Способ получения чистых фосфатидов и их применение в области косметики, фармацевтики и питания
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ основан на взаимодействии смесей природных фосфатидов или их отдельных компонентов, например соевого или яичного лецитина или животных фосфолипидов, или синтетических фосфатидов, посредством их реакции с фосфолипазой D, обладающей трансфосфатидилазной активностью, в водной среде. Способ позволяет получить чистые фосфатиды и упростить процесс выделения, а также увеличить выход фосфатидов и степень их чистоты. 11 н. и 17 з.п. ф-лы, 2 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу получения чистых фосфатидов исходя из смесей природных фосфатидов или их отдельных компонентов, таких как соевый или яичный лецитин, или животные фосфолипиды, или синтетических фосфатидов, посредством их реакции с фосфолипазой D, обладающей трансфосфатидилазной активностью, в одной водной фазе в присутствии определенных субстратов, содержащих первичную или вторичную спиртовую группу.
Изобретение также относится к получению, очистке и определению характеристик фосфолипазы D, используемой в способе.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Синтез чистых фосфолипидов, особенно в промышленном масштабе, является очень широко распространенной проблемой. Действительно, имеются многочисленные научные публикации и патенты, включая ряд совсем недавних, в которых описаны различные методологии. Обычно в упомянутых способах используют трансфосфатидилазные свойства фосфолипазы D для получения оптически активных фосфатидов. Одной из основных проблем является то, что каждый из этих способов пригоден только для получения одного специфического фосфатида и не может быть адаптирован для синтеза всего класса соединений. В целом, наиболее широко исследованным фосфолипидом является фосфатидилсерин (ФС), поскольку он широко используется для получения фармацевтических композиций для приготовления рецептур, содержащих липосомы, и пищевых добавок. Относительно мало или ничего не опубликовано относительно синтеза сфингофосфолипидов.
Одно из ограничений всех способов, описанных в научной и патентной литературе, обусловлено тем, что реакция трансфосфатидилирования идет в двухфазных системах, состоящих из воды и органического растворителя. Это создает ряд технических проблем, связанных с использованием больших количеств растворителя, особенно если промышленный способ имеет химическую природу, и его целью является получение высококачественного продукта. В заявке на патент DE 19917249 А1 описан способ, в котором фактически используется одна водная фаза, но не указаны ни выход, ни степень чистоты полученного ФС, ни тип использованного фермента. Кроме того, нет сведений о том, можно ли с использованием той же методики и тех же субстратов получить другие фосфолипиды, кроме ФС, и могут ли в описанных условиях другие фосфолипиды выполнять роль субстратов реакции. В Японской Патентной Публикации №5/42917 (JP 2130088) также описан способ, в котором используется среда, состоящая только из воды или из смеси воды и органического растворителя. Однако в этом патенте сделан вывод, что для предотвращения побочных реакций предпочтительно содержание воды, равное 10% или менее. Таким образом, данная работа позволяет предположить, что использование одной водной среды неблагоприятно. Фактически в примерах, содержащихся в ней, описаны только способы, в которых использована двухфазная смесь воды и этилового эфира.
Общий характер приведенной информации и отсутствие в упомянутых работах предшествующего уровня техники сведений о применимости реакции трансфосфатидилирования с фосфолипазой D в одной водной фазе не позволяли специалистам в данной области техники считать, что это могло бы быть решением проблемы. Кроме того, о важности удаления загрязнений, возникающих из-за использования органических растворителей в способах производства продуктов, используемых в области питания и фармацевтики, стало известно лишь в последние годы после ограничений, установленных Фармакопеей Соединенных Штатов Америки (USP) и директивами Европейского Сообщества (СРМР/СН/283/95).
Другой критический вопрос, который не был глубоко исследован ни в научной литературе, ни на больных, касается перекисного окисления продуктов, образующихся при использовании гетерогенных фаз «вода/растворитель» в эмульсии в ходе реакции трансфосфатидилирования, используемых условий реакции и последующей необходимости осуществлять многочисленные стадии способа (повторное осаждение, промывки и, возможно, также хроматографию) для получения продуктов с высоким уровнем чистоты. Многие растворители, используемые для этих реакций, в гетерогенной фазе не гарантируют отсутствия свободнорадикальных предшественников (промежуточных продуктов), типичных для инициации реакции перекисного окисления. Кроме того, встряхивание/перемешивание, необходимые для осуществления реакции в гетерогенной фазе, повышают вероятность контакта с атмосферным кислородом и последующего запуска окислительных явлений. Это перекисное окисление действует наподобие цепной реакции, когда даже незначительные начальные первичные стадии могут с течением времени дать огромные результаты, несмотря на то что запускающие условия были устранены или минимизированы. Перекисное окисление «жировых» веществ, таких как триглицериды (масла или жиры), а также фосфолипидов, приводит к тому, что жирные кислоты «прогоркают» с последующим образованием неприятного запаха и вкуса. Особенно важно то, что продукты должны иметь высокий уровень аппетитности (запах и вкус), если они, особенно ФС, используются для приготовления пищевых добавок (нутрицевтиков, биологически активных добавок) с особыми рецептурами, например - гранул или так называемых «функциональных пищевых продуктов», к которым добавляется продукт для обогащения их состава. Поэтому важно, чтобы полученные продукты, особенно ФС, могли быть четко охарактеризованы химическими терминами как в отношении химического состава жирных кислот, так и по степени перекисного окисления и обусловленной этим аппетитности.
Наконец, следует отметить, что препараты фермента фосфолипазы D, имеющиеся на рынке, обычно проявляют трансфосфатидилазную активность в отношении фосфатидилхолиновой фракции фосфолипидной смеси. В результате этого другие компоненты, такие как фосфатидилэтаноламин (ФЭ), подвергаются гидролизу до фосфатидной кислоты, за счет чего снижаются как выход, так и степень чистоты конечного продукта.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что при использовании очищенной фракции фосфолипазы D, выделенной из Streptoverticillium hachijoense, можно провести реакцию трансфосфатидилирования с различными спиртовыми рецепторами, начиная от смеси природных фосфатидов или их очищенных фракций, в 100% водной среде с высоким выходом продукта и перекисным числом (уровнем перекисного окисления) менее 5 мЭкв О2/кг, установленным в Европейской Фармакопее - Дополнение 2000, страница 41 (способ А), посредством одной стадии реакции и одного осаждения.
Реакцию трансфосфатидилирования можно проводить при различных условиях в отношении температуры и концентрации субстрата, устанавливая первую в диапазоне от 20 до 60°С, предпочтительно 45°С, а вторую - в диапазоне от 10 до 500 мг/мл, предпочтительно - 150 мг/мл, в зависимости от степени дисперсности субстратов.
Второй аспект настоящего изобретения состоит в том, что этот конкретный ферментативный препарат обладает трансфосфатидилазной активностью с высокими выходами продукта даже при использовании субстратов, отличающихся от фосфатидилхолина (лецитина), что позволяет использовать этот способ и для недорогих, неочищенных сырьевых материалов.
Значение штамма, использованного для получения Фосфолипазы D и ее фракционирования, можно понять из следующей таблицы, в которой проведено сравнение очищенной фракции фермента, полученной согласно Примеру 1, с различными имеющимися в продаже ферментативными препаратами.
Получение фосфатидилсерина
| Штамм | Компания | Продукт | ФС | ФК | ФХ |
| Streptomyces sp. | Sigma | P4912 Тип VI | 50% | 45% | 5% |
| Streptomyces sp. | Asahi Chemical Industry Co., Ltd | PL-DP | 50% | 45% | 5% |
| Streptomyces chromofuscus | Sigma | P8023 Тип VI | 40% | 40% | 20% |
| Actinomadura sp. | Meito Sangyo Co., Ltd. | Кода нет | 45% | 40% | 15% |
| Streptoverticillium hachijoense | Fidia | FRS | 95% | 5% | - |
(чистый лецитин с содержанием фосфатидилхолина, равным 95%, в качестве субстрата; условия реакции, как в Примере 1).
Другим преимуществом данного ферментативного препарата и условий реакции, описанных в настоящем изобретении, является практически полное превращение субстрата в ФС по сравнению со степенью преобразования, не превышающей 70%, достигнутой в двухфазной системе вода/органический растворитель, описанной в JP 213008.
Третий аспект настоящего изобретения касается получения фармацевтических и косметических композиций и пищевых и диетических добавок на основе фосфолипидов, полученных в соответствии с вышеописанным способом и имеющих степень перекисного окисления менее 5 мЭкв O2/кг и высокий уровень аппетитности, для того чтобы сделать их более предпочтительными по сравнению с другими сходными продуктами, имеющимися на рынке, но не имеющими указанных характеристик.
Фармацевтические композиции и пищевые и диетические добавки особенно показаны к применению при лечении состояний психофизического стресса с нарушениями внимания, концентрации и памяти, часто связанных со старением, и они могут быть изготовлены, например, в форме капсул, таблеток и гранул.
Косметические композиции прежде всего можно использовать при лечении нарушений физиологических функций кожи и в качестве вспомогательных средств при лечении дерматита экзематозного и/или воспалительного типа, и их можно изготовить, например, в форме кремов или гелей.
С чисто иллюстративными целями ниже приводятся несколько примеров получения Фосфолипазы D и фосфолипидов, полученных с ее помощью согласно настоящему изобретению.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1: Получение Фосфолипазы D
Использован штамм Streptoverticillium hachijoense ATCC 19769.
Приготовление инокулята для использования в испытании с ферментацией начинается с колонии на твердой среде в чашке Петри. Состав твердой среды является следующим: 21,0 г/литр дрожжевого экстракта, 2% агара. Бактерии, взятые из чашек Петри, используют для запуска системы «масштабирования» в колбах Эрленмейера следующим образом:
- бактерии берут с твердой среды стерильной платиновой петлей и инокулируют в колбу объемом 100 мл, содержащую 20 мл среды следующего состава: 21,0 г/л дрожжевого бульона;
- колбу помещают в инкубатор-шейкер с установками на 30°С, 150 об/мин на 48 часов;
- 20 мл культуры переносят в колбу на 5,0 литров, содержащую 2,5 л среды описанного выше состава;
- колбу помещают в инкубатор-шейкер с установками на 30°С, 150 об/мин на 72 часа.
После этого культура готова для инокуляции в биореактор. Эта операция возможна благодаря тому, что культура находится в колбе, снабженной системой, состоящей из силиконовой трубки и иглы. Используемый биореактор имеет емкость, равную 50 литрам (Braun Biostat U). Состав среды следующий: дрожжевой бульон - 21,0 г/л, рН 6,5 (среда стерилизуется прямо в биореакторе при добавлении антивспенивающего средства); параметры ферментации: взбалтывание - 200 об/мин, температура 30°С, поток воздуха 0,5 vvm.
Через 72 часа ферментацию прерывают. Максимальное полученное количество фермента равно 5000 Ед/л, а ферментативную активность определяют по модифицированному способу Kato et al., описанному в литературе (К.Shimbo et al., Agric. Biol. Chem. 54(5), 1189-93, 1990).
Культуральный бульон фильтруют с целью удаления биомассы, супернатант концентрируют с помощью спирального картриджа в ацетате целлюлозы с уровнем отсечки по молекулярной массе, соответствующим 10000 Д, и диализируют против Трис-HCl-буфера в концентрации 50 мМ, рН 8,0. Полученную таким образом пробу загружают в хроматографическую колонку (внутренний диаметр = 10 см, h=50 см), наполненную 500 г анионообменной смолы Watman DE-52, предварительно уравновешенной тем же буфером, который был использован для диализа. Фермент не адсорбируется и элюируется из колонки, его диализируют против Na-фосфатного буфера с рН 5,4, а затем загружают в хроматографическую колонку (внутренний диаметр = 10 см, h=50 см), наполненную 50 г катионобменной смолы CM-Sephadex Pharmacia C-50, предварительно сбалансированной с тем же буфером, что и фермент. Фермент элюируют в градиенте рН от 5,5 до 7,0 с использованием Na-фосфатного буфера (20 мМ, рН 7,0). Фракцию, которая элюируется при рН 6,2, собирают, концентрируют и диализируют против Трис-HCl буфера (50 мМ, рН 8,0) до концентрации 100 Ед/мл, а затем лиофилизируют.
| Общая активность (Единицы × 103) | Общее содержание белка (мг × 103) | Специфическая активность (Единицы × мг белка) | Выделение (%) | |
| Необработанный бульон | 250 | 250 | 1 | 100 |
| Концентрирование и диализ | 237,5 | 118,8 | 2 | 95 |
| DE-52 Whatman | 212,5 | 2,2 | 97 | 85 |
| CM-Sephadex C-50 Pharmacia | 150 | 0,26 | 577 | 60 |
| Концентрирование и диализ | 145 | 0,24 | 604 | 58 |
| Лиофилизация | 112,5 | 0,24 | 469 | 45 |
Пример 2: Получение ФС (фосфатидил-L-серина) из ФХ (фосфатидилхолина)
В реакторе с рубашкой, оборудованном встряхивателем и дефлегматором, 272 г ацетата натрия тригидрата и 59 г гидрохлорида натрия тригидрата растворяют в 10 литрах воды. рН доводят до 5,6 (ацетатный буфер, 0,2 М + хлорид кальция, 0,04 М, рН 5,6), добавляют 5,0 кг L-серина и солюбилизируют посредством нагревания до 45°С. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
После завершения солюбилизации добавляют 1,5 кг очищенного соевого лецитина следующего состава: ФХ (фосфатидилхолина) 95%, ФК (фосфатидной кислоты) 4%, лизо-ФХ (лизофосфатидилхолина) 1%. Через десять минут добавляют 16100 Ед фосфолипазы D из Примера 1 и эту смесь оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 10 литров смеси п-гексана/изопропанола/воды (60/80/15); массу растворяют посредством встряхивания, затем встряхивание прекращают и оставляют реакционную смесь для разделения фаз.
Нижнюю фазу собирают и выделяют непрореагировавший L-серин посредством охлаждения в кристаллизаторе.
Верхнюю фазу промывают 6950 мл 1N HCl и 1113 мл изопропанола при 5°С. Кислую фазу повторно экстрагируют 10 литрами смеси гексана/изопропанола/воды (60/80/15), после чего две органические фазы в каскадной установке промывают смесью 7 литров воды и 6 литров изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом и осаждают посредством медленного добавления смеси 450 мл 4,5 М водного раствора ацетата натрия и 33,2 литров этанола.
Осадок фильтруют и высушивают.
Получают 1,14 кг фосфатидилсерина с титром более 95%, содержанием фосфатидной кислоты менее 5% и перекисным числом менее 5.
После кристаллизации и сушки выделяют 3,25 кг L-серина.
Пример 3: Получение ФС (фосфатидил-L-серина) из яичного лецитина
180 мл смеси 0,2 М ацетатного буфера и 0,04 М хлорида кальция с рН 5,6 помещают в реактор с рубашкой, оборудованный встряхивателем и дефлегматором, после чего добавляют 90 г L-серина и солюбилизируют посредством нагревания до 45°С. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
После завершения солюбилизации добавляют 27 г очищенного яичного лецитина (содержание ФХ≥95%); через 10 минут добавляют 290 Ед фосфолипазы D из Примера 1 и оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 200 мл смеси п-гексана/изопропанола/воды (60/80/15) и растворяют массу посредством встряхивания, затем встряхивание прекращают и оставляют две фазы для разделения.
Нижнюю фазу отбрасывают.
Верхнюю фазу промывают 150 мл 1N HCl и 30 мл изопропанола при 5°С.
Кислую фазу повторно экстрагируют 180 мл смеси п-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем две органические фазы в каскадной установке промывают смесью 100 мл воды и 130 мл изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом и осаждают посредством медленного добавления раствора 8 мл 4,5 М ацетата натрия в воде в 600 мл этанола. Осадок фильтруют и высушивают.
Это дает 20,8 г фосфатидилсерина с титром более 95% с содержанием фосфатидной кислоты менее 5% и перекисным числом менее 5.
Пример 4: Получение фосфатидил-L-серина из неочищенного соевого лецитина
180 мл смеси 0,2 М ацетатного буфера и 0,04 М хлорида кальция с рН 5,6 помещают в реактор с рубашкой, оборудованный встряхивателем и дефлегматором, после чего добавляют 90 г L-серина и солюбилизируют посредством нагревания до 45°С. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
После завершения солюбилизации добавляют 27 г неочищенного соевого лецитина (общее содержание фосфолипидов 75%, процентное содержание ФХ 60,6/ФЭ 29,5/ФК 3,4/лизо-ФХ 2,5/прочих 3,9); через 10 минут добавляют 290 Ед фосфолипазы D из Примера 1 и оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 200 мл смеси п-гексана/изопропанола/воды (60/80/15) и растворяют массу посредством встряхивания, затем встряхивание прекращают и оставляют две фазы для разделения.
Нижнюю фазу отбрасывают.
Верхнюю фазу промывают 150 мл 1N HCl и 30 мл изопропанола при 5°С.
Кислую фазу повторно экстрагируют 180 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем две органические фазы в каскадной установке промывают смесью 100 мл воды и 130 мл изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом и осаждают посредством медленного добавления смеси 8 мл 4,5 М водного раствора ацетата натрия и 600 мл этанола. Осадок фильтруют и высушивают.
Это дает 19 г фосфатидилсерина с титром более 83,5% (ФК 7,7%, лизо-ФС 2,3%, ФЭ 1,9%, прочие 4,5%) и перекисным числом менее 5.
Пример 5: Получение фосфатидил-D-серина
180 мл смеси 0,2 М ацетатного буфера и 0,04 М хлорида кальция с рН 5,6 помещают в реактор с рубашкой, оборудованный встряхивателем и дефлегматором, после чего добавляют 90 г D-серина и солюбилизируют посредством нагревания до 45°С. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
После завершения солюбилизации добавляют 27 г очищенного соевого лецитина, как в Примере 2; через 10 минут добавляют 290 Ед фосфолипазы D из Примера 1 и оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 200 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15) и растворяют массу посредством встряхивания, затем встряхивание прекращают и оставляют две фазы для разделения.
Нижнюю фазу отбрасывают.
Верхнюю фазу промывают 150 мл 1 N HCl и 30 мл изопропанола при 5°С.
Кислую фазу повторно экстрагируют 180 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем две органические фазы в каскадной установке промывают смесью 100 мл воды и 130 мл изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом и осаждают посредством медленного добавления смеси 8 мл 4,5 М водного раствора ацетата натрия и 600 мл этанола. Осадок фильтруют и высушивают.
Это дает 18,7 г фосфатидил-D-серина с титром более 95%, с содержанием фосфатидной кислоты менее 5% и с перекисным числом менее 5.
Пример 6: Получение фосфатидилэтаноламина (ФЭ) из фосфатидилхолина (ФХ)
200 мл смеси 0,2 М ацетатного буфера и 0,04 М хлорида кальция с рН 5,6 помещают в реактор с рубашкой, оборудованный встряхивателем и дефлегматором. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
Добавляют 58 г этаноламина и доводят рН до 5,6 ледяной уксусной кислотой при заданной температуре 30°С.
В конце операции смесь нагревают до 45°С и добавляют 30 г очищенного соевого лецитина, как в Примере 2. Через 10 минут добавляют 325 Ед фосфолипазы D из Примера 1, а затем оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 400 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем встряхивание прекращают и оставляют две фазы для разделения.
Нижнюю фазу отбрасывают.
Верхнюю фазу промывают 150 мл 1N HCl и 30 мл изопропанола при 5°С.
Кислую фазу повторно экстрагируют 180 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем две органические фазы в каскадной установке промывают смесью 100 мл воды и 130 мл изопропанола, затем - 100 мл 1N раствора ацетата натрия и 130 мл изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом.
Их очищают посредством хроматографии на силикагеле с использованием хроматографа аксиального давления с колонкой на 1 л, уравновешенной смесью хлороформа и метанола (80/20); выполняют градиентное элюирование до соотношения хлороформа/метанола/воды, равного 70/30/3.
Чистые фракции испаряют, растворяют в 250 мл циклогексана и лиофилизируют с получением 24 г светло-желтого твердого продукта, не содержащего фосфатидной кислоты и лизопроизводных и имеющего чистоту более 99%.
Пример 7: Получение фосфатидил-гомосерина из ФХ
180 мл смеси 0,2 М ацетатного буфера и 0,04 М хлорида кальция с рН 5,6 помещают в реактор с рубашкой, оборудованный встряхивателем и дефлегматором, после чего добавляют 102 г гомосерина и солюбилизируют посредством нагревания до 45°С. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
После завершения солюбилизации добавляют 27 г очищенного соевого лецитина, как в Примере 2; через 10 минут добавляют 290 Ед фосфолипазы D из Примера 1 и оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 200 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15). Массу растворяют посредством встряхивания, затем встряхивание прекращают и оставляют две фазы для разделения.
Нижнюю фазу отбрасывают.
Верхнюю фазу промывают 150 мл 1N HCl и 30 мл изопропанола при 5°С.
Кислую фазу повторно экстрагируют 180 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем две органические фазы в каскадной установке промывают смесью 100 мл воды и 130 мл изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом и осаждают посредством медленного добавления смеси 8 мл 4,5 М водного раствора ацетата натрия и 600 мл этанола. Осадок фильтруют и высушивают.
Получают 22,6 г фосфатидил-гомосерина с титром более 95%, с содержанием фосфатидной кислоты менее 5% и с перекисным числом менее 5.
Пример 8: Получение фосфатидил-гидроксипролина из ФХ (фосфатидилхолина)
180 мл смеси 0,2 М ацетатного буфера и 0,04 М хлорида кальция с рН 5,6 помещают в реактор с рубашкой, оборудованный встряхивателем и дефлегматором, после чего добавляют 112 г гидроксипролина и солюбилизируют посредством нагревания до 45°С. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
После завершения солюбилизации добавляют 27 г очищенного соевого лецитина, как в Примере 2; через 10 минут добавляют 290 Ед фосфолипазы D из Примера 1 и оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 200 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15) и растворяют массу посредством встряхивания, затем встряхивание прекращают и оставляют две фазы для разделения.
Нижнюю фазу отбрасывают.
Верхнюю фазу промывают 150 мл 1N HCl и 30 мл изопропанола при 5°С.
Кислую фазу повторно экстрагируют 180 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем две органические фазы в каскадной установке промывают смесью 100 мл воды и 30 мл изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом и осаждают посредством медленного добавления смеси 8 мл 4,5 М водного раствора ацетата натрия и 600 мл этанола. Осадок фильтруют и высушивают.
Это дает 18,4 г фосфатидил-гидроксипролина с титром более 95%, с содержанием фосфатидной кислоты менее 5% и с перекисным числом менее 5.
Пример 9: Получение фосфатидилглицерина из ФХ (фосфатидилхолина)
200 мл смеси 0,2 М ацетатного буфера и 0,04 М хлорида кальция с рН 5,6 помещают в реактор с рубашкой, оборудованный встряхивателем и дефлегматором. Весь процесс проводят в атмосфере азота.
Добавляют 80 г глицерина; его нагревают до 45°С, затем добавляют 30 г очищенного соевого лецитина, как в Примере 2; через 10 минут добавляют 325 Ед фосфолипазы D из Примера 1 и оставляют для протекания реакции на 24 часа при 45°С.
После завершения реакции реактор разгружают посредством добавления 400 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем встряхивание прекращают и оставляют две фазы для разделения.
Нижнюю фазу отбрасывают.
Верхнюю фазу промывают 150 мл 1N HCl и 30 мл изопропанола при 5°С.
Кислую фазу повторно экстрагируют 180 мл смеси n-гексана/изопропанола/воды (60/80/15), затем две органические фазы промывают в каскадной установке смесью 100 мл воды и 130 мл изопропанола, а затем - 100 мл 1N раствора ацетата натрия и 130 мл изопропанола.
Органические фазы концентрируют под вакуумом.
Очистку производят посредством хроматографии на силикагеле с использованием хроматографа аксиального давления с колонкой на 1 л, уравновешенной смесью хлороформа и метанола (80/20). Выполняют градиентное элюирование до соотношения хлороформа/метанола/воды, равного 70/30/3.
Чистые фракции испаряют, растворяют в 250 мл циклогексана и лиофилизируют с получением 22,2 г белого твердого продукта, не содержащего фосфатидной кислоты и лизопроизводных и имеющего чистоту более 95%.
Его фильтруют и высушивают.
Пример 10: Выделение и повторное использование L-серина
Маточные воды от первого распределения ферментативной реакции, как в Примере 2, выдерживают при температуре 0°С в течение 24 часов, затем кристаллизовавшийся продукт фильтруют. Его промывают этанолом и высушивают с получением белых игольчатых кристаллов чистого продукта, идентичного исходному.
Восполняют недостающее количество (примерно 20%), после чего продукт может быть использован как нормальный.
Пример 11: Примеры фармацевтических композиций
(а) Каждая желатиновая капсула содержит:
| фосфатидилсерина | 100,0 мг |
| растительного масла | 270,0 мг |
| соевого лецитина | 30,0 мг |
(б) Каждая ампула для инъекций содержит:
| фосфатидилсерина | 50,0 мг |
| маннита | 100,0 мг |
| соевого лецитина (пригодного для инъекций) | 7,5 мг |
| фосфатного буфера | 2,2 мг |
| воды сколько нужно до | 2,0 мл |
Пример 12: Примеры пищевых и диетических добавок
(а) Каждая желатиновая капсула содержит:
| фосфатидилсерина | 100,0 мг |
| витамина Е | 5,0 мг |
| растительного масла | 295,0 мг |
(б) Каждый пакет содержит:
| фосфатидилсерина | 100 мг |
| креатина | 1,5 г |
| бета-каротина | 0,6 мг |
| витамина Е | 5,0 мг |
| витамина С | 30,0 мг |
| витамина В1 | 0,7 мг |
| витамина В6 | 1,0 мг |
| витамина В12 | 0,5 мкг |
| фолиевой кислоты | 0,1 мг |
(в) Каждая жевательная таблетка содержит:
| фосфатидилсерина | 75,0 мг |
| витамина Е | 5,0 мг |
| витамина С | 30,0 мг |
| витамина В1 | 0,7 мг |
| витамина В6 | 1,0 мг |
| витамина В12 | 0,5 мкг |
| фолиевой кислоты | 0,1 мг |
18 Пример 13: Примеры косметических композиций
(а) Каждый тюбик крема для тела содержит:
| фосфатидилсерина | 4,0 г |
| macadamia ternifolia (ореха австралийского) | 2,0 г |
| гиалуроната натрия | 10,0 мг |
| цетеарилоктаноата | 8,0 г |
| триглицерида каприловой/капроновой кислоты | 7,0 г |
| сорбита | 5,0 г |
| цетеарилового спирта | 4,0 г |
| полисорбата 20 | 1,0 г |
| карбомера | 0,8 г |
| дегидроацетата натрия | 0,4 г |
| динатрий-ЭДТА | 0,3 г |
| антиоксиданта (токоферола) | 50,0 мг |
| воды | сколько нужно |
| до 100,0 мл |
(б) Каждый тюбик мази для тела содержит:
| фосфатидилсерина | 3,0 г |
| холестерина | 2,0 г |
| гиалуроната натрия | 10,0 мг |
| цетеарилоктаноата | 9,0 г |
| триглицерида каприловой/капроновой кислоты | 7,0 г |
| сорбита | 7,0 г |
| цетеарилового спирта | 3,5 г |
| полисорбата 20 | 1,0 г |
| карбомера | 0,6 г |
| дегидроацетата натрия | 0,5 г |
| динатрий-ЭДТА | 0,3 г |
| антиоксиданта (токоферола) | 50,0 мг |
| воды сколько нужно до | 100,0 мл |
1. Способ получения фосфатидов с формулой (I):
где R является диацилглицерином, a R1 является остатком спиртовой группы, который включает реакцию фосфатида с формулой (II):
R-O-PO(OH)-O-R2,
где R является таким, как указано выше, a R2 является CH2-CH2-NH2 и/или СН2-СН2-N+(CH3)3,
с первичным или вторичным спиртом с длиной цепи от С2 до С4, возможно замещенным одной или несколькими полярными группами, выбранными из группы, состоящей из аминогруппы, гидроксильной группы и карбоксильной группы, в чисто водной среде в присутствии фосфолипазы D, обладающей трансфосфатидилазной активностью, продуцируемой бактериями вида Streptomyces hachijoense.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что диацилглицерин содержит две жирные кислоты, которые могут быть одинаковыми или различными, насыщенными или ненасыщенными, и имеют длину от С12 до С24.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что температура реакции составляет 45±5°С.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что фосфолипазу D очищают на анион- и катионобменной смоле.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что используемую фракцию фосфолипазы D элюируют при рН 6,2 с катионобменной смолы.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что бактерии вида Streptomyces hachijoense представляют собой штамм АТСС 19769.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что фосфатид с формулой (I) является фосфатидил-D-серином, фосфатидилэтаноламином, фосфатидилгомосерином, фосфатидилгидроксипролином или фосфатидилглицерином.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что фосфатид с формулой (I) является фосфатидил-L-серином, а фосфатид с формулой (II) является неочищенным или очищенным соевым лецитином.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что фосфатид с формулой (I) является фосфатидил-L-серином, а фосфатид с формулой (II) является яичным лецитином.
10. Продукт фосфатидил-L-серина, полученный способом по любому из пп.1-9, имеющий жирнокислотный состав, идентичный составу соевого или яичного лецитина, и перекисное число меньше 5 мЭкв O2/кг.
11. Фармацевтическая композиция для лечения состояний психофизического стресса, нарушения внимания, концентрации и памяти, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фосфатид с формулой (I), полученный способом по любому из пп.1-9.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что она имеет жирнокислотный состав, идентичный яичному или соевому лецитину, и перекисное число менее 5 мЭкв O2/кг.
13. Фармацевтическая композиция по п.12, отличающаяся тем, что она имеет форму капсулы, таблетки или гранулы.
14. Косметическая композиция для лечения нарушений физиологических функций кожи и в качестве вспомогательного средства при лечении дерматита экзематозного и/или воспалительного типа, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фосфатид с формулой (I), полученный способом по любому из пп.1-9.
15. Пищевая добавка, содержащая носитель и фосфатид с формулой (I), полученный способом по любому из пп.1-9.
16. Пищевая добавка по п.15, отличающаяся тем, что фосфатид с формулой (I) является фосфатидил-L-серином.
17. Пищевая добавка по п.15 или 16, отличающаяся тем, что она имеет жирнокислотный состав, идентичный яичному или соевому лецитину, и перекисное число менее 5 мЭкв О2/кг.
18. Пищевая добавка по п.17, отличающаяся тем, что она имеет форму капсулы, таблетки или гранулы.
19. Диетическая добавка, содержащая носитель и фосфатид с формулой (I), полученный способом по любому из пп.1-9.
20. Диетическая добавка, отличающаяся тем, что фосфатид с формулой (I) является фосфатидил-L-серином.
21. Диетическая добавка по п.19 или 20, отличающаяся тем, что она имеет жирнокислотный состав, идентичный яичному или соевому лецитину, и перекисное число менее 5 мЭкв О2/кг.
22. Диетическая добавка по п.21, отличающаяся тем, что она имеет форму капсулы, таблетки или гранулы.
23. Косметическая композиция для местного нанесения на кожу, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фосфатидил-L-серин, полученный способом согласно п.1, имеющий жирнокислотный состав, идентичный яичному или соевому лецитину, и перекисное число менее 5 мЭкв О2/кг.
24. Косметическая композиция по п.23, отличающаяся тем, что она имеет форму крема или геля.
25. Применение фосфатида с формулой (I), полученного способом по любому из пп.1-9, для приготовления фармацевтической композиции для лечения психофизического стресса, нарушения внимания, концентрации и памяти, обычно связанных со старением.
26. Применение фосфатида с формулой (I), полученного способом по любому из пп.1-9, для приготовления пищевой добавки для лечения психофизического стресса, нарушения внимания, концентрации и памяти, обычно связанных со старением.
27. Применение фосфатида с формулой (I), полученного способом по любому из пп.1-9, для приготовления диетической добавки для лечения психофизического стресса, нарушения внимания, концентрации и памяти, обычно связанных со старением.
28. Применение фосфатида с формулой (I), полученного способом по любому из пп.1-9, для приготовления косметической композиции для лечения дерматита или нарушений физиологических функций кожи.
