методом TNBS, который показывает степень конъюгации 90%. Раствор подкисляют до рН 5,0, добавляя 1М HCl и диализуют против воды в течение 2 дней в приборе Slide-A-Lyzer, MWCO 3500, фирмы Pierce, а затем лиофилизируют. Белый пушистый порошок получают с выходом 70%. Строение соединения 21 показано на Фигуре 12.

Пример 38: Сополимер β-циклодекстрин-DMS с концевьм ПЭГ₃₄₀₀ 22; Пэгирование перед образованием комплекса с ДНК.

20,3 мг соединения 12 (3 мкмол) и 10 экв. FMOC-PEG₃₄₀₀-NHS (190 мг, 60 мкмол) помещают в стеклянную колбу, снабженную магнитной мешалкой, и растворяют в 1 мл 50 мМ NaHCO₃, рН 8,5. Раствор перемешивают в темноте при комнатной температуре, а затем лиофилизируют. Сухое соединение растворяют в 0,5 мл 20% пиперидина в ДМФА и перемешивают в течение 30 мин для снятия защиты FMOC. Растворитель удаляют в вакууме, а оставшуюся вязкую жидкость растворяют в воде и с помощью 0,1 М HCl доводят рН до значения ниже 6,0. Полимер отделяют от непрореагировавшего ПЭГ анионообменной хроматографией и лиофилизируют, получают белый пушистый порошок. Структура 22 показана ниже.

Пэгирование перед образованием комплекса с ДНК. Как 12, так и 22 смешивают с плазмидной ДНК для измерений размера частиц. В то время, как βCDP6 12 конденсируется с плазмидой, давая однородные частицы с гидродинамическим диаметром, 130 нм, пэгированный 22 не способен конденсироваться с ДНК. Присутствие ПЭГ на конце полимера нарушает конденсацию с ДНК.

Пример 39 (сравнительный): Пэгирование методом привитой сополимеризации после образования комплекса с ДНК.

Применяют модифицированную методику Ogris et al., Gene Therapy, 595-605 (1999). 5 мкг pGL-CV3 в 500 мкл dH₂O смешивают с равным объемом PEI (в dH₂O) при соотношении зарядов 3+/- или 6+/-. Порошкообразные композиты 12/ДНК получают так же, как и при соотношении зарядов 5+/-. Диаметр частиц порошкообразных композитов определяют, используя динамическое рассеяние света (DLS). После образования порошкообразного композита прибавляют PEG₅₀₀₀-SPA (10 мг/мл в ДМФА) к раствору, который перемешивают в течение двух часов. На второй стадии после определения размера частиц к раствору добавляют 500 мкл PBS, рН 7,2. Раствор инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре прежде, чем методом DLS определяют конечный размер частиц. См. схематическое изображение на Фигуре 8.

На Стадии 1 порошкообразный композит PEI/ДНК или 12/ДНК получают в 1,2 мл dH₂O. Размеры частиц определяют динамическим рассеянием света (DLS). К растворам порошкообразного композита, полученным на Стадии 2, добавляют PEG₅₀₀₀-SPA и оставляют реагировать с первичными аминогруппами в течение 1 часа. Размер частиц "пэгированных" образцов определяют с помощью DLS. На Стадии 3 к каждому образцу добавляют 600 мкл PBS, рН 7,2, для испытания устойчивости пэгированных частиц к соли. Размер частиц определяют через 30 мин после добавления соли для определения степени агрегации частиц.

Порошкообразные композиты PEI готовят при соотношении зарядов 3+/- и 6+/-, а плексы порошкообразных композитов 12/ДНК получают при соотношении зарядов 5+/- для Стадии 1. PEG₅₀₀₀-SPA добавляют к PEI в соотношении 10:1 вес/вес в соответствии с методикой, опубликованной Ogris et al.. Gene Therapy, 595-606, 1999. 12 пэгируют при 100%, 150% и 200% ПЭГ: амин (мол %). В качестве контроля к 12 также добавляют нереакционноспособный ПЭГ в количестве 100%. Диаметр частиц на каждой стадии показан в таблице на Фигуре 9. Размер частиц порошкообразного композита PEI слегка увеличивается при пэгировании (с 58 нм до 65 нм для соотношения зарядов 3+/- и с 55 нм до 60 нм для соотношения зарядов 6+/-). Пэгирование защищает порошкообразные композиты PEI от вызываемой солью агрегации. В то время, как частицы немодифицированного PEI увеличиваются в диаметре до 80 нм после добавления соли, размер частиц порошкообразного композита пэгированного PEI немного увеличивается до 78 нм (для соотношения зарядов 6+/-) и 115 нм (для соотношения зарядов 3+/-).

Добавление 150% или 200% PEG₅₀₀₀-SPA к порошкообразному композиту на основе соединения 12 приводит к разрушению частиц; число частиц резко падает, и не наблюдается никакой соответствующей корреляции функции. По-видимому, пэгирование соединения 12 предупреждает связывание полимер/ДНК. Размер частиц сохраняется 67 нм после пэгирования под действием 100% PEG₅₀₀₀-SPA. Однако мониторинг размера частиц как функции времени показывает, что частицы разрушаются, примерно, через 30 секунд после прибавления ПЭГ, после чего снова наблюдаются малые частицы. Следовательно, при добавлении 100% PEG₅₀₀₀-SPA может пэгироваться часть 12. Так как добавляют избыток полимера 12 по отношению к ДНК (при соотношении зарядов 5+/-), частицы могут перегруппировываться, так что немодифицированный полимер образует полиплексы с плазмидой ДНК, тогда как большая часть пэгированного полимера остается свободным в растворе. Добавление соли к этим частицам приводит к агрегации частиц (300 нм), хотя размер частиц не достигает размера частиц порошкообразного композита с немодифицированным 12 (700 нм). В целом, пэгирование по реакции с первичными аминогруппами полимера после образования комплекса с ДНК, по-видимому, эффективно для полимеров с высокой молекулярной массой (м.В.) с высокой плотностью заряда. Однако реакция с 12, даже после образования комплекса с ДНК, приводит к недостаточной стабилизации в присутствии соли при добавлении 100% PEG₅₀₀₀-SPA и к разрушению частиц при более высоких концентрациях PEG₅₀₀₀-SPA.

Пример 40: Пэгирование после образования комплекса с ДНК за счет образования комплекса включения.

Используя приведенную ниже методику, молекулы Адамантан-ПЭГ (Ad-PEG) добавляют к растворам заранее полученных композиций 100% адамантана с циклодекстрином (мол. %). Затем к растворам добавляют PBS и с интервалом 2 минуты с помощью DLS проверяют размер частиц. Результаты показаны на Фигуре 10.

Методика: 2 мкг pGL-CV3 в 600 мкл dH₂О смешивают с равным объемом 12 (в dH₂O) при соотношении зарядов 5+/-. Добавляют нужное количество Ad-PEG (10 мг/мл в dH₂O) и с помощью DLS определяют размер частиц. К раствору добавляют 600 мкл PBS, рН 7,2, и проводят мониторинг размера частиц в течение 8 минут с интервалами 2 минуты.

Средний диаметр частиц непэгированного 12 увеличивается с 58 им до 250 нм в течение 8 минут после прибавления соли. Присутствие свободного ПЭГ в растворе не предотвращает агрегации (средний диаметр после прибавления соли 240 нм). Однако пэгирование за счет образования комплексов включения с линейными молекулами Ad-PEG уменьшает агрегацию частиц в зависимости от длины. Через 8 минут после добавления соли частицы, пэгированные с помощью Ad-PEG₃₄₀₀, агрегируются, достигая 210 нм в диаметре, тогда как размер агрегированных частиц с Ad-PEG₃₄₀₀-Lac составляет 200 нм. Частицы, пэгированные с помощью Ad-PEG₅₀₀₀, увеличиваются в диаметре только до 90 нм через 8 минут после прибавления соли и до 160 нм через 2 часа после прибавления соли. Модификация с помощью Ad-(PEG₅₀₀₀)₂ оказывает слабое влияние на агрегацию (диаметр частиц 200 нм после прибавления соли).

Стабилизация также зависит от плотности ПЭГ (Фигура 10А). Средний диаметр частиц, измеряемый через 10 минут после прибавления соли, увеличивается в 4,7 раза для немодифицированных полиплексов (с 58 нм до 272 нм), но только в 1,2 раза для полиплексов, модифицированных путем добавления 150% или 200% адамантана к циклодекстрину.

Пример 41: Пониженное поглощение в клетках вследствие пэгирования после комплексообразования.

Стадия 1. Смеси для трансфекции готовят следующим образом: Равный объем катионного 12 прибавляют к 3 мкг FITC-Oligos (0,1 мкг/мл) при соотношении зарядов полимера к ДНК 3+/-. К комплексам прибавляют свободный ПЭГ или Ad-PEG₅₀₀₀ (полученный в Примере 40) в соотношении ПЭГ к циклодекстрину 1:1.

Стадия 2. Клетки HUH-7 помещают в 6-луночные планшеты при плотности 3×10⁵ клеток/лунка и в течение 24 часов выдерживают в 4 мл DMEM + 10% FBS + Антибиотик/Фунгицид. Через 24 часа клетки отмывают PBS и к клеткам добавляют 1 мл Optimem, содержащей смеси для трансфекции из Стадии 1. После инкубации в течение 15 минут среды для трансфекции удаляют, клетки отмывают PBS и в каждую лунку добавляют 1 мл Optimem. Клетки инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем клетки отмывают буфером для отмывания клеток (Cell Scrub Buffer, Gene Therapy Systems) для удаления комплексов, ассоциированных с поверхностью, и PBS, a затем отделяют от лунок, обрабатывая трипсином. Затем клетки готовят и анализируют методом FACS на включение FITC-Oligo. Результаты представлены ниже, в Таблице 1. Модификация комплексов с помощью Ad-PEG₅₀₀₀ уменьшает поглощение комплексов FITC-Oligo/полимер.

Таблица 1.
Образец	Трансфекция, %
Одни клетки	0%
Клетки + FITC-Oligo	0%
Клетки + порошкообразный композит + Свободный ПЭГ	43%
Клетки + порошкообразный композит, модифицированный Ad-PEG5000	27%

Пример 42: Получение композиции 12/ Ad-PEG₅₀₀₀⁺ FITC и доставка к культивируемым клеткам.

Клетки ВНК-21 помещают в 6-луночные планшеты, 200000 клеток/лунка, и инкубируют в течение 24 часов при 37°С. Осуществляют комплексообразование 3 мкг олиго (0,1 мг/мл в dH₂O) с равным объемом 12 (2 мг/мл в dH₂O) при соотношении зарядов 5+/-. После 5-минутной реакции образования комплекса к комплексам добавляют 1,5 мкл ПЭГ (PEG)-FITC или Ad-PEG-FITC. Среду удаляют из клеток и клетки отмывают PBS. Для трансфекции к раствору каждой терапевтической композиции добавляют 940 мкл Optimem и весь раствор трансфицируют в клетки, клетки инкубируют со смесью для трансфекции в течение 4 часов, удаляют среду, отмывают клетки PBS и добавляют 4 мл полной среды. Клетки инкубируют еще в течение 24 часов при 37°С, среду удаляют и клетки дважды отмывают PBS. Клетки собирают трипсинизацией и готовят для анализа FACS. Клетки отмывают дважды буфером для отмывания (уравновешенный раствор солей Хэнкса, содержащий ДНК-азу и MgCl₂ и снова суспендируют в 500 мкл буфера FACS (уравновешенный раствор солей Хэнкса, 2,5 /мл бычьего сывороточного альбумина, 10 мкг/мл пропидия йодида). Анализ FACS осуществляют, используя проточный цитометр FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) и программное обеспечение CellQuest. Результаты показаны на Фигуре 11.

Образование комплексов включения с Ad-PEG₃₄₀₀-FITC вызывает заметно повышенное поглощение флуоресцеина по сравнению с 12, инкубированным с Ad-PEG₃₄₀₀-FITC (43% по сравнению с 14%, Фиг.11). Свободный Ad-PEG₃₄₀₀-FITC в средах может поглощаться клеткой как часть пиноцитозного или эндоцитозного пути. Однако Ad-PEG₃₄₀₀-FITC способен также поглощаться клетками и в виде комплекса с 12. Не похоже, чтобы модификация порошкообразных композитов 12 с помощью Ad-PEG₃₄₀₀-FITC при низких соотношениях (10%) ингибировала интернализацию. Скорее всего порошкообразные композиции 12 легко связываются с клеточной поверхностью и совместно доставляют Ad-PEG₃₄₀₀-FITC к клеткам, поскольку они интернализованы. Доставка с помощью порошкообразных композиций 12 приводит к более высокой флуоресценции флуоресцеина, наблюдаемой в клетках, трансфицированных при использовании 12/Ad-PEG₃₄₀₀-FITC. Этот способ можно также применять для совместной доставки низкомолекулярных терапевтических веществ вместе с интересующим геном.

Пример 43: Трансфекция клеток HUH-7.

Трансфекция люциферазы. Клетки HUH-7 помещают в 24-луночные планшеты, 50000 клеток/лунка, и инкубируют в течение 24 часов при 37°С. Для образования комплекса 3 мкг плазмидного GL-CV3 (0,1 мг/мл в dH₂O) смешивают с равным объемом 12 (в dH₂O) или 21 (см. Фиг.13) при различных соотношениях зарядов. Среды удаляют из клеточных культур перед трансфекцией и клетки промывают PBS. В каждую терапевтическую композицию добавляют 600 мкл Optimem с целью образования раствора для трансфекции, 230 мкл которого добавляют в каждую из 3 лунок на 4 часа. Через четыре часа в каждую лунку добавляют 800 мкл полной среды. Среду меняют через 24 часа после трансфекции и клетки лизируют в 50 мкл буфера для лизиса клеточных культур (Promega, Madison, WI) через 48 часов после трансфекции. Люциферазную активность определяют, используя реагент фирмы Promega для люциферазного анализа. Результаты показаны на Фигуре 13.

Пример 44: Синтез PEI, дериватизированного адамантаном (Ad-PEI)

Полиэтиленимин (PEI) и адамантанкарбоновую кислоту смешивают в сухом СН₂Cl₂ и охлаждают до 0°С. К смеси добавляют DCC (1 эквив.), 1-гидроксибензоилтриазол (1 эквив) и триэтиламин (1 эквив.). Раствор медленно доводят до комнатной температуры и перемешивают в течение 16 часов. Осадок отфильтровывают, а затем растворитель отгоняют в вакууме. К оставшемуся желтоватому раствору добавляют воду. Не растворенное твердое вещество отделяют центрифугированием. Водный раствор осторожно переносят в диализный мешок и диализуют против воды в течение 24 часов. После лиофилизации получают PEI-CD.

Пример 45: Синтез циклодекстрин-ПЭГ (CD-PEG)

ПЭГ-сукцинимидилпропионовую кислоту (SPA) (Shearwater Polymers) и циклодекстрин-моноамин (1,2 эквив.) растворяют в ДМСО и перемешивают в течение 24 часов при комнатной температуре. Продукт циклодекстрин-PEG очищают диализом.

Пример 46: Образование порошкообразного композита Ad-PEI/ДНК и последующая модификация с помощью CD-PEG

1 мкг плазмидной ДНК (0,1 мкг/мкл в dH₂O) смешивают с Ad-PEI из Примера 44 при соотношении зарядов 5+/-. Затем к комплексу прибавляют CD-PEG (растворенный в dH₂O) в заданном соотношении CD: Ad.

Пример 47: Стабилизация с помощью пэгирования: рецептура при высоких концентрациях

4 мкг плазмидной ДНК смешивают с равным объемом полимерной смеси (содержащей полимер циклодекстрина 12 с соотношением зарядов 1,5+/- и, в некоторых случаях, Адамантан-PEG₅₀₀₀ при соотношении 1 CD:PEG₅₀₀₀) с конечной концентрацией в интервале 0,1 мг/мл-4 мг/мл (см. Фигура 14). Половину раствора разводят 1,2 мл воды и динамическим рассеянием света определяют диаметр. Другую половину раствора пропускают через колонку Qiagen Quiaquick для экстракции ДНК, остающейся в растворе. Концентрацию ДНК определяют УФ-адсорбцией при λ=260.

Результаты (Фигуры 15 и 16): Однородные порошкообразные композиты, состоящие из малых частиц (диаметр <100 нм), модифицированные с помощью адамантана-PEG₅₀₀₀, можно приготовить с концентрациями вплоть до и включая 4 мг ДНК/мл без высаживания. Немодифицированные полиплексы образуют большие частицы (>300 нм) при концентрациях выше 0,2 мг/мл, и при всех концентрациях рецептуры наблюдается интенсивное осаждение (потеря >50% ДНК).

Пример 48; Ингибирование неспецифического поглощения с помощью модификации поверхности полиплекса

Клетки ВНК-21 помещают в 6-луночные планшеты. Клетки трансфицируют с помощью 3 мкг FITC-Oligo (конечная концентрация смеси для трансфекции: 0,05 мг ДНК/мл), закомплексованного с равным объемом 12 при соотношении зарядов 12/ДНК 2,5 +/-. Порошкообразные композиты затем модифицируют при использовании следующих линкеров:

Анионный линкер:	WEAALAEALAEALAEAC
Ad-анионный линкер:	Ad-WEAALAEALAEALAEAC
Ad-PEG	Ad-PEG5000
Ad-анионный линкер-PEG	Ad-WEAALAEALAEALAEAC-PEG5000

1 мл среды optimem добавляют в смесь для трансфекции и весь раствор переносят в предварительно отмытые клетки ВНК-21 (отмытые PBS) на 15 минут. Затем среду удаляют и клетки отмывают с помощью CellScrub, трипсинизируют и готовят для анализа FACS.

Результаты: Гость включения (адамантан), спейсер (анионный линкер) и функциональная группа (PEGD₅₀₀₀) действуют так, чтобы модифицировать порошкообразные композиты 12/ДНК и ингибировать неспецифическое поглощение культивированными клетками (включение в клетки). См. Фигура 17. Оптимальное ингибирование достигается комбинацией всех трех компонентов.

Пример 49: Поглощение клетками гепатомы, опосредуемое галактозой

Клетки HepG2 помещают в 24-луночные планшеты по 50000 клеток/лунка. 1 мкг pCMV-Luc контактирует с равным объемом 12 и модифицируют, как указано ниже. Модификацию с помощью ПЭГ-содержащих комплексообразующих агентов осуществляют при соотношении CD:PEG (CD представляет собой циклодекстрины в 12), равном 2:1.

Порошкообразный композит 12/pcMV-Luc без модификации

Glu-PEG-Pep-Ad	Glucose-PEG3400-CAEAEAEAE-Ad, 2 CD:1 PEG
Gal-PEG-Pep-Ad	Galactose-PEG3400-CAEAEAEAE-Ad, 2 CD:1 PEG
PEG-Pep-Ad	PEG5000-CAEAEAEAE-Ad, 2 CD:1 PEG

К порции каждой смеси для трансфекции добавляют 200 мкл среды Optimem и переносят в каждую лунку с клетками. Через 4 часа после трансфекции в каждую лунку добавляют 800 мкл полной среды. Через 24 часа после трансфекции среду удаляют, клетки отмывают PBS и в каждую лунку добавляют 1 мл полной среды. Через 48 часов после трансфекции клетки отмывают PBS, лизируют и анализируют на люциферазную активность. Описанную процедуру трансфекции осуществляют также в присутствии 1 мМ глюкозы или 1 мМ галактозы в качестве конкурентного ингибитора.

Результаты: Порошкообразные композиты, модифицированные при использовании Glu-PEG-Pep-Ad или PEG-Pep-Ad, имеют отрицательный дзета-потенциал и, следовательно, с трудом трансфицируют клетки. Однако у полиплексов, модифицированных Gal-PEG-Pep-Ad, наблюдается повышенная трансфекция, которая ингибируется в присутствии свободной галактозы, тем самым демонстрируется опосредуемая галактозой трансфекция в клетки гепатомы. См. Фигура 18.

Пример 50: Синтез соединения диадамантана.

Ссылка: Breslow et al., JACS (1996) v118 р8495-8496.

Zhang et al., JACS (1993) v115 р9353-9354.

Безводный пиридин (5 мл) помещают в реактор с небольшой магнитной мешалкой и охлаждают в бане со льдом. По каплям прибавляют метилдихлорфосфат (1,0 мл). Смесь оставляют на холоду на 15 минут, за это время образуется осадок дихлорфосфата. В реактор добавляют адамантилэтанол, растворенный в 5 мл пиридина, и после замораживания смеси реактор герметически закрывают. Образующуюся смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Затем закрытый герметически реактор открывают и образующуюся смесь выливают в 10% раствор бикарбоната натрия (50 мл). Затем образовавшийся раствор упаривают в вакууме. К твердому остатку добавляют 800 мл воды и продукт экстрагируют 150 мл эфира. Водную фазу подкисляют 2N HCl до рН=1,4, а затем экстрагируют 3×150 мл CHCl₃: н-BuOH (7:3). Органический слой промывают водой и смесь растворителей упаривают в вакууме, получая твердую фазу. Это твердое вещество перекристаллизовывают из смеси ацетон/гексан и получают 27% твердого вещества белого цвета. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением показывает наличие чистого заданного продукта.

Пример 51: Синтез соединения диадамантан-PEG₅₀₀₀

Хлористый метилен сушат CaH₂ при кипячении в течение ночи, затем перегоняют непосредственно перед реакцией. К раствору ПЭГ-эпоксид (М.в. 5000) в свежеперегнанном хлористом метилене (0,2 мл) медленно прибавляют раствор бис-(2-(1-адамантил)этилфосфата (соединение диамантана, описанное в Примере 51) а 0,4 мл хлористого метилена. Образующийся раствор перемешивают при 35°С в течение 4 дней. Растворитель отгоняют в вакууме досуха. Образующееся твердое вещество при добавлении 6 мл воды выпадает в осадок. Образовавшуюся смесь перемешивают полчаса при комнатной температуре, а затем центрифугируют, отделяя твердую фазу (непрореагировавшее диадамантановое соединение). Супернатант диализуют в течение ночи против мембраны 3500MWCO в воде и лиофилизируют досуха. При этом получают белое вещество с выходом 99%. Анализ MALDI-TOF показывает искомый продукт.

Пример 52: Эксперименты по конкурентному замещению между Ad-PEG₃₄₀₀ и диадамантан-PEG₅₀₀₀:

Эксперименты по конкурентному поглощению осуществляют, добавляя раствор диAdPEG₅₀₀₀ к заранее полученной композиции AdPEG₃₄₀₀, полимера и ДНК. Затем добавляют раствор соли и определяют размер частиц как функцию от времени.

Исходное получают, добавляя раствор 12 (16,6 мкл воды + 2,61 мкл 12 с концентрацией 5 мг/мл + 2,37 мкл AdPEG₃₄₀₀ с концентрацией 12,5 мг/мл) к раствору ДНК (20 мкл ДНК с концентрацией 0,1 мг/мл). Ниже даны характеристики этого раствора композиции:

[ДНК] = 0,05 мг/мл

Молярное соотношение AdPEG₃₄₀₀:CD=1:1

Соотношение зарядов = 3 +/-

Общий полученный объем = 40 мкл

Эту композицию инкубируют 10 минут и добавляют раствор ди-AdPEG5K (10 мг/мл). Объем этого раствора определяют таким образом, чтобы молярное соотношение между диAdPEG₅₀₀₀ и AdPEG₃₄₀₀ было 1:1, 1:2, 1:4 или 1:6. Например, чтобы молярное соотношение было 1:2, добавляют 2,38 мкл AdPEG₅₀₀₀.

Еще через 10 минут инкубации добавляют 1,2 мл воды, чтобы можно было считывать с помощью приборов DLS. Размер частиц определяют для 10 минут, а затем с раствором композиции быстро смешивают 600 uL 1×PBS. Затем размер частиц определяют каждую минуту в течение следующих 30 минут.

Для сравнения готовят два других раствора композиции. В одном случае совсем не добавляют диAdPEG₅₀₀₀. В другом случае не добавляют AdPEG₃₄₀₀. Можно видеть, что в этих условиях размер частиц порошкообразного композита не стабилизируется при использовании AdPEG₃₄₀₀. Соли вызывают увеличение среднего диаметра частиц от 70 нм до 350 нм в течение 30 минут. Однако один диAdPEG₅₀₀₀ не вызывает устойчивости в отношении соли. Размер частиц остается постоянным после добавления раствора соли Это остается верным, даже когда ди-AdPEG5K присутствует в количестве 1/6 от AdPEG₃₄₀₀. Результаты показаны на Фигуре 19.

Пример 53: Чувствительный к рН модификатор адамантан-PEG

Константа ассоциации гостя и хозяина соединения включения понижается, когда заряжен либо гость, либо хозяин. Например, протонированная форма (нейтральная форма) адамантанкарбоновой кислоты имеет константу ассоциации ˜500000, тогда как непротонированная (анионная) форма адамантанкарбоновой кислоты имеет константу ассоциации ˜30000. Это можно использовать для того, чтобы ввести рН-чувствительное поведение в материал, содержащий соединения включения. Например, можно модифицировать, используя соединение адамантан-PEG (Ad-PEG), содержащее вторичные аминогруппы около адамантана. Соединение Ad-PEG имеет высокую аффинность при физиологических значениях рН, но более легко высвобождается при кислых рН, наблюдаемых в эндосомах клеток. Более легкое нарушение упаковки в эндосомах промотирует высвобождение ДНК и клеточную интернализацию полиплексов.

Пример 54: Синтез модификаторов рН-чувствительного гидролизуемого адамантана-PEG.

PEG5k-NH₂ (132 мг, 0,0264 ммол) растворяют в воде и охлаждают до 0°С. К смеси добавляют раствор NaOH (5N, 0,053 мл, 0,264 ммол, 10 экв.) и раствор 1-адамантилфторформиата (52 мг, 0,264 ммол, 10 экв.) в ТГФ (3 мл). Смесь перемешивают при этой температуре в течение пяти минут, а затем доводят до комнатной температуры и перемешивают два часа. ТГФ удаляют в вакууме. Нерастворившееся твердое вещество удаляют центрифугированием. Оставшийся водный раствор переносят на мембрану Spectra/Por MWCO 35000 и диализуют против воды в течение двух дней. После лиофилизации получают адамантилкарбамат-PEG5k (80 мг). Строение этого соединения подтверждено ¹Н ЯМР, ВЭЖХ и MALDI TOF MS.

Синтез гидролизуемого соединения Адамантан-основание Шиффа-PEG

PEG5K-ALD и 1-адамантилметиламин (1 экв.) смешивают в метаноле. Добавляют несколько капель муравьиной кислоты в качестве катализатора образования основания Шиффа. Смесь перемешивают при 60°С в течение 12 часов, затем растворитель упаривают в вакууме. Смесь диализуют в воде и получают искомое соединение Адамантан-основание Шиффа-PEG5K.

Пример 55: Синтез соединения Адамантан-PEG-Трансферрин (Ad-PEG-Tf), Фигура 20

1. Конденсация трансферрина по углеводным группам.

Стадия 1: Синтез Ad-PEG-NH₂-NH₂

FMOC-NH-PEG₅₀₀₀-NHS (Shearwater Polymers, 0,2 ммол, 1 г) помещают в круглодонную колбу с магнитной мешалкой. Добавляют трет.-бутилкарбазат (ВОС-гидразид) (Aldrich, 1,6 ммол, 0,2112 мг), растворенный в 7 мл смеси хлористый метилен/этилацетат (1:1). Образующийся раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день растворители отгоняют в вакууме. Группу FMOC снимают, растворяя образовавшееся твердое вещество в 10 мл 20% пиперидина в диметилформамиде в течение 5 часов. Растворитель отгоняют в вакууме и остаток снова растворяют в воде. Полученный раствор центрифугируют, удаляя нерастворившуюся группу FMOC, а затем диализуют в течение ночи в приборе Slide-A-Lyzer фирмы Pierce, 3500MWCO. Затем раствор лиофилизируют, получая H₂N-PEG₅₀₀₀-NH-NH-CO-OtBu.

N-Гидроксисукцинимид (Aldrich, 0,24 ммол, 27,3 мг) и адамантанкарбоновую кислоту (Aldrich, 0,39 ммол, 71,2 мг) добавляют к H₂N-PEG₅₀₀₀-NH-NH-CO-OtBu (2) (0,16 ммол, 790 мг), растворенному в 7 мл хлористого метилена. К полученному раствору прибавляют 1,3-дициулогексилкарбодиимида (Aldrich, 1,6 ммол, 0,326 г), растворенного в 3 мл хлористого метилена. Полученный раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день образовавшийся осадок отфильтровывают через плотный стеклянный фильтр и фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл воды и центрифугируют, удаляя непрореагировавшую адамантанкарбоновую кислоту. Растворитель отгоняют в вакууме и остаток снова растворяют в 6 мл 4М HCl в диоксане для удаления снятой защитной трет.-бутоксикарбонильной группы. Полученный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем растворитель отгоняют в вакууме и остаток снова растворяют в воде. Полученный раствор диализуют в течение ночи в приборе Slide-A-Lyzer фирмы Pierce, 3500MWCO и лиофилизируют, получают 635 мг Ad-PEG-NH₂-NH₂.

Стадия 2: Синтез конъюгата Трансферрин-PEG-Ad

Раствор 100 мг (1,28 мкмол) человеческого трансферрина (обедненного железом) (Sigma-Aldrich) в 1 мл 30 мМ натрийацетатного буфера (рН 5) подвергают гель-фильтрации на колонке Sephadex G-25 (Supelco). Полученные 4 мл раствора, содержащего трансферрин (мониторинг: УФ-поглощение при 280 нм), охлаждают до 0°С и добавляют 80 мкл 30 мМ натрийацетатного буфера (рН 5), содержащего 4 мг (19 мкмол) периодатата натрия. Смесь выдерживают 2 часа в бане со льдом в темноте. Для удаления низкомолекулярных продуктов применяют дополнительную гель-фильтрацию (Sephadex G-25, 30 мМ натрийацетатный буфер (рН 5). Получают раствор, содержащий около 85 мг (1,09 мкмол) окисленного трансферрина. Раствор окисленного трансферрина быстро прибавляют к раствору, содержащему 54,5 мг (10,9 мкмол) Ad-PEG-NH₂-NH₂ в 1 мл 100 мМ ацетата натрия (рН 5). Полученный раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Затем доводят рН до 7,5, прибавляя 1 М бикарбонат натрия, и с интервалами в 1 час прибавляют четырьмя порциями 9,5 мг (150 мкмол) цианоборгидрида натрия. Через 18 час пэгированный трансферрин очищают и концентрируют на приборе Centricon YM-50000 NMWI (Millipore).

Стадия 3: Нагрузка железом Трансферрин-PEG-Ad, синтезированного окислением трансферрина

40 мг соединения на основе апо-трансферрина (апо-трансферрин или апо-трансферрин-PEG-Ad) растворяют в 700 мкл dH₂O. К этому раствору добавляют 200 мкл 5мМ цитрата железа и 100 мкл NaHCO₃ с концентрацией 84 мг/мл. Этот раствор оставляют на 2-3 часа, а затем в течение ночи диализуют против PBS. Эффективность нагрузки железом вычисляют, определяя отношение поглощения при 465 нм (окисленного железа) к поглощению при 280 нм (остатков триптофана в белке), и нормализуют по отношению A₄₆₅/A₂₈₀ промышленного голо-трансферрина. Определяемая эффективность нагрузки железом для трансферрина в окислительном буфере (ацетат натрия рН 5) и свежеокисленного трансферрина показана на Фигуре 21.

Стадия 4. Аффинность связывания Трансферрин-PEG-Ad (синтезированного окислением трансферрина) с рецепторами трансферрина на клетках РС3.

Клетки РС3 инкубируют с 250 нМ флуоресцеина-трансферрина (FITC-TF) при различных количествах немеченого трансферрина и трансферрин-PEG-Ad. Ассоциацию клеток FITC-hTF оценивают методом FACS. Немеченый трансферрин очень эффективно конкурирует с FITC-hTF, в то время как трансферрин-PEG-Ad очень слабо конкурирует с FITC-hTF, наиболее вероятно, вследствие пониженной аффинности в отношении рецептора. Результаты показаны на Фигуре 22.

Пример 56: Конденсация трансферрина с группами лизина. Фигура 23.

Стадия 1: Синтез VS-PEG₃₄₀₀-Ad

Винилсульфон-PEG₃₄₀₀-NHS (Shearwater Polymers, 0,147 ммол, 0,5 г) помещают в круглодонную колбу с мешалкой и растворяют в 5 мл ДМСО. Прибавляют адамантилметиламин (Aldrich, 0,147 ммол, 0,0243 г). Полученный раствор перемешивают 1 час при комнатной температуре. Растворитель отгоняют в вакууме и остаток снова растворяют в воде. Полученную смесь диализуют в течение ночи против мембраны 1000 MWCO (Spectra Рог). Затем раствор лиофилизируют и получают Винилсульфон-PEG₃₄₀₀-Ad.

Стадия 2: Синтез конъюгата Трансферрин-PEG-Ad (Tf-PEG-Ad)

К 109 мг (32,1 мкмол) Винилсульфона-PEG₃₄₀₀-Ad прибавляют раствор человеческого трансферрина (обедненный железом) (Sigma-Aldrich) в 10 мл 0,1 М натрийтетраборатного буфера (рН 9,4). Образующийся раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Пэгированный трансферрин очищают от непрореагировавшего Винилсульфон-PEG₃-Ad на приборе Centricon YM-50000 NMWI (Millipore) и от непрореагировавшего трансферрина на колонке с гидрофобным взаимодействием Butyl-650S (Tosoh Biosep) (чистота подтверждена ВЭЖХ и MALDI-TOF MS).

Стадия 3: Нагрузка железом Трансферрин-PEG-Ad, синтезированного конденсацией через группы лизина

Апо-трансферрин и Tf-PEG-Ad нагружают железом по методике, описанной в Примере 55. Избыток нагрузки железом определяют количественно, как описано ранее. Эффективность нагрузки железом Tf-PEG-Ad, синтезированного конденсацией по группам лизина, составляет почти 100%.

Пример 57: Аффинность связывания Трансферрин-PEG-Ad (синтезированного конденсацией по группам лизина) с рецепторами трансферрина на клетках РС3.

Клетки РС3 помещают в 6-луночные планшеты при плотности 125000 клеток/мл. Через 24 часа клетки экспонируют с 250 нМ FITC-Tf, смешиваемых в различных концентрациях с hTf, hTf-PEG-Ad (синтезированным окислением hTf), hTf-PEG-Ad (синтезированным по реакции с VS-лизином и очищенным) и hTf-(PEG-Ad)₂. Поглощение через 20-минутной экспозиции определяют методом FACS. В отличие от Tf-PEG-Ad, синтезированного окислением трансферрина, соединения трансферрина, синтезированные конденсацией с лизином, эффективно конкурирует с FITC-Tf за рецепторы РС3-клеточной поверхности. Результаты показаны на Фигуре 24.

Пример 58: Дзета-потенциал FITC-Tf-модифицированных полиплексов

Аликвоту 12 равного объема добавляют к аликвоте плазмидной ДНК (2 мкг ДНК, 0,1 мг/мл в воде) при соотношении зарядов 3+/- с образованием порошкообразного композита. Голо-трансферрин или голо-Tf-PEG-Ad добавляют к порошкообразному композиту. Частицы разбавляют, добавляя 1,2 мл воды, и определяют дзета-потенциал на приборе ZetaPals динамического рассеяния света (Brookhaven Instruments). Результаты показаны на Фигуре 2. Немодифицированный голо-трансферрин ассоциируется с порошкообразными композитами с помощью электростатических взаимодействий. Когда добавляют 2 нмол Tf/мкг ДНК, порошкообразные композиты становятся нейтральными (достигают нейтрального состояния). По-видимому, голо-Трансферрин-PEG-Ad (обозначенный на Фигуре 25 Tf-PEG-Ad) ассоциируется в частицы порошкообразного композита как электростатическим взаимодействием, так и за счет образования соединений включения. Следовательно, существует более прочная ассоциация голо-Tf-PEG-Ad с частицами, что ясно показывает непрерывное понижение дзета-потенциала модифицированных частиц при более высоких концентрациях голо-Tf-PEG-Ad. При 2 нмол Tf/мкг порошкообразные композиты, модифицированные голо-Tf-PEG-Ad, заряжены отрицательно (дзета-потенциал ˜-7 мВ).

Пример 59: Синтез AD-Phos-PEG₅₀₀₀-Галактоза

Номера соединений, указанные ниже, относятся к приведенной выше схеме.

I. Синтез адамантанфосфоновой кислоты 2. Дибензилфосфит (0,712 г, 2,71 ммол) вводят шприцом в раствор 1-адамантилметиламина (0,493 г, 2,98 ммол) в сухом CCl₄ в атмосфере аргона. Почти сразу после добавления дибензилфосфита выпадает белый осадок. Раствор перемешивают в течение 12 часов. К смеси добавляют СН₂Cl₂ (30 мл). Органический слой дважды (2×40 мл) промывают разбавленной кислотой (подкисленной водой, рН=4). Затем сушат органический слой MgSO₄. Растворитель упаривают в вакууме. Полученное белое вещество кристаллизуют из смеси растворителей CH₂Cl₂ и гексана. Получают кристаллы соединения 1 в виде игл (0,69 г, выход 60%). Кристаллическое соединение гидрируют водородом под давлением 15 psi (103,42 кПа) с 10% Pd/C (200 мг) в качестве катализатора в этаноле (40 мл) в течение 16 час. Катализатор отфильтровывают, растворитель отгоняют из фильтрата под вакуумом. Получают 2 с количественным выходом. Полученное соединение 2 используют без дополнительной очистки.

II. Синтез NH₂-PEG₅₀₀₀-Галактозы 4. FMOC-NH-PEG₅₀₀₀-NHS (Shearwater, 760 мг, 0,152 ммол) растворяют в ДМСО (3,7 мл). К этому раствору добавляют раствор галактозамина (385 мг, 1,52 ммол) и диизопропилэтиламин (0,264 мл, 1,52 ммол) в ДМСО (14 мл). Раствор перемешивают в течение 20 минут, а затем диализуют в воде (4×4 л), используя мембрану 3500 MWCO (Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.), в течение 24 часов. Затем раствор лиофилизируют, получают 745 мг FMOC-NH-PEG₅₀₀₀-Галактозы 3. 3 растворяют в ДМФА (12 мл), содержащем пиперидин (3 мл). Раствор перемешивают в течение 16 часов. Затем ДМФА отгоняют в высоком вакууме. К твердому остатку прибавляют 40 мл воды. Белое твердое вещество отделяют центрифугированием. Водный раствор диализуют в воде, (4×4л), используя мембрану 3500 MWCO (Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.), в течение 24 часов. Раствор лиофилизируют, получают 625 мг NH₂-PEG₅₀₀₀-Галактозы 4.

III. Синтез Адамантан-Phos-PEG₅₀₀₀-Галактозы 5. 4 (63 мг, 0,013 ммол) растворяют в имидазольном буферном растворе (1 мл, 0,1 N, рН=6,5). К этому раствору добавляют раствор 2 в СН₃CN (4 мл), а затем 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (EDC, 100 мг, 40 экв.). Раствор перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре. Раствор диализуют в воде (4×4 л), используя мембрану 3500 MWCO (Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.), a затем лиофилизируют, получая 5.

Пример 60: Синтез AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀-Галактозы

Номера соединений, указанные ниже, относятся к приведенной выше схеме.

I. Синтез Н-Glu-Glu-Адамантана 7. Н-Glu(Bn)-OH (3,55 г, 15 ммол) растворяют в воде (16 мл), содержащей бикарбонат натрия (1.26 г; 15 ммол). К смеси прибавляют Z-Glu(Bn)-OSu (4,68 г, 10 ммол) в ТГФ (30 мл). Затем к смеси прибавляют еще 30 мл ТГФ, 20 мл CH₃CN и затем 10 мл 2N NaOH. Раствор перемешивают 16 часов при комнатной температуре. ТГФ и СН₃СН упаривают в высоком вакууме. К водной смеси добавляют 1 N HCl, доводя значение рН до 3. Наблюдают образование осадка. Смесь экстрагируют хлороформом (3×30 мл). Органический слой сушат MgSO₄. MgSO₄ отфильтровывают. Органический растворитель упаривают, получая белое липкое твердое вещество 6. 6 используют на следующей стадии без дальнейшей очистки.

6 (3,51 г, 6,1 ммол) растворяют в сухом ТГФ (40 мл). К этому раствору под аргоном при 0°С добавляют 1-адамантилметиламин (1,007 г, 6,1 ммол), 1-гидроксибензотриазол (0,93 г, 6,1 ммол), DCC (1,32 г, 6,4 ммол) и диизопропилэтиламин (1,06 мл, 6,1 ммол) под аргоном при 0°С. Смесь затем доводят до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Осадок отфильтровывают. Затем в вакууме удаляют ТГФ и получают твердое вещество желтого цвета. Это желтое вещество кристаллизуют из метанола, получая кристаллы 6 в форме пластин (2,1 г, 49%). Затем 6 растворяют в 40 мл метанола и встряхивают в приборе для гидрирования в присутствии 200 мг 10% Pd/C при давлении водорода 25-30 psi (172,37-206,84 кПа). Катализатор отфильтровывают через 24 часа. Н-Glu-Glu-AD 7 получают с количественным выходом после отгонки метанола в вакууме. 7 используют без дополнительной очистки.

II. Синтез AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀-Галактозы 9. Винилсульфон(VS)-PEG₅₀₀₀-NHS (Shearwater, 423 мг, 0,085 ммол) и галактозамин (216 мг, 0,85 ммол) добавляют в раствор PBS (2,25 мл, 1х, рН 7,2). Раствор перемешивают в течение 1 часа, а затем в течение 24 часов диализуют в воде (4×4 л), используя мембрану 3500 MWCO (Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.). Затем раствор лиофилизируют. Продукт 8 анализируют, используя MALDI-TOF MS и ВЭЖХ. 8 растворяют в боратном буферном растворе (6 мл, 0,1 N, рН 9,4). Соединение 7 (121 мг) растворяют в ДМСО (2 мл) и затем добавляют к раствору полимера. Смесь перемешивают при 35°С в течение 16 часов, а затем при 50°С в течение 17 часов. За реакцией следят с помощью ВЭЖХ. Полимер диализуют, используя мембрану 3500 MWCO, и лиофилизируют, получая 419 мг AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀-Галактозы 9 с выходом 90%.

Пример 61: Синтез AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀

Синтез AD-Glu-Glu-mPEG₅₀₀₀ 10. mPEG₅₀₀₀-SPA (Shearwater, 300 мг, 0,06 ммол) и 7, Пример 60, растворяют в ДМСО (2 мл) и CH₃CN (1 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем раствор диализуют в воде (4×4 л), используя мембрану 3500 MWCO (Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.) в течение 24 часов. Раствор лиофилизируют, получают 276 мг Ad-Glu-Glu-mPEG₅₀₀₀ 10. Строение 10 подтверждают MALDI-TOF MS, ВЭЖХ и ¹Н ЯМР.

Пример 62: Препарат трансферрина и ПЭГ-модифицированных полиплексов.

Полиплексы (соотношение заряда полимера к заряду ДНК 3+/-), модифицированные при использовании Tf-PEG-AD (или Tf-(PEG-AD)₂) и PEG-AD (или PEG-Glu-Glu-AD), можно готовить следующим образом. Берут равные объемы всех компонентов. К раствору 12 в воде добавляют Tf-PEG-AD (или Tf-(PEG-AD)₂). К этому смешанному раствору добавляют аликвоту PEG-AD (или PEG-Glu-Glu-AD). Эту трехкомпонентную смесь полимеров добавляют затем к раствору ДНК. Раствор осторожно перемешивают, отбирая пипеткой, и размер частиц, дзета-потенциал и устойчивость к действию соли определяют, как описано выше. Дзета -потенциал частиц можно менять ("настраивать"), изменяя относительные соотношения Tf-PEG-AD (или Tf-(PEG-AD)₂) и PEG-AD (или PEG-Glu-Glu-AD). Некоторые примеры изменения дзета-потенциала и размера частиц в зависимости от модификации частиц показаны на Фигурах 26, 27 и 28.

Пример 63: Адамантан-анионный пептид-PEG₃₄₀₀-галактоза/глюкоза (AD-nen-PEG-gal-glu). Анионный пептид (последовательность: Е-А-Е-А-Е-А-Е-А-С) синтезируют с помощью устройства для синтеза биополимеров (Biopolymer Synthesis Facility, Beckman Institute, California Institute of Technology), используя автоматический синтезатор. Перед отщеплением пептида от полимера адамантанкарбоновая кислота (АСА, Aldrich) конъюгирует с N-концом пептида в присутствии DCC. Полученный пептид (АСА-Е-А-Е-А-Е-А-Е-А-С, М.в. 1084) отщепляют от полимера и анализируют методом MALDI-TOF.

Галактоза- и глюкоза-PEG₃₄₀₀-винилсульфон (gal/glu-PEG₃₄₀₀-VS) получают с выходом около 95 % по реакции NHS-PEG₃₄₀₀-VS (Shearwater Polymers) с 20 эквивалентами глюкозамина или галактозамина (Sigma) в забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,2, в течение двух часов при комнатной температуре. Раствор подвергают интенсивному диализу против воды, а затем лиофилизируют. Тиолы анионного пептида (два эквивалента) реагируют с галактозой-PEG₃₄₀₀-VS или глюкозой-PEG₃₄₀₀-VS в 50 мМ натрийборатном буфере (рН 9,5), содержащем 10 мМ ТСЕР. Раствор подкисляют и выпавший осадок (не растворимый ниже рН 9,0) удаляют центрифугированием. Супернатант собирают, интенсивно диализуют и лиофилизируют. Строение искомых продуктов подтверждают методом MALDI-TOF.

Пример 64: Синтез нафталин-PEG₅₀₀₀

500 мг PEG₅₀₀₀-NHS (0,1 ммол, Shearwater Polymers) добавляют в стеклянный сосуд с мешалкой. Прибавляют 146 мкл 1-нафталинметиламина (1 ммол, 10 экв., Aldrich), растворенного в 8 мл хлористого метилена, и раствор перемешивают в течение 16 часов. Затем растворитель удаляют в вакууме. К смеси прибавляют 20 мл воды. Нерастворившийся осадок удаляют центрифугированием. Водный раствор диализуют с мембраной Spectra/Por 3500 MWCO в течение 24 часов. Затем раствор лиофилизируют, получая белый пушистый твердый нафталин-PEG₅₀₀₀. Продукт анализируют методами ¹H ЯМР, MALDI-TOF MS и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Нафталин-PEG₅₀₀₀ синтезируют по аналогичной методике (выход 56%; строение продукта подтверждают методом MALDI-TOF).

Пример 65: Синтез Нафталин-PEG₅₀₀₀-Галактозы

Винилсульфон(VS)-PEG₅₀₀₀-NHS (Shearwater, 423 мг, 0,085 ммол) и галактозамин (216 мг, 0,85 ммол) добавляют к раствору PBS (2,25 мл, 1х, рН 7,2). Раствор перемешивают в течение 1 часа, а затем в течение 24 часов диализуют в воде (4×4 л), используя мембрану 3500 MWCO (Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.). Затем раствор лиофилизируют, получая Винилсульфон-PEG₅₀₀₀-Галактозу. Продукт анализируют MALDI-TOF MS и ВЭЖХ. 300 мг (0,06 ммол) Винилсульфон-PEG₅₀₀₀-Галактозы растворяют в боратном буферном растворе (3 мл, 0,1 N, рН 9,4). 1-Нафталинметиламин (8,8 мкл, 0,06 ммол) растворяют в ДМСО (3 мл), а затем добавляют к раствору полимера. Смесь перемешивают при 55°С в течение 36 часов. Полимер диализуют, используя мембрану 3500 MWCO, и лиофилизируют, получая Нафталин-PEG₅₀₀₀-Галактозу.

Следует понимать, что вышеприведенное обсуждение и примеры представляют собой подробное описание лишь некоторых предпочтительных вариантов изобретения. Специалисты в данной области техники понимают, что различные модификации и эквиваленты могут быть сделаны без отступления от сущности и объема изобретения.

1. Соединение формулы

где J обозначает -NH-, -C(=O)NH-(CH₂)_d-, -NH-C(=O)-(CH₂)_d-, -CH₂SS-, -C(=O)O-(CH₂)_e-O-P(=O)(O-(CH₂)_e-Y)O-,

пептидный или полипептидный остаток, или

-NH-(C=О)-CH(R¹)-NH-(С=О)-CH(R¹)-NH-;

Y обозначает дополнительную функциональность хозяин/гость;

R¹ обозначает -(CH₂)_а -CO₂Н, ее эфир или соль; или -(CH₂)_a-CONH₂;

PEG (ПЭГ) обозначает -O(СН₂СН₂О)_z-, где z варьируется от 2 до 500;

L обозначает Н, -NH₂, -NH-(C=O)-(CH₂)_e-(C=O)-CH₂-, -S(=O)₂-НС=СН₂-, - SS-, С(=O)O- или углеводный остаток;

хозяин-гость выбирается из адамантила, нафтила, холестерола, циклодекстрина или любой их комбинации;

а обозначает 0 или 1;

b обозначает 0 или 1;

d имеет значение в интервале от 0 до 6;

е имеет значение в интервале от 1 до 6;

n имеет значение в интервале от 0 до 6;

q имеет значение в интервале от 1 до 5;

w имеет значение в интервале от 1 до 5;

y обозначает 1;

х обозначает 1; и

z имеет значение в интервале от 1 до 5.

2. Соединение по п.1, где q обозначает 1; w обозначает 1 и z обозначает 1.

3. Соединение по п.2, где

и Y представляет собой адамантил.

4. Композиция, предназначенная для доставки терапевтического агента, содержащая порошкообразный композит полимера и терапевтического агента и комплекс включения указанного полимера и комплексообразующего агента, причем комплексообразующий агент содержит функциональную группу, а полимер содержит один или более фрагментов циклодекстрина.

5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что полимер имеет функциональность хозяина, а комплексообразующий агент имеет функциональность гостя.

6. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что полимер имеет функциональность гостя, а комплексообразующий агент имеет функциональность хозяина.

7. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что полимер имеет функциональность хозяина и гостя и содержащая смесь комплексообразующих агентов имеет функциональность гостя и хозяина.

8. Композиция по одному из пп.5, 6 или 7, отличающаяся тем, что функциональность хозяина выбирают из циклодекстрина, карцеранда, кавитанда, краун-эфира, криптанда, кукурбитурила, каликсарена, сферанда или их любой комбинации.

9. Композиция по одному из пп.5, 6 или 7, отличающаяся тем, что комплексообразующий агент дополнительно содержит спейсерную группу.

10. Композиция по одному из пп.5, 6 или 7, отличающаяся тем, что функциональность гостя выбирают из адамантана, диадамантана, нафталина и холестерола.

11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что функциональность хозяина представляет собой циклодекстрин, а функциональность гостя представляет собой адамантан или диадамантан.

12. Композиция по одному из пп.4-7, отличающаяся тем, что функциональную группу выбирают из лиганда, сигнала ядерной локализации, пептида эндосомного высвобождения, полимера эндосомного высвобождения, второго терапевтического агента, стабилизирующего полимера/гидрофильного полимера для стабилизации или любой их комбинации; спейсерную группу выбирают из простой связи, фосфатной группы, полиэтиленгликоля и короткой анионной пептидной последовательности.

13. Композиция по одному из пп.4-7, отличающаяся тем, что терапевтический агент выбирают из антибиотика, стероида, полинуклеотида, низкомолекулярного фармацевтического вещества, вируса, плазмиды, пептида, пептидного фрагмента, хелатирующего агента, биологически активной макромолекулы и любой их комбинации.

14. Композиция по п.13, отличающаяся тем, что терапевтический агент представляет собой полинуклеотид.

15. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что полимер представляет собой циклодекстринсодержащий полимер, а комплексообразующий агент дополнительно содержит гостя включения, выбранного из адамантана и диадамантана.

16. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что терапевтический агент выбирают из антибиотика, стероида, полинуклеотида, низкомолекулярного фармацевтического вещества, вируса, плазмиды, пептида, пептидного фрагмента, хелатирующего агента, биологически активной макромолекулы и любой их комбинации.

17. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что терапевтический агент представляет собой полинуклеотид.

18. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что комплексообразующий агент представляет собой соединение формулы:

где

J обозначает -NH-, -C(=O)NH-(CH₂)_d-, -NH-C(=O)-(CH₂)_d-, -CH₂SS-, -C(=O)O-(CH₂)_e-O-P(=O)(O-(CH₂)_e-Ad)O-,

или -NH-(С=O)-CH(R¹)-NH-(С=О)-CH(R¹)-NH-;

Ad обозначает адамантил;

R¹ обозначает -(CH₂)_a-CO₂H, ее эфир или соль; или -(CH₂)_a-CONH₂;

PEG (ПЭГ) обозначает -O(СН₂СН₂O)_z -, где z варьируется от 2 до 300;

L обозначает Н, -NH₂, -NH-(C=O)-(CH₂)_e-(C=O)-CH₂-, -S(=O)₂-HC=CH₂-, -SS-, -С(=O)O- или углеводный остаток;

а обозначает 0 или 1;

b обозначает 0 или 1;

d имеет значение в интервале от 0 до 6;

е имеет значение в интервале от 1 до 6;

n имеет значение в интервале от 0 до 6;

y обозначает 1; и

х обозначает 1.

19. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что полимер представляет собой циклодекстринсодержащий полимер, а комплексообразующий агент содержит гостя включения, представляющего собой соединение по п.4 или 5.

20. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что терапевтический агент выбирают из антибиотика, стероида, полинуклеотида, низкомолекулярного фармацевтического вещества, вируса, плазмиды, пептида, пептидного фрагмента, хелатирующего агента, биологически активной макромолекулы или любой их комбинации.

21. Композиция по п.20, отличающаяся тем, что терапевтический агент представляет собой полинуклеотид.

22. Способ приготовления композиции по п.4, включающий стадию объединения терапевтического агента, полимера и комплексообразующего агента с образованием композиции, при этом полимер и терапевтический агент образуют порошкообразный композит, а полимер и комплексообразующий агент образуют комплекс включения.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что терапевтический агент сначала объединяют с полимером с образованием порошкообразного композита, а затем порошкообразный композит объединяют с комплексообразующим агентом таким образом, что полимер и комплексообразующий агент образуют комплекс включения.

24. Способ по п.22, отличающийся тем, что полимер сначала объединяют с комплексообразующим агентом с образованием комплекса включения и комплекс включения объединяют с терапевтическим агентом таким образом, что полимер и терапевтический агент образуют порошкообразный композит.

25. Способ доставки терапевтического вещества, включающий стадию введения человеку, нуждающемуся по показаниям в терапевтическом агенте, терапевтически эффективного количества композиции по пп.4, 5 или 7.

26. Способ доставки терапевтического вещества, включающий стадию введения человеку, нуждающемуся по показаниям в терапевтическом агенте, терапевтически эффективного количества композиции по пп.15-18.