Консервант для хранения микроорганизмов

Изобретение относится к микробиологии, в частности к области хранения микроорганизмов. Поставленная задача решается тем, что в качестве консерванта для хранения бактерий используют 5-гидрокси-5-метил-3-(3-нитрофенил)-2,4-диэтоксикарбонил-N(фенил)-1-циклогексениламин (енамин (А)). Техническим результатом является увеличение продолжительности хранения культур при сохранении их жизнеспособности.

 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к хранению микроорганизмов, и может быть использовано в научной и практической медицине, в биотехнологии и пищевой промышленности для хранения штаммов - продуцентов различных веществ.

Известны составы сред, применяемые при консервировании микроорганизмов. Среда "Mist, dissicans" (Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы. - М.: Мир, 1975, 423 с.), содержащая 7,5% глюкозы, 3 ч. нормальной лошадиной сыворотки и 1 ч. бульона.

Недостатком данной среды следует признать отсутствие стандартности ее приготовления в силу присутствия в ней лошадиной сыворотки и бульона, приготовленного из сырья различного качества,

Сахарозожелатиновая среда (Данилова М.В., Надирова И.М., Кудрявцев В.И. Лиофилизация бактерий. В кн,: Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. - М.: Наука, 1967, с.131), содержащая 10% сахарозы и 0,1% агара в 1,5% желатине.

Недостатком данной среды является невозможность хранения различных бактериальных штаммов в течение длительного времени.

Известны защитные среды (патенты РФ №2088657, МПК C 12 N 1/04; №2045573, МПК C 12 N 1/04; №2041942, МПК C 12 N 1/04), используемые для лиофилизации штаммов различной родовой и видовой принадлежности. Проведенные исследования показали, что высокие защитные свойства указанных сред в основном обусловлены высокой антиокислительной активностью входящих в них веществ. Например, 2,4-Дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин (Пат. №2045573) имеет антиокислительную активность 3.06, 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)- циклогександион-1,3 (Пат. №2041942) - 2.77.

Наиболее близким к предлагаемому решению является изобретение по пат. РФ №2041942.

Недостатком указанных выше компонентов является неудобство методики их получения, в частности нагревание в запаянной ампуле при синтезе 7,7-диметил-2-фенил-4-(4-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина и 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина.

Задачей настоящего изобретения является использование в качестве консерванта вещества с высокой антиокислительной активностью, расширение круга антиоксидантных компонентов для средств защиты микроорганизмов, упрощение и удешевление методики их получения. Техническим результатом является увеличение продолжительности хранения культур при сохранении жизнеспособности.

Поставленная задача решается тем, что в качестве консерванта для хранения бактерий используют 5-гидрокси-5-метил-3-(3-нитрофенил)-2,4-диэтоксикарбонил-N(фенил)-1-циклогексениламин (енамин (А)).

Неизвестны факты пригодности енамина как компонента защитной среды. По сравнению с известными компонентами для средств защиты микроорганизмов (7,7-диметил-2-фенил-4-(4-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин, 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин) предложенное соединение может быть получено по более простой методике и содержит структурные фрагменты, предопределяющие высокие антиоксидантные свойства, в частности N-ариленаминный фрагмент, гидроксильную группу. Так, антиокислительная активность енамина, измеренная хемилюминесцентным методом, составляет 2.57 (в аналогах 2.41 и 3.06), что позволяет предложить это соединение в качестве компонента для средств защиты микроорганизмов.

В научной, патентной литературе отсутствуют данные о подобных составах для хранения бактерий. Неизвестны факты пригодности енамина (А) как консерванта (компонента криопротекторной среды). Это не только неочевидное, более того - неожиданное свойство данного соединения. Увеличение срока хранения бактерий до 3,85-16 лет обусловило положительный эффект изобретения.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения.

Заявляемый состав для хранения бактерий приготавливают следующим образом (расчет на 1 л воды). 0,1-1 г агара-агара замачивают в 0,7 л дистиллированной воды, ставят на огонь, при постоянном помешивании добавляют предварительно замоченный разбухший желатин (7-50 г). После растворения желатина добавляют сахарозу (10-100 г), доводят до кипения. Снимают с огня и доводят объем до 1 л дистиллированной водой, фильтруют, разливают в посуду и стерилизуют при 110°С 30 мин. Затем в полученную смесь вводят енамин (А), растворенный в одном из указанных растворителей (диметилсульфооксиде, этаноле).

Енамин (А) получен путем ариламинирования 5-гидрокси-5-метил-3-(3-нитрофенил)-2,4-диэтоксикарбонилциклогексанона под действием анилина (выход продукта составляет 68%) [Кривенько А.П., Голиков А.Г., Григорьев А.В., Сорокин В.В. Внутримолекулярная водородная связь в ряду замещенных циклогексанолонов и их азотсодержащих производных // ЖОрХ. 2000. Т.36. Вып.8. С.1152-1155.]. Состав и строение полученного енамина (А) было подтверждено данными элементного анализа и ИК-спектроскопии. Образец соединения, используемого в данных исследованиях, был идентифицирован по температуре плавления пробы смешения с образцом полученным впервые нами ранее [Кривенько А.П., Голиков А.Г., Григорьев А.В., Сорокин В.В. Внутримолекулярная водородная связь в ряду замещенных циклогексанолонов и их азотсодержащих производных // ЖОрХ. 2000. Т.36. Вып.8. C.1152-1155].

Были приготовлены следующий состав для хранения бактерий, содержащий водный раствор защитной белковой среды и енамин в качестве консерванта, мас.%:

Защитная белковая среда	0,1-3,0
Енамин (А)	0,001-0,1
Растворитель енамина (А)	0.1-10
Вода	Остальное.

В качестве защитной белковой среды могут использованы желатин и агар-агар.

В качестве растворителя енамина (А) может быть использован диметилсульфоксид или этанол.

В качестве стабилизатора состава может быть добавлена сахароза в количестве 1-10 мас.% .

Пример 1. Изучение влияния защитной среды с енамином с применением в качестве растворителя ДМСО проводили на модели представителя семейства Enterobacterlaceae, которые широко распространены в природе и наиболее часто используются в научных исследованиях микробиологического, генетического, иммунологического и биохимического плана - вакцинном штамме чумного микроба EV.

Штамм выращивали при оптимальном температурном режиме на скошенном агаре Хоттингера до стационарной фазы роста и суспендировали в варьируемой по составу среде, состоящей из сахарозы (1-10%), желатины (0,5-3,0%) и агара-агара (0,01-0,1%) с добавлением 0,001-0,1% енамина, растворенного в 0,1% диметилсульфооксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что енамин в концентрациях 0,01-0,05% увеличивает продолжительность штамма в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 2,0 лет (в контроле) до 2,9-6,5 лет в зависимости от концентрации енамина (А), т.е. в 1,45-3,25 раза. Определение сроков хранения во всех экспериментах проводили по ускоренной методике (Методика определения термостабильности живых сухих вакцин и прогнозирование их жизнеспособности в процессе, Ставрополь, 1985 г.).

Пример 2. В составе, описанном в примере 1, хранили тот же штамм при аналогичных условиях, но с измененной концентрацией ДМСО - 10%. Срок хранения увеличивался с 2,0 до 3,5-7,7 лет (в 1,75-3,85 раза).

Пример 3. В составе, описанном в примере 1, хранили тот же штамм при использовании в качестве растворителя енамина (А) 0,1% этанола. Срок хранения увеличивался с 2,0 до 3,5-7,7 лет (в 1,75-3,85 раза).

Пример 4. В составе, описанном в примере 1, хранили псевдотуберкулезный микроб (штамм II а) - представителя семейства Enterobacterlaceae. Срок хранения увеличивался с 4,1 до 7,2-16,0 лет (в 1,76-3,90 раза).

Пример 5. Возбудитель кишечного иерсиниоза хранили в составе, мас.%:

Сахароза	10
Желатин	1
Агар-агар	0,02
Енамин(А)	0,001-0,1
Растворитель - ДМСО	0,25
Вода	Остальное.

При соблюдении технологии хранения, описанной в примере 1, срок хранения увеличивается с 1,9 до 2,6 лет, что превышает контрольный срок в 1,37 раза.

Вывод: из приведенных в примерах данных следует, что оптимальный результат получается при растворении енамина (А) в 1-10% ДМСО с концентрацией енамина 0,001-0,01% (срок хранения увеличивается в 3,25-3,90 раза).

На следующем этапе была использована дополнительная защитная белковая среда.

Пример 6. Изучение влияния защитной среды с енамином с применением в качестве основного компонента защитной белковой среды нормальной лошадиной сыворотки проводили на представителе семейства. Enterobacteriaceae - вакцинном штамме чумного микроба EV.

Штамм выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспендировали в среде, состоящей из нормальной лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера рН 7,2 (3:1) в соотношении 1,7-18 мас.% к общему составу с добавлением енамина 0,001-0.1%, растворенного в 0,1% ДМСО.

В результате проведенных экспериментов установлено, что защитная белковая среда с применением лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера с енамином в указанной выше концентрации увеличивает продолжительность хранения штамма в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% выживших клеток с 3,8 лет (в контроле) до 7,5 лет, т.е. в 1,97 раза.

Пример 7. Изучение влияния защитной среды с 5-гидрокси-5-метил-3-(3-нитрофенил)-2,4-диэтоксикарбонил-N(фенил)-1-циклогексениламином на продолжительность хранения широко распространенных в природе спорообразующих микроорганизмов семейства Bacillaceae в лиофилизированном состоянии проведено на вакцинном штамме возбудителя сибирской язвы - "СТИ".

Штамм выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 при температуре 37°С до стационарной фазы роста (18-24 ч). Суспензию готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины, 0,1% агар-агара с добавлением 0,001-0,1% енамина, растворенного в 0,1% ДМСО. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что енамин в концентрации 0,01% увеличивает продолжительность хранения штамма возбудителя сибирской язвы в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 6,3 лет (в контроле) до 16 года, т.е. в 2,54 раза.

Приведенные примеры подтверждают свойство енамина как консерванта для хранения бактерий, при этом сроки хранения увеличиваются до 3,9 раза при сохранении жизнеспособности тестируемых объектов.

Применение 5-гидрокси-5-метил-3-(3-нитрофенил)-2,4-диэтоксикарбонил-N(фенил)-1-циклогексениламина в качестве консерванта для хранения бактерий.