Способ получения иммобилизованной уреазы

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания ферментных электродов при очистке сточных вод от мочевины. Способ предусматривает иммобилизацию фермента на неорганическом носителе - аэросиле, поверхность которого модифицирована казеином. Изобретение позволяет повысить удельную активность фермента, повысить диапазон термостабильности иммобилизованной уреазы, повысить процент связывания фермента с носителем, упростить процесс иммобилизации фермента. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованной уреазы, и может найти применение в аналитической промышленности (создание ферментных электродов) при очистке сточных вод от мочевины.

Известен способ получения иммобилизованной уреазы (АС 1373730, опубл. 15.02.88), заключающийся в увеличении стабильности фермента при хранении после его связывания с окисленным углем в присутствии стероидных гликозидов. Недостатком способа является значительное увеличение активности исходной уреазы (более 100%), что может быть связано с влиянием самих гликозидов на ход ферментативной реакции.

Следующий способ получения иммобилизованной уреазы состоит в связывании фермента с окисленным активированным углем, модифицированным четыреххлористым титаном (АС 1090715, опубл. 07.05.84). Недостатками являются невысокий процент связывания фермента с носителем и небольшой срок сохранения активности ферментного препарата.

Наиболее близким к предполагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения иммобилизованной уреазы, заключающийся в связывании фермента с неорганическим носителем, активированным γ-аминопропилтриэтоксисиланом и глутаровым альдегидом (АС 925183, опубл. 15.10.82). Недостатком является использование вредных веществ в качестве модификаторов поверхности неорганического носителя, длительность и многостадийность процесса иммобилизации, а также невысокая величина удельной активности иммобилизованной уреазы при низком диапазоне термостабильности.

Задачей изобретения является увеличение удельной активности и диапазона термостабильности иммобилизованной уреазы при оптимуме рН с высоким процентом связывания фермента с носителем и упрощении процесса иммобилизации фермента.

Поставленная задача решается способом, включающим иммобилизацию фермента уреазы на неорганическом носителе - аэросиле, поверхность которого модифицирована природным высокомолекулярным соединением - казеином.

Способ осуществляют следующим образом. К 5 г аэросила добавляют 50 мл дистиллированной воды и перемешивают его с казеином, взятым в количестве 3-15 мас.% и растворенным в 10 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Полученную суспензию оставляют созревать при комнатной температуре в течение 24 часов. Формирование жесткого остова носителя проводят при тщательном перемешивании в течение 1 часа при температуре 110-130°С. Полученный носитель просеивают через сито с размером ячеек 230 мкм и пятикратно отмывают дистиллированной водой по 100 мл до рН промывных вод 7,0. Для иммобилизации используют фермент уреазу, выделенную из бобов сои, с удельной активностью 3460 Е/г. К 1 г влажного носителя добавляют 2,0 мл раствора фермента в фосфатно-солевом буфере рН 7,0 с концентрацией уреазы 4,0 мг/мл. Объем раствора фермента был выбран с учетом полной смачиваемости носителя. Концентрация фермента обусловлена возможностью более полного проведения процесса иммобилизации. Раствор фермента с концентрацией менее 4,0 мг/мл использовать нецелесообразно, т.к. будет иметь место неполная нагрузка фермента на носитель. Увеличение концентрации фермента выше 4,0 мг/мл недопустимо в связи с конкуренцией молекул уреазы за право обладать центрами связывания, находящимися на поверхности носителя. Иммобилизацию проводят в течение 24 часов при температуре 4°С. Время иммобилизации обусловлено процессом полного связывания фермента с носителем. Температура иммобилизации выбрана с учетом максимального сохранения активности нативного фермента. По завершению процесса иммобилизации носитель с иммобилизованным ферментом отмывают трехкратно бидистиллированной водой объемом по 50 мл до полного удаления несвязавшегося фермента, что фиксируют на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм против бидистиллированной воды. Активность нативного и иммобилизованного фермента оценивают фотоколориметрическим методом. В качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере. Для установления оптимума рН-активности иммобилизованной уреазы ферментативную реакцию проводят в фосфатном буфере при рН 5,4-7,0. Предел термостабильности иммобилизованной уреазы устанавливают по значениям наибольшей активности фермента при проведении ферментативной реакции в интервале температур от 10 до 60°С, так как ниже 10°С ферментативная реакция не протекает, а выше 70°С фермент теряет активность в результате процесса денатурации. За единицу уреазной активности принимается такое количество фермента, в результате реакции которого с субстратом выделяется 1 мкмоль аммиака за 1 минуту при 20°С.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. К 5 г аэросила добавляют 50 мл дистиллированной воды и перемешивают его с казеином, взятым в количестве 3 мас.% и растворенным в 10 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Полученную суспензию оставляют созревать при комнатной температуре в течение 24 часов. Формирование жесткого остова носителя проводят при тщательном перемешивании в течение 1 часа при температуре 110-130°С. Полученный носитель просеивают через сито с размером ячеек 230 мкм и пятикратно промывают дистиллированной воды по 100 мл до рН промывных вод 7,0. Для иммобилизации используют фермент уреазу, выделенную из бобов сои, с удельной активностью 3460 Е/г. К 1 г влажного носителя добавляют 2,0 мл раствора фермента в фосфатно-солевом буфере рН 7,0 с концентрацией уреазы 4,0 мг/мл. Иммобилизацию проводят в течение 24 часов при температуре 4°С. По завершению процесса иммобилизации носитель с иммобилизованным ферментом отмывают трехкратно бидистиллированной водой объемом по 50 мл до полного удаления несвязавшегося фермента. Активность иммобилизованного фермента оценивают фотоколориметрическим методом. В качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере при рН 7,0. Ферментативную реакцию проводят при температуре 20-60°С. Получают препарат иммобилизованной уреазы с удельной активностью 3391 Е/г носителя, что составляет 98% сохранения исходной активности при 70%-ном связывании фермента.

Пример 2. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что для модификации поверхности носителя используют казеин в количестве 5 мас.%, а в качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере рН 5,4. Ферментативную реакцию проводят при температуре 10-30°С, получают препарат с удельной активностью 3460 Е/г носителя, что составляет 100% сохранения исходной активности при 63%-ном связывании фермента.

Пример 3. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что для модификации поверхности носителя используют казеин в количестве 15 мас.%, а в качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере рН 5,4. Ферментативную реакцию проводят при 10-20°С, получают препарат с удельной активностью 3460 Е/г носителя, что составляет 100% сохранения исходной активности при 83%-ном связывании фермента.

В таблице представлены сравнительные характеристики иммобилизованной уреазы в сопоставлении с прототипом.

Таблица Сравнительные характеристики иммобилизованной уреазы
Способ получения иммобилизованной уреазы	Удельная активность фермента уреазы, Е/г сорбента	Процент связывания уреазы, %	Сохранение активности иммобилизованной уреазы, %	Оптимум рН	Оптимум термостабильности, °С
Известный способ	3400	75	88	7,3	18
По примеру 1 (предлагаемый)	3391	70	98	6,0	20-60
По примеру 2 (предлагаемый)	3460	63	100	5,4	10-30
По примеру 3 (предлагаемый)	3460	83	100	5,4	10-20

В отличие от прототипа предлагаемый способ иммобилизации уреазы позволяет увеличить удельную активность фермента и его диапазон термостабильности при оптимуме рН с высоким процентом связывания фермента с носителем, что достигается путем его иммобилизации на кремнеземе - аэросиле, поверхность которого модифицирована казеином. Кроме того, предложенный способ исключает использование вредных компонентов в качестве модификаторов поверхности носителя и делает процесс иммобилизации фермента более простым, так как исключает проведение ряда стадий, которые могут существенно понижать активность иммобилизованного фермента.

1. Способ получения иммобилизованной уреазы, предусматривающий иммобилизацию фермента на модифицированном неорганическом носителе, отличающийся тем, что в качестве неорганического носителя используют аэросил, модифицированный казеином.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют аэросил, модифицированный путем перемешивания с казеином, взятым в количестве 3-5 мас.% и растворенным в 10 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, в течение 1 ч при температуре 110-130°С.