Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской микробиологии. Предлагается способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем путем замораживания. Из зараженного бледными трепонемами яичка кролика путем механического измельчения и экстрагирования в растворе натрия хлорида изотонического получают взвесь штамма патогенных бледных трепонем, содержащую экстракт нативных тканей яичка зараженного кролика, и затем добавляют 15% глицерина от общего объема среды. Полученный продукт после перемешивания разделяют на аликвоты объемом 0,75-1,5 мл и немедленно замораживают для последующего хранения при температуре минус 70-80°С. Использование способа гарантированно позволяет сохранять вирулентность возбудителя; за счет возможности дробного использования аликвот, содержащих взвесь возбудителя в криопротекторе, возможно произвольно регулировать время работы по перевивке штамма и получению взвеси микроорганизма.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано в эксперименте по изучению биологических свойств возбудителя сифилиса, при сохранении и поддержании штамма патогенных бледных трепонем для целей промышленного производства, в специализированных лабораториях при серодиагностике сифилиса с использованием реакций иммобилизации и непрямой иммунофлюоресценции.

Возбудитель сифилиса, бледная трепонема, был выделен в 1905 году, относится к виду Treponema pallidum (Schaudin et Hoffman). В последующие годы путем заражения лабораторных животных (приматы, кролики, морские свинки, мыши) биологическим материалом от больных сифилисом людей были получены, а затем и детально охарактеризованы штаммы патогенной бледной трепонемы (Никольса, Будапештский, 1 Иркутский, VIII и XII ЦКВИ и другие), последующее сохранение штаммов проводилось путем регулярных перевивок на лабораторных животных.

Попытки выращивания бледной трепонемы на питательных средах в анаэробных условиях привели к получению определенного количества штаммов культуральной бледной трепонемы (штаммы Ставрополь 1-5,7-9, Рейтера и другие). При изучении морфологии и биологии установлены определенные различия между штаммами патогенных и культуральных бледных трепонем, выявлены различия антигенных детерминант даже внутри этих двух групп бледной трепонемы. Ни одна из культур бледной трепонемы не обладает патогенностью для человека.

Имеются публикации о возможности 1-3-кратного пассирования патогенной бледной трепонемы на культурах клеток, но при этом отмечается постепенная утрата способности к росту и размножению через один-два пассажа, что приводит в конце концов к гибели штамма.

В качестве лабораторного животного для сохранения и перевивки патогенной бледной трепонемы наиболее приемлемым является кролик. Разработаны различные способы получения взвеси возбудителя для экспериментальных и исследовательских целей (заражение в переднюю камеру глаза, внутрикожная инокуляция на выбритых участках на спине или на мошонке, заражение внутрь яичка и другие) (Н.М.Овчинников. Экспериментальный сифилис. - М.: Медгиз, 1955. - С.388).

Основным недостатком метода является необходимость регулярных перевивок штамма, учет возможности потери штамма не только по причине непреднамеренного нарушения методики перевивки, но и по причине гибели лабораторного животного. Для более успешного получения взвеси с обильным содержанием возбудителя применяют дополнительное введение кроликам суспензии гидрокортизона, что приводит к снижению функции механизмов гуморального и клеточного иммунитета животных и может повышать смертность при неблагоприятных условиях. Указанные трудности сохранения штаммов приводят к необходимости систематического дублирования количества заражаемых животных, поддержания множества коммерческих связей с учреждениями, также сохраняющими штаммы патогенной бледной трепонемы.

Известен способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем в тканях яичка, полученного через 7 дней после заражения кролика, при замораживании яичка в цельном виде при температуре минус 20°С (В.Е.Павловская. Применение замороженного антигена для реакции иммобилизации бледных трепонем. // Лабораторное дело. - 1964. - №11. - С.668-670). Этот способ выбран за прототип.

Основные недостатки указанного способа: автором отмечено стабильное сохранение подвижности трепонем лишь в течение 1-2 недель и существенное понижение количества бледных трепонем в материале, полученном из тканей яичка, хранившихся в течение 3-4 недель. Кроме того, автором показано выраженное снижение вирулентности бледных трепонем в процессе хранения: при перевивке штамма материалом из яичка зараженного кролика, сохранявшимся в течение 30 суток при температуре минус 20°С, сроки образования сифилитического орхита увеличивались до 20-30 дней по сравнению с 7 днями инкубации при использовании свежей, не подвергавшейся замораживанию взвеси микроорганизмов. Отсутствие стабильности в сроках получения сифилитических орхитов по описанному способу не позволяет уверенно планировать экспериментальные и лабораторные исследования, приводит к неоправданным материальным затратам по дополнительному содержанию здоровых животных перед началом опыта. Возможно лишь однократное использование сохраненного биологического материала.

Задачей изобретения является увеличение сроков сохранения жизнеспособности штаммов патогенной бледной трепонемы, снижение прямых экономических затрат на приобретение и содержание лабораторных животных-дублеров, создание возможности произвольно регулировать (приостанавливать) работы по перевивке штаммов в ситуациях экономического или эпидемиологического характера.

Эта задача достигается за счет того, что из зараженного бледными трепонемами яичка кролика путем механического измельчения и экстракции в растворе натрия хлорида изотонического получают взвесь штамма патогенных бледных трепонем, добавляют к ней 15% глицерина от общего объема среды, после перемешивания разделяют на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл и немедленного замораживают для последующего хранения при температуре минус 70-80°С.

Добавление 15% глицерина в качестве криопротектора препятствует разрушению микроорганизмов, разделение на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл позволяет достигать оптимальных темпов замораживания и размораживания полученного продукта, а последующее хранение при температуре минус 70-80°С обеспечивает сохранение жизнеспособности микроорганизмов без потери их вирулентности не менее года (по данным экспериментальных исследований).

Преимущества указанного способа:

- при бесперебойной работе холодильного оборудования гарантированно сохраняется вирулентность патогенной бледной трепонемы;

- взвесь патогенной бледной трепонемы может быть использована для заражения кроликов непосредственно после размораживания (оттаивания) без дополнительного отмывания или другой обработки, так как среда сохранения включает тканевые компоненты, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов, и не содержит материалов или ингредиентов, способных вызывать реакцию несовместимости или отторжения со стороны лабораторного животного;

- сроки развития сифилитического орхита при применении взвеси патогенной бледной трепонемы, сохранявшейся по предлагаемому способу, не отличаются от сроков развития после заражения свежей взвесью возбудителя (7±2 дня);

- хранение взвеси в виде раздельных аликвот позволяет дробно использовать первоначально приготовленный биологический материал без ухудшения его свойств и многократно воспроизводить перевивки штамма;

- при систематическом применении данного способа снижаются прямые затраты, связанные с приобретением и содержанием лабораторных животных-дублеров (не менее чем в 2 раза) или необходимых для пассажей кроликов при временном прекращении работ по перевивке штамма бледной трепонемы.

Способ осуществляется следующим образом:

Из зараженного бледными трепонемами яичка кролика путем механического измельчения и экстрагирования в растворе натрия хлорида изотонического получают взвесь штамма патогенных бледных трепонем, содержащую экстракт нативных тканей яичка зараженного кролика, добавляют 15% глицерина от общего объема среды, перемешивают, разделяют на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл и немедленно замораживают для последующего хранения при температуре минус 70-80°С.

Пример №1

Кролик №8196 (пассаж 389) был умерщвлен 18 ноября 2003 г., от него с соблюдением стерильных условий были получены два яичка, каждое из которых освободили от оболочек и механически измельчили путем многочисленного разрезания хирургическими ножницами. К приготовленной массе добавили по 5,0 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического и произвели экстрагирование при покачивании на платформе орбитального шейкера. Крупные элементы ткани яичка кролика были осаждены при центрифугировании со скоростью до 1000 об/мин, полученную взвесь патогенных бледных трепонем с соблюдением условий стерильности мерной пипеткой перенесли в пробирку, добавили 15% от общего объема стерильного глицерина и тщательно перемешали. Подготовленную к сохранению взвесь разлили на аликвоты в пробирки типа эппендорф по 1,0 мл; пробирки укупорили крышками и поместили в морозильную камеру с температурой минус 70-80°С.

Через 2,5 месяца хранения (03 февраля 2004 г.) содержимое 2 пробирок после оттаивания при комнатной температуре использовали для заражения кролика №8217 (по 1,0 мл внутрь яичка с каждой стороны). Через 7 дней после заражения (10 февраля 2004 г.) у кролика развился двусторонний специфический орхит. Яички удалены, и по описанной выше методике приготовлена взвесь патогенных бледных трепонем, которая была использована в качестве антигена для постановки реакции иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) и реакции непрямой иммунофлюоресценции (РИФ), а также для заражения кролика №8219, у которого, в свою очередь, через 7 дней наблюдали развитие специфического орхита с обеих сторон.

Пример №2

23 марта 2004 г. от кролика №8231 (пассаж 405) по стандартной методике была приготовлена взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса, к ней добавлено 15% глицерина. После тщательного перемешивания взвесь была разлита в пробирки типа эппендорф по 1,5 мл, пробирки закрыты крышками и помещены в морозильную камеру с температурой минус 70-80°С.

Взвесь сохранялась при температуре минус 70-80°С в течение 12,5 месяцев и была использована 12 апреля 2005 г. для заражения кролика №8296. После размораживания при комнатной температуре и тщательного перемешивания материал набирали в шприц и вводили внутрь яичка по 1,0 мл с каждой стороны. Для снижения темпов выработки антител кролик перед заражением и через 4 дня после него получил две внутримышечные инъекции суспензии гидрокортизона ацетата в разовой дозе 0,4 мл. На 7-ой день после заражения (19.04.2005 г.) кролик был умерщвлен путем воздушной эмболии, и по стандартной методике приготовлена взвесь патогенных бледных трепонем, которая содержала до 400 бледных трепонем в поле зрения микроскопа (хорошая плотность взвеси). Материал был использован в качестве антигена для постановки серологических реакций (РИБТ и РИФ), а также для очередного пассажа на кролике №8297, у которого в свою очередь через 7 дней (26.04.2005 г.) наблюдали развитие специфического орхита с обеих сторон.

Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем, включающий заражение штаммом патогенной бледной трепонемы яичка кролика и замораживание, отличающийся тем, что из зараженного яичка кролика путем экстракции раствором натрия хлорида изотонического получают взвесь патогенных бледных трепонем, содержащую экстракт нативных тканей яичка зараженного кролика, добавляют 15% от общего объема взвеси глицерина, перемешивают, разделяют на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл, немедленно их замораживают и хранят при температуре -(70-80)°С.