Биопрепарат-нефтедеструктор

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическому препарату для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы при одновременном восстановлении ее физико-химических свойств и естественного биоценоза. Биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians. В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3K с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения. Изобретение позволяет повысить нефтедеструктирующую активность, стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры, увеличить скорость разложения нефти, обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы, проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом. 6 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическому препарату на основе микробного удобрения (переработки отходов птицеводческих хозяйств) и на основе микроорганизмов - деструкторов (бактерий рода Bacillus), и может быть использовано для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы при одновременном восстановлении ее физико-химических свойств и естественного биоценоза.

Известны бактериальные культуры p.Bacillus, для которых характерна способность продуцировать антибиотические вещества и подавлять рост фитопатогенных микроорганизмов, см. Junge H., Krebs S., Frier К.// Mitt.Biol. Land - und Frostwirt. Berlin-Dahlem. - 1990. - №226.

Известно бактеризованное удобрение, включающее гуминосодержащую основу и бактериальную добавку из группы бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, см. патент Российской Федерации №2186049 по кл. C 05 F 11/08, C 12 N 1/20, опубл. 2002 г. В бактериальной добавке использованы бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д в количестве 5,0·10⁶ клеток/г основы.

Известны штаммы бактерий, используемые для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, в частности Bacillus sp., см. патенты Российской Федерации №2083667 по кл. C 12 N 1/20, В 09 С 1/10, C 02 F 3/34, опубл. 1997 г., №2115629 по кл. C 02 F 3/34, В 09 С 1/10, C 12 N 1/20, C 12 N 1/26, опубл. 1998 г., №2182529 по кл. В 09 С 1/10, C 02 F 3/34, C 12 N 1/26, опубл. 2002 г., №2204597 по кл. C 12 N 1/20, C 02 F 3/34, В 09 С 1/10, опубл. 2003 г.

Известно микробное удобрение Омут, см. Архипченко И.А. Урожай создают микробы.//Дачная жизнь. 2001. №11. С.15.

Известно биоорганическое удобрение на основе ферментации помета птиц, содержащее ассоциацию микроорганизмов, способных вызвать биодеградацию нефти и стимулировать рост микроорганизмов, см. патент Российской Федерации №2141932, по кл. C 05 F 11/08, опубл. 1999 г.

Известен способ получения биоудобрения, включающее приготовление микробной массы и иммобилизацию биомассы на органическом носителе в виде сухого гранулированного куриного помета, см. патент Российской Федерации №2130005 по кл. C 05 F 11/08, C 12 N 11/02, опубл. 1999 г.

Известен состав для очистки почвы от нефтяных загрязнений, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы и комплексное удобрение, см. патент Российской Федерации №2112610 по кл. В 09 С 1/10, C 02 F 3/34, C 12 N 1/26, опубл. 1998 г.

Известно микробное удобрение в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы р. Bacillus, см. Фисинин В.И., Архипченко И.А., Попова Э.В., Солнцева И.Э. Использование птичьего помета для получения микробных удобрений с полифункциональными свойствами. Микробиология.//Доклады РАСХН.1999. №2. С.32-34.

Все известные биопрепараты обладают низкой деструктирующей способностью.

Известен нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение в виде ферментированного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians, см. Архипченко И.А., Загвоздкин В.К. Очистка нефтезагрязненных почв с помощью биопрепаратов на основе микробных удобрений. //Экология и промышленность России. Спецвыпуск. 2004. С.16-18.

Данное техническое решение принято ближайшим аналогом настоящего изобретения.

Однако оно обладает недостатками.

Микробное удобрение этого аналога обладает положительными свойствами минеральных и органических удобрений, но нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов не достаточна для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.

В основу настоящего изобретения положено решение технической задачи, позволяющей создать эффективный, простой и экономичный биопрепарат - нефтедеструктор комплексного действия:

- с высокой нефтедеструктирующей активностью,

- с положительными свойствами минеральных и органических удобрений,

- с простым и рентабельным режимом получения,

- с предпочтительной возможностью использования для очистки нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians.

В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения /в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы/ достигаются важные новые свойства объекта.

В предложенном техническом решении совместное использование микробного удобрения Омуг, содержащего микроорганизмы - алканотрофы, и обогащенного микроорганизмами - нефтедеструкторами (бактериями штамма Bacillus cereus 3 К), позволяет получить эффективный биопрепарат - нефтедеструктор с высокой нефтедеструктирующей активностью.

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат, в связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения заключается в следующем.

Биопрепарат-нефтедеструктор включает микробное удобрение Омуг и культуру бактерий штамма Bacillus cereus 3 К, иммобилизованную на него.

Микробное удобрение Омуг выполнено в виде ферментированного подстилочного птичьего помета и содержит нативные микроорганизмы устойчивой ассоциации: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians.

Микробное удобрение Омуг получают в результате аэробной ферментации отходов птицеводческих хозяйств (подстилочного птичьего помета). В ферментированную массу добавляют минеральные удобрения (NPK) массой около 2% от массы перерабатываемого материала. Ферментацию осуществляют аэробными термофильными бактериями. Активация их жизнедеятельности обеспечивается за счет оптимизации влажности исходной смеси (40%-60%), поддержания высокой пористости (20%-30%). Температура обработки смеси поддерживается 55%-70% за счет тепла, выделенного при окислении органического вещества обрабатываемого материала. Аэробная ферментация активизирует рост аэробной микрофлоры.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus шт.3 К депонирована в ГНУ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ, 2003 (дата заполнения 25.11.03). Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К выделена из техногенной почвы, загрязненной дизельным топливом (г.Санкт-Петербург).

Из техногенной почвы на территории Кировского завода в районе ТЭЦ (г.Санкт-Петербург) были взяты образцы. Выделение проводили посевом (методом серийных разведении) на плотную питательную среду Придхем-Готлиба, в которой единственным источником углерода использована сырая нефть.

Сущность изобретения поясняется примерами.

ПРИМЕР 1.

Биоорганические носители:

- микробное удобрение Омуг (ближайший аналог) в виде ферментированного подстилочного птичьего помета содержит нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians,

- органическое удобрение Пудрет в виде воздушно-сырой массы, полученной путем сушки птичьего помета (влажностью 75%) в ИК-лучах при температуре 80-96 градусов, при среднем составе в расчете на сухое вещество (% масс.): белковый азот - 3,9; в виде мочевой кислоты - 2,9, NH - 0,36-1,2; С - 34, Р - 1,1; сырые протеины - 26-38; клетчатка - 123-14; углеводы - 35-43; безазотистые экстрактивные вещества - 30-37.

Физические и химические характеристики удобрений представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что органическое удобрение Пудрет не способствует утилизации нефти, хотя обладает адсорбционной емкостью почти в 2 раза ниже, чем у микробного удобрения Омуг.

ПРИМЕР 2.

Биоорганические носители:

- микробное удобрение Омуг в виде ферментированного подстилочного птичьего помета содержит нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Mierococcus varians,

- органическое удобрение Пудрет, представляющее воздушно-сырую массу, полученную путем сушки птичьего помета (влажностью 75%) в ИК-лучах при температуре 80-96 градусов, при среднем составе в расчете на сухое вещество (% масс.): белковый азот - 3,9; в виде мочевой кислоты - 2,9, NH - 0,36-1,2; С - 34, Р - 1,1; сырые протеины - 26-38; клетчатка - 123-14; углеводы - 35-43; безазотистые экстрактивные вещества - 30-37.

Численность трофических групп бактерий в носителях определяют методом Коха: посев носителей на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть - 1%.

Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH₄)₂ SO₄ - 2,64; К₂HPO₄ - 5,65; КН₂PO₄ - 2,38; MgSO₄·7H₂O - 1,0; CuSO₄ - 0,064; FeSO₄ - 0,01; MnCl₂ - 0,079; ZnSO₄ - 0,015.

Бактерии-аммонификаторы учитывают на сухом питательном агаре (СПА), олигонитрофилы - на среде Эшби.

Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 очевидно, что в микробном удобрении Омут содержатся микроорганизмы, утилизирующие сырую нефть (титр алканотрофов 10⁶ клеток/г).

ПРИМЕР 3.

Из нефтезагрязненных почв (40 лет загрязнения дизельным топливом) изолируют бактерии Bacillus cereus шт. 3 К., способные расти с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода.

Культуры бактерий - аналоги:

- производственная культура Bacillus subtilis шт. 2843,

- производственная культура Rhodococcus erythropolis шт. 1231.

Проводят анализ нефтедеструктирующей активности почвенных бактерий методом флуоресцентной спектроскопии.

Результаты анализа приведены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что наибольшая степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К.

Примечание:

Контроль - питательная среда Придхем-Готлиба с 1% нефти.

Из таблиц 3 и 1 видно, что степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К почти в два раза (1,93) выше, чем у микробного удобрения Омуг (ближайший аналог).

ПРИМЕР 4.

Бактерии штамма Bacillus cereus 3 К наращивают на плотном сухом питательном агаре в течение 3 суток. Создают водную суспензию бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹³ клеток/г. На поверхности 1 м распределяют 1 кг воздушно-сухого микробного удобрения Омуг, распрыскивают 100 мл суспензии бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹³ клеток/г и получают биопрепарат, содержащий бактерии штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения Омуг.

ПРИМЕР 5.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном нефтезагрязненном участке (г.Усинск) площадью 2000 м², в который вносят минеральное удобрение (N, P, K) и биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг (100 г/м²).

Образцы отбирают через месяц и через два после закладки эксперимента.

Содержание углеводородов в образцах определяют весовым методом. Вытяжку углеводородов проводят гексаном. Фракционирование нефти производят после пиролиза сухого остатка, образующегося после выпаривания гексана из вытяжки при t=480°C. Образовавшуюся после пиролиза газовую фазу анализируют на хроматографе ЛХМ-80, модель №5.

Динамика содержания углеводородов в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг представлена в таблице 4.

Из таблицы 4 видно, что в контроле нефть разложилась на 6%-12%, а в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омуг на 32%-50%.

Примечание:

Контроль - нефтезагрязненная почва.

ПРИМЕР 6.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном нефтезагрязненном участке (г.Усинск) площадью 2000 м², в который вносят минеральное удобрение (N, P, K) и биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг (100 г/м²).

Образцы отбирают через месяц после закладки эксперимента.

Численность трофических групп бактерий в нефтезагрязненной почве и в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омут определяют методом Коха: посев почв на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть - 1%.

Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH₄)₂ SO₄ - 2,64; К₂HPO₄ - 5,65; КН₂PO₄ - 2,38; MgSO₄·7H₂O - 1,0; CuSO₄ - 0,064; FeSO₄ - 0,01; MnCl₂ - 0,079; ZnSO₄ - 0,015.

Бактерии-аммонификаторы учитывают на сухом питательном агаре (СПА), олигонитрофилы - на среде Эшби.

Динамика численности бактерий в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омут представлена в таблице 5.

Из таблицы 5 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омуг численность бактерий увеличилась в среднем на 35% по сравнению с контролем.

Примечание:

Контроль - нефтезагрязненная почва.

ПРИМЕР 7.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном нефтезагрязненном участке (г.Усинск) площадью 2000 м², в который вносят минеральное удобрение (N, P, K) и биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг (100 г/м²).

Образцы отбирают через месяц после закладки эксперимента.

Биологическую активность нефтезагрязненной почвы и нефтезагрязненной почвы с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омуг оценивают по интенсивности выделения ими СО₂.

СО₂ определяют газохроматографическим методом.

Навеску почвы массой 20 г (в расчете на абсолютно сухой вес) помещают в склянки объемом 120 мл, закрывают ватной пробкой и инкубируют во влажной камере при температуре 27°С. Интенсивность выделения СО₂ определяют через 3-е суток. Для этого склянки «промывают» сжатым воздухом в течение 3-х минут и герметически закрывают пластмассовыми крышками с эластичной резиновой прокладкой. Инкубируют 24 часа в термостате при температуре 27°С. После этого медицинским шприцом отбирают пробы газа объемом 0,5 мл и вводят их в приемник газового хроматографа Хром-4, предварительно делают его калибровку. Для хроматографии используют сорбционные колонки из нержавеющей стали длиной 120 см с внутренним диаметром 2 мм, наполненные сорбентом полисорб-1. В качестве газа применяют гелий, который пропускают со скоростью 20 мм/мин. Температура термостата детектора 100°С. Температура камеры и колонок 20-22°С. Выход CO₂ происходит на 48-й секунде, на хроматографе появляется четкий пик, фиксирующий выход CO₂.

Интенсивность выделения CO₂ в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг представлена в таблице 6.

Из таблицы 6 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепарагом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Омут СО₂ выделяется в 5 раз больше по сравнению с контролем.

Примечание:

Контроль - нефтезагрязненная почва.

Приведенные примеры подтверждают, что биопрепарат-нефтедеструктор, полученный путем иммобилизации бактерий штамма Bacillus cereus 3 К на микробное удобрение Омуг, является перспективным биологическим препаратом, способным интенсифицировать микробные процессы в почве, и имеет нефтедеструктирующую активность в два раза выше, чем у ближайшего аналога.

Предложенный биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Омуг использовался для обработки загрязненных нефтью почв после аварийного разлива нефти в окрестностях г.Усинска, расположенного в Усинско-Колвинском елово-лесотундровом округе в подзоне лесотундры и крайнесеверной тайги Печерско-Уральской подпровинции, наблюдения за динамикой процессов в нефтезагрязненной почве и оценка активизации восстановления почв при введении этого биопрепарата подтверждают его соответствие критерию «промышленная применимость».

Использование эффективного биопрепарата-нефтедеструктора для очистки нефтезагрязненных почв позволяет:

- повысить нефтедеструктирующую активность,

- стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры,

- увеличить скорость разложения нефти,

- обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы,

- совместить положительные свойства минеральных и органических удобрений,

- проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Таблица 1
Физические и химические характеристики удобрений
Удобрение	Полная влагоемкость, %	Адсорбционная емкость, 106 клеток/г	Нефтедеструкция, %
Микробное удобрение Омуг (ближайший аналог)	350	4,8	45
Органическое удобрение Пудрет	150	2,8	1

Таблица 2
Численность трофических групп бактерий в удобрениях
Удобрение	Бактерии, КОЕ/1 г удобрения
аммонификаторы	олигонитрофилы	алканотрофы
Микробное удобрение Омуг (ближайший аналог)	6·108	1·108	3·106
Органическое удобрение Пудрет	4·102	2·101	1·101

Таблица 3
Нефтедеструктирующая активность почвенных бактерий
Культуры	Деструкция нефти, %
Контроль	8
Bacillus subtilis шт. 2843	69
Rhodococcus erythropolis шт.1231	74
Bacillus cereus шт. 3 К. (40 лет загрязнения дизельным топливом)	87

Таблица 4
Динамика содержания углеводородов в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг
Опытные участки	Точки отбора образцов	Углеводороды, мг/г а.с.в.
Через 1 месяц после начала эксперимента	Через 2 месяца после начала эксперимента	% утилизации
	1	162,23	143,00	11,9
Контроль	2	245,38	236,02	5,9
	3	347,02	325,37	6,3
Нефтезагрязненная	1	991,15	459,90	49,6
почва +	2	966,10	528,60	45,3
Биопрепарат-нефтедест-руктор	3	406,09	278,10	32,3

Таблица 5
Динамика численности бактерий в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг
Опытные участки	Точки отбора образцов	Численность микроорганизмов алканотрофов, 105 клеток/г а.с.в.
	1	9
Контроль	2	7
	3	7
Нефтезагрязненная	1	21
почва +	2	29
Биопрепарат-нефтедеструктор	3	18

Таблица 6
Интенсивность выделения CO2 в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг
Опытные участки	Точки	CO2
	X	%
	отбора	мг/кг	мг/кг	к контролю
	образцов	час	час
	1	35,4
Контроль	2	49,1	50,1	100
	3	65,8
Нефтезагрязненная	1	271,0
почва +	2	184,0	251,3	501,6
Биопрепарат-нефтедеструктор	3	299,0

Биопрепарат-нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение - носитель в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians, отличающийся тем, что в качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения.