Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а
Владельцы патента RU 2294760:
Федеральное государственное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГУ ВНИИЗЖ) (RU)
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура, адъюванты гидроокись алюминия с сапонином и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока. 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 10 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А.
Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Для обеспечения устойчивого благополучия страны по ящуру в Российской Федерации реализуется система мероприятий, приоритетными в которой являются предупреждение заноса вируса ящура на территорию, а в районах высокой степени риска - вакцинопрофилактика. В настоящее время в Российской Федерации и странах СНГ для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота против ящура применяют, как правило, инактивированные сорбированные, а для иммунизации свиней - инактивированные эмульсионные вакцины (1).
Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.
Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении (2).
Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья животных, его иммунного статуса и множества других факторов.
Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами (2,3).
Известны штаммы вируса ящура типа А, выделенные на территории СССР и использованные в качестве производственных при изготовлении противоящурных инактивированных вакцин. К ним относятся штамм А7 №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; штамм Ат №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; штамм А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае. После ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в Коллекции эпизоотических штаммов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ ВНИИЗЖ (1-4).
Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма A22 №550, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении (5).
Штамм А22 №550 вируса ящура выделен в 1964 году в Азербайджане и используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.
В качестве чувствительной биологической системы используют новорожденных крольчат, а в качестве поддерживающей среды - фосфатно-буферный раствор.
Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.
Для инактивации вируса используют формальдегид, а из адъювантов - гидроокись алюминия (ГОА) с сапонином.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №1707 «Армения-98-ДЕП», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъювантов ГОА с сапонином и поддерживающую среду в соотношении, мкг:
| Антигенный материал не менее | 3,0 |
| ГОА | 1132,0-2108,0 |
| Сапонин | 750,0 |
| Поддерживающая среда | До 1000000,0 (5) |
Штамм A22 №1707 «Армения-98-ДЕП» выделен в 1998 году в Республике Армения и используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.
В качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6.
Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют полигексаметиленгуанидин (ПГМГ), а для инактивации вируса - аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию добавляют тиосульфат натрия.
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №1707 «Армения-98-ДЕП» представляет собой суспензию преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура. В качестве адъювантов используют ГОА с сапонином.
Основной недостаток известных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоит в их недостаточной иммуногенной активности. Они не обеспечивают надежной защиты восприимчивых животных от эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины противоящурной инактивированной сорбированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных сорбированных против ящура типа А.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
Предлагаемая вакцина содержит в 1 мл препарата: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученного предпочтительно в суспензионной культуре клеток ВНК-21, в количестве не менее 3,0 мкг и целевые добавки: ГОА предпочтительно в количестве 1132,0-2108,0 мкг, сапонин предпочтительно в количестве 750,0 мкг и поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг.
Исходный вирус для получения штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП выделен в 1999 году в Республике Грузия. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6.
Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025-0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия (7).
Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,005-0,007% (8).
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.
Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии (9).
Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 мл не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 мл готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОА в 1 мл готового препарата в диапазоне от 1132,0 мкг до 2108,0 мкг.
К полученному концентрату добавляют дополнительно 10% водный раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%, что соответствует 750,0 мкг его содержания в 1 мл готового препарата.
Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.
1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А;
2. активное вещество;
3. целевые добавки.
По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП» вируса ящура типа А в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток животного происхождения и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 мл готового препарата.
5. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА.
6. ГОА предпочтительно в количестве 1132,0-2108,0 мкг в 1 мл готового препарата.
7. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант сапонин.
8. Сапонин предпочтительно в количестве 750,0 мкг в 1 мл готового препарата.
9. В качестве целевой добавки вакцина содержит поддерживающую среду.
10. Поддерживающая среда в количестве до 1000000,0 мкг в 1 мл готового препарата.
11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг:
| Антигенный материал не менее | 3,0 |
| ГОА | 1132,0-2108,0 |
| Сапонин | 750,0 |
| Поддерживающая среда | До 1000000,0 |
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура серотипа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего получение противоящурной вакцины сорбированной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП выделен в 1999 году от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия. Производственный штамм получен из данного изолята путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Полученный штамм депонирован 19 августа 2003 г. во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - Центр качества ветеринарных препаратов и кормов» (ФГУ ВГНКИ) под регистрационным номером - производственный, культуральный штамм вируса ящура А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, серотипа А.
Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А (Грузия)1999/№1721-ДЕП вируса ящура относится к серотипу А.
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА и РН. При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:128-1:512 и в ИФА в разведении 1:6000-1:10000.
Антигенное родство штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Турции и Ирана изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 1, штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов.
По антигенным свойствам новый штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А также отличается от ранее изученного производственного штамма А№1707/Армения/98-ДЕП.Двухстороннее родство (R) в РСК между ними составляет 20%.
Изучение антигенного родства выделенного штамма было проведено в РН, где в качестве иммунных использовались сыворотки реконвалесцентов КРС на вирусы штаммов А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, А Турция/97, и A22 №550. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.
Приведенные в таблице 2 данные подтверждают антигенное отличие выделенного штамма от производственного штамма А22 №550 и эпизоотического штамма, выделенного в Турции в 1997 году.
Молекулярно-генетическая характеристика
Методом нуклеотидного секвенирования определена первичная структура гена VP1 (SEQ ID NO1) штамма А (Грузия)1999/№1721 и из нее выведена аминокислотная последовательность белка VP1 (SEQ ID NO2). Сравнительный анализ установленных последовательностей показал, что по первичной структуре гена и белка VP1 штамм А (Грузия)1999/№1721 отличается от всех ранее выделенных изолятов вируса ящура, в том числе и от штаммов А22 №550 и А/№1707/Армения/98, используемых в настоящее время для производства вакцин против ящура типа А. Филогенетические взаимоотношения штамма А (Грузия)1999/№1721 с ранее изученными изолятами вируса ящура типа А, выделенными в разных регионах мира за четыре последних десятилетия, отражены в дендрограмме.
Биотехнологические характеристики
Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также для изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП репродуцируется в монослойных культурах первичнотрипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 18-24 часов инкубирования накапливается до 6,0-8,0 Ig ТЦД50/мл. При массированном заражении (1-100 ТЦД/клетку) вызывает ЦПД через 4 часа. Результаты исследований представлены в таблице 3.
После 3-4 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-8,0 Ig ТЦД50/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 - ДЕП является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10 МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP3D) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/мл.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,0-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентальном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А (Грузия)1999/№1721-ДЕП по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А.
Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная вакцинопрофилактика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходима высокоиммуногенная вакцина.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы.
Следовательно, заявляемая вакцина соответствует уровню патентоспособности «новизна».
Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности «изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемой вакцины преобразований для достижения технического результата.
Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура серологического типа А с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена также примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем правовой охраны изобретения.
Пример 1.
Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вирус ящура типа А был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ в виде эпителия афт от КРС, подозреваемого в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов.
Биологические и вирусологические методы включали инокуляцию материала полевого изолята КРС и последующую адаптацию вируса к культурам первичнотрипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВНК-21. Первичные и перевиваемые культуры клеток для постановки биопробы выращивали на соответствующих питательных средах в стационарных условиях во флаконах емкостью 50-100 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% ГЛА и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом в отношении 1:10. После 30-минутного инкубирования при 37°С во флаконы вносили по 5-10 мл поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 минут. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранившихся в музее штаммов ВНИИЗЖ.
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.
Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.
Изолированный с помощью перечисленных методов вирус был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура, везикулярного стоматита, везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 4.
Приведенные в таблице 4 результаты свидетельствуют о том, что выделенный вирус относится к типу А.
Пример 2.
Инактивированную адсорбат-вакцину против ящура типа А готовят из вируса штамма А (Грузия) №1999/№1721-ДЕП, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,4-1,5 ТЦД50 на клетку.
Культивирование вируса ведут при температуре 36-37°С. Через 11-13 часов инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то инкубирование продолжают еще 2-3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов. Количество 146S±75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.
В теплую суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка и 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в 1 мл адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена ГОА.
Расчетный объем ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 Р<0,01 мг/мл n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 3,0 мкг/мл готового препарата. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%, что соответствует 750,0 мкг сапонина в 1 мл готовой вакцины. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТом 28085-89.
Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 мл, а затем подкожно в дозе 10,0 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.
Полученная вакцина представляют собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
Оптимальный компонентный состав полученной адсорбат-вакцины против ящура типа А приведен в таблице 5.
В таблицах 6, 7 и 8 приведены результаты культивирования штаммов А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, А№1707 «Армения-98-ДЕП» и A22 №550 вируса ящура типа А, из которых следует, что культуральные свойства перечисленных штаммов существенно отличаются по двум изученным параметрам:
1) штаммы А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и А №1707 «Армения-98-ДЕП» имеют более длительный период репродукции (15-16 часов) по сравнению со штаммом А22 №550 (12,5 часа);
2) штаммы А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и А №1707 «Армения-98-ДЕП» дают более низкий процент выхода иммуногенных компонентов (61,5 и 58,1% соответственно) по сравнению со штаммом А22 №550 (89,9%).
В таблице 9 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75S) компоненты вируса ящура штаммов А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и А №1707 «Армения-98-ДЕП».
Приведенные в таблице 9 данные свидетельствуют о том, что иммуногенные компоненты вируса ящура штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП не уступают в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства вирусу ящура штамма А №1707 «Армения-98-ДЕП». Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса из штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП не произошло изменений в количестве 146S и 75S компонентов, полученных при репродукции вируса.
Пример 3.
Проведены испытания адсорбат-вакцины против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мкг:
| Авирулентный и очищенный | |
| антигенный материал из штамма | |
| А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А | 3,0 |
| ГОА | 1132,0 |
| Сапонин | 750,0 |
| Поддерживающая среда | До 1000000,0 |
Авирулентность и безвредность вакцины проверили на 5 головах КРС. Препарат вводили каждому животному под слизистую языка в дозе 2,0 мл, а затем подкожно в дозе 10,0 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток.
По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность. Испытание провели на 5 головах КРС. Адсорбат-вакцину вводили подкожно в дозе 2,0 мл. Результаты исследований представлены в таблице 10.
Приведенные в таблице 10 данные показали, что все 5 голов КРС были защищены от генерализации процесса на 21 день после вакцинации. Уровень гуморального иммунитета у привитых животных составил 5,15±0,19 лог2.
Пример 4.
Проведены испытания адсорбат-вакцины против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мкг:
| Авирулентный и очищенный | |
| антигенный материал из штамма | |
| А (Грузия)1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А | 3,0 |
| ГОА | 1740,0 |
| Поддерживающая среда | До 1000000,0 |
Авирулентность и безвредность полученной вакцины проверили на 5 головах КРС. Препарат вводили каждому животному под слизистую языка в дозе 2,0 мл, а затем подкожно в дозе 10,0 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток.
По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность на КРС. Испытание провели на КРС, ИмД50 препарата была равна 0,15 мл, т.е. в одном мл вакцины содержалось 6,07 ПД50.
Для сравнения производственная серия адсорбат-вакцины из штамма А22 №550 имела ИмД50 для КРС, равную 0,22±0,012 мл Р<0,001, т.е. в 1 мл вакцина содержала 4,55 ПД50.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемой вакцины следующей совокупности условий:
- вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А, изготовленная из штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А».
1. Bojko A.A. Declaration sur l'apparition en URSS d'un type virus aphteux different des souches de type A anterieurement etudiees dans le Pays. BOIE, 1965, 64, V.2. - P.1075-1077.
2. Ререр Х. Ящур / Перевод с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В.Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
3. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур / Под ред. А.Н.Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990. - С.231-250.
4. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С.532-548.
5. Временная инструкция по изготовлению и контролю противоящурной концентрированной гидроокись алюминиевой формолвакцины из лапинизированного вируса А22. Утверждена ГУВ СССР 25.03.1971 г.
6. Патент РФ №2143921, А 61 К 39/135, С 07 К 14/09, С 12 N 7/00, 7/04; 10.01.2000 г. (протитип).
7. Патент РФ №594771, А 61 К 39/12, 07.07.93 г.
8. Патент РФ №2054039, C 12 N 7/02, А 61 К 39/35, 10.02.1996.
9. Авт. свид. СССР №784335, C 12 Q 1/02, 20.03.2000 г.
| Таблица 1 Антигенный спектр штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А (по данным РСК) | |||
| n=3 | |||
| Сравниваемые штаммы | Показатели | ||
| r1 | r2 | R% | |
| А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и А/Иран/96 | 0,28 | 0,9 | 49 |
| А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и А/Киргизия/93 | 0,1 | 0,24 | 15 |
| А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и А/Армения/98 | 0,32 | 0,12 | 20 |
| А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и А/Турция/97 | 0,23 | 1,0 | 47 |
| А (Грузия) 1999/1721 -ДЕП и A22 №550 | 0,1 | 0,32 | 18 |
| А (Грузия) 1999 №1721-ДЕП и А/Турция/99 | 0,47 | 0,69 | 57 |
| Таблица 2 Антигенное родство штамма А (Грузия)1999/№1721-ДЕП с известными штаммами вируса ящура типа А (по данным РН) | |||
| n=3 | |||
| Сравниваемые штаммы | Показатели | ||
| r1 | r2 | R% | |
| А (Грузия)1999/№1721-ДЕП и А22 №550 | 0,38 | 0,4 | 41 |
| А (Грузия)1999/№1721-ДЕП и А Турция/97 | 0,44 | 0,58 | 47 |
| Таблица 3 Биологические свойства штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А | ||||
| Культура клеток | Время проявл. ЦПД (час) | Кол-во адаптационных пассажей | Характеристика адаптированного вируса | |
| Активность в РСК | Титр Ig ТЦД50/мл | |||
| СП | 18 | 3 | цельн. | 106,0-6,5 |
| ПСГК-30 | 16 | 2 | 1:2 | 106,0-7,0 |
| ВНК-21 | 18-20 | 3 | 1:2-1:4 | 106,5-7,5 |
| IB-RS-2 | 18 | 1 | 1:2-1:4 | 106,07,0 |
| Таблица 4 Типирование 33%-ной суспензии ящурного афтозного материала (экспертиза №1721) | |||||||
| Гиперимм. сыворотка в рабочем титре | Антиген (№1721) в разведениях | ||||||
| цельн. | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:12 | 1:24 | Без антигена | |
| А22 №550 | 4 | 3 | - | - | - | - | - |
| А/Армения/98 | 4 | 4 | 2 | - | - | - | - |
| O1 №194 | - | - | - | - | - | - | - |
| C1 №564 | - | - | - | - | - | - | - |
| Азия-1 №48 | - | - | - | - | - | - | - |
| CAT-1 №96 | - | - | - | - | - | - | - |
| CAT-2 K183/74 | - | - | - | - | - | - | - |
| CAT-3 Been 1/65 | - | - | - | - | - | - | - |
| Без сыворотки | - | - | - | - | - | - | - |
| Примечание: процент задержки гемолиза выражен в крестах: 4-100% задержка; 3-75% задержка; 2-50% задержка; 1-25% задержка; - отрицательная реакция (полный гемолиз). |
| Таблица 5 Оптимальная рецептура противоящурной инактивированной адсорбат-вакцины из вируса ящура типа А, штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП (мкг в 1 мл готовой вакцины) | |||
| Ингредиенты | Минимум | Средний | Максимум |
| Авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S и 75S) компонентов вируса ящура типа А, штамм А(Грузия) 1999/№1721-ДЕП | 3,0 | >3,0 | >3,0 |
| ГОА | 1132,0 | 1620,0 | 2108,0 |
| Сапонин | 750,0 | 750,0 | 750,0 |
| Поддерживающая среда | До 1000000,0 | До 1000000,0 | До 1000000,0 |
| Таблица 8 Культивирование вируса ящура типа А, штамм А22 №550, в суспензии клеток ВНК-21 | |||||||
| №№ п/п | Концентрация клеток (млн/мл) | Доза заражения (ТЦД50/кл) | Длительность репродукции, (часы) | Титр вируса (Ig ТЦД50/мл) | ВСБ (м кг/мл) | 146S+75S компоненты (мкг/мл) | % выхода 146S+75S |
| 1. | 2,5 | 1.5 | 13 | 8,00 | 2,48 | 2,19 | 88,3 |
| 2. | 2,6 | 1,0 | 12 | 7,25 | 1,17 | 1,04 | 88,8 |
| 3. | 2,7 | 1,0 | 11 | 7,75 | 2,00 | 1,83 | 91,6 |
| 4. | 2,4 | 0,8 | 14 | 8,00 | 1,78 | 1,48 | 89,3 |
| 5. | 2,4 | 0,5 | 12 | 7,50 | 1,34 | 1,26 | 94,3 |
| 6. | 3,0 | 0,05 | 13 | 7,25 | 2,06 | 1,80 | 87,2 |
| M+m | 2,60±0,09 | 0,81+0,20 | 12,5±0,43 | 7,62+0,14 | 1,80±0,20 | 1,60+0,17 | 89,9+1,1 |
| р<0,001 | р<0,025 | р<0,001 | р<0,001 | р<0,001 | р<0,001 | Р<0,001 |
| Таблица 9 Сравнительные данные по устойчивости штамма вируса ящура А №1707 «Армения-98-ДЕП» и штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП к инактивации АЭЭИ и стерилизующей очистке ПГМГ | ||||||||
| №№ п/п | А №1707 «Армения-98-ДЕП» | А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП | ||||||
| после культивирования | после инактивации и очистки | после культивирования | после инактивации и очистки | |||||
| ВСБ мкг/мл | 146S+75S мкг/мл | ВСБ мкг/мл | 146S+75S мкг/мл | ВСБ мкг/мл | 146S+75S мкг/мл | ВСБ мкг/мл | 146S+75S мкг/мл | |
| 1. | 2,54 | 1,76 | 2,72 | 2,05 | 2,38 | 1,27 | 2,14 | 1,18 |
| 2. | 2,31 | 1,19 | 1,89 | 1,27 | 2,71 | 1,83 | 2,27 | 1,61 |
| 3. | 2,34 | 2,03 | 2,56 | 1,86 | 2,93 | 1,72 | 2,50 | 1,48 |
| 4. | 1,17 | 0,94 | 1,25 | 0,75 | 3,12 | 1,80 | 2,69 | 1,93 |
| 5. | 2,06 | 1,34 | 2,15 | 1,44 | ||||
| 2,09±0,31 | 1,48±0,25 | 2,10+0,34 | 1,48±0,30 | 2,64+0,19 | 1,59±0,2 | 2,35±0,11 | 1,53+0,12 | |
| р<0,001 | р<0,01 | р<0,001 | р<0,025 | р<0,001 | р<0,001 | р<0,001 | р<0,005 |
| Таблица 10 Результаты испытания адсорбат-вакцины против ящура типа А из штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП | |||||
| Кол-во привитых жив-х | Прививная доза (мл) | Кол-во 146S+75S компонентов в прививной дозе | Результаты контрольного заражения на 21 день после вакцинации | Количество ВНА (лог2) в сыворотке крови на 21 день после вакцинации | |
| первичные афты | генерализация | ||||
| 5 | 2 | 6,0 | 4/5 | 0/5 | 5,15±0,19 р<0,001 |
| Контроль-2 | - | - | 2/2 | 2/2 |
1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа А, коллекция ФГУ ВГНКИ А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, в эффективном количестве.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 мл готового препарата.
5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адъювант-сорбент гидроокись алюминия (ГОА).
6. Вакцина по п.5, отличающаяся тем, что она содержит ГОА предпочтительно в количестве 1132,0-2108,0 мкг в 1 мл готового препарата.
7. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адъювант сапонин.
8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что она содержит адъювант сапонин предпочтительно в количестве 750,0 мкг в 1 мл готового препарата.
9. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит поддерживающую среду.
10. Вакцина по п.9, отличающаяся тем, что она содержит поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг в 1 мл готового препарата.
11. Вакцина по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг:
| Антигенный материал | Не менее 3,0 |
| ГОА | 132,0-2108,0 |
| Сапонин | 50,0 |
| Поддерживающая среда | До 1000000,0 |
