Криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов при низкой температуре

Изобретение относится к области медицины, в частности к криобиологии. Раствор содержит гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, диметилсульфоксид, оксиметилэтилпиридина сукцинат и воду при определенном соотношении компонентов, замораживают лейкоциты при минус 70°С. Изобретение обеспечивает получение раствора для хранения физиологически полноценных клеток, сохранения их в физиологически активном состоянии после оттаивания. 3 табл.

 

Изобретение относится к криобиологии и медицине, а именно к созданию криопротекторного раствора для замораживания лейкоцитов, в частности, человека.

В качестве прототипа нами выбран криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов [Патент 2184449 РФ. Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умереннонизкой температуре // Сведенцов Е.П. и соавт., 2001], включающий гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, фумарат натрия, лимонную кислоту и воду.

Существенным недостатком прототипа является то, что данный раствор не применяется для замораживания лейкоцитов при низкой температуре (-70°С), не содержит оптимального состава сильных криопротекторов ГМБТОЭМ и ДМСО (последний в прототипе отсутствует), которые стабилизируют внеклеточную, а также свободную и связанную внутриклеточную воду при охлаждении и переводят ее в аморфный лед, не разрушающий внутриклеточные органеллы и плазматическую мембрану, и устраняют его рекристаллизацию - образование крупных кристаллов (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994) при оттаивании, обеспечивая высокую сохранность и функционально активное состояние ядросодержащих клеток крови.

В криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов при низкой температуре, содержащий криопротекторы - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (кратко ГМБТОЭМ) и диметилсульфоксид (кратко ДМСО) - впервые включено отечественное вещество - оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающее, кроме антиоксидантного, мембраностабилизирующим действием, восстанавливающее нарушенные структуры и функции мембран клеток, а также тормозящее процессы перекисного окисления липидов, которые имеют место при криоконсервировании. Надо отметить, что сукцинат - производное янтарной кислоты (Несмеянов А.Н., Несмеянов Н.А. Начало органической химии. Книга 1. - М.: Химия, 1974. - с.314-315, с.436-437) - участвует в энергетическом обмене клетки, обеспечивающем ее жизнедеятельность, а пиридин в нуклеиновом обмене (Герман А.С. Пиридин. Большая медицинская энциклопедия. - М.; 1981. - Т.17. - с.1054-1055). Хладоограждающий раствор имеет оптимальный для лейкоцитарных клеток рН среды 7,0-7,4. Все ингредиенты, примененные в данном растворе, производятся в Российской Федерации.

Пример использования средства

Криопротекторный раствор, содержащий ГМБТОЭМ в концентрации 22%, ДМСО 8%, оксиметилэтилпиридина сукцинат 0,2%, воду для инъекций до 100 мл и имеющий рН 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 8 мин при комнатной температуре, охлаждают по экспоненциальной программе в электрическом морозильнике в 4-литровой ванне с этиловым 96° спиртом до -27°С в течение 19-20 минут. Затем замороженный лейкоконцентрат переносят в камеру электроморозильника, имеющую температуру -70°С. Термограмму записывают по термопаре, введенной в контейнер «Компопласт» с криопротекторным раствором в конечной концентрации. Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 30-45 секунд при покачивании контейнера 3-4 раза в сек. Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2-+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - № 9. - с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ГУ Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

Изучены три варианта криопротекторного раствора для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов раствора представлен в таблице 1.

Таблица 1 Характеристика состава различных вариантов хладоограждающего раствора для замораживания лейкоцитов при низкой температуре, в расчете на 100 г сухого вещества (г).
Номер варианта хладоограждающего раствора	Состав хладоограждающего раствора
ГМБТОЭМ, в %	ДМСО, в %	ОМЭПС, в %	Вода для инъекций, в мл.
1	24	6	0.30	До 100
2	22	8	0.20	До 100
3	20	10	0.10	До 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав растворов N1, N2 и N3 после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом, оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.

Таблица 2. Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах хладоограждающего раствора после смешивания с лейкоцитным концентратом.
Номер варианта хладоограждающего раствора	Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах хладоограждающего раствора после смешивания с лейковзвесью
ГМБТОЭМ, в %	ДМСО, в %	ОМЭПС, в %	Вода для инъекций, в мл.
1	12	3	0.15	До 200
2	11	4	0.10	До 200
3	10	5	0.05	До 200

Охлаждение производят по экспоненциальной программе: погружают пластикатный контейнер с лейкоконцентратом в 4-литровую спиртовую ванну, охлажденную до -70°С, через 19-20 минут контейнер с замороженным биообъектом извлекают из ванны и переносят в камеру электроморозильника с температурой -70°С для хранения. Контроль замораживания производят по термограмме, записываемой по датчику, находящемуся в контейнере с имитатором-раствором криоконсерванта с конечной концентрацией его ингредиентов. Размораживание осуществляют в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 30-45 сек, покачивая контейнер 3-4 раза в сек. Отогревают лейкоконцентрат до +2°С - +4°С. Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (табл.3).

Таблица 3. Результаты после замораживания до -70°С и оттаивания лейкоцитов с различными вариантами предложенного хладоограждающего раствора
Вариант хладоограждающего раствора	Жизнеспособность лейкоцитов
Морфологическая сохранность, %	Фагоцитарная активность нейтрофилов, %
Верхний предел дозировок ингредиентов раствора	82,8±13,41	55,0±7,21*
n=6	n=6
Оптимальное соотношение ингредиентов раствора	94,5±6,89	75,5±8,50
n=6	n=6
Нижний предел дозировок ингредиентов раствора	68,2±18,34	57,0±4,00*
n=6	n=6
* - различие достоверное (р<0,05)

Биологическую полноценность лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, определяет их фагоцитарная активность. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после замораживания-отогрева при использовании хладоограждающего раствора с оптимальным соотношением его ингредиентов.

Готовый оптимальный раствор прозрачен, с легким желтоватым оттенком, без запаха, рН=7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Раствор проявляет выраженное хладоограждающее свойство при охлаждении лейкоцитов по экспоненциальной программе с +20°С до -70°С.

Таким образом, разработанный криопротекторный раствор при замораживании лейкоконцентрата до -70°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных лейкоцитарных клеток. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля, где имеется необходимое холодильное оборудование.

Криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов, содержащий гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, оксиметилэтилпиридина сукцинат и воду для инъекций, отличающийся тем, что замораживают лейкоциты до -70°С, а раствор дополнительно содержит диметилсульфоксид, при следующем соотношении ингредиентов, %:

Гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина	20,0-24,0
Диметилсульфоксид	6,0-10,0
Оксиметилэтилпиридина сукцинат	0,3-0,1
Вода для инъекций	до 100 мл