Способ получения 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]- , -диметилфенилуксусной кислоты

Изобретение относится к области биотехнологии. 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилфенилуксусную кислоту (КМТ) получают путем инкубирования смеси, содержащей терфенадин и микроорганизм, способный продуцировать КМТ, и выделения целевого продукта. Способ позволяет упростить процесс получения и увеличить выход целевого продукта (КМТ). 19 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Область техники

Данное изобретение относится к способу получения производных пиперидина с применением микроорганизмов.

Предшествующий уровень

Терфенадин, 1-(п-трет-бутилфенил)-4-[-4'-(α-гидроксидифенилметил)-1'-пиперидинил]бутанол представляет собой неседативное антигистаминное средство. Описано, что он является специфическим антагонистом рецептора Н¹, который также лишен какого-либо антихолинергического, антисеротонергического и антиадренергического действия как in vitro, так и in vivo. См. D. McTavish, K. L. Goa, M. Ferrill, Drugs, 1990, 39, 552; C. R. Kingsolving, N. L. Monroe, A. A. Carr, Pharmacologist, 1973, 15, 221; J. K. Woodward, N. L. Munro, Arzneim-Forsch, 1982, 32, 1154; K. V. Mann, K. J. Tietze, Clin. Pharm., 1989, 6, 331. Значительные усилия были предприняты для исследования взаимосвязи структура - активность аналогов терфенадина, они отражены во множестве патентов США, в которых описывается это соединение и родственные структуры, а именно:

патенте США № 3687956, Zivkovic

патенте США № 3806526, Carr, et al

патенте США № 3829433, Carr, et al

патенте США № 3862173, Carr, et al

патенте США № 3878217, Carr, et al

патенте США № 3922276, Duncan, et al

патенте США № 3931197, Carr, et al

патенте США № 3941795, Carr, et al

патенте США № 3946022, Carr, et al

патенте США № 3956296, Duncan, et al

патенте США № 3965257, Carr, et al

патенте США № 4742175, Fawcett, et al.

Исследования метаболизма животных и человека показали, что терфенадин подвергается экстенсивному печеночному метаболизму первого цикла и, после обычной дозировки он не может быть определен в плазме, если только не применяются анализы с очень высокой чувствительностью. Специфический печеночный фермент цитохром Р-450 превращает терфенадин в основной метаболит 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилфенилуксусную кислоту, также известную как метаболит карбоновой кислоты терфенадина. Этот метаболит может быть легко определен в плазме и считается активной формой перорально вводимого терфенадина.

Побочные действия, описанные для терфенадина, включают сердечные аритмии (желудочковая тахиаритмия, трепетание-мерцание, желудочковая фибрилляция), седативный эффект, желудочно-кишечное расстройство, сухость во рту, запор и/или диарею. Наиболее серьезными среди них и потенциально опасными для жизни являются сердечные аритмии, которые связаны со способностью терфенадина пролонгировать сердечный интервал QT и описаны только для пациентов, которым вводится терфенадин, страдающих заболеваниями печени, которые также принимают противогрибковое средство кетоконазол или антибиотик эритромицин.

Так как сердечные побочные действия терфенадина описаны для пациентов с ослабленной функцией печени, а также для пациентов, которые принимают антибиотики, которые, как известно, подавляют функцию печеночных ферментов, полагают, что сердечные побочные действия возникают из-за аккумуляции терфенадина, а не из-за аккумуляции метаболита карбоновой кислоты терфенадина. "Пэтч-кламп" исследования на изолированном желудочковом миоците кошки подтверждают утверждение, что терфенадин, а не метаболит карбоновой кислоты ответственен за сердечные побочные действия. При концентрации 1 мкМ терфенадин вызывает более чем 90% ингибирование замедленного выпрямления калиевого тока. При концентрациях вплоть до 5 мкМ метаболит карбоновой кислоты терфенадина не оказывает значительного действия на калиевый ток в данном исследовании (см. R. L. Woosley, Y. Chen, J. P. Frieman and R. A. Gillis, JAMA, 1993, 269, 1532). Так как ингибирование транспорта ионов связано с сердечными аномалиями, такими как аритмии, эти результаты указывают на то, что карбоновая кислота терфенадина по всей вероятности не ответственна за сердечные аритмии при уровнях дозировки, при которых существует определенный риск возникновения таких побочных действий, вызываемых самим терфенадином.

Каребастин, 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-оксобутил]-α,α-диметилфенилуксусная кислота представляет собой метаболит карбоновой кислоты эбастина, 1-(п-трет-бутилфенил)-4-[4'-(α-дифенилметокси)-1'-пиперидинил]бутанола. Оба соединения обладают мощным селективным блокирующим действием на Н₁-рецептор гистамина и свойствами антагониста кальция, и доказано, что они являются полезными при лечении различных респираторных, аллергических и сердечно-сосудистых болезненных состояний.

Эти соединения расслабляют бронхиальную и сердечную гладкую мышцу in vitro и in vivo и ингибируют сжимающее действие норадреналина, ионов калия и различных других лекарств-агонистов. Соединения также ингибируют реакцию кишечных и трахеальных препаратов на гистамин, ацетилхолин и хлорид бария и блокируют бронхостеноз, вызванный аэрозолем гистамина у морских свинок в дозах менее чем 1 мг/кг массы тела животного при пероральном введении. Они также обладают антианафилактическими свойствами у крыс, ингибируют поражение кожи различными анафилактическими медиаторами (гистамин, 5-гидрокситриптамин, брадикинин, LCD₄ и т.д.) и являются антагонистами реакции Шульца-Дэйла у чувствительных морских свинок.

Производные пиперидина, родственные метаболиту карбоновой кислоты терфенадина, описаны в следующих патентах США:

патенте США № 4254129, Carr, et al

патенте США № 4254130, Carr, et al

патенте США № 4285957, Carr, et al

патенте США № 4285958, Carr, et al.

В указанных патентах 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолуксусную кислоту и родственные соединения получают алкилированием замещенного производного пиперидина формулы:

α-галогеналкилзамещенным фенилкетоном формулы:

где заместители галоген, R¹, R², n, Z и R⁶ описаны в столбце 6 патента США № 4254130.

Таким же образом в патенте США № 4550116, Soto et al. описано получение производных пиперидина родственных каребастину взаимодействием α-галогеналкилзамещенного фенилкетона с замещенным производным гидроксипиперидина формулы:

В патенте США № 4254130 указано, что α-галогеналкилзамещенные фенилкетоны, в которых Z является водородом, получают взаимодействием подходящего низшего С_1-6 алкилового с прямой или разветвленной цепью сложного эфира α,α-диметилфенилуксусной кислоты с соединением следующей формулы:

в обычных условиях ацилирования Фриделя-Крафтса, где галоген и m описаны в столбце 11 патента США № 4254129. Реакцию проводят в дисульфиде углерода в качестве предпочтительного растворителя.

Другие методы синтетического получения метаболита карбоновой кислоты терфенадина описаны в патентах США № 5578610, 5581011, 5589487, 5663412, 5750703 и 5994549, а также в заявках РСТ № WO 95/00492, WO 94/03170 и WO 95/00480.

Другой подход к получению соединений, подобных метаболиту карбоновой кислоты терфенадина включает превращение соединений, подобных терфенадину, с применением грибков. Такая методика описана в патенте США № 5204249, Schwartz et al и патенте США № 5990127, Meiwes et al. В патенте Schwartz грибки рода Cunninghamella применяют для превращения эбастина в каребастин. В патенте Meiwes применяют виды грибков из рода Cunninghamella и Absidia для превращения терфенадина в его метаболит кислоты. Хотя было обнаружено, что данные методики полезны для получения соединений, подобных метаболиту карбоновой кислоты терфенадина, первоначальный выход указанных продуктов в таком процессе довольно низкий и ограничения гифомицетами из указанных выше родов приводят к нежелательным ограничениям для коммерчески осуществимого способа.

Данное изобретение относится к улучшенному способу получения метаболита карбоновой кислоты терфенадина и производных каребастина с применением микробного катализа.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение относится к получению соединения, имеющего формулы IA и/или IB:

где

n означает 0 или 1;

R¹ является водородом или гидрокси;

R² является водородом;

или если n означает 0, R¹ и R², взятые вместе, образуют вторую связь между атомами углерода, несущими R¹ и R², при условии, что если n означает 1, R¹ и R² каждый является водородом;

R³ является -СООН или -COOR⁴;

R⁴ является алкилом или арилом;

А, В и D являются заместителями на соответствующих кольцах, которые могут быть различными или одинаковыми и которые выбирают из группы, включающей водород, галогены, алкил, гидрокси и алкокси.

Способ включает инкубирование исходного соединения, имеющего формулы IIA и/или IIB:

где R³* является -СН₃ и R¹, R², A, B и D такие, как определено выше,

в присутствии микроорганизма в условиях, эффективных для получения целевого соединения. Микроорганизм может быть выбран из рода Streptomyces, Stemphylium, Gliocladium, Bacillus, Botrytis, Cyathus, Rhizopus, Pycniodosphora, Pseudomonas, Helicostylum, Aspergillus, Mucor, Gelasinospora, Rhodotorula, Candida, Mycobacterium или Penicillium.

Данное изобретение также относится к получению целевого соединения, имеющего структуру согласно формулам IA и/или IB, инкубированием исходного соединения, имеющего структуру согласно формулам IIA и/или IIB, в присутствии Cunninghamella bainieri в условиях, эффективных для получения целевого соединения.

Данное изобретение представляет альтернативный и/или улучшенный способ получения карбокситерфенадина из терфенадина. Селективность и выход карбокситерфенадина, полученного с применением штаммов и способов в соответствии с данным изобретением, могут быть выше, чем те же показатели, полученные при применении известных штаммов. Кроме того, идентификация многих штаммов, особенно штаммов бактерий (грамположительных и грамотрицательных) для целевого превращения, дает возможность значительного улучшения штамма, преимущества в обработке и производстве по сравнению с применяемыми ранее штаммами гифомицетов.

Важно и неожиданно, что Streptomyces, Bacillus и Pseudomonas представляют собой грамположительные и грамотрицательные эубактериальные штаммы, то есть область, полностью отличную от гифомицетов, которые ранее применялись для проведения целевого превращения. Методики улучшения штамма и генетических манипуляций над штаммами бактерий, особенно включая виды Streptomyces, Bacillus и Pseudomonas, значительно проще и лучше разработаны по сравнению с грибками, такими как штаммы Cunninghamella. Более того, промышленная обработка ненитевидных микроорганизмов, включая ненитевидные грибки, дрожжи и эубактерии, позволяет применять множество дополнительных и более экономичных ферментеров и способов очистки по сравнению с теми, которые применяются только для гифомицетов.

Более того, множество микробных биокатализаторов применяются для превращения во множество структурных вариантов. Кроме того, идентификация разнообразных штаммов, обладающих генами и ферментами, полезными для такого превращения, является важной предпосылкой для применения современных методик молекулярной биологии для дальнейшей оптимизации микроорганизмов в качестве промышленных катализаторов для получения производных пиперидина.

Подробное раскрытие изобретения

Данное изобретение относится к получению целевого соединения, имеющего формулы IA и/или IB:

где

n означает 0 или 1;

R¹ является водородом или гидрокси;

R² является водородом;или если n означает 0, R¹ и R², взятые вместе, образуют вторую связь между атомами углерода, несущими R¹ и R², при условии, что если n означает 1, R¹ и R² каждый является водородом;

R³ является -СООН или -COOR⁴;

R⁴ является алкилом или арилом;

А, В и D являются заместителями на соответствующих кольцах, которые могут быть различными или одинаковыми, и которые выбирают из группы, включающей водород, галогены, алкил, гидрокси и алкокси.

Способ включает инкубирование исходного соединения, имеющего формулы IIA и/или IIB:

где R³* является -СН₃ и R¹, R², A, B и D такие, как определено выше, в присутствии микроорганизма в условиях, эффективных для получения целевого соединения. Микроорганизм может быть выбран из рода Streptomyces, Stemphylium, Gliocladium, Bacillus, Botrytis, Cyathus, Rhizopus, Pycniodosphora, Pseudomonas, Helicostylum, Aspergillus, Mucor, Gelasinospora, Rhodotorula, Candida, Mycobacterium или Penicillium.

Данное изобретение также относится к получению целевого соединения, имеющего структуру согласно формулам IA и/или IB, инкубированием исходного соединения, имеющего структуру согласно формулам IIA и/или IIB, в присутствии Cunninghamella bainieri в условиях, эффективных для получения целевого соединения.

Способ в соответствии с данным изобретением осуществляют в жидкой питательной среде. Состав подходящей питательной среды зависит от конкретного микроорганизма и цели и известен специалистам в данной области техники. В общем, питательная среда содержит источники углерода, такие как декстроза, сахароза, цитрат и/или крахмал, и источники азота, такие как соевая мука, дрожжевой экстракт, триптон, солодовый экстракт и/или ацетат аммония. Кроме того, питательная среда содержит неорганические соли, такие как фосфат натрия, фосфат калия, хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат кальция, карбонат кальция и/или сульфат магния, и микроэлементы, такие как соли железа, цинка, меди, молибдена, марганца или других металлов.

Микроорганизмы, применяемые в соответствии с данным изобретением, могут быть выбраны из следующих родов: Streptomyces, Stemphylium, Gliocladium, Bacillus, Botrytis, Cyathus, Rhizopus, Pycniodosphora, Pseudomonas, Helicostylum, Aspergillus, Mucor, Gelasinospora, Rhodotorula, Candida, Mycobacterium или Penicillium. Для рода Streptomyces подходящие виды включают Streptomyces catenulae, Streptomyces cavourensis, Streptomyces rimosus и Streptomyces griseus. Для рода Stemphylium подходящим видом является Stemphylium consortiale. Полезные виды Aspergillus включают Aspergillus aliaceus, Aspergillus carbonarium (Bainier) Thom, Aspergillus flavipes, Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceous и Aspergillus terricola. Для рода Gliocladium особенно полезным является вид Gliocladium deliquescens. Из рода Bacillus для осуществления способа в соответствии с данным изобретением могут применяться виды Bacillus cereus, Bacillus subtilis и Bacillus fusiformis. Подходящим видом Botrytis является Botrytis allii. Из рода Cyathus может применяться Cyathus striatus. Rhizopus oryzae является представителем рода Rhizopus, который может применяться в соответствии с данным изобретением. Полезные виды Pseudomonas включают Pseudomonas putida. Из рода Pycniodosphora могут применяться Pycniodosphora dispersa. Из рода Helicostylum для осуществления способа в соответствии с данным изобретением может применяться Helicostylum piriforme. Из рода Mucor для осуществления способа в соответствии с данным изобретением могут применяться Mucor circinelloides f. griseo-cyanus, Mucor recurvatus и Mucor mucedo. Вид Gelasinospora autosteria является представителем рода Gelasinospora, который подходит для осуществления способа в соответствии с данным изобретением. Из рода Rhodotorula может применяться вид Rhodotorula rubra. Из рода Penicillium в практике способа в соответствии с данным изобретением могут применяться виды Penicillium notatum и Penicillium chyrsogenum. Из рода Candida могут применяться виды Candida guilliermondii, Candida lipolytica и Candida parasilosis var. quercus. Подходящие виды Mycobacterium включают Mycobacterium bisrymcum.

Для каждого штамма данное изобретение относится к применению всего микроорганизма и его компонентов, включая, но, не ограничиваясь ими, экстракты клеток, микросомы, изолированные ферменты и гены, для хемо- и региоселективного окисления соединений формул IIA и/или IIB до продуктов формул IA и/или IB.

Более того, мутанты и селектанты микробов перечисленных родов и, особенно, конкретных штаммов, перечисленных выше, также подходят для применения в способе в соответствии с данным изобретением. Мутанты могут быть получены классическими методами мутагенеза для улучшения штамма, такими как неспецифический мутагенез, медиированный химическими средствами или электромагнитными волнами, или современными методами генетического манипулирования, такими как PCR с пронированным расхождением, мутагенез кодона или перестановка генов.

Другой аспект данного изобретения относится к применению видов Cunninghamella bainieri для осуществления способа в соответствии с данным изобретением.

Данное изобретение также относится к обнаружению и применению микроорганизмов рода Streptomyces, Gliocladium и Stemphyllium в качестве агентов для селективного окисления терфенадина (формулы IIA/IIB) до карбокситерфенадина (формулы IA/IB), превосходящих грибки рода Cunninghamella и Absidia.

Кроме того, микробные штаммы родов Botrytis, Rhizopus, Cyathus, Bacillus, Pycniodosphora, Pseudomonas, Helicostylum, Aspergillus, Gelasinospora, Rhodotorula, Penicillium и Candida также идентифицированы как окисляющие терфенадин до карбокситерфенадина с выходом более 3% без оптимизации. В предшествующих экспериментах Meiwes et al. идентифицировали только два штамма, которые дают выход 3% или более во время исходного скриннинга.

Более того, было обнаружено, что микроорганизмы из рода Ascoidia, Enterococcus, Fusidium, Lentinus, Lophotrichus, Mycobacterium, Polyporus, Spicaria и Trichophyton являются биокатализаторами, способными окислять терфенадин до карбокситерфенадина.

Все указанные микроорганизмы легко доступны из общедоступных коллекций культур. Конкретные виды и источники микробных культур описаны в приведенных ниже примерах.

Микробные культуры, применяемые в соответствии с данным изобретением, могут храниться с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как в твердой среде, консервация в минеральном масле и лиофилизация или заморозка.

Микробные культуры могут храниться в подходящей твердой среде, такой как 30 грамм/литр бульона сабурад декстрозы и 20 грамм/литр агара. Предпочтительно, для некоторых штаммов получение инокулята, включающее криоконсервацию при низкой температуре и оттаивание (т.е. методику "Cryoready"), служит для улучшения подхода к превращению исходного материала в продукт пиперидина в соответствии с данным изобретением тем, что уменьшает время получения подходящего инокулята и повышает выход продукта пиперидина. После выращивания культуры в подходящей жидкой среде микробную суспензию центрифугируют, отработавшую жидкую среду удаляют и концентрированный осадок клеток в пробирке повторно суспендируют в равном объеме стерильного 20% глицеринового исходного раствора и свежего бульона с получением суспензии клеток в 10% глицерине.

Из твердой среды микроорганизмы сначала разводят в одну или несколько стадий в нейтральной среде жидкой культуры, подходящей для роста конкретных штаммов (например, методика "Multistage"). Типовая среда для исходного разведения содержит 20 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л соевой муки, 5 г/л NaCl и 5 г/л K₂HPO₄. Исходную фазу микробных культур инкубируют при 29°С и 250 об/мин в течение 48-72 часов. Дальнейшие стадии инокулируют тяжелым инокулятом (1-20% об/об, особенно 10% об/об микробной суспензии жидкой культуры с предыдущей стадии в свежей жидкой среде).

Для проведения реакционной стадии тяжелый инокулят (1-20% об/об, особенно, 10% об/об) микробной суспензии или оттаявших криоконсервированных клеток инокулируют в свежую среду. Микроорганизмы культивируют при температурах от примерно 20°С до 80°С, предпочтительно от 25°С до 37°С, и рН от 4 до 9, особенно при рН от 5 до 8, в зависимости от конкретного микроорганизма, применяемого для превращения. Инкубирование микроорганизмов проводят в течение 2-240 часов, предпочтительно от 75 до 170 часов. Реакцию проводят аэробно, сначала параллельно, в многоячеечных реакционных камерах, в которые непрерывно подают воздух или обогащенный кислород, и перемешивают. Следовательно, подобным методом ферментация может проводиться в промышленных масштабах во встряхиваемых колбах и затем в ферментерах при перемешивании и аэрации.

Добавление исходного материала к микробной культуре проводят в течение 0-72 часов инокуляции реакционной среды полученным инокулятом, предпочтительно после приблизительно 8-48 часов и особенно предпочтительно после 24 часов инкубации. Добавление исходного материала наиболее целесообразно проводить из раствора в подходящем органическим растворителе, но он также может быть добавлен в виде твердого порошка или в виде суспензии. Из раствора исходный материал наиболее предпочтительно добавляют в диметилформамиде (ДМФ), но также можно в этаноле, диметилсульфоксиде (ДМСО), диметилацетамиде (ДМА), ацетонитриле, тетрагидрофуране (ТГФ) и формамиде (например, дибутил-, диизопропил- или диэтил-), пирролидоне (например, 1-метил-, 1-этил-, 1-циклогексил-), 4-формилморфолине, 1-формилпиперидине, 1-формилпирролидине, тетраметил-, тетраэтил-, тетрабутилмочевине, фосфиноксиде (например, трипиперидино- или трипирролидино-), сульфолане, N-метилкапролактаме или их смесях. К реакционной среде, содержащей микроорганизм, также могут быть добавлены биосовместимые органические солюбилизаторы, такие как циклодекстрины или поверхностно-активные вещества (например, Tween 80 или Pluronic F38).

Соединения формул IA и/или IB могут быть выделены непосредственно из микробного бульона или из очищенной жидкости после отделения клеток, например, центрифугированием или фильтрацией. Данные продукты могут быть выделены экстракцией органическими растворителями или адсорбцией на гидрофобных смолах или ионообменниках.

В дополнительных вариантах данного изобретения могут применяться микроорганизмы и стандартные методики и обычные методы инкубации микроорганизмов и проведения реакций, как описано в общедоступных руководствах. Например, методы описанные Demain, A. L. and J. E. Davies, в Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2^nd Ed. (1999) и Crueger, W. and A. Crueger, в Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology (1984), применяются для получения культур и осуществления способа в соответствии с данным изобретением.

Особое значение имеют соединения формул IIIA и/или IIIB:

где R¹, R², R³, A, B и D такие, как определено выше. Среди данных соединений особо предпочтительной является 4-(4-(4-гидроксидифенил)-1-пиперидинил)-1-гидроксибутил)-α,α-диметилфенилуксусная кислота.

Другим предпочтительным видом соединений являются соединения формул IVA и/или IVB:

где R¹, R², R³, A, B и D такие, как определено выше. Среди данных соединений особо предпочтительной является 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]оксобутил]-α,α-диметилфенилуксусная кислота.

Данное изобретение также относится к способу получения дополнительных аналогов формул IA и/или IB, исходя из соединений формул IIA и/или IIB с микроорганизмами в соответствии с данным изобретением.

Другими иллюстративными примерами соединений, полученных способом в соответствии с данным изобретением, являются:

4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметилен)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-3-гидроксибензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-2-гидроксибензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметилен)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-3-гидроксибензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметилен)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолуксусная кислота;

этил 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат;

н-пентил 4-[4-[4-(дифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат;

этил 4-[4-[4-(дифенилметилен)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат;

метил 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат;

этил 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-(3-гидроксибензол)ацетат;

н-пропил 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-(2-гидроксибензол)ацетат;

н-гексил 4-[4-[4-(дифенилметилен)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-(3-гидроксибензол)ацетат;

этил 4-[4-[4-(дифенилметилен)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат;

4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-3-гидроксибензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-2-гидроксибензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-3-гидроксибензолуксусная кислота;

4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолуксусная кислота;

н-пентил 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат;

этил 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат;

этил 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-(3-гидроксибензол)ацетат;

н-пропил 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-(2-гидроксибензол)ацетат;

н-гексил 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметил-(3-гидроксибензол)ацетат и

этил 4-[4-[4-(дифенилметокси)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилбензолацетат.

Данное изобретение также относится к способу получения дополнительных аналогов соединений формул IA и/или IB, исходя из соединений формул IIA и/или IIB с микроорганизмами, применяемым в соответствии со способом данного изобретения (или практически эквивалентным способом), описанным в данном описании.

Особо предпочтительными являются соединениями формул:

и

Необязательно обе дифенильные группы пиперидина могут быть замещены алкилом (например, метилом) в пара-положении к метилену, например,

или

Соединения, полученные способами в соответствии с данным изобретением, могут быть фармацевтически приемлемыми солями, в виде неорганических и органических кислотных или основных аддитивных солей, указанных выше соединений. Подходящие неорганические кислоты включают, например, хлористоводородную, бромистоводородную, серную и фосфорную кислоты. Подходящие органические кислоты включают карбоновые кислоты, такие как уксусная, пропионовая, гликолевая, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, цикламиновая, аскорбиновая, малеиновая, гидроксималеиновая, дигидроксималеиновая, бензойная, фенилуксусная, 4-аминобензойная, антраниловая, коричная, салициловая, 4-аминосалициловая, 2-феноксибензойная, 2-ацетоксибензойная и миндальная кислоты. Также подходящими кислотами являются сульфокислоты, такие как метансульфоновая, этансульфоновая и β-гидроксиэтансульфоновая кислоты. Нетоксичные соли соединений указанных выше формул, образованные с неорганическими и органическими основаниями включают, например, соли щелочных металлов, таких как натрий, калий и литий, соли щелочноземельных металлов, например, кальция и магния, соли легких металлов, например, алюминия, соли органических аминов, таких как первичные, вторичные или третичные амины, например, циклогексиламин, этиламин, пиридин, метиламиноэтанол и пиперазин. Данные соли получают обычными способами, например, обработкой производных пиперидина формулы IA и/или IB:

где A, B, D, n, R¹, R² и R³ такие, как определено выше, подходящей кислотой или основанием.

Производные пиперидина, полученные способами в соответствии с данным изобретением, могут применяться в качестве биологически активных соединений в фармацевтических композициях. Данные соединения полезны в качестве антигистаминных средств, противоаллергических агентов и бронходилататоров. Они могут вводиться в чистом виде или с подходящими фармацевтическими носителями и могут быть в твердой или жидкой форме, например в виде таблеток, капсул, порошков, растворов, суспензий или эмульсий.

Соединения, полученные способами в соответствии с данным изобретением, могут вводиться перорально, парентерально, например подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, с помощью внутриносового инстиллятора или нанесением на слизистые оболочки, такие как слизистые носа, горла и бронхиол. Нанесение на слизистые оболочки может проводиться с помощью аэрозольного спрея, содержащего небольшие частицы соединения в соответствии с данным изобретением в виде капель или сухого порошка.

Количество вводимого соединения зависит от пациента и способа введения и может быть любым эффективным количеством. Количество вводимого соединения может варьироваться в широком диапазоне с получением единичной дозы с эффективным количеством от 0,01 до 20 мг/кг массы тела пациента в день, для достижения желаемого эффекта. Например, желательное антигистаминное, противоаллергическое и бронходилататорное действие может быть достигнуто с помощью единичной дозированной формы, такой как таблетка, содержащей 1-50 мг соединения в соответствии с данным изобретением, принимаемой 1-4 раза в день.

Твердые единичные дозированные формы могут быть обычного типа. Такая твердая форма может быть в виде капсул, таких как обычные желатиновые капсулы, содержащие соединение в соответствии с данным изобретением и носитель, например лубриканты и инертные наполнители, такие как лактоза, сахароза или кукурузный крахмал. В другом варианте данные соединения формуют в таблетки с обычными основами для таблеток, такими как лактоза, сахароза или кукурузный крахмал, в сочетании со связующими агентами, такими как аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин, дезинтегрантами, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или альгиновая кислота, и лубрикантом, таким как стеариновая кислота или стеарат магния.

Соединения, полученные в соответствии с данным изобретением, также могут вводиться в виде дозированных форм для инъекций в виде растворов или суспензий соединений в соответствии с данным изобретением в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем. Такие носители включают стерильные жидкости, такие как вода или масла, с или без добавления поверхностно-активного вещества и других фармацевтически приемлемых адъювантов. Иллюстративные масла включают масла нефтехимического, животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло или минеральное масло. В основном, вода, физиологический раствор, водная декстроза и растворы родственных сахаров, и гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями, особенно для инъецируемых растворов.

Для применения в качестве аэрозолей соединения в растворе или суспензии могут быть упакованы в аэрозольный контейнер под давлением вместе с подходящими пропеллентами, например углеводородными пропеллентами, такими как пропан, бутан или изобутан, с обычными адъювантами. Данные соединения могут вводиться в форме, не находящейся под давлением, такой как распылитель или пульверизатор.

Соединения, полученные в соответствии с данным изобретением, могут применяться для лечения теплокровных животных, птиц и млекопитающих. Примеры таких созданий включают человека, кошек, собак, лошадей, овец, коров, свиней, ягнят, крыс, мышей и морских свинок.

Следующие примеры являются иллюстративными и не ограничивают данное изобретение.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 - Скрининг эффективных микробных штаммов для трансформации

Микробные культуры для реакций инокулируют по описанным выше методикам, такие культуры описаны в таблице 2. Реакционный инокулят получают для каждого микроорганизма, перечисленного в таблице 2, следующим образом: 2,5 мл каждого инокулята добавляют к 22,5 мл среды в 125 мл колбе Делонга и инкубируют на орбитальном смесителе в течение 24 часов при 29°С и 225 оборотах в минуту (об/мин). По прошествии указанного времени рН каждой культуры регистрируют и 0,5 мл культуры переносят в отдельные лунки 48-луночного полипропиленового планшета стандартного формата (номинальный объем 5 мл/лунка), покрытого стекловатой, марлей, покрытым тефлоном полотном или другим подходящим проницаемым для газов барьером, и реакцию инициируют добавлением 5 мкл 25 г/л исходного раствора кислотного метаболита терфенадина в ДМФ (конечная реакционная концентрация 250 мг/л). Реакционные планшеты инкубируют при 29°С и 225 об/мин внутри инкубационных камер с контролируемой атмосферой и в камеры при 1 см³/мин подают газ, содержащий 95% кислорода и 5% СО₂, насыщенный водой в камере для увлажнения опрыскиванием.

Аликвоты образцов собирают из всех культур в моменты реакции между 2 и 168 часами. К 100 мкл реакционного образца, перенесенным в соответствующие лунки чистого многолуночного планшета, добавляют 100 мкл ацетонитрила и планшет вращают в течение 1 минуты. В каждую лунку добавляют 250 мкл этилацетата и планшеты вращают, затем обрабатывают ультразвуком в течение 4 минут. Планшеты центрифугируют при 3500 об/мин в течение 5 минут и 200 мкл полученной органической фазы переносят в соответствующие лунки 96-луночного планшета. Эктрагирование этилацетатом повторяют второй раз на реакционном образце и органические фазы объединяют и сушат в вакууме без нагревания. Полученный остаток повторно растворяют в 150 мкл ДМФ.

Образцы анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с масс-спектрометрией с химической ионизацией при атмосферном давлении (МС-ХИАД, APCI-MS) на 5 мкм колонке Luna C8(2) (500 мм длина х 2,0 мм диаметр) производства Phenomenex (таблица 1).

Таблица 1
Стадия	Т. время (мин)	Длительность (мин)	Поток (мкл/мин)	Градиент	Растворитель А	Растворитель В
0	-0,10	0,10	1000	0	90%	10%
1	0,00	0,50	1000	0	90%	10%
2	0,50	2,50	1000	1	40%	60%
3	3,00	2,00	1000	1	0%	100%
4	5,00	1,00	1000	1	0%	100%
5	6,00	0,50	1000	1	90%	10%
6	6,50	0,40	1000	0	90%	10%
7	6,90	0,10	1000	0	90%	10%
Растворитель: А = вода + 0,4% уксусная кислота В = ацетонитрил + 0,4% уксусная кислота Градиент: 0 = ступенчатый градиент; 1 = линейный градиент Определители: УФ при 230 нм вместе с МС-МС-ХИАД (APCI-MS-MS) (Triple Quadripole Mass Spectrometer, модель API 2000 от Perkin-Elmer Sciex)

Выход рассчитывают из показателей интегрирования площади для каждого хроматографического пика, соответствующего определенному молекулярному иону при положительной ионизации МС-ХИАД. Молекулярные ионы для терфенадина (соединение 1) и кислотного метаболита терфенадина (соединения 2) показаны в таблице 2. Ответные факторы кислотного метаболита терфенадина приняты идентичными показателям самого терфенадина.

В таблице 2 показано, что превращение вплоть до 54% терфенадина в кислотный метаболит терфенадина может быть достигнуто с помощью некоторых исследуемых штаммов.

Таблица 2 Катализаторы для окисления терфенадина до кислотного метаболита терфенадина (КМТ)
Биокатализатор	№ коллекции культурA-D	Тип штамма	Получение биокатализатораЕ	рН культуры	Получение КМТ через 6 дней
Streptomyces rimosus	NRRL-2234	грам+	multistage	5	54%
Stempliylium consortiale	UI-4136	грибки	multistage	7	50%
Gliocladium deliquescens	NRRL-1086	грибки	cryoready	7	39%
Cunninghamella bainieri	SC-3065	грибки	cryoready	7	27%
Bacillus cereus	UI-1477	грам+	cryoready	7	25%
Cunninghamella bainieri	SC-3065	грибки	multistage	7	18%
Botrytis allii	NRRL-2502	грибки	multistage	5	18%
Cyathus striatus	MR-356	грибки	multistage	5	11%
Streptomyces rimosus	NRRL-2234	грам+	cryoready	5	11%
Rhizopus sp.	MR-224	грибки	multistage	5	10%
Pycniodosphora dispersa	MR-346	грибки	multistage	7	10%
Absidia spinosa var. biappendiculata	MR-7600	грибки	multistage	7	9%
Rhizopus oryzae	MR-RO	грибки	cryoready	6	8%
Cunninghamella echinulata	NRRL-1386	грибки	multistage	7	8%
Cunninghamella echinulata	NRRL-3655	грибки	multistage	5	8%
Gliocladium deliquescens	NRRL-1086	грибки	multistage	7	7%
Pseudomonas sp	DG-9816	грам-	multistage	7	6%
Helicostylum piriforme	QM-6945	грибки	cryoready	7	5%
Aspergillus flavipes	ATCC-1030	грибки	multistage	7	4%
Mucor circmelloides f griseo-cyanus	IFO-4563	грибки	multistage	7	4%
Gelasinospora autosteria	MR-GA	грибки	multistage	6	3%
Bacillus fusiformis	ATCC-7055	грам+		8	3%
Streptomyces griseus	mutant of ATCC-13273	грам+	multistage	5	3%
Rhodotorula rubra	ATCC-36994	дрожжи	cryoready	7	3%
Cunninghamella echinulata	(+)	грибки	cryoready	6	3%
Cunninghamella echinulata		грибки	cryoready	7	3%
Mucor mucedo	ATCC-7941	грибки	multistage	7	3%
Pennicillium chrysogenum	UI-251	грибки	cryoready	7	3%
Candida parasilosis var quercus	ATCC-56466	дрожжи	multistage	7	3%
Streptomyces gliseus	10137-ATCC	грам+	cryoready	7	2%
Bacillus cereus	14591-NRRL-B	грам+	cryoready	7	2%
Streptomyces cavourensis	27732-ATCC	грам+	cryoready	7	2%
Mucor recurvatus	36-MR	грибки	cryoready	7	2%
Pennicillium notatum	36740-ATCC	грибки	cryoready	7	2%
Aspergillus carbonarium (Bainier) Thorn	6277-ATCC	грибки	cryoready	5	2%
Candida lipolytica	8661-UI	дрожжи	cryoready	4	2%
Ascoidia	MR-Asc	грибки	multistage	7	2%
Lentinus lepidius	MR-LL	грибки	multistage	7	2%
Pseudomonas putida (Whiled)	9866-NCIMB	бактерии	cryoready	6	2%
Trichophyton gallinae	1210-MR	грибки	cryoready	7	1%
Streptomyces griseus	13968-ATCC	грам+	cryoready	7	1%
Lophotrichus martinii	177-MR	грибки	cryoready	7	1%
Penicilliun notatum	18233-ATCC	грибки	cryoready	7	1%
Aspergillus ochraceous	18500-ATCC	грибки	cryoready	6	1%
Streptomyces catenulae	23893-ATCC	грам+	cryoready	7	1%
Bacillus subtilis	2485-UI	грам+	cryoready	7	1%
Aspergillus alliaceus	315-UI	грибки	cryoready	7	1%
Mycobacterium sp.	3683-NRRL	грибки	cryoready	7	1%
Spicaria violacea	3702-MR	грибки	cryoready	7	1%
Mycobacterium bisrymcum	463-AM	грибки	cryoready	7	1%
Aspergillus fumigatus	51-MR	грибки	cryoready	7	1%
Candida lipolytica	746-IFO	дрожжи	cryoready	4	1%
Polyporus anceps	784-F-S	грибки	cryoready	7	1%
Candida guilliermondii	9058-UI	дрожжи	cryoready	6	1%
Cunninghamella elegans	9245-ATCC	грибки	cryoready	7	1%
Pseudomonas sp (naphthalene дикого типа)	9816-DG	грам-	cryoready	7	1%
Aspergillus terricola	MR-At	грибки	cryoready	7	1%
Hansends cadaver yeast	MR-Hans	дрожжи	cryoready	7	1%
Pseudomonas putida (Trevisan), рода toluene	33015-ATCC	бактерии	cryoready	5	1%
Fusidium coccineum	14700-ATCC	грибки	cryoready	7	1%
Enterococcus faecium	51558-ATCC	бактерии	cryoready	4	1%
Streptomyces griseus мутант	13273-ASFZ	бактерии	cryoready	7	1%
Streptomyces griseus мутант	13273-#11	бактерии	cryoready	6	1%

^ААТСС = Американская коллекция типов культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209

^ВDSM = Deutsche Samlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток), Grisebachstrasse, 8, D-34 Goettingen, Braunschweig, Germany

^CUI, SC, MR, DG и QM = Коллекция культур университета Айовы, Iowa City IA, 52240

^DNRRL = Служба сельскохозяйственных исследований USDA, 1815 N. University Ave. Peoria IL, 60604

^ЕОбозначения "multistage" и "cryoready" относятся к определенным способам, применяемым в определенном примере для получения микробного инокулята для реакции. Подробное описание каждого способа дано в разделе "Описание изобретения" данного описания.

Пример 2

25 мл среды на основе соевой муки в 125 мл колбе Делонга инокулируют Streptomyces rimosus (NRRL-2234), полученным из твердой культуры на скошенном агаре, как описано в примере 1. После инкубации при 29°С и 225 об/мин в течение 24 ч 500 мкл раствора культуры (рН 5,0) переносят в лунки 48-луночного глубокого планшета и к культуре добавляют 125 мкг терфенадина, растворенного в 5 мкл ДМФ. После дальнейшей культивации в инкубационной камере при 29°С в течение 7 дней полученный микробный бульон экстрагируют ацетонитрилом и этилацетатом. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и затем растворитель удаляют. Остаток повторно растворяют в ДМФ и анализируют с помощью ВЭЖХ-МС (HPLC-MS). Интегрирование показывает, что 76% выделенного материала составляет КМТ.

Пример 3

Как описано выше, 2,5 мл замороженной культуры Gliocladium deliquescens культивируют в 25 мл культуральной среды при рН 7 в течение 24 часов. 500 мкл жидкой культуры переносят в лунки 48-луночного глубокого планшета и к культуре добавляют 125 мкг терфенадина, растворенного в 5 мкл ДМФ, и инкубируют при 29°С в течение 1 недели в инкубационной камере. Выделение продукта и анализ показывают, что выход составляет 39% КМТ.

Пример 4

Как описано в примере 2, 125 мкл терфенадина, растворенного в 50 мл ДМФ, добавляют к 500 мкл раствора культуры Stemphylium Consortiale (4136-UI) в реакторе с многолуночным планшетом. Выделение продукта и анализ показывают, что выход составляет 50% КМТ.

Пример 5

Двухнедельную культуру Streptomyces rimosus (АТСС-14673) в твердом агаре инокулируют в 25 мл соевой среды в 125 мл колбе Делонга в течение 72 часов при 29°С и 225 об/мин. 2,5 мл полученной жидкой культуры переносят в 22,5 мл среды на основе соевой муки при рН 5 и культивируют при 29°С, 225 об/мин в течение 24 часов. К культуре добавляют 12,5 мг терфенадина, растворенного в 250 мкл ДМФ, и инкубируют в течение 1 недели. Выделение продукта и анализ показывают, что выход в соответствии с методикой примера 2 составляет 72% КМТ.

Хотя данное изобретение подробно описано для иллюстрации, понятно, что такое подробное описание дано только для данной цели и специалистами в данной области техники могут быть проведены вариации, которые не выходят за объем и сущность данного изобретения, которое определено формулой изобретения.

1. Способ получения 4-[4-[4-(гидроксидифенилметил)-1-пиперидинил]-1-гидроксибутил]-α,α-диметилфенилуксусной кислоты, где указанный способ включает: инкубирование 1-(п-трет-бутилфенил)-4-[4'-(α-гидроксидифенил-метил)-1'-пиперидинил]бутанола в присутствии микроорганизма в условиях, эффективных для получения целевого соединения, где микроорганизм выбирают из группы, включающей Stemphylium consortiale, Gliocladium deliquescens, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus fusiformis, Botrytis allii, Cyathus striatus, Rhizopus oryzae, Pycniodosphora dispersa, Pseudomonas putida, Helicostylum piriforme, Mucor circmelloides f. griseo-cyanus, Mucor recurvatus, Mucor mucedo, Gelasinospora autosteria, Rhodotorula rubra, Mycobacterium bisrymcum, Candida guilliermondii, Candida lipolytica, Candida parasilosis var. quercus, Penicillium notatum и Penicillum chrysogenum.

2. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Stemphylium consortiale.

3. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Gliocladium deliquescens.

4. Способ по п.1, в котором микроорганизм выбирают из группы Bacillus cereus, Bacillus subtilis. Bacillus fusiformis.

5. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Botrytis allii.

6. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Cyathus striatus.

7. Способ по п.6, в котором микроорганизм представляет собой Rhizopus oryzae.

8. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Pycniodosphora dispersa.

9. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Pseudomonas putida.

10. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Helicostylum piriforme.

11. Способ по п.1, в котором микроорганизм выбирают из группы, включающей Mucor circinelloides f. griseo-cyanus, Mucor recurvatus и Mucor mucedo.

12. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Gelasinospora autosteria.

13. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Rhodotorula rubra.

14. Способ по п.1, в котором микроорганизм представляет собой Mycobacterium bisrymcum.

15. Способ по п.1, в котором микроорганизм выбирают из группы, включающей Candida guilliermondii, Candida lipolytica, Candida parasilosis var. quercus.

16. Способ по п.1, в котором микроорганизм выбирают из группы, включающей Penicillium notatum и Penicillum chrysogenum.

17. Способ по п.1, в котором указанное инкубирование проводят при температуре от 20 до 80°С.

18. Способ по п.1, в котором указанное инкубирование проводят при рН от 4 до 9.

19. Способ по п.1, в котором указанное инкубирование проводят в течение от 2 до 240 ч.

20. Способ по п.1, в котором перед указанным инкубированием микроорганизм подвергают криоконсервированию или многостадийной индукции в жидкой культуре.