Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических боевых отравляющих веществ

Изобретение относится к области детоксикации фосфорорганических боевых отравляющих веществ (БОВ) нервно-паралитического действия, а именно к способам ферментативного гидролиза зарина, зомана и Vx. Способ включает введение полигистидинсодержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы, выделенного из штамма бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29, в реакционную смесь, содержащую БОВ в концентрации до 10^-2 М. Способ проводят при рН 7,5-11,0, а полигистидинсодержащий полипептид используют в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, а также в виде клеточного гомогената. Изобретение позволяет проведение детоксикации БОВ, включая Vx, в виде чистых веществ и в составе сложных по химическому составу реакционных массах, обеспечивает 10-кратное снижение расхода фермента, вводимого в реакционную среду, а также позволяет решить существенную экологическую и экономическую проблему, связанную с утилизацией реакционных масс, остающихся после химического уничтожения БОВ.

 

Изобретение относится к области детоксикации фосфорорганических боевых отравляющих веществ (БОВ) нервно-паралитического действия, а именно к способам ферментативного гидролиза зарина, зомана и Vx в виде чистых веществ и в сложных по химическому составу композитах, в том числе в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения БОВ.

Согласно Международной конвенции о химическом разоружении [United Nation, Convention on the prohibition of the development, production, stockpiling and use of chemical weapons and on their destruction, corrected version in accordance with Depositary Notification C.N. 246. 1994.] на территории Российской Федерации должно быть уничтожено 40 тыс. т отравляющих веществ, в том числе 32,3 тыс. т фосфорорганических БОВ смертельного действия (зарин, зоман и типа Vx) [Белецкая И.П., Новиков С.С., Химическое оружие в России // Вести. РАН, 1995, 65, №2, 99-111]. Уничтожение химического оружия является чрезвычайно важной задачей и требует разработки оптимальных безопасных технологических решений, основанных на высокой эффективности разложения высокотоксичных БОВ.

Известен целый ряд способов уничтожения фосфорорганических БОВ в результате высокотемпературных воздействий (плазменный пиролиз, сжигание, переплавка вместе с металлом и т.п.) [Патент РФ №2123368, 1998, Способ утилизации отравляющего вещества типа Vx, A 62 D 3/00; Патент РФ №2163345, 2001, Способ уничтожения отравляющих веществ и ядохимикатов боевого и промышленного назначений, F 42 D 5/04, A 62 D 3/00; Патент РФ №2175110, 2001, Способ уничтожения боевых отравляющих веществ и устройство для его реализации, F 42 D 5/04, G 21 J 3/00], предусматривающих применение температур в диапазоне 390-3000°С.

Основными недостатками таких технологических решений являются их высокая стоимость и необходимость использования специального технического оборудования, высококвалифицированного персонала и колоссальные энергетические затраты.

Ряд способов детоксикации фосфорорганических БОВ предложен на основе проведения щелочного гидролиза нейротоксинов под действием нуклеофильных агентов, а именно 10-40%-ного (по массе) водного раствора гидроксида натрия или калия, аммонийных соединений, при нагревании до 40-300°С [Патент РФ №2182505, 2002, Непрерывный способ детоксикации отравляющих веществ и токсичных соединений, A 62 D 3/00; Патент РФ №2209103, 2003, Способ уничтожения люизита, A 62 D 3/00; Патент РФ №2123368, 1998, Способ утилизации отравляющего вещества типа V, A 62 D 3/00; Патент РФ №2227052, 2004, Способ уничтожения отравляющих веществ, A 62 D 3/00]. Реализация этих способов с применением концентрированных щелочных растворов также требует специального оборудования, выполненного из коррозионно-стойких материалов, а также энергетических затрат для обеспечения требуемого температурного режима проведения процессов.

В последнее время быстро растет интерес к экологически безопасным, легко реализуемым и экономически выгодным способам детоксикации БОВ, основанным на применении ферментов, способных катализировать гидролиз зарина, зомана и Vx при значениях рН, близких к нейтральным, и при температурах окружающей среды [Kolakowski J.E., DeFrank J.J., Harvey S.P., Szafraniec L.L., Beaudry W.T., Lai K., Wild J.R., Enzymatic Hydrolysis of the Chemical Warfare Agent VX and its Neurotoxic Analogues by Organophosphorus Hydrolase, Biocatal. Biotransform., 1997, 15, 297-302; Hoskin F.C., Walker J.E., Dettbarn W.-D., Wild J.R., Hydrolysis of tetriso by an enzyme derived from Pseudomonas diminuta as a model for the detoxication of O-ethyl S-(2-diisopropylaminoethyl) methylphosphonothiolate (VX), Biochem. Pharm., 1995, 49, 711-716; Rastogi V.K., DeFrank J.J., Cheng T.-C., Wild J.R., Enzymatic hydrolysis of Russian-Vx by organophosphorus hydrolase, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 241, 294-299; LeJeune, K.E., Mesiano, A.J., Bower, S.B., Grimsley, J.K., Wild, J.R., Russell, A.J., Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agents degradation. Biotechnol. Bioeng., 1997, 54 (2), 105-114].

На сегодняшний день известны два фермента - органофосфатгидролаза (ОРН) (арилдиалкилфосфатаза, фосфотриэстераза, ЕС 3.1.8.1) и кислая органофосфтангидролаза (зоманаза, ЕС 3.1.8.2), для которых показан эффективный гидролиз БОВ, но при этом только ОРН катализирует гидролиз всех трех основных БОВ (зарина, зомана и Vx), тогда как другой указанный фермент способен гидролизовать только фторсодержащие фосфорорганические вещества (зоман и зарин) [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов, Успехи биолог. химии, 2004, Т.44, 307-340].

Известен способ обезвреживания и устранения химической и/или биологической угрозы в виде БОВ и/или биологических агентов, предусматривающий применение смеси фермента в свободном или иммобилизованном виде, взятого из ряда ОРН, кислая органофосфатангидролаза, хитиназа, лизоцим, коллагеназа, щелочная фосфатаза, и биоцидов (бензалконий хлорида, триклозан и стрептомицин), составляющих 0,5-10% от общей смеси с ферментом [Patent WO 01/56380 A1, 2001, Chemical and / or biochemical decontamination system; A 61 K 38/43, 38/46, 33/32]. Такая сложная смесь может быть применена напрямую или введена в состав забуференной композиции с пенообразующим веществом, например пожарной пеной. Концентрация фермента при этом составляет 8-700 мг/л обрабатываемого объекта. Показано, что такой способ позволяет за 60 мин гидролизовать чистое вещество зарин (концентрация авторами не указана) на 99% при использовании 8 мг высокоочищенного препарата ОРН в составе смеси с биоцидом для обработки 1 л раствора вещества (рН 7,5-8,0).

Явными недостатками указанного способа являются нестабильность фермента в смеси с биоцидами и необходимость применения фермента в больших количествах для достижения требуемой степени гидролиза БОВ при минимальной продолжительности процесса.

Другой способ, обеспечивающий гидролиз фосфорорганических соединений, включая химические БОВ, основан на применении рекомбинантной кислой органофосфатангидролазы, которая может быть представлена в растворимой и лиофилизованной форме для деградации веществ в объеме или на поверхности [Patent US 5928927, 1999; Enzymatic detoxification of organophosphorus compounds, C 12 N 009/16; C 12 N 015/55; C 12 N 015/70; B 09 B 003/00].

Этот способ имеет существенные недостатки, проявляющиеся в низкой активности фермента и длительных временах гидролиза веществ, поэтому те же авторы предлагают усовершенствованный способ ферментативного гидролиза БОВ, согласно которому, в состав композиции с ферментом, гидролизующим БОВ, дополнительно вводят ионы аммония и металлов, а также биодеградируемые пенообразные материалы (AFC-380.RTM., BioSolve.RTM., Cold Fire-Retardant.RTM., Cold Fire.RTM., BV 406LF.RTM. и Odor Seal.RTM), обеспечивающие высокую каталитическую активность системы. Согласно этому способу, при введении 12 мг фермента в 1 л гидролизуемого вещества за 40 мин при рН 8,0 происходит детоксикация 4,42×10^-6 М зарина или 1,50×10^-6 М зомана.

Явными недостатками способа является использование в нем фермента, принципиально не способного гидролизовать Vx, а только зарин и зоман, к тому же его применение может быть реализовано только в присутствии дополнительных активаторов и стабилизаторов.

Согласно известному способу [Patent US 5589386, 1996; Hydrolysis of cholinesterase inhibitors using parathion hydrolase, C 12 S 013/00; C 12 N 015/00; C 12 N 001/20; C 12 N 001/14], гидролиз чистых веществ (зарина и зомана) проводят с помощью ОРН в присутствии ионов металлов (Со²⁺ и Zn²⁺), для этого к реакционной смеси, состоящей из буферного раствора (рН 7,0-8,5) отравляющего вещества (зарина или зомана), добавляют ОРН. Способ позволяет за 30 мин гидролизовать чистые вещества, а именно 5×10^-3 М зарина или зомана, при использовании соответственно 1 мг и 10 мг фермента на 1 л раствора отравляющего вещества в 20 мМ PIPES буфере (рН 7,0) или 20 мМ Трис буфере (рН 8,5), содержащих 390 мМ KCl и 40 мМ NaCl.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу ферментативного гидролиза БОВ, принято за прототип.

При очевидной простоте технической реализации способ требует применения больших концентраций фермента, что является существенным недостатком этого способа. Гидролиз Vx используемым в способе ферментом теоретически возможен, но авторами способа не показан и не обсуждается тогда, как именно это вещество является самым токсичным из трех ранее указанных БОВ (летальные дозы соответственно для зомана, зарина и Vx составляют 0,14 мг/кг, 0,05 мг/кг и 0,008 мг/кг). К тому же в реальных условиях требуется детоксикация БОВ не в виде чистых веществ, а в составе реакционных масс, образующихся после проведения химического уничтожения БОВ, согласно принятому в Российской Федерации промышленному методу [Жданов В.А., Кошелев В.М., Новиков В.К., Шувалов А.А. Методы уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ, Рос. хим. журнал, 1993, Т.37, №3, с.22-25], и содержащих химически не прореагировавшие БОВ (10^-8÷Ю^-5 М). Прототип не учитывает такого способа проведения ферментативного гидролиза БОВ, что обусловлено низкой активностью используемого фермента.

Задачей предлагаемого изобретения является способ ферментативного гидролиза фосфорорганических БОВ, позволяющий осуществлять высокоэффективную детоксикацию смертельно опасных нейротоксинов как в виде чистых веществ, так и в составе реакционных масс при использовании более низких концентраций фермента, вводимых в реакцию.

Поставленная задача решается тем, что полигистидинсодержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, а также в виде клеточного гомогената вводится в реакционную смесь при рН 7,5-11,0, содержащую БОВ в концентрации до 10^-2 М.

Применение полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, выделенного из штамма бактерий E.coli ЦКМИБХ-29 (штамм депонирован 4 июля 2003 г. в Центральной коллекции микроорганизмов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина - Ю.А.Овчинникова РАН), гарантирует возможность масштабирования предлагаемого способа гидролиза БОВ, так как применение простой процедуры выделения пептида с использованием металл-хелатирующей хроматографии, широко применяемой для выделения полигистидинсодержащих белков (Тегре К. Overview of tag protein fusion: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.60. p.523-533), обеспечивает возможность его получения в промышленных количествах для практического использования.

Предлагаемый к применению вместо нативного фермента ОРН полигистидинсодержащий пептид со свойствами ОРН характеризуется улучшенными каталитическими характеристиками по различным субстратам, более широким диапазоном рН действия и повышенной температурной стабильностью, что должно обеспечить существенное улучшение показателей процесса детоксикации БОВ, а также гарантирует возможность проведения гидролиза БОВ в виде чистых веществ и в сложных по составу реакционных массах, образующихся после реализации технологии химического уничтожения БОВ.

Заявляемый способ ферментативного гидролиза фосфорорганических БОВ осуществляется тем, что к отравляющему веществу (10^-8÷10^-2 М), находящемуся в растворе при рН 7,5-11,0 в виде чистого вещества или в составе реакционных масс, полученных после химической детоксикации БОВ, добавляется раствор полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, предварительно разбавленный до необходимой концентрации по белку так, чтобы он обеспечивал 100% гидролиз БОВ в течение 30 мин.

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является проведение детоксикации БОВ, включая Vx, в сложных по химическому составу реакционных массах, а не только в виде чистых веществ, и значительное снижение расхода фермента, вводимого в реакционную среду.

Кроме того, заявляемое техническое решение позволяет решить существенную экологическую и экономическую проблему, связанную с утилизацией реакционных масс, которые, согласно принятым нормам, подлежат длительному хранению, в ходе которого БОВ должны подвергаться медленной деградации, и последующей битуминизации во избежание контакта живых объектов с непрореагировавшими концентрациями БОВ.

Предлагаемый способ позволяет осуществить детоксикацию реакционных масс и избежать необходимости их хранения и соответственно элиминировать все затраты, связанные с этим (применение специальной тары, проведение фасовочных мероприятий, использование специальных помещений, привлечение обслуживающего персонала и т.д.), а также отказаться от необходимости их битуминизации.

Таким образом, благодаря предлагаемому способу может быть существенно упрощено экономическое и техническое решение проблемы утилизации реакционных масс.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Гидролиз зарина в виде чистого вещества под действием полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, введенного в реакцию виде раствора.

Для получения препарата полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН (His-OPH) выращивают клетки бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29 [Свидетельство о депонировании штамма микроорганизма от 04.07.2003] на среде следующего состава: триптон - 12,0 г/л, дрожжевой экстракт - 24,0 г/л, глицерин - 4,0 мл/л, КН₂PO₄ - 6,95 г/л, К₂HPO₄×3Н₂O - 12,54 г/л, в которую добавляют CoCl₂×6Н₂О (10^-4 М), а также ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). 16-часовой инокулят вносят в колбу, содержащую 100 мл питательной среды, культуру выращивают при 30°С и постоянном перемешивании (200 об/мин) до тех пор, пока оптическая плотность при длине волны 540 нм не достигнет 0,6, после чего добавляют изопропил-β,D-галактопиранозит (0,4 мМ). Клетки культивируют в течение 24 ч. Полученную биомассу отделяют центрифугированием (5000 g, 15 мин), взвешивают и ресуспендируют в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 300 мМ хлорида натрия. Клетки разрушают обработкой ультразвуком (частота 44 кГц), и осадок клеточного дебриса отделяют центрифугированием (15000 g, 30 мин). К супернатанту добавляют равный объем 50% суспензии Ni-NTA агарозы в 50 мМ фосфатном буфере (рН 8,0) и перемешивают. Колонку заполняют полученной суспензией, промывают элюирующим буфером (50 мМ фосфат натрия (рН 6,0), 300 мМ хлорид натрия, 10% глицерин) и элюируют фермент с колонки градиентным раствором имидазола (от 0 до 0,5 М). Полученные фракции, содержащие His-OPH, объединяют и подвергают диализу против 20 мМ фосфатно-карбонатного буфера (рН 8,5). В результате получают препарат His-OPH с концентрацией 5 мг белка/мл и 98% гомогенностью по белку.

Перед внесением в реакцию гидролиза БОВ препарат His-OPH разбавляют до нужной концентрации белка буфером, применение которого предусмотрено в эксперименте. Здесь препарат His-OPH разбавляют до концентрации 0,1 мг белка на 1 мл 20 мМ фосфатно-карбонатного буфера (рН 8,5).

Концентрацию отравляющего вещества в реакционной смеси до начала ферментативной реакции и после ее окончания определяют с помощью автоматического проточно-инжекционного экспресс-анализатора фосфорорганических соединений по методу, основанному на ингибировании холинэстераз [Еременко А.В., Курочкин И.Н., Сиголаева Л.В., Еремеев Н.Л., Бармин А.В., Морзунова Т.Г., Кондрашов Ю.В., Райнина Е.И., Варфоломеев С.Д., Завьялова Н.В., Холстов В.И. Автоматический проточно-инжекционный экспресс-анализатор фосфорорганических соединений и других ингибиторов холинэстераз, 2004, №3-4, с.26-35].

Для проведения гидролиза БОВ при температуре 20°С в герметичную емкость, содержащую 1 л 5×10^-3 М раствора чистого вещества зарина в буфере (10 мМ HEPES, рН 7,5), добавляют 1 мл раствора препарата His-OPH с концентрацией 0,1 мг белка/мл 20 мМ фосфатно-карбонатного буфера (рН 8,5). Через 30 мин устанавливают 100% гидролиз БОВ. Таким образом, для полного гидролиза той же концентрации чистого зарина в тех же условиях, что указаны в прототипе, фермента требуется в 10 раз меньше.

Пример 2. Гидролиз зомана в виде чистого вещества под действием полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, исходно взятого в виде лиофилизованного препарата.

Предлагаемый способ гидролиза БОВ реализуется с использованием лиофилизованного препарата His-OPH.

Для получения лиофильно высушенного препарата пептида со свойствами ОРН растворимый препарат His-OPH с 98% гомогенностью по белку, исходно полученный как описано в Примере 1, замораживают при - 20°С и высушивают на лиофильной сушилке при остаточном давлении в камере сублиматора 0,2-0,3 мБ до остаточной влажности препарата 6%.

Лиофилизованный препарат His-OPH перед использованием в процессе гидролиза регидратируют, для этого навеску сухого препарата растворяют в 20 мМ фосфатно-карбонатном буфере (рН 8,5) так, чтобы получить концентрацию 1,25 мг белка на 1 мл раствора.

Для проведения гидролиза БОВ при температуре 20°С в герметичную емкость, содержащую 1 л 5х10^-3 М раствора чистого вещества зомана в буфере (10 мМ фосфатно-карбонатном буфере (рН 8,5), добавляют 1 мл раствора регидратированного лиофилизованного препарата His-OPH с концентрацией 1,25 мг белка/мл. Через 30 мин устанавливают 100% гидролиз БОВ. Таким образом, для полного гидролиза той же концентрации чистого зарина в тех же условиях, что указаны в прототипе, фермента требуется в 8 раз меньше.

Пример 3. Гидролиз Vx в виде чистого вещества под действием полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, введенного в реакцию в виде раствора.

Для гидролиза БОВ, согласно заявляемому способу, используют препарат His-OPH с 98% гомогенностью по белку, исходно полученный как описано в Примере 1. Перед внесением в реакцию гидролиза БОВ препарат His-OPH разбавляют до концентрации 1,0 мг белка/мл 10 мМ фосфатно-карбонатного буфера (рН 8,0).

При температуре 20°С в герметичную емкость, содержащую 1 л 1×10^-2 М раствора чистого вещества Vx в буфере (10 мМ фосфатно-карбонатном буфере, рН 8,0), добавляют 1 мл раствора препарата His-OPH с концентрацией 1,0 мг белка/мл. Через 30 мин устанавливают 100% гидролиз БОВ. В прототипе гидролиз Vx не показан.

Пример 4. Гидролиз зарина в составе реакционных масс под действием полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, введенного в реакцию в виде раствора.

Для гидролиза БОВ, согласно заявляемому способу, используют препарат His-OPH с 98% гомогенностью по белку, исходно полученный как описано в Примере 1. Перед внесением в реакцию гидролиза БОВ препарат His-OPH разбавляют до концентрации 0,125 мг белка/мл 10 мМ фосфатно-карбонатного буфера (рН 8,5).

Для гидролиза берут заринсодержащие реакционные смеси, имеющие следующий состав: 11% (вес.) смешанного эфира СН₃Р(O)(ОС₃Н₇i)(ОСН₂СН₂NH₂), 38% (вес.) кислого эфира СН₃Р(O)(ОС₃Н₇i)(ОН), 20% (вес.) моноэтаноламина НОСН₂CH₂NH₂, 25% (вес.) фторгидрата моноэтаноламина НОСН₂CH₂NH₂ HF, 1% O,O-диизопропилметилфосфоната СН₃Р(O)(ОС₃Н₇i)₂, 1% изопропилового спирта, остальное (до 100%) - вода.

При температуре 20°С в герметичную емкость, содержащую 1 л разбавленных 10 мМ HEPES буфером (рН 7,5) в 100 раз исходных реакционных масс, где конечная концентрация зарина составляет 6×10^-6 М, добавляют 1 мл раствора препарата His-OPH с концентрацией 0,125 мг белка/мл. Через 30 мин устанавливают 100% гидролиз БОВ в составе реакционных масс.

Пример 5. Гидролиз Vx в составе реакционных масс под действием полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, введенного в реакцию в составе клеточного гомогената.

Для гидролиза БОВ, согласно заявляемому способу, используют клеточный гомогенат, содержащий His-OPH.

Для получения клеточного гомогената клетки бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29 выращивают, как описано в Примере 1. Полученную биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (5000 g, 15 мин), взвешивают и ресуспендируют в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 300 мМ хлорида натрия. Клетки разрушают обработкой ультразвуком (частота 44 кГц), осадок клеточного дебриса отделяют центрифугированием (15000 g, 30 мин), а супернатант с общим содержанием белка 150 мг/мл далее используют для гидролиза БОВ. Компьютерная обработка с помощью Sigma Gel Program результатов электрофоретического анализа, проведенного в SDS-полиакриламидном геле, белкового состава полученного препарата, показывает, что His-OPH в общем составе белков при такой процедуре получения клеточного гомогената составляет 12%, то есть 18 мг/мл клеточного гомогената.

Для гидролиза берут Vx-содержащие реакционные смеси, имеющие следующий состав: 12% (вес.) O,O-диизобутиллметилфосфоната СН₃Р(O)(ОС₄Н₉i)₂, 20% калиевой соли O-изобутилметилфосфоната СН₃Р(O)(ОС₄Н₉i)(ОК), 10% (вес.) калиевой соли 2-диэтиламиномеркаптана KSCH₂CH₂N(C₂H₅)₂, 12% (вес.) 2-(диэтиламино)-этилизобутилсульфида iC₄H₉SCH₂CH₂N(C₂H₅)₂, 10% (вес.) изобутилового спирта, 30% N-метилпирролидона, 3% капролактама, 1% изобутилата калия, остальное (до 100%) - вода.

При температуре 20°С в герметичную емкость, содержащую 1 л разбавленных 10 мМ карбонатным буфером (рН 11,0) в 100 раз исходных реакционных масс, где конечная концентрация Vx составляет 6×10^-8 М, добавляют 0,5 мл клеточного гомогената, содержащего 18 мг His-OPH/мл. Через 30 мин устанавливают 100% гидролиз БОВ в составе реакционных масс.

Пример 6. Гидролиз Vx в составе реакционных масс под действием полигистидинсодержащего пептида со свойствами ОРН, введенного в реакцию в виде раствора.

Для гидролиза БОВ, согласно заявляемому способу, используют препарат His-OPH с 98% гомогенностью по белку, исходно полученный как описано в Примере 1. Перед внесением в реакцию гидролиза БОВ препарат His-OPH разбавляют до концентрации 2,5 мг белка/мл 10 мМ HEPES буфера (рН 7,5).

Для гидролиза берут Vx-содержащие реакционные смеси, имеющие следующий состав: 15% (вес.) O,O-диизобутиллметилфосфоната СН₃Р(O)(ОС₄Н₉i)₂, 15% калиевой соли O-изобутилметилфосфоната СН₃Р(O)(ОС₄Н₉i)(ОК), 7% (вес.) калиевой соли 2-диэтиламиномеркаптана KSCH₂CH₂N(C₂H₅)₂, 15% (вес.) 2-(диэтиламино)-этилизобутилсульфида iC₄H₉SCH₂CH₂N(C₂H₅)2, 10% (вес.) изобутилового спирта, 30% N-метилпирролидона, 3% капролактама, 1% изобутилата калия, остальное (до 100%) - вода.

При температуре 20°С в герметичную емкость, содержащую 1 л разбавленных 10 мМ HEPES буфером (рН 7,5) в 100 раз исходных реакционных масс, где конечная концентрация Vx составляет 7×10^-6 М, добавляют 1 мл раствора препарата His-OPH с концентрацией 2,5 мг белка/мл. Через 30 мин устанавливают 100% гидролиз БОВ в составе реакционных масс.

Таким образом, предлагаемое изобретение по сравнению с аналогами и прототипом обладает рядом существенных преимуществ:

- способ проведения ферментативного гидролиза БОВ в виде чистых веществ с применением полигистидинсодержащего полипептида со свойствами ОРН позволяет снизить количество фермента, вводимого в реакцию, в 8-10 раз для достижения аналогичного результата (Примеры 1 и 2);

- способ позволяет проводить гидролиз БОВ в составе реакционных масс, полученных после химической детоксикации (Примеры 4-6). Ферментативный гидролиз БОВ в составе реакционных масс показан впервые;

- способ позволяет проведение эффективного гидролиза Vx (Примеры 3, 5, 6);

- способ позволяет проведение высокоэффективного ферментативного гидролиза БОВ без введения каких-либо дополнительных стабилизаторов или активаторов для фермента.

Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических боевых отравляющих веществ, отличающийся тем, что полигистидинсодержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, выделенный из штамма бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29, в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, а также в виде клеточного гомогената вводится в реакционную смесь при рН 7,5-11,0, содержащую БОВ в концентрации до 10^-2 М.