Способ разделения клеток спермы, несущих x-хромосому, и клеток спермы, несущих y-хромосому
Изобретение относится к области искусственного осеменения. Способ содержит следующие этапы: отбор клеток спермы от самца определенного вида млекопитающего за исключением человека; ввод клеток спермы в поток текучей среды; анализ клеток спермы, захваченных потоком текучей среды; определение количества ДНК в ядрах клеток спермы; облучение окрашенной ДНК в ядрах клеток спермы; детектирование флуоресцентного света, излучаемого облученной окрашенной ДНК, находящейся в ядрах клеток спермы; дифференцирование клеток спермы на основе количества ДНК внутри ядер клеток спермы, находящихся в данной капельке; электростатическое отклонение каждой из капелек; раздельное накопление капелек на основании количества ДНК внутри ядер клеток спермы, захваченных в каждую капельку; разделение дифференцированных клеток спермы на популяции, несущие Х-хромосому, и популяции, несущие Y-хромосому; и получение популяций интактных клеток спермы, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, со степенью чистоты выше, чем 90% для каждой. Способ позволяет улучшить разделение сперматозоидов и повысить его скорость. 19 з.п. ф-лы, 28 ил.
I. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области отделения популяции сперматозоидов, несущих Х-хромосому или Y-хромосому с высокой степенью чистоты, и технологии отделения сперматозоидов, частиц или событий на основе характеристик дифференциации таких как масса, объем, содержание ДНК или тому подобное.
II. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изолированные популяции сперматозоидов, несущих Х-хромосому или Y-хромосому с высокой степенью чистоты, могут использоваться для проведения искусственного осеменения in vitro или in vivo или для оплодотворения яйцеклетки или ооцитов различных млекопитающих, таких как полорогие жвачные животные, лошади, бараны, козы, свиньи, собаки, кошки, верблюды, слоны, быки, буйволы или подобные животные. См. также патент США 5,135,759, приведенный здесь в качестве ссылки.
Однако обычные способы разделения сперматозоидов на популяции, несущие Х-хромосому и несущие Y-хромосому, позволяют получить популяции сперматозоидов с низкой степенью чистоты. Независимо от способа разделения, при разделении образцов сперматозоидов на популяции сперматозоидов, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, обычно не получается более высокая степень чистоты, чем 90%, 95% или выше 95%.
Был описан ряд способов разделения сперматозоидов, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, прямо или косвенно основанных на разнице размера, массы или плотности. В американском патенте №4, 474, 875 описан способ, в ходе которого ко всем клеткам сперматозоидов одновременно прикладывается выталкивающая сила, и сперматозоиды, несущие X-хромосому и несущие Y-хромосому, могут затем быть изолированы в различных местах в среде разделения. В американском патенте №5,514,537 описан способ, с помощью которого сперматозоиды пропускают через колонку, заполненную шариками двух разных размеров. Более крупные сперматозоиды, несущие Х-хромосому, изолируются в слое, содержащем более крупные шарики, в то время как меньшие по размеру сперматозоиды, несущие Y-хромосому, изолируются в слое, содержащем мелкие шарики. В американском патенте №4,605,558 описано, что сперматозоидам может быть придана способность различного отклика на градиент плотности, и в американском патенте №4,009,260 используется разница в скорости миграции, или в скорости проплывания сперматозоидов, несущих Y-хромосому, и сперматозоидов, несущих Х-хромосому, через колонку с замедляющей средой.
Общая проблема каждого из вышеуказанных способов состоит в том, что в них производится воздействие на все сперматозоиды в "массе", что означает, что все сперматозоиды проходят одну и ту же обработку одновременно и что клетки сперматозоидов, несущие Y-хромосому, выходят быстрее, раньше или в другом месте, чем клетки сперматозоидов, несущих Х-хромосому. При этом не обеспечивается доступ к отдельным клеткам сперматозоидов и фактически не производится "измерение" объема, массы, плотности или других характеристик отдельной клетки сперматозоида. Поочередная оценка клеток сперматозоидов позволяет получить преимущества, состоящие в том, что можно отслеживать действительно проходящий процесс разделения, и при этом могут быть получены объективные количественные данные уже в ходе процесса разделения, и можно изменять параметры разделения в соответствии с требованиями. Кроме того, известные способы невозможно совместить с устройствами сортировки потока клеток.
Использование способов очной цитометрии для разделения сперматозоидов также было описано в литературе. При использовании этих способов сперматозоиды могут быть окрашены флуорохромом и могут быть выстроены так, что они будут протекать в виде узкого потока или полосы, проходящей мимо источника возбуждения или облучения, такого как лазерный луч. По мере того как окрашенные частицы или клетки проходят мимо источника возбуждения или облучения, флуорохром излучает флуоресцентное свечение. Флуоресцентное свечение может собираться узлом оптических линз, фокусироваться на детектор, такой как трубка фотоумножителя, который генерирует и усиливает электронный сигнал, который затем может анализироваться с помощью анализатора. Данные затем могут представляться в виде хроматограмм или гистограмм множественных или одиночных параметров. Количество клеток и уровень флуоресценции на клетку может использоваться в качестве координат. См. патент США №5,135,759, приведенный здесь в качестве ссылки. Однако в этом способе остаются не решенными множество проблем, и разделение популяций клеток сперматозоидов, несущих Х-хромосому или Y-хромосому, с высокой степенью очистки является трудноосуществимой.
Существенная проблема, связанная с обычными способами проточной цитометрии, состоит в необходимости ориентации объектов, частиц или клеток, заключенных в оболочку потока текучей среды. Эта проблема становится особенно острой, когда объект или клетки имеют неоднородную форму по разным осям, такие, например, как сперматозоиды. Один из аспектов этой проблемы может состоять в установлении исходной ориентации объекта в оболочке потока текучей среды. Второй аспект этой проблемы может представлять собой необходимость поддержания ориентации объекта по отношению к детектору (трубке фотоумножителя или тому подобное) в течение периода, когда производится измерение света, излучаемого объектом.
Другая существенная проблема, связанная с использованием обычных способов проточной цитометрии, состоит в неспособности заключать объекты или клетки в капельках жидкости. В частности, когда капельки формируются вокруг объектов с неоднородной формой, они могут иметь недостаточный размер для того, чтобы полностью охватить все характерные элементы объектов или клеток. Например, при выполнении операции проточной цитометрии, как описано выше, капельки могут формироваться с очень высокой скоростью, от 10000 до 90000 капелек в секунду, и в некоторых вариантах применения - 80000 капелек в секунду. Когда сперматозоиды обволакиваются капельками, в особенности при таких высоких скоростях, часть хвостика или шейки может не быть заключена в капельку. Эта часть хвостика или шейки, не заключенная в капельку, может затем реагировать с соплом или может реагировать со средой, окружающей капельку так, что это влияет на последующее формирование капельки или на соответствующее отклонение капельки. В результате некоторые из сперматозоидов не могут быть подвергнуты анализу вообще, что снижает эффективность процедуры, или по ним не может быть принято достаточное надежное решение с тем, чтобы назначить их к той или другой популяции, либо они могут быть отражены по ошибочным траекториям, или может происходить комбинация этих факторов.
Другая существенная проблема, связанная с обычными технологиями проточной цитометрии, а также с другими технологиями, представляет собой совпадение измеряемых событий. Один аспект этой проблемы может состоять в том, что падающий поток света от первого события продолжает производить сигналы после того, как начнет генерировать сигнал падающего потока света от второго события. При этом два события остаются, по меньшей мере, частично неразделенными друг от друга. Другой аспект этой проблемы может состоять в том, что два или большее количество событий инициируются одновременно, и падающий поток света содержит вклад всех событий. Как таковое, множество событий не может быть разрешено вообще и объекты, соответствующие множеству событий, могут быть неправильно отнесены к популяции или не отнесены ни к какой популяции вообще, или могут иметь место оба случая. В частности, при проточной цитометрии отдельные частицы, объекты, клетки или сперматозоиды в потоке суспензии протекают через пучок света, с которым они взаимодействуют, вырабатывая измеримый отклик, такой, как флуоресцентная эмиссия. В обычной проточной цитометрии сперматозоиды, окрашенные препаратом Hoechst, пересекают луч лазера, что вызывает эмиссию флуоресцентного света. Эмиссия флуоресцентного света от возбужденного флуорохрома, связанного с ДНК, может быть достаточно яркой для получения потока электронов в обычных трубках фотоумножителя в течение некоторого периода времени после окончания собственно события эмиссии. Кроме того, в обычном проточном цитометре луч лазера имеет высоту 30 мкм и ширину приблизительно 80 мкм. Ядро сперматозоида быка, который содержит флюорохром, связанный с ДНК, может иметь приблизительно 9 мкм в длину, так что высота луча лазера будет приблизительно в три (3) раза больше, чем ядро. Эта разница может обеспечить возбуждение лазером связанного флюорохрома, содержащегося в более, чем одном сперматозоиде, находящихся в пределах лазерного луча одновременно. Каждая из этих проблем обычной проточной цитометрии снижает возможность разрешения отдельных событий друг от друга.
Другая существенная проблема, связанная с обычными способами проточной цитометрии и другими способами, состоит в том, что объекты с неоднородной формой, такие как сперматозоиды, генерируют различные сигналы (по форме, длительности или количеству) в зависимости от их ориентации на пути возбуждения, регистрации. Как таковые, отдельные представители однородной популяции могут генерировать широкий спектр характеристик эмиссии, которые могут перекрываться характеристиками эмиссии отдельных представителей другой однородной популяции, исключая или снижая способность разрешения отдельных представителей двух популяций.
Другая существенная проблема, связанная с обычными способами проточной цитометрии и с другими способами, состоит в том, что объекты неравномерно экспонируются источником возбуждения. Обычные оптические средства формирования луча не могут обеспечить равномерную экспозицию лазерным лучом, когда объекты находятся вблизи от внешнего контура луча.
Другие существенные проблемы, связанные с обычными технологиями проточной цитометрии, состоят в том, что объекты, такие как сперматозоиды, могут экспонироваться источником возбуждения в течение слишком длительного периода времени. Облучение клеток таких, как сперматозоиды, лазерным светом может привести к повреждению клеток или ДНК, содержащейся в них.
Другая существенная проблема, связанная с обычными способами проточной цитометрии, состоит в том, что в сопле инжекционной трубки могут образовываться разрывы ламинарного потока. Разрыв ламинарного потока может изменять ориентацию объектов с неоднородной формой, находящихся в потоке, и уменьшать скорость сортировки, а также чистоту сортируемых популяций сперматозоидов, несущих Х-хромосому, или сперматозоидов, несущих Y-хромосому.
С технологиями, в которых используются красители, связанные с ядерной ДНК клеток сперматозоидов, связаны другие проблемы. Прежде всего, поскольку ДНК в ядре является в высокой степени сжатой и имеет плоскую форму, стехиометрическое окрашивание ДНК может быть трудноосуществимым или невозможным. Во-вторых, окрашенное ядро может иметь высокий коэффициент преломления. В-третьих, краситель, связанный с ДНК для формирования комплекса ДНК-краситель, может ухудшить способность к оплодотворению или жизнестойкость получаемых в последствии эмбрионов. В-четвертых, комплекс ДНК-краситель обычно облучают ультрафиолетовым светом для получения флуоресценции красителя. Такое облучение может отрицательно влиять на жизнестойкость сперматозоидов. Вследствие возможных перечисленных выше проблем может быть предпочтительным использовать способ, в котором требуется применение меньшего количества красителя, или не требуется применение красителя вообще, или используется меньший уровень ультрафиолетового излучения, или такое облучение не используется вообще, или используется меньшее количество обоих этих факторов, или оба этих фактора не используются вообще.
Настоящее изобретение направлено на решение всех вышеуказанных проблем в практической области, что касается получения образцов с высокой степенью чистоты популяции клеток сперматозоидов, несущих Х-хромосому, или популяции клеток сперматозоидов, несущих Y-хромосому (живых, фиксированных, жизнестойких, не жизнестойких, не поврежденных, бесхвостых или в виде ядер), или, в общем, детектирования небольших различий в фотогенерируемом сигнале между последовательными событиями, в которых используется относительно высокий уровень падающего потока света, или обеспечения ориентации объектов с неоднородной формой в потоке текучей среды, или исключения совпадающих событий в пределах оптического пути, или удаления нежелательно ориентированных объектов из анализа.
III. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В широком смысле настоящее изобретение направлено на получение изолированных популяций сперматозоидов с высокой степенью чистоты, несущих Х-хромосому и Y-хромосому. Изолированные, не встречающиеся в природе популяции сперматозоидов, с высокой степенью очистки имеют множество вариантов применения, включая селекцию по половому признаку потомства млекопитающих, различные in vitro протоколы, такие как искусственное осеменение, коммерческие способы, включающие разведение породистых животных или мясных животных, или сохранение редких животных или животных, для которых существует опасность вымирания, которые представляют собой лишь несколько вариантов использования популяций сперматозоидов с высокой степенью очистки.
Другим аспектом в широком смысле настоящего изобретения является устройство и способы получения образцов сперматозоидов с высокой степенью чистоты, несущих Х-хромосому и Y-хромосому.
Ниже описаны конкретные варианты воплощения настоящего изобретения, которые могут использоваться в множестве вариантов применения, указанных выше, для достижения конкретных целей дифференциации между событиями яркой фотоэмиссии, имеющими незначительные различия в общем потоке света, ориентирования объектов с неоднородной формой в потоке текучей среды, минимизации совпадающих событий в пределах оптического пути, удаления сигнала, связанного с объектами с нежелательной ориентацией, находящихся в пределах оптического пути (включая удаление самих объектов), и заключения объектов с неоднородной формой внутри капельки. По существу, конкретные цели настоящего изобретения могут в достаточной степени изменяться.
Другой аспект в широком смысле настоящего изобретения состоит в получении образцов сперматозоидов, несущих X-хромосому или Y-хромосому (живых, фиксированных, жизнеспособных, нежизнеспособных, не поврежденных, бесхвостых или ядер сперматозоидов), имеющих градуированный уровень высокой степени чистоты в диапазоне 80%, 85%, 90%, 95% или даже больше, чем 95%.
Другой существенный аспект конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения может состоять в сортировке сперматозоидов на популяции, несущие Х-хромосому и несущие Y-хромосому, с высокой степенью чистоты даже при больших скоростях разделения. Разделение с высокой скоростью позволяет получать живой сперматозоид каждого пола со скоростью приблизительно 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или даже 10000 в секунду, или выше.
Другой существенный аспект конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения может состоять в том, что, по существу, устраняются или удаляются сперматозоиды (живые, фиксированные, жизнеспособные, нежизнеспособные, не поврежденные, бесхвостые или ядра спермы), имеющие нежелательную ориентацию в части возбуждения/ детектирования пути потока проточного цитометра.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является получение образцов сперматозоидов, несущих Х-хромосому, или сперматозоидов, несущих Y-хромосому, имеющих высокий уровень чистоты, для искусственного осеменения.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является обеспечение образцов сперматозоидов для осеменения in vitro, несущих X-хромосому или несущих Y-хромосому, имеющих высокий уровень чистоты.
Другим существенным аспектом конкретного варианта воплощения настоящего изобретения является предварительный выбор пола потомства самок, осемененных образцами для искусственного осеменения с высокой степенью чистоты, пола потомства яйцеклеток, оплодотворенных образцами для искусственного осеменения с высокой степенью чистоты, с уровнями успешной селекции 80%, 85%, 90%, 95% или выше, чем 95%.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является дифференциация между событиями фотоэмиссии, имеющими незначительные различия в общем излучаемом потоке света.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения может быть, по существу, устранение или уменьшение количества фонового шума, генерируемого трубкой фотоумножителя, даже при отсутствии света в течение периода после экспозиции мощным падающим потоком света.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является, по существу, устранение насыщения фотокатода трубки (трубок) фотоумножителя (фотоумножителей), используемой при проточной цитометрии или в других случаях.
Также существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является снижение количества электронов, мигрирующих из фотокатода трубки фотоумножителя на первый динод.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является уменьшение общего потока электронов на N-тый электрод трубки фотоумножителя.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является возможность увеличения потока света на фотокатод трубки фотоумножителя без пропорционального повышения величины фонового сигнала, генерируемого трубкой фотоумножителя.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является повышение отношения сигнала к фоновому сигналу для измеряемых событий фотоэмиссии.
Еще одним существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения может быть обеспечение возможности повышения усиления сигнала, генерируемого трубкой фотоумножителя, события при мощном падающем потоке света или последовательности событий при мощном падающем потоке света без насыщения фотокатода трубки фотоумножителя.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является повышение разрешающей способности хроматограмм или гистограмм, получаемых при сортировке сперматозоидов, окрашенных флуорохромом, или других клеток, или других объектов, имеющих незначительные различия в излучаемом потоке света, после возбуждения связанного флуорохрома (флуорохромов).
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является улучшение калибровки сортирующих инструментов проточных цитометров при их использовании для сортировки сперматозоидов.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является повышение скорости сортировки сперматозоидов в системе проточного цитометра.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является повышение чистоты образцов спермы, сортируемых с помощью проточной цитометрии.
Другой существенной целью конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является создание способов отсортировки спермы, несущей Х-хромосому, от спермы, несущей Y-хромосому, при незначительных различиях в количестве ДНК Y-хромосомы и ДНК Х-хромосомы по отношению к общему количеству ядерной ДНК.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является создание способов, которые улучшают видимую разрешающую способность гистограмм, генерируемых в ходе процесса сортировки сперматозоидов, несущих Х-хромосому, от сперматозоидов, несущих Y-хромосому, с помощью проточного цитометра.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является создание оптического средства, формирующего пучок, который минимизирует совпадение объектов в пределах пути возбуждения/детектирования.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является создание оптического средства, формирующего пучок, который минимизирует общую величину светового потока, экспонирующего объект, пересекающий луч возбуждения. Один из аспектов этой цели может состоять в уменьшении общей величины светового потока, экспонирующего объект. Другой аспект этой цели состоит в увеличении мощности источника света без увеличения общей величины светового потока, экспонирующего объект.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является создание оптического средства, формирующего пучок, который позволяет обеспечить равномерную экспозицию объектов, проходящих через оптический путь.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является создание сопла, которое ориентирует объекты с неоднородной формой в потоке текучей среды. Один из аспектов данной цели состоит в ориентации удлиненных объектов в одном направлении. Второй аспект этой цели может состоять в ориентации дорсолатерально сплющенных объектов в одном направлении.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является полное заключение объектов с неоднородной формой внутри капельки жидкости.
Другим существенным аспектом конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения является разделение объектов с нежелательной ориентацией от объектов с предпочтительной ориентацией в потоке текучей среды.
Другим аспектом варианта воплощения настоящего изобретения является получение технологии, обеспечивающей контраст дифференциальной интерференции, при использовании которой плоскость объекта состоит из потока текучей среды, несущего объекты, представляющие интерес, и с помощью которой плоскость изображения может использоваться для измерения сигнала от проходящих объектов.
Еще одним вариантом воплощения настоящего изобретения обеспечивается создание оптического средства, которое формирует два поперечно разделенных изображения от каждого объекта таким образом, что одно из них может использоваться для измерения действительного объема и другое может использоваться для определения ориентации. Таким образом, объекты, которые не были правильно ориентированы для обеспечения точных измерений их объема, могут быть отсортированы. Это может выполняться с помощью модификаций, в которых импульсы света, получаемые от этих двух изображений, могут детектироваться независимо, используя два микроотверстия в плоскости изображения. Оптическое средство настраивают таким образом, что первое изображение позволяет увеличить импульс света пропорционально объему объекта, и второе изображение позволяет увеличить импульс света, в зависимости от ориентации объекта, которую объект имел в момент измерения.
Другим предпочтительным вариантом воплощения настоящего изобретения является способ компенсации искажений, возникающих из-за того, что объекты находятся внутри потока текучей среды. Поток текучей среды может представлять собой, например, цилиндр воды, который действует как цилиндрическая линза, искажая, таким образом, изображение объекта. Оптически это соответствует цилиндру с более высоким коэффициентом преломления (вода), чем у окружающей среды (воздух). Компенсация, описанная в настоящем изобретении, может состоять, например, в использовании цилиндра, имеющего коэффициент преломления меньший, чем у окружающей среды, хотя в соответствии с поставленными требованиями могут быть разработаны другие элементы компенсации с различной формой и различными коэффициентами преломления. При обеспечении прохода света через такой элемент компенсации, оптическое влияние потока текучей среды может быть компенсировано с помощью точно противоположного поведения элемента компенсации.
Естественно, что другие цели настоящего изобретения будут описаны в других частях описания и формулы изобретения.
IV. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 изображен в общем виде проточный цитометр;
фиг.2 - второй обобщенный вариант проточного цитометра;
фиг.3а, в - сравнение одномерных гистограмм, получаемых с помощью проточных цитометров (№1, №2 и №3), без использования усилителя в соответствии с настоящим изобретением (фигура 3а), с одномерными гистограммами для тех же проточных цитометров с использованием конкретного варианта воплощения усилителя, в соответствии с настоящим изобретением (фигура 3в), что иллюстрирует улучшенную разрешающую способность между популяциями сперматозоидов быка, несущими Х-хромосому и Y-хромосому;
фиг.4 - одномерная и двумерная гистограммы, иллюстрирующие обычную разрешающую способность между популяциями сперматозоидов быка, несущими Х-хромосому и Y-хромосому;
фиг.5 - одномерная и двумерная гистограммы, иллюстрирующие улучшенную разрешающую способность между популяциями сперматозоидов, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, с использованием конкретного варианта воплощения усилителя в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.6 - второй пример одномерной и двумерной гистограмм, иллюстрирующих обычно получаемую разрешающую способность между популяциями сперматозоидов быка, несущих Х-хромосому и Y-хромосому;
фиг.7 - второй пример одномерной и двумерной гистограмм, иллюстрирующих улучшенную разрешающую способность, между популяциями сперматозоидов быка, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, с использованием конкретного варианта воплощения усилителя в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.8 - одномерная и двумерная гистограммы, иллюстрирующие обычно получаемую разрешающую способность между популяциями сперматозоидов лошади, несущих Х-хромосому и Y-хромосому;
фиг.9 - одномерная и двумерная гистограммы, иллюстрирующие улучшенную разрешающую способность между популяциями ядер сперматозоидов лошади, несущих Х-хромосому и Y-хромосому, с использованием конкретного варианта воплощения усилителя в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.10 - одномерная и двумерная гистограммы, иллюстрирующие улучшенную разрешающую способность между популяциями сперматозоидов лошади, несущих Х-хромосому и Y-хромосому, с использованием конкретного варианта воплощения усилителя в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.11 - конкретный вариант воплощения печатной схемы, используемой для усиления в соответствии с настоящим изобретением, которая применяется с проточным цитометром MoFlo®;
фиг.12а, в, с - принципиальная электрическая схема конкретного варианта воплощения усилителя в соответствии с настоящим изобретением, который используется с проточным цитометром MoFlo®;
фиг.13а, в - форма луча лазера при использовании обычного оптического средства формирования луча (фиг.13а) и форма луча лазера при использовании оптического средства, формирующего луч с уменьшенной высотой пятна (фиг.13в);
фиг.14 - гистограмма, которая позволяет сравнить степень очистки разделенных сперматозоидов, несущих Х-хромосому (фиг.14а) и сперматозоидов, несущих Y-хромосому (фиг.14в), с использованием обычной технологии или с использованием усилителя в соответствии с настоящим изобретением, независимо или совместно с оптическим средством, формирующими луч с уменьшенной высотой пятна;
фиг.15 - вид спереди оптического средства, формирующего луч с уменьшенной высотой пятна;
фиг.16 - вид сверху оптического средства, формирующего луч с уменьшенной высотой пятна;
фиг.17а, в - вид в перспективе и два вида в поперечном разрезе сопла, ориентирующего объект в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.18 - градуированные последовательности поперечного сечения сопла, ориентирующего объект в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.19 - вид спереди и вид с торца варианта воплощения инжекционной трубки со скошенной формой в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.20а, в, c, d - иллюстрация удаления нежелательных, неправильно ориентированных сперматозоидов (УННС (RUUS)) в соответствии с настоящим изобретением путем сравнения сигнала (сигналов) от правильно ориентированных сперматозоидов (фиг.20а и 20в) и сигнала (сигналов) от неправильно ориентированных сперматозоидов (фиг.20с и 20d);
фиг.21a, в - вид в перспективе и сечение по А-А′ другого варианта воплощения трубки инжекции со скошенной формой, имеющей скошенную кромку в виде лопатки;
фиг.22 - обычное оптическое средство, используемое в проточных цитометрах;
фиг.23а - форма и размер типичного сперматозоида и фиг.23в - различие между правильно и неправильно ориентированными сперматозоидами;
фиг.24 - вариант воплощения в соответствии с настоящим изобретением, конструкция которого позволяет производить измерение двух сигналов, представляющих, например, объем и ориентацию;
фиг.25а и 25в - вариант воплощения настоящего изобретения, в котором используют две детали в форме половины круга с микроотверстием, соответствующим каждой половине, при этом на фиг.25с показана плоскость изображения варианта воплощения настоящего изобретения, на фиг.25d показан вариант воплощения настоящего изобретения, содержащий два независимо вращающихся поляризатора;
фиг.26а и 26в - способ компенсации искажений, вносимых потоком текучей среды, для варианта воплощения в соответствии с настоящим изобретением, на фиг.26с показан вариант воплощения элемента компенсации, на фиг.26d представлен другой вариант воплощения элемента компенсации, в котором изображения потока текучей среды и элемента компенсации проецируются с наложением друг на друга в плоскости изображения;
фиг.27 - вариант воплощения интерференционного оптического средства в соответствии с настоящим изобретением;
фиг.28 - второй вариант интерференционного оптического средства в соответствии с настоящим изобретением.
V. СПОСОБ (СПОСОБЫ) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение направлено на изолирование популяций сперматозоидов или клеток спермы, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, с высокой чистотой. Популяции сперматозоидов, несущие Х-хромосому и несущие Y-хромосому, с высокой чистотой могут содержать популяции не поврежденных сперматозоидов (ядер спермы) или популяции других жизнеспособных или не жизнеспособных форм сперматозоидов в требуемом виде. В то время как здесь представлены конкретные примеры, которые описывают настоящее изобретение в контексте разделения не поврежденных живых клеток спермы, каждая из которых имеет головку, шейку и хвостик, следует понимать, что описанные технологии могут иметь различные варианты применения также и по отношению к ядрам сперматозоидов. Термин популяции сперматозоидов, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, следует дополнительно понимать, как охватывающий сперматозоиды любого самца определенных видов млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, сперматозоиды человека и сперматозоиды общеизвестных животных таких, как быки, лошади, бараны, собаки, кошки, козы или свиньи, а также менее распространенных животных, таких как слоны, зебры, верблюды или винторогая антилопа. Этот список представляет собой только пример большого разнообразия животных, сперматозоиды которых можно обычно отсортировывать со степенью очистки 90% или выше, и не предназначен для ограничения настоящего описания изобретения сперматозоидами каких-то конкретных видов млекопитающих.
Разделенные сперматозоиды с высокой чистотой различных видов млекопитающих могут быть внедрены в продукты, которые могут использоваться в протоколах искусственного осеменения или как часть коммерческих способов, таких как описаны в заявках на американский патент №60/211,093, 60/224,050 или в заявке РСТ №US99/17165; или могут использоваться в протоколах осеменения с малой дозой, как описано в заявке РСТ №US98/27909, или использоваться при оплодотворении in vitro ооцитов животных, включая человека, как описано в заявке на американский патент №60/253,785, каждый из указанных выше источников литературы приводится здесь в качестве ссылки.
Используемый термин чистота или высокая степень очистки следует понимать, как процент изолированной популяции сперматозоидов, несущей конкретную, дифференцирующую характеристику или требуемую комбинацию характеристик. Например, в случаях, когда популяция сперматозоидов разделяется на основе того признака, что она несет X-хромосому, в отличие от Y-хромосомы, популяция, несущая X-хромосому, с 90% чистоты содержит популяцию сперматозоидов, в которой 90% отдельных сперматозоидов несут Х-хромосому, в то время как 10% такой популяции сперматозоидов могут нести Y-хромосому. Как таковая высокая степень чистоты по отношению к популяции, несущей Х-хромосому, или популяции, несущей Y-хромосому, может содержать степень чистоты, выбранную из группы, состоящей из от 90% до приблизительно 100%, от приблизительно 91% до приблизительно 100%, от приблизительно 92% до приблизительно 100%, от приблизительно 93% до приблизительно 100%, от приблизительно 94% до приблизительно 100%, от приблизительно 95% до приблизительно 100%, от приблизительно 96% до приблизительно 100%, от приблизительно 97% до приблизительно 100%, от приблизительно 98% до приблизительно 100%, от приблизительно 99% до приблизительно 100%.
Важно отметить, что, хотя во многих вариантах воплощения настоящего изобретения описаны изолированные популяции сперматозоидов с высокой степенью чистоты, несущих X-хромосому и Y-хромосому, и хотя в настоящем описании дополнительно раскрыты устройства разделения сперматозоидов с высокой степенью чистоты и способы, направленные на изолирование и использование изолированных популяций сперматозоидов с высокой степенью чистоты, основные концепции настоящего изобретения следует понимать, как применимые к другим типам частиц или событий, имеющих характеристики дифференциации частиц или характеристики дифференциации событий. Следует понимать, что настоящее изобретение может использоваться для множества обстоятельств, в которых может требоваться обеспечение разрешения незначительных различий в фотогенерируемом сигнале, например, при детектировании дефекта продуктов, фракционировании потока поля, в жидкостной хроматографии, при электрофорезе, в компьютерной томографии, в гамма-камерах, в инструментах измерения времени пролета или тому подобное, что будет очевидно для специалистов в данной области техники.
Кроме того, хотя в настоящем описании приведено описание вариантов воплощения устройств и способов, предназначенных для разделения потока сперматозоидов, несущих Х-хромосому, от спрематозоидов, несущих Y-хромосому, этим не подразумевается, что описание этих вариантов воплощения настоящего изобретения ограничивает объем настоящего изобретения только разделением потока сперматозоидов или только системами проточного цитометрического разделения сперматозоидов с высокой степенью очистки, но скорее эти примеры предназначены для использования в качестве иллюстрации основных концепций настоящего изобретения при применении на практике так, чтобы их можно было использовать в различных вариантах применения.
Рассмотрим теперь фигуры 1 и 2, на которых показан вариант воплощения проточного цитометра в соответствии с настоящим изобретением, который включает источник 1 клеток или частиц, работающий таким образом, что он вводит или подает для анализа частицы или клетки, окрашенные с помощью, по меньшей мере, одного флуорохрома. Частицы или клетки поступают внутрь сопла 2 таким образом, что они вводятся в поток текучей среды или обволакивающей текучей среды 3. Обволакивающая текучая среда 3 обычно поступает из некоторого источника 4 обволакивающей текучей среды таким образом, что источник 1 частиц или клеток подает частицы или клетки в текучую среду 3 оболочки так, что затем они одновременно проходят через сопло 2.
При этом можно легко понять, как обволакивающая текучая среда 3 формирует оболочку из текучей среды для частиц или клеток. Поскольку различные текучие среды подают в проточный цитометр при определенном давлении, они вытекают через сопло 2 и выходят через отверстие 5 сопла. С помощью осциллятора 6 определенного типа, которым можно очень точно управлять с помощью устройства 7 управления осциллятора, внутри сопла 2 могут быть установлены волны давления, которые затем могут передаваться на текучую среду, выходящую из сопла 2, через отверстие 5 сопла. Поскольку осциллятор 6 воздействует на обволакивающую текучую среду 3, поток 8, выходящий через отверстие 5 сопла, в конечном счете, регулярно формируется в виде капелек 9. Поскольку частицы или клетки окружены потоком текучей среды или средой оболочки, внутри капелек 9 могут содержаться отдельные изолированные частицы или клетки, которые в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения могут представлять собой клетки сперматозоидов.
Поскольку капельки 9 могут захватывать частицы или клетки, проточный цитометр можно использовать для разделения частиц, клеток, клеток сперматозоидов или подобного материала в зависимости от характеристик частицы или клетки. Это осуществляется с помощью системы 10, чувствительной к частицам или клеткам. Система, чувствительная к частицам или клеткам, содержит, по меньшей мере, детектор или датчик 11 определенного типа, который взаимодействует с частицами или клетками, содержащимися в потоке 8 жидкости. Система 10, чувствительная к частицам или клеткам, может выполнять действия в зависимости от относительного наличия или относительного отсутствия некоторой характеристики, такой как флуорохром, связанный с частицей или клеткой, или ДНК, находящейся в клетке, который может возбуждаться с помощью источника излучения, такого как лазерный возбудитель 12, генерирующий луч излучения, взаимодействующий с частицами. Каждый тип частицы, клетки или ядерная ДНК клеток сперматозоидов может быть окрашен с помощью, по меньшей мере, одного типа флуорохрома, при этом различное количество флуорохрома связывается с каждой отдельной частицей или клеткой в зависимости от количества мест связывания, доступных для конкретного типа используемого флурохрома. Что касается сперматозоидов, доступное количество мест связывания для красителя Hoechst 33342 зависит от количества ДНК, содержащейся в каждом сперматозоиде. Поскольку сперматозоиды, несущие Х-хромосому, содержат больше ДНК, чем сперматозоиды, несущие Y-хромосому, сперматозоиды, несущие X-хромосому связывают большее количество флурохрома, чем сперматозоиды, несущие Y-хромосому. Таким образом, путем измерения флюоресценции, излучаемой связанным флюорохромом при возбуждении, становится возможным разделять сперматозоиды, несущие X-хромосому, и сперматозоиды, несущие Y-хромосому.
Для обеспечения разделения и изолирования частиц или клеток, излучаемый свет может приниматься датчиком 11 и поступать в систему или анализатор 13 разделения определенного типа, соединенный с устройством заряда капельки, которое по-разному заряжает каждую капельку 9, основываясь на характеристиках частицы или клетки, содержащейся в этой капельке 9. Таким образом, система или анализатор 13 разделения действует таким образом, что пластины 14 электростатического отклонения отклоняют капельки 9 в зависимости от того, содержат ли они или нет соответствующую частицу или клетку.
В результате проточный цитометр действует так, что он разделяет частицы или клетки 16, направляя их в один или несколько контейнеров 15 для сбора. Например, когда анализатор дифференцирует клетки спермы в зависимости от их характеристик, капельки, содержащие сперматозоиды, несущие X-хромосому, могут быть заряжены положительно и, таким образом, отклоняться в одном направлении, в то время как капельки, содержащие сперматозоиды, несущие Y-хромосому, могут быть заряжены отрицательно и, таким образом, отклоняться в другую сторону, и поток отходов (то есть капельки, которые не содержат частицу или клетку, или содержат нежелательные или не сортируемые клетки), могут оставаться незаряженными и, таким образом, собираться в не отклоненном потоке в трубку всасывания или в подобное устройство, как описано в заявке на американский патент 09/001,394, который приводится здесь в качестве ссылки. Естественно, могут быть установлены различные траектории отклонения и может осуществляться одновременный сбор.
Для того, чтобы обеспечить поточное разделение с высокой степенью чистоты частиц, клеток спермы или сперматозоидов (не поврежденных, живых, фиксированных, жизнеспособных, не жизнеспособных или ядер) в популяции, несущей X-хромосому и несущей Y-хромосому, используемые устройство или способы дифференциации частиц, должны обеспечить высокую разрешающую способность характеристик дифференциации, которые используются в качестве основы анализа и разделения.
Что касается сперматозоидов, дифференциация между светом, излучаемым флуорохромом, связанным с ядерной ДНК клеток спермы несущих X-хромосому, и светом, излучаемым флуорохромом, связанным ядерной ДНК клеток спермы, несущих Y-хромосому, может быть трудноосуществимой, как описано выше.
Во многих вариантах применения общее количество света, излучаемое в случаях фотоэмиссии, попадающее на детектор, который может представлять собой трубку фотоумножителя, может быть высоким, в то время как разница между излучаемым светом в каждом из случаев фотоэмиссии, различие между которыми требуется определять, может быть незначительным. Эта проблема может быть усугублена, когда события фотоэмиссии происходят последовательно с высокой скоростью, и период времени между событиями фотоэмиссии будет коротким, как, например, при высокоскоростной сортировке клеток с использованием проточных цитометров. При разделении частиц, клеток или клеток спермы на основе различий связанного флуорохрома, может устанавливаться поток клеток, проходящий мимо источника возбуждения, и большое количество событий излучения в течение секунды. В результате количество излучаемого света, генерируемого в потоке частиц, клеток или клеток спермы, может быть чрезвычайно большим. По мере увеличения скорости прохода спермы, точка пересечения с источником возбуждения становится очень яркой. Такой высокий уровень света, падающего на фотокатод трубки фотоумножителя, приводит к получению очень низкого значения отношения сигнала к фоновому сигналу. Высокий уровень фонового сигнала дополнительно усугубляется, когда для мечения ядерной ДНК клеток спермы используется такой флуорохром, как Hoechst 33342.
Большинство вариантов решения проблемы фокусируется на снижении общего количества потока света на трубку фотокатода путем установки оптических фильтров перед трубкой фотоумножителя. Такой подход не меняет пропорцию сигнала по отношению к фоновому сигналу, и последующие попытки повысить чувствительность трубки фотоумножителя дополнительно увеличивают фоновый сигнал, поскольку происходит насыщение трубки фотоумножителя из-за большого уровня фонового сигнала.
Как правило, трубки фотоумножителей имеют диапазон рабочих напряжений от приблизительно 400 вольт до приблизительно 900 вольт. Нижний предел линейного участка рабочей характеристики стандартных трубок фотоумножителей, таких как трубки фотоумножителей R928 и R1477, поставляемые компанией Hamamatsu Corporation, может составлять приблизительно 300 вольт. Само оборудование или инструменты, в которых используются трубки фотоумножителей, конфигурируют для обеспечения работы таких трубок фотоумножителей при напряжении выше 400 вольт. Даже когда требуется уменьшить количество электронов на аноде, как описано в американских патентах №№4,501,366 и 5,880,457, напряжение между фотокатодом и первым динодом поддерживается на высоком уровне, и уменьшение количества электронов на аноде осуществляется либо путем уменьшения напряжения на остальных динодах, или с помощью электронного отфильтровывания неотъемлемо существующего шума в состоянии темноты или теплового шума.
Неожиданно оказалось, что снижение напряжения на трубке фотоумножителя ниже уровня 400 вольт, либо приблизительно до уровня 280 вольт, либо приблизительно до 250 вольт, либо даже до величины 0 вольт, позволяет дифференцировать незначительные различия света фотоэмиссии, даже когда общее количество излучаемого света фотоэмиссии будет большим или когда происходит большое количество ярких последовательных событий в течение одной секунды. Что касается вероятности установления отделимых событий фотоэмиссии, генерируемых при облучении флуорохромов, связанных с ядерной ДНК сперматозоидов, в настоящем изобретении обеспечивается вероятность разделения событий фотоэмиссии, которая происходит при разделении сперматозоидов на популяции, несущие X-хромосому и несущие Y-хромосому, повышенная до вероятности разделения событий, составляющей, по меньшей мере, 5000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 6000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 7000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 8000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 9000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 10000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 11000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 12000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 13000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 14000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 15000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 16000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 17000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 18000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 19000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 20000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 25000 отделимых событий в секунду, по меньшей мере, 30000 отделимых событий в секунду, и, по меньшей мере, 35000 отделимых событий в секунду, или больше.
Для конкретного примера возьмем существующий сортирующий проточный цитометр Cytomation SX MoFlo®, который сконфигурирован так, что трубка фотоумножителя работает при напряжении минимум 400 вольт. Коэффициент усилия может регулироваться так, что трубка фотоумножителя может работать при более высоких напряжениях, но при этом нет возможности подавать более низкое напряжение. Проточные цитометры SX MoFlo® могут быть модифицированы путем доработки контроллеров фотоумножителя. Резистор R16C (2,49 килоом) в канале три может быть заменен на резистор 2,0 килоом для того, чтобы изменить коэффициент усиления усилителя, который управляет трубкой фотоумножителя. Такое изменение позволяет изменить рабочее напряжение фотоумножителя до значения 280 вольт. Аналогичная модификация проточных цитометров SX MoFlo® путем параллельного включения двух резисторов с сопротивлением 3,75 килоом, или резисторов с сопротивлением 1,3 килоом позволяет изменить рабочее напряжение трубки фотоумножителя, снизив его до уровня приблизительно 200 вольт или немного выше, чем ноль вольт, соответственно. Кроме того, при такой модификации можно убрать фильтр нейтральной плотности, установленный перед фотокатодом, благодаря тому, что трубка фотоумножителя будет работать за пределами обычного диапазона рабочих напряжений.
Такая модификация неожиданно позволила повысить отношение сигнал-шум события фотоэмиссии, когда оно преобразуется в электронный сигнал с помощью трубки фотоумножителя. Более чистый сигнал затем может быть усилен до требуемого уровня путем повышения коэффициента усиления аналогово-цифрового преобразователя анализатора 13, и выходной сигнал может генерироваться в виде одномерных или двумерных гистограмм.
На фигуре 3а, в показано сравнение одномерных гистограмм, генерируемых с помощью трех различных проточных цитометров типа SX MoFlo® (№1, №2, №3) до использования настоящего изобретения (фигура 3а) и с использованием настоящего изобретения (фигура 3в) при разделении неповрежденной живой эякулированной спермы быка. Как можно видеть на одномерных гистограммах, разрешающая способность (очевидное различие между популяцией, несущей X-хромосому, от популяцией, несущей Y-хромосому, представленное впадиной между двумя пиками) не поврежденных сперматозоидов 17, несущих X-хромосому, от живых сперматозоидов 18, несущих Y-хромосому, может быть существенно улучшена при использовании настоящего изобретения.
Средняя скорость разделения, или скорость разделения не поврежденных живых сперматозоидов до использования данного варианта воплощения настоящего изобретения с использованием проточных цитометров типа SX MoFlo®, составляла приблизительно 17,9 х 106/4,5 часа как для сперматозоидов, несущих X-хромосому, так и для сперматозоидов, несущих Y-хромосому (то есть приблизительно 1100 отделимых событий или сортировок в секунду в каждом из двух потоков - в первом потоке сперматозоидов, несущих X-хромосому, и во втором потоке сперматозоидов, несущих Y-хромосому) при обеспечении уровня чистоты приблизительно 87% с диапазоном очистки от 84% до 93%. Вероятность отделимых событий составляла 22000, 23000 и 20000, соответственно, для всех трех сортов.
Средние скорости сортировки живых сперматозоидов после вышеуказанной модификации составили приблизительно 40,3×106/4,5 часа сортировок (то есть приблизительно 2500 сортировок в секунду на поток) при обеспечении уровня чистоты приблизительно 90,8%, в диапазоне от 89% до приблизительно 92%. Количество событий в секунду составило 13000, 15000 и 19500, соответственно, для трех сортировок.
Как можно понять по полученным данным, данный вариант воплощения настоящего изобретения приводит не только к повышению чистоты разделения популяции сперматозоидов, но также позволяет более чем вдвое повысить скорость сортировки, в то время как вероятность отделимых событий, по существу, понижается.
Аналогичная ситуация показана на фигурах 4 и 5, на которых представлены двумерные гистограммы сортировки не поврежденных сперматозоидов быка с помощью проточного цитометра №1 типа SX MoFlo® до использования настоящего изобретения (фигура 4) и после вышеуказанной модификации (фигура 5). До использования настоящего изобретения проточный цитометр SX MoFlo® работал при напряжении 440 вольт на фотокатоде с мощностью лазера, выставленной на уровне 135 мВт, с коэффициентом усилия 1X и с фильтром нейтральной плотности 1,0 (1/10-ая амплитуды) при приблизительно 10000 событий в секунду. После использования настоящего изобретения проточный цитометр SX MoFlo® стал работать при напряжении приблизительно 262 вольт на фотокатоде, мощность лазера была выставлена на уровне приблизительно 100 мВт, коэффициент усиления 4Х, без фильтра нейтральной плотности, со скоростью разделений приблизительно 10000 событий в секунду. Как можно понять по этим данным, произошло существенное повышение разрешающей способности, что можно видеть по увеличенной глубине впадины между популяцией 19, несущей X-хромосому, и популяцией 20, несущей Y-хромосому.
Аналогичная ситуация показана на фигурах 6 и 7, на которых представлены двумерные гистограммы, полученные при сортировке не поврежденных живых сперматозоидов быка с помощью проточного цитометра №2 типа SX MoFlo®, до использования данного варианта воплощения, в соответствии с настоящим изобретением (фигура 6), и после использования данного варианта воплощения настоящего изобретения (фигура 7), который работал при тех же параметрах, которые использовались для получения данных, показаны на фигурах 3 и 4, соответственно. И вновь повторим, что при этом можно достичь существенного повышения разрешающей способности, о чем свидетельствует глубина впадины между популяцией 21, несущей X-хромосому, и популяцией 22, несущей Y-хромосому.
Рассмотрим теперь фигуры 8 и 9, на которых показаны двумерные гистограммы разделения или сортировки не поврежденных живых сперматозоидов лошади с помощью проточного цитометра SX MoFlo® до использования данного варианта воплощения в соответствии с настоящим изобретением (фигура 8) и после использования данного варианта воплощения, в соответствии с настоящим изобретением (фигура 9). При использовании данного варианта воплощения настоящего изобретения живые сперматозоиды лошади были разделены или рассортированы при использовании лазера мощностью 100 мВт, при напряжении трубки фотоумножителя ниже 300 вольт. Скорость разделения или скорость сортировки в среднем превысила 4800 сортировок в секунду при 12000 событий в секунду. Произошло значительное повышение разрешающей способности разделения популяции 23, несущей X-хромосому, и популяции 24, несущей Y-хромосому. Данные показывают, что с использованием данного варианта воплощения настоящего изобретения может быть получено от приблизительно 8 до приблизительно 9 каналов разделения, по сравнению с 5 каналами разделения между пиками без использования данного варианта воплощения настоящего изобретения. Чистота обеих отсортированных популяций, несущих X-хромосому и несущих Y-хромосому, составила приблизительно 93%.
Рассмотрим теперь фигуру 10, на которой показана одномерная гистограмма и двумерная точечная диаграмма, представляющая результаты сортировки окрашенных препаратом Hoechst 33342 ядер спермы жеребца (S-05400), которые разделяли с использованием данного варианта воплощения настоящего изобретения. Ядра были приготовлены из свежеэякулированной спермы жеребца. Сперма была промыта с помощью центрифуги, обработана ультразвуком, и полученные в результате головки и хвостики были разделены с использованием градиентного центрифугирования плотности Перколля (Percoll). Изолированные головки были промыты, зафиксированы 2%-ным раствором формалина и затем окрашены препаратом Hoechst 33342. Окрашенные ядра были стабилизированы с использованием азида натрия (0,5%). Образец обрабатывали со скоростью 5000 событий в секунду для получения гистограммы. Окрашенные ядра затем использовались для калибровки проточного цитометра типа SX MoFlo®, который был модифицирован, как указано выше, так, что в нем использовалась трубка фотоумножителя, в соответствии с вариантом воплощения настоящего изобретения. Для установки уровня двух популяций 59, 60 (окрашенных ядер Х и окрашенных ядер Y) на двумерной гистограмме использовалась компенсация. Следует отметить, что две популяции ядер спермы лошади были практически полностью разделены до линии основы, как показано на одномерной гистограмме.
Рассмотрим теперь фигуру 11, на которой показана схема модификации, специально приспособленной для проточного цитометра SX MoFlo®, в которой использованы два резистора, включенные параллельно, для обеспечения требуемого значения сопротивления 1,8 килоом. Два резистора 25 и 26 с сопротивлением 3,57 килоом имеют общее сопротивление приблизительно 1,785 килоом, что достаточно близко к требуемому значению. При такой модификации трубка фотоумножителя в данном инструменте может работать с напряжением приблизительно 200 вольт. Естественно, аналогичная модификация может быть выполнена для других инструментов проточного цитометра или других инструментов, в которых трубка фотоумножителя используется для измерения количества света, излучаемого при конкретных событиях. На фиг.12а, в, с представлена принципиальная электрическая схема данного варианта воплощения настоящего изобретения.
Другое важное преимущество варианта воплощения настоящего изобретения состоит в уменьшении высоты пятна луча облучения с помощью оптических средств. Как показано на фигуре 13а, обычные оптические средства, формирующие пучок облучения, генерируют такую форму пятна 27, которая может иметь высоту больше, чем высота головки (головок) 28 клеток спермы, проходящей через него. В результате этого в пятно луча облучения могут одновременно попадать несколько головок клеток спермы, содержащих ДНК с прикрепленным флуорохромом. В этом случае флуорохром (флуорохромы), прикрепленные к ДНК, содержащимся в множестве головок спермы, могут возбуждаться одновременно и флуоресцировать в пределах одиночного события эмиссии. При этом на поток света от предыдущего или последующего события эмиссии может накладываться совпадающий поток света, полученный от другой головки (головок) спермы, в пятне 27 пучка. Это приводит к снижению разрешающей способности в среднем потоке света между событиями эмиссии света, с помощью которых осуществляется разделение между сперматозоидами, несущими X-хромосому, и сперматозоидами, несущими Y-хромосому. Это также снижает разрешающую способность в среднем потоке света между событиями, в которых сравнивается эмиссия света от сперматозоидов, несущих X-хромосому, или сперматозоидами, несущими Y-хромосому. Важно отметить, что совпадение возбуждения флуорохромов, связанных с множеством ДНК, увеличивает среднюю яркость событий, дополнительно уменьшая измеримое различие светового потока между событиями по отношению к общему излучаемому световому потоку. Это еще больше затрудняет квантификацию различий между событиями.
При уменьшении высоты пятна луча, как показано на фигуре 13в, снижается вероятность попадания нескольких головок спермы в пятно 29 пучка с уменьшенной высотой в течение одного измеримого события. Это приводит к повышению средней разницы между событиями излучения света, что позволяет более эффективно разделять сперматозоиды, несущие X-хромосому, и сперматозоиды, несущие Y-хромосому. Это также позволяет уменьшить средний общий световой поток в каждом измеряемом событии излучения. Для конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения, используемых для сортировки бычьей спермы, клетки которой имеют ядро с размером приблизительно 9 мкм, было определено, что высота пучка должна составлять приблизительно 20 мкм. В данном варианте применения было определено, что уменьшение высоты пучка по вертикали до уровня меньше 20 мкм не дает дополнительного прироста разрешающей способности.
Как показано на фиг.14а, в, использование оптических средств с уменьшенной высотой пятна облучения позволяет улучшить чистоту сортировки популяций бычьих сперматозоидов, несущих Х-хромосому (фигура 14а) и сортировки популяций бычьей спермы, несущей Y-хромосому (фигура 14в), которые были окрашены с помощью красителя Hoechst 33342. Это справедливо как для 25%-ного, так и для 40%-ного селекторов сортировки одномерного пика. Как можно дополнительно видеть при анализе фигуры 14, оптические средства с уменьшенной высотой пятна облучения позволяют улучшить чистоту разделения сперматозоидов, независимо от других аспектов настоящего изобретения, таких как модификация цепей питания фотоумножителя в соответствии с одним из вариантов воплощения настоящего изобретения, как описано выше, или может использоваться совместно с модифицированным вариантом воплощения фотоумножителя в соответствии с настоящим изобретением для дополнительного повышения чистоты разделенных образцов сперматозоидов.
Другое преимущество использования оптических средств с уменьшенной высотой пятна облучения может состоять в том, что время прохода сперматозоидов в лазерном луче возбуждения, облучающем сперматозоиды, может быть уменьшено. Уменьшенное количество времени облучения в пределах лазерного пучка возбуждения приводит к меньшему стрессу или повреждению сперматозоидов.
И снова, как показано на фигуре 13в, следует понимать, что при уменьшении высоты пятна облучения общая площадь пятна облучения может быть большей, чем используется обычно. Например, обычная форма пятна 27, такая, как показана на фигуре 13а, имеют эллиптическую форму с размерами приблизительно 30 мкм×80 мкм, в то время, как в настоящем изобретении, когда оно используется для сортировки бычьей спермы, оптимальная разрешающая способность между популяциями, несущими Х-хромосому и Y-хромосому, достигается, когда пучок имеет форму пятна 29 с размерами 20 мкм×160 мкм. Пятно 29 облучения с размерами 20 мкм×160 мкм приблизительно в 1,3 раза больше по площади, чем пятно 27 с размерами 30 мкм×80 мкм. В результате, обратно пропорционально уменьшаются потери энергии в точке падения. Это позволяет повысить мощность лазера возбуждения, не опасаясь повышения вероятности повреждения из-за облучения сперматозоидов. Например, если в инструменте используются обычные оптические средства, формирующие пучок, которые позволяют получить пятно 27 облучения с размерами 30 мкм×80 мкм, и обычно мощность питания лазера составляет 150 мВт, то в конкретных вариантах воплощения в соответствии с настоящим изобретением, в которых используется пятно 29 с размерами 20 мкм×160 мкм, можно использовать лазер возбуждения с мощностью 300 мВт без повышения общей мощности в точке падения. В качестве альтернативы, лазер возбуждения может работать с мощностью 150 мВт с преимуществами меньшего уровня энергии облучения на единицу площади для снижения вероятности повреждения из-за облучения, повышения срока службы лазера и т.п.
По сравнению с обычными оптическими средствами формирования пучка и обычными устройствами усилителей на трубках фотоумножителей, применение оптических средств с уменьшенным по высоте пятном облучения в соответствии с настоящим изобретением и усилителей на трубке фотоумножителя в соответствии с настоящим изобретением позволяет повысить степень чистоты популяций сперматозоидов, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому, приблизительно на 4%, или больше.
Оптические средства 30, формирующие луч, в соответствии с настоящим изобретением могут быть установлены в проточном цитометре, как показано на фигурах 15 и 16. Как можно видеть, свет 31, излучаемый лазером возбуждения флуорохрома (флуорохромов), связанного с ДНК, содержащейся в сперматозоидах, может детектироваться с помощью трубок 32 фотоумножителя, расположенных под углами 0 и 90 градусов, по отношению к плоской поверхности головки 28 сперматозоида, по мере его протекания через пятно лазерного луча возбуждения.
Как можно видеть, окрашенные сперматозоиды должны точно проходить через пучок возбуждения или пучок облучения таким образом, чтобы каждая головка сперматозоида была ориентирована так, чтобы плоская поверхность головки сперматозоида была направлена к трубке фотоумножителя, которая представляет собой детектор, установленный под углом 0 градусов. Точное измерение содержания ДНК в сперматозоидах может быть обеспечено только со стороны плоской поверхности головки 28 сперматозоида, имеющей форму лопатки. Таким образом, только та часть сперматозоидов, которые входят в луч возбуждения при правильной ориентации, может точно измеряться и сортироваться на основе содержания ДНК.
Рассмотрим теперь фигуры 17а, в, 18 и 19, на которых представлены конкретные варианты воплощения настоящего изобретения, которые также могут содержать сопло 33, предназначенное для ориентирования частицы или клетки сперматозоида, которое гидродинамически устанавливает сплющенную головку сперматозоида в правильной ориентации, по мере его прохождения перед фотоумножителем (фотоумножителями). Как показано на фиг.17а, в, ориентирующее сопло имеет внутренние поверхности 34 конусообразной формы. Внутренний конус постепенно изменяется от круглой формы на входном торце 35, переходя в значительно выраженную эллиптическую форму возле отверстия 36, через которое сперма выходит на кончике сопла. Отверстие 36 может быть также выполнено круглым, а не эллиптическим. При этом вид внутренних сторон ориентирующего сопла 34 переходит от круглого входа до узкого эллипса с последующим переходом в круглый выход непосредственно перед отверстием 36. Такая внутренняя форма дополнительно поясняется на примере, представленном на видах поперечного сечения ориентирующего сопла, показанных на фиг.18.
Как показано на фигурах 19 и 21а, в, вместе с ориентирующим соплом (или с обычным соплом) 33 может использоваться трубка 37 инжектора (которая может иметь диаметр приблизительно 0,061 дюйма (1,55 мм)), и которая может быть выполнена со скошенной кромкой кончика, так, что формируется лопатка 38. Сплющенная лопатка 38 может быть ориентирована под углом 90 градусов по отношению к наибольшему размеру эллипса ориентирующего сопла 33. Внутренний диаметр иглы инжекции может составлять приблизительно 0,010 дюйма (0,25 мм), так что в центре лопатки 38 трубки сплющенной иглы формируется закругленное отверстие 39.
В конкретных вариантах воплощения трубки инжекции со скошенной кромкой такая скошенная кромка может быть сконфигурирована в форме лопатки, как показано на фиг.21а, в. Лопатка со скошенной кромкой позволяет поддерживать ламинарный поток обволакивающей текущей среды в сопле (при использовании обычного сопла или ориентирующего сопла). Ламинарный поток жидкости, поддерживаемый лопаткой со скошенной кромкой, привносит меньше нарушений построения объектов, инжектируемых в него.
Сперматозоиды, вводимые в ламинарный поток обволакивающей текущей среды, поддерживаемый в варианте воплощения трубки инжектора в соответствии с настоящим изобретением, в котором используется лопатка со скошенной кромкой, позволяют на 20%, 30%, 40%, 50% или даже на большую величину повысить скорость сортировки сперматозоидов по сравнению с использованием обычной трубки инжекции. При этом может быть достигнута высокая скорость сортировки сперматозоидов на уровнях от приблизительно 4000 до приблизительно 10000 сортировок каждого пола в секунду. При этом даже при таких высоких скоростях сортировки может быть установлена высокая степень чистоты (90% или выше) популяций, несущих Х-хромосому и несущих Y-хромосому. Трубка инжектора в соответствии с настоящим изобретением с кончиком, выполненным в форме лопатки со скошенной кромкой, может использоваться независимо или в комбинации с другими вариантами воплощения настоящего изобретения, описанными в настоящем описании, или с другой технологией, такой как описана в заявке на американский патент №09/454/488 или в международной заявке на патент № PCT/US00/42350, каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки.
Как показано на фиг.21а, в, в определенных вариантах воплощения трубка инжектора со скошенной кромкой в соответствии с настоящим изобретением, или в форме лопатки со скошенной кромкой в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содерать канавки 40, предназначенные для улучшения ламинарного потока. Канавки 40, предназначенные для улучшения ламинарного потока помогают поддерживать ламинарный поток в отверстии трубки инжектора. И снова отметим, что улучшенный ламинарный поток позволяет поддерживать правильную ориентацию в ламинарном потоке обволакивающей текучей среды большего количества сперматозоидов, что позволяет получить большее количество сортируемых событий, что, в свою очередь, приводит к повышению скорости сортировки для каждого пола или сперматозоида.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения, отверстие 39 ориентирующего сопла или другого обычного сопла может иметь такие размеры, что будут формироваться капельки, которые будут обволакивать неповрежденные живые сперматозоиды по мере того, как они выходят через отверстие 39. При использовании обычной технологии вовлечения клеток спермы в поток не обеспечивается полное обволакивание клеток спермы. При этом обычно часть хвостика клетки спермы располагается снаружи капельки. Например, клетки бычьей спермы имеют длину приблизительно 13,5 микросекунд, когда поток текучей среды имеет давление приблизительно 50 фунтов на квадратный дюйм (3,5 кг/см2) (то есть длительность времени, в течение которого вся длина клетки сперматозоида полностью проходит через пятно облучения при давлении в потоке текучей среды приблизительно 50 фунтов на квадратный дюйм). Обычные технологии формирования капелек для захвата клеток бычьей спермы позволяют формировать капельки с размером 14 микросекунд (то есть это время, которое требуется для формирования волны колебаний одиночной капельки в потоке жидкости) через сопло, имеющее отверстие с диаметром приблизительно 70 микрометров, при использовании осциллятора, работающего с частотой приблизительно 35 килогерц. При этом часть хвостика клетки спермы обычно выходит за пределы капельки. Для предотвращения выхода хвостика клетки спермы из капельки, в одном из вариантов воплощения захвата капельки в соответствии с настоящим изобретением, предложено использовать отверстие диаметром приблизительно 100 микрометров, которое позволяет получать капельку диаметром приблизительно 28 микросекунд при давлении приблизительно 50 фунтов на квадратный дюйм и при частоте приблизительно 30 килогерц. При полном обволакивании не поврежденной живой клетки спермы, включая часть хвостика, клетка спермы в меньшей степени взаимодействует с соплом при заряде капельки, и отклонение капельки может быть выполнено более точно. Это приводит к меньшей степени перекрестного загрязнения спермы, несущей X-хромосому, и спермы, несущей Y-хромосому, и также позволяет отклонять сперматозоиды так, чтобы их можно было более равномерно собирать. Равномерно отклоняемая сперма может быть направлена на поверхности сбора, которые смягчают различными жидкостями. Смягчение разделенных сперматозоидов может быть важным для уменьшения стресса, как описано в заявке на американский патент №09/001,394, которая приводится здесь в качестве ссылки. При разделении сперматозоидов других видов млекопитающих настоящее изобретение может быть изменено для получения таких размеров капелек, которые позволяют обволакивать клетки сперматозоидов различной длины. В зависимости от длины сперматозоидов и давления потока текучей среды при инкапсуляции капельками, в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивается возможность достижения скорости формирования капелек, по меньшей мере, 10000 капелек в секунду, по меньшей мере, 20000 капелек в секунду, по меньшей мере, 30000 капелек в секунду, по меньшей мере, 40000 капелек в секунду, по меньшей мере, 50000 капелек в секунду, по меньшей мере, 60000 капелек в секунду, по меньшей мере, 70000 капелек в секунду, по меньшей мере, 80000 капелек в секунду, по меньшей мере, 90000 капелек в секунду, по меньшей мере, 100000 капелек в секунду и так далее, вплоть до приблизительно 200000 капелек в секунду в некоторых вариантах воплощения обволакивания в капельках, в соответствии с настоящим изобретением.
Даже при использовании ориентирующего сопла в соответствии с настоящим изобретением в потоке остается определенное количество сперматозоидов или частиц, которые не имеют правильной ориентации в пятне луча. Как описано выше, если ориентация головки сперматозоида будет неправильной, становится невозможным обеспечить точное измерение содержания ДНК на основе излучаемого света. Конкретные варианты воплощения настоящего изобретения обеспечивают удаление сперматозоидов с неправильной ориентацией (УННС) или частиц из потока жидкости.
Как показано на фигурах 16 и 20а, можно видеть, что точное измерение содержания ДНК в сперматозоиде зависит от правильной ориентации по отношению к детектору плоской поверхности головки 28 сперматозоида в форме лопатки. Таким образом, только та часть сперматозоидов, которые входят в луч возбуждения в правильной ориентации, как показано на фигурах 16 и 20а, может правильно измеряться и сортироваться на популяции, несущие Х-хромосому и несущие Y-хромосому, по содержанию ДНК. Как показано на фигурах 20а и 20в, сперматозоиды, которые проходят через луч возбуждения в правильной ориентации, генерируют 40 ориентированный сигнал эмиссии, изображенный кривой 40, который имеет другую форму, чем кривая 41 (фиг.20d), неориентированного сигнала эмиссии, который генерируется при неправильной ориентации сперматозоида. Естественно, что форма кривой 41 сигнала эмиссии при неправильной ориентации, генерируемого сперматозоидами с неправильной ориентацией, будет изменяться в зависимости от степени неправильной ориентации в луче возбуждения. Неправильная ориентация может включать ориентацию, показанную на фигуре 20с, но также может включать все разновидности ориентации при вращении головки сперматозоида при любой величине поворота, при которой поверхность головки в форме лопатки ориентирована так, что не обеспечивается совмещение с детектором (правильное совмещение показано на фигуре 16), или при любой величине поворота, при которой ориентация оси головки 42 сперматозоида не совмещается с направлением потока. Естественно, что правильная ориентация может быть определена по-разному, в зависимости от вида животного. Для некоторых видов, у которых головка сперматозоида не имеет форму лопатки, правильная ориентация в луче возбуждения, или по отношению к детекторам, или в другом направлении, может быть определена по другим анатомическим характеристикам или характеристикам сигнала. Тем не менее, оптимизированный сигнал для правильно ориентированных сперматозоидов различных видов в пределах окна возбуждения может генерироваться в виде стандартных кривых сигнала эмиссии для последующего сравнения с последовательными событиями эмиссии.
Путем сравнения формы (или общей площади или обоих этих факторов) каждой кривой сигнала эмиссии со стандартной кривой сигнала эмиссии (или стандартной общей площадью, или обоих этих параметров) установленного правильно ориентированного сперматозоида различных видов млекопитающих, можно идентифицировать неправильно ориентированные сперматозоиды, их сигнал можно вычитать из одномерных или двумерных гистограмм, и неправильно ориентированный сперматозоид при подтверждении может удаляться, если требуется, так что неправильно ориентированные сперматозоиды не будут собираться ни в популяциях, несущих Х-хромосому, ни в популяциях, несущих Y-хромосому.
Важно отметить, что с помощью настоящего изобретения обеспечивается улучшение разделения между двумя популяциями разделяемых сперматозоидов при увеличении скорости разделения популяций друг от друга, и при повышении чистоты разделяемых популяций. При этом становится возможным сортировать сперматозоиды при значительно более высоких скоростях. Скорости сортировки или разделения событий могут достигать приблизительно 35000 в секунду (не включая совпадающие события, когда несколько сперматозоидов одновременно находятся в окне возбуждения/детектирования), скорости сортировки или разделения событий коррелируют с высокими скоростями разделения или сортировки, которые могут составлять от приблизительно 5000 до приблизительно 11000 для неповрежденных живых сперматозоидов каждого пола в секунду, при степени чистоты 90%, 92%, 93%, 95% или выше. Вышеописанные варианты изобретения также позволяют обеспечить более высокую степень очистки популяций, несущих Х-хромосому и Y-хромосому, которая составляет от приблизительно 97% до приблизительно 98% или даже выше при уменьшении скорости сортировки или разделения, до уровня приблизительно 2000 живых сперматозоидов каждого пола в секунду.
Очевидно, что вышеописанные варианты воплощения настоящего изобретения являются в особенности важными для достижения наиболее высоких возможных скоростей сортировки или разделения событий, при наиболее высоких получаемых в результате скоростях разделения, которые могут составлять, по меньшей мере, 1000 разделений в секунду, по меньшей мере, 2000 разделений в секунду, по меньшей мере, 3000 разделений в секунду, по меньшей мере, 4000 разделений в секунду, по меньшей мере, 5000 разделений в секунду, по меньшей мере, 6000 разделений в секунду, по меньшей мере, 7000 разделений в секунду, по меньшей мере, 8000 разделений в секунду, по меньшей мере, 9000 разделений в секунду или, по меньшей мере, 10000 разделений в секунду каждого пола или выше.
Настоящее изобретение, как указано выше, позволяет обеспечить высокую скорость сортировки сперматозоидов, даже когда они являются трудноокрашиваемыми или имеют другие анатомические или химические свойства, которые затрудняют дифференциацию между популяциями, несущими Х-хромосому и популяциями, несущими Y-хромосому. Даже в таких трудных случаях могут быть изолированы популяции бычьей спермы, несущие Х-хромосому и несущие Y-хромосому, со степенью очистки от 92% до 93% при обеспечении скорости сортируемых событий приблизительно 15000-20000 сортируемых событий в секунду или выше, как описано выше, и скорости сортировки или разделения неповрежденных живых сперматозоидов каждого пола (несущих X-хромосому и несущих Y-хромосому), составляющей 2000 неповрежденных живых сперматозоидов каждого пола в секунду.
Рассмотрим теперь фигуры 23а, в и 24, на которых представлен вариант воплощения настоящего изобретения, в котором используется технология контраста дифференциальной интерференции для измерения объема частицы или капсулы. В основном варианте воплощения настоящего изобретения могут использоваться частицы, которые имеют разность объема, такие, как головки 28 клеток сперматозоида, которые имеют разный объем у клеток сперматозоидов, несущих Х-хромосому и Y-хромосому. Источник 43 электромагнитного излучения генерирует электромагнитное излучение или луч 44 электромагнитного излучения, имеющий исходные характеристики колебаний, дифференциально чувствительные к разности объема между частицами или головками 28 клеток сперматозоидов. Электромагнитное излучение может представлять собой луч лазера, но также может представлять различные типы электромагнитного излучения, включая, но не ограничиваясь, микроволновое излучение, ультрафиолетовое излучение или тому подобное. При пересечении частицы или капсулы с головкой сперматозоида, объем которой содержит материал сдвига фазы, электромагнитное излучение может быть сфокусировано через линзу 45 объектива на детектор 46, который определяет характеристики формы колебаний электромагнитного излучения. Детектор может быть соединен с анализатором 47. Анализатор может различать частицы в зависимости от изменений характеристик формы колебаний до прохода через объем частицы и после прохода через объем частицы, и может анализировать сигнал на основе общих площадей или формы сигнала, или в зависимости от обоих параметров. В определенных вариантах воплощения настоящего изобретения, характеристики анализа формы колебаний могут содержать наложение исходных характеристик формы колебаний с измененными характеристиками формы колебаний после прохода через объем частицы, капсулы или головки клетки сперматозоида. Наложение исходных характеристик формы колебаний и характеристик формы колебаний со сдвигом фазы, позволяет по-разному модулировать интенсивность луча электромагнитного излучения так, чтобы такая разность модуляции коррелировала с количеством среды, сдвигающей фазу, через которую проходит электромагнитное излучение. В настоящем изобретении также могут использоваться дополнительные фильтры 48, такие как цветные фильтры.
На фигуре 24 показан вариант воплощения оптического средства в соответствии с настоящим изобретением, который содержит использование различных оптических средств контрастного дифференциального интерферометра, что повышает расстояние, на котором расщепляется свет, по сравнению с обычной, микроскопией с использованием контрастного дифференциального интерферометра, что соответствует пределу разрешающей способности микроскопа. В данном варианте воплощения настоящего изобретения расщепление получают большим, чем размер объектов, что позволяет увеличить два независимых изображения, разделенных в поперечном направлении, получаемых от одного объекта. Вторая модификация включает использование пластин двоякопреломляющего материала, такого как пластины Саварта (Savart), установленных на некотором расстоянии от линзы объектива. Данный вариант воплощения настоящего изобретения является более простым для построения, поскольку не требуется устанавливать двоякопреломляющие материалы внутри корпуса объектива. В обычных микроскопах с использованием контрастного дифференциального интерферометра двоякопреломляющий материал используют в форме так называемых призм Волластона (Wollaston), которые должны быть установлены внутри корпуса объектива, что требует использовать дорогостоящие объективы, которые были специально изготовлены для этой цели.
Компоненты варианта воплощения, в соответствии с настоящим изобретением могут быть установлены в линию по отношению друг к другу и состоять из: источника 43 электромагнитного излучения, например, ртутной дуговой лампы; элемента регулировки спектра, например, полосового фильтра; элемента 49 регулировки поляризации, например, листового поляризатора 53 и волновой пластины 54, которая необходима для установки поворота; конденсатора 51 света, позволяющего конденсировать свет, например, на частицу или клетку сперматозоида, линзы конденсатора или набора линз, или объектива микроскопа; потока 8 текучей среды, которая может содержать частицы или клетки сперматозоидов, например, струи жидкости, подаваемой под давлением; коллектора 45 света, предназначенного для сбора света, поступающего от частицы или клетки, объектива микроскопа, например, с 50-кратным рабочим увеличением и трубчатой линзой; расщепителя 50 луча, предназначенного для разделения луча на два или большее количество компонентов, например, выполненного из двоякопреломляющего материала в форме пластины Саварта, установленной таким образом, что его ориентация и местоположения могут точно контролироваться; селектора 55 светоизображения, предназначенного для выбора только света, соответствующего частице или клетке сперматозоида, выполненного, например, в виде набора микроскопических отверстий, в котором одно микроскопическое отверстие 53 предназначено для каждого из формируемых изображений.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения компоненты могут быть установлены таким образом, чтобы источник 43 света или его изображение был расположен позади фокальной плоскости конденсатора 45 света, что часто называют освещением типа Коллера (Kohler). Лучше всего, чтобы изображение плоскости объекта совпадало с селектором 55 объекта света или микроскопическим отверстием (отверстиями) 53, для захвата света от отдельных частиц или клеток сперматозоидов. Как показано на фигурах 27 и 28, компоненты могут быть установлены на устойчивом оптическом столе или на стойке с использованием креплений, подпорок и держателей. Компоненты могут быть установлены таким образом, чтобы фокусировка плоскости объекта могла быть точно установлена. Это может быть выполнено путем оборудования потока текучей среды контроллером положения потока, таким как микрометрический контроллер, для того, чтобы вводить поток в положение фокусировки. Кроме того, может потребоваться установка контроллера 61 положения на конденсатор 51 света, что позволяет фокусировать его на плоскость объекта. Может потребоваться особенно тщательно устанавливать двоякопреломляющие элементы или расщепитель 50 луча, при этом, предпочтительно, использовать элемент с возможностью вращения по трем осям.
Рассмотрим теперь фигуру 25a, b, c, d, на которой представлены варианты воплощения настоящего изобретения, которые также могут включать использование обоих генерируемых изображений, для определения ориентации асимметричных частиц в потоке текучей среды, включая, но не ограничиваясь, сперматозоиды, такие как клетки бычьих сперматозоидов. Варианты воплощения для оценки ориентации в соответствии с настоящим изобретением могут включать оптическую систему, которая позволяет независимо контролировать состояние поляризации света, поступающего в систему, для обоих генерируемых изображений. Оптическая система в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать элемент 56 регулировки поляризации, который управляет поляризацией света, поступающего в систему. Для варианта воплощения настоящего изобретения с определением ориентации элемент 56 регулировки поляризации может быть выбран таким образом, чтобы он состоял из двух деталей, изображение которых формируется на плоскости 55 селектора света, который в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения содержит микроотверстия 53. Это может осуществляться путем установки элемента 56 регулировки поляризации в плоскости, сопряженной с плоскостью 55 изображения, или путем использования других оптических средств для получения того же эффекта. Простой пример этого компонента может представлять собой "полутеневую" деталь, состоящую, например, из двух деталей в форме половины круга из поляризующего материала, такого, как листовой поляризатор, угол ориентации которых может выбираться независимо. Каждое микроотверстие в плоскости изображения может соответствовать одной из двух половинок указанных деталей в форме половины круга. Углы поляризации могут выбираться таким образом, чтобы сигнал от одного микроотверстия 53 соответствовал объему и был относительно независимым от угла ориентации проходящего объекта, и другое микроотверстие 53 формировало сигнал, который в большей степени зависит от угла ориентации. Два сигнала могут обрабатываться анализатором 47 так же, как и при обычной многоканальной цитометрии потока, которая приведена здесь в качестве примера. В отношении этого примера могут быть построены двумерные точечные гистограммы, что также позволяет пользователю выбрать окна на этой гистограмме.
Улучшение "полутеневой" детали, описанной выше, может состоять в том, что используется конструкция, показанная на фигуре 25d. Здесь те же указанные две полусферические части проецируются на плоскость изображения, но способ их генерирования является другим. Зеркало 57 расщепляет луч 44 света на полукруглые части, и взаимно их рекомбинирует. Каждая из половинок проходит через отдельное средство управления состоянием ее поляризации. Преимущество этого варианта воплощения состоит в том, что углы поляризации могут управляться непрерывно и независимо, что улучшает установочную регулировку. Материалы, используемые в этом варианте воплощения, могут поставляться фирмами, поставляющими стандартные оптические средства, и могут быть установлены в виде требуемой конфигурации с использованием аналогичных монтажных элементов, которые используются для интерферометрических оптических средств.
Рассмотрим теперь фигуру 26a, b, c, d, на которой для коррекции искажений, вводимых при проходе света через неплоскую область прозрачного материала, такую как, по существу, цилиндрический поток текучей среды, включая также другие геометрические формы, в вариантах воплощения настоящего изобретения представлено использование компонента, аналогичного по форме неплоской области, но действующего противоположно, благодаря соответствующему выбору значений относительных коэффициентов преломления. В конкретном случае использования проточного цитометра такая форма приближается к цилиндру. Для коррекции ошибок, вводимых из-за того, что объекты, оценка которых производится, расположены в пределах цилиндрического потока воды, вводят оптический компонент 58, который может иметь форму прозрачного цилиндра, расположенного внутри прозрачного материала 59 с более высоким коэффициентом преломления. Предпочтительно, чтобы изображение потока и элемента компенсации накладывались друг на друга в плоскости изображения. Это может быть выполнено путем установки элемента компенсации между линзами объектива и плоскостью изображения, и с помощью использования дополнительных линз.
Вариант воплощения оптического компонента 58 может быть установлен в пределах тонкого слоя прозрачного материала 59 с более высоким коэффициентом преломления, например, из стекла или органического стекла, с цилиндрическим отверстием, высверленным в нем. Органическое стекло имеет то преимущество, что в нем легче высверлить круглый канал. Цилиндрическое отверстие может быть заполнено прозрачным материалом, коэффициент преломления которого меньше, чем у окружающего материала. Разница коэффициентов преломления между веществом и окружающим материалом может быть такой же, но противоположной, что и разница коэффициентов преломления между водой в потоке и окружающим воздухом для некоторых вариантов воплощения. При этом нет необходимости, чтобы цилиндр имел тот же размер, что и поток воды, поскольку увеличение используемых линз позволяет свести проецируемые на плоскость изображения к одинаковым размерам. В некоторых вариантах применения может быть необходимым регулировать разность коэффициентов преломления для компенсации такого увеличения. Такие элементы могут быть достаточно просто изготовлены из органического стекла, что может быть выполнено в большинстве механических мастерских, которые имеют опыт по обработке органического стекла или выбранного материала. Этот элемент может быть изготовлен с такими размерами, чтобы его можно было устанавливать в стандартные устройства оптического монтажа для упрощения установки в оптические системы.
Обеспечение точного соответствия коэффициентов преломления может быть трудноосуществимым. В одном из вариантов настоящего изобретения, который позволяет осуществлять такую регулировку, используется вещество внутри органического стекла или другого выбранного материала в виде прозрачной жидкости 58 с определенным коэффициентом преломления, в качестве одного из примеров, органическое масло или смесь масел, которая имеет коэффициент преломления, близкий к требуемому значению. Благодаря тому, что коэффициент преломления большинства жидкостей изменяется при температуре в намного большей степени, чем у твердых веществ или у стекла, можно точно регулировать разность коэффициента преломления с помощью регулировки температуры. Это может осуществляться с помощью контроллера 60 установки температуры.
Оптический компонент 58 из прозрачной жидкости или жидкости с определенным значением коэффициента преломления может поставляться фирмами, занимающимися поставками химических соединений. На этих фирмах часто можно получить готовые данные, относящиеся к коэффициенту преломления производимых ими жидкостей. Некоторые фирмы даже предлагают материалы, которые специально приготовлены для использования в качестве жидкостей с определенным значением коэффициента преломления и имеют гарантированный и стабильный коэффициент преломления. Контроллеры температуры и термостаты поставляются множеством фирм. Практический способ приложения тепла к жидкости с определенным коэффициентом преломления может состоять в использовании полого монтажного элемента, изготовленного из теплопроводного материала, например, из металла, содержащего жидкость с определенным значением коэффициента преломления. При использовании обычного погружного термостатического датчика циклов, который можно найти во многих лабораториях, через монтажный элемент можно прокачивать воду, поддерживая таким образом фиксированную и управляемую температуру элемента.
Описание, включенное в заявку РСТ, предназначено для использования в качестве основного описания. Следует понимать, что в данном конкретном варианте описания может содержаться неполное описание всех возможных вариантов воплощения; при этом подразумевается множество альтернативных вариантов. В нем также может не полностью поясняться характерная природа настоящего изобретения и может быть не полностью показано, как в действительности могут быть воплощены каждое свойство или элемент, выполняющие более широкие функции, или когда для них возможно большое количество альтернативных или эквивалентных вариантов. Также отметим, что они не явно включены в настоящее описание. В случаях, когда настоящее изобретение описано в функционально-ориентированной терминологии, каждый аспект функции выполняется с помощью устройства, процедуры или программы. Для описанных устройств не только могут быть приведены соответствующие пункты формулы изобретения, направленные на устройство, но в формулу изобретения также могут быть включены пункты, направленные на способ или процесс для описания функций настоящего изобретения, которые выполняет каждый из элементов. При этом описание и терминология не предназначены для ограничения объема формулы изобретения, которая будет приведена ниже.
Кроме того, каждый из различных элементов настоящего изобретения и формулы изобретения также может быть получен с использованием множества способов. Данное описание не следует понимать как охватывающее каждый такой вариант, независимо от того, является ли он вариантом воплощения какого-либо устройства, способа или процесса, или всего лишь вариантом какого-либо их элемента. В частности, следует понимать, что, поскольку настоящее описание относится к элементам настоящего изобретения, формулировки, описывающие каждый из элементов, могут быть выражены эквивалентными терминами, описывающими устройства, или терминами, описывающими способ, даже если у них совпадает только функция или результат. Такие эквивалентные, более широкие или даже более общие обозначения следует рассматривать, как охватываемые описанием каждого элемента или действия. Такие термины могут быть заменены в тех местах, где требуется ясно представить не явно выраженный широкий охват, на который направлено настоящее изобретение. В качестве одного из примеров следует понимать, что все действия могут быть выражены как средство для выполнения такого действия или как элемент, с помощью которого выполняется это действие. Аналогично, каждый описанный физический элемент следует понимать, как охватывающий описание действия, которое позволяет выполнять такой элемент. В отношении последнего аспекта, в качестве одного из примеров описание "устройства разделения капелек" следует понимать как охватывающее описание действия по "разделению капелек", независимо от того, описано ли это явным образом или нет, и, наоборот, в тех случаях, где приведено только описание действия "преобразования жидкость-газ", такое описание следует понимать как охватывающее описание "устройства разделения капелек" и даже средства для "разделения капелек". Такие изменения и альтернативные термины следует понимать как явным образом включенные в описание.
Кроме того, могут быть созданы и представлены различные комбинации и изменения всех элементов или вариантов применения. Все это может выполняться для оптимизации конструкции или рабочих характеристик в конкретных вариантах применения.
Кроме того, в отношении каждого используемого термина следует понимать, что до тех пор, пока такая интерпретация не станет несовместимой с использованием настоящей заявки, каждый используемый термин и все альтернативные термины и синонимы следует понимать в соответствии с их определениями, приведенными в словарях общего пользования, таких как содержатся в словаре Random House Webster′s Unabridged Dictionary, второе издание, который приводится здесь в качестве ссылки. Однако в отношении вышеуказанного, если информация или заявление, содержащееся в документе ссылки, может рассматриваться как несовместимое с патентованием настоящего/ настоящих изобретения (изобретений), такое заявление не следует рассматривать как сделанное заявителем (заявителями).
Кроме того, если только контекст не потребует другого, следует понимать, что термин "содержать" или такие его варианты, как "содержит" или "содержащий", подразумевают включение указанного элемента или этапа или группы элементов или этапов, но не исключение любого другого элемента или этапа или группы элементов или этапов. Такие термины следует интерпретировать в наиболее широкой форме, которая предоставляет заявителю самый широкий охват, что разрешено в соответствии с законом в таких странах, как Австралия и т.п.
Таким образом, следует понимать, что заявитель (заявители) должен иметь поддержку в отношении заявления, по меньшей мере: i) каждого из устройств преобразования жидкости в газ, описанных в настоящем описании; ii) соответствующих, раскрытых и описанных способов; iii) аналогичных, эквивалентных, и даже подразумевающихся вариантов каждого из этих устройств и способов; iv) альтернативных конструкций, которые выполняют каждую из раскрытых и описанных функций; v) альтернативных вариантов конструкций и способов, которые выполняют каждую из представленных функций, подразумевающихся для выполнения того, что раскрыто и описано; vi) каждого свойства, компонента и этапа, представленного, как отдельные и независимые изобретения; vii) заявок, расширенных с помощью различных описанных систем или компонентов; viii) полученных в результате продуктов, с использованием таких систем или компонентов; ix) способов и устройств, по существу, как описано выше, и со ссылкой на любые прилагаемые примеры; х) различных комбинаций и изменений каждого из раскрытых элементов.
Кроме того, если только контекст не потребует другого, следует понимать, что термин "содержать" или такие его варианты, как "содержит" или "содержащий", подразумевают включение указанного элемента или этапа или группы элементов или этапов, но не исключение любого другого элемента или этапа или группы элементов или этапов. Такие термины следует интерпретировать в наиболее широкой форме, которая предоставляет заявителю самый широкий охват, что разрешено в соответствии с законом в таких странах, как Австралия и т.п.
Формула изобретения приведена в настоящем описании и содержится в нем как часть настоящего описания изобретения, и заявитель сохраняет за собой исключительное право использовать все части такого включенного содержания такой формулы изобретения как дополнительное описание для поддержки любого или всех пунктов формулы изобретения или любого их элемента или компонента, и заявитель, кроме того, определенно сохраняет за собой право перемещать любую часть или все приведенное содержание таких пунктов формулы изобретения или любого их элемента или компонента из описания в формулу изобретения или, наоборот, по мере необходимости, для определения предмета, для которого испрашивается защита с помощью настоящей заявки или с помощью любого последующего продолжения, разделения или частичного продолжения его заявки, или для получения какой-либо прибыли или снижения выплат в связи с ней, или для соответствия патентному законодательству, правилам или установлениям в любой стране или в соответствии с любым из договоров, и такое содержание, приведенное в качестве ссылки, должно быть действительным в течение всего периода рассмотрения настоящей заявки, включая любые последующие продолжения, разделения или частичные продолжения его заявки или любые ее повторные издания или продолжения.
Любые законодательные акты, законы, инструкции или правила, указанные в настоящей заявке на патент: или патенты, публикации или другая ссылочная литература, указанные в настоящей заявке на патент, приводятся здесь в качестве ссылки. В частности, заявки на американский патент №№60/267,571, 60/239,752, и 60/203,089 каждая из которых приводится здесь в качестве ссылки, включая все чертежи или приложения, и каждая из ссылок на источники литературы, указанная в следующей таблице источников литературы приводятся здесь в качестве ссылки.
1. Способ разделения клеток спермы, несущих Х-хромосому, и клеток спермы, несущих Y-хромосому, содержащий следующие этапы: отбор клеток спермы от самца определенного вида млекопитающего за исключением человека, ввод клеток спермы в поток текучей среды, анализ клеток спермы, захваченных потоком текучей среды, определение количества ДНК в ядрах клеток спермы, облучение окрашенной ДНК в ядрах клеток спермы, детектирование флуоресцентного света, излучаемого облученной окрашенной ДНК, находящейся в ядрах клеток спермы, дифференцирование клеток спермы на основе количества ДНК внутри ядер клеток спермы, формирование множества капелек, содержащих одну из клеток спермы, сообщение заряда каждой из капелек по-разному, в зависимости от количества ДНК внутри ядер клеток спермы, содержащихся в данной капельке, электростатическое отклонение каждой из капелек, раздельное накопление капелек на основании количества ДНК внутри ядер клеток спермы, захваченных в каждую капельку, разделение дифференцированных клеток спермы на популяции, несущие Х-хромосому, и популяции, несущие Y-хромосому, и получение популяций интактных клеток спермы, несущих Х-хромосому, и несущих Y-хромосому со степенью чистоты выше, чем 90% для каждой.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап дифференцирования клеток спермы с учетом характеристики дифференцирования половых признаков содержит оценку объема капсулы, содержащей указанное количество ДНК.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что этап оценки объема капсулы, содержащей указанное количество ДНК, включает определение объема ядер в клетках спермы.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что этап оценки объема капсулы, содержащей указанное количество ДНК, включает определение объема головки клетки сперматозоида.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что этап оценки объема капсулы, содержащей указанное количество ДНК, дополнительно включает следующие этапы: генерирование пучка электромагнитного излучения с исходными характеристиками формы колебаний, перемещение объема капсулы, содержащей указанное количество ДНК, через пучок электромагнитного излучения, изменение исходных характеристик формы колебаний при перемещении объема капсулы, анализ измененных характеристик формы колебаний.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что изменение исходных характеристик формы колебаний при перемещении капсулы состоит в сдвиге по фазе исходных колебаний в пучке электромагнитного излучения.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что содержит этап наложения пучка электромагнитного излучения со сдвигом фазы на пучок электромагнитного излучения, имеющий исходные характеристики формы колебаний.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап сравнения интенсивности электромагнитного излучения наложенных пучков электромагнитного излучения с интенсивностью электромагнитного излучения пучка с исходными характеристиками формы колебаний.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап определения объема капсулы, содержащей указанное количество ДНК, в зависимости от разности интенсивности света между наложенными пучками электромагнитного излучения и пучком электромагнитного излучения с исходными характеристиками формы колебаний.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап детектирования флуоресцентного света от облученной окрашенной ДНК, находящейся в ядрах клеток спермы, содержит генерирование сигнала с помощью трубки фотоумножителя.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап формирования капелек содержит формирование капелек с размером, достаточным для обволакивания клеток спермы.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап выбрасывания потока текучей среды через сопло, содержащее отверстие диаметром 70 мкм.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что дополнительно содержит следующие этапы: ориентирование клеток спермы по отношению к детектору, детектирование света, имеющего характеристики, отличающиеся в зависимости от ориентации клетки по отношению к детектору, преобразование света, имеющего характеристики, отличающиеся в зависимости от ориентации клетки спермы, по меньшей мере, в один сигнал, содержащий информацию об ориентации клетки спермы, и определение ориентации клетки спермы по отношению к указанному детектору.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап раздельного накопления клеток в зависимости от определенной ориентации клетки спермы по отношению к указанному детектору.
15. Способ по любому из пп 1, 5, 11 или 13, отличающийся тем, что степень чистоты популяций клеток спермы, несущих Х-хромосому, и клеток спермы, несущих Y-хромосому, выбирают из группы, состоящей из от 90 до приблизительно 100%, от приблизительно 91 до приблизительно 100%, от приблизительно 92 до приблизительно 100%, от приблизительно 93 до приблизительно 100%, от приблизительно 94 до приблизительно 100%, от приблизительно 95 до приблизительно 100%, от приблизительно 96 до приблизительно 100%, от приблизительно 97 до приблизительно 100%, от приблизительно 98 до приблизительно 100%, от приблизительно 99 до приблизительно 100%.
16. Способ по любому из пп 1, 5, 11 или 13, отличающийся тем, что на этапе разделения клеток спермы скорость разделения выбирают из группы, состоящей из по меньшей мере, 500 разделений в секунду, по меньшей мере, 1000 разделений в секунду, по меньшей мере, 2000 разделений в секунду, по меньшей мере, 3000 разделений в секунду, по меньшей мере, 4000 разделений в секунду, по меньшей мере, 5000 разделений в секунду, по меньшей мере, 6000 разделений в секунду, по меньшей мере, 7000 разделений в секунду, по меньшей мере, 8000 разделений в секунду, по меньшей мере, 9000 разделений в секунду, по меньшей мере, 10000 разделений в секунду.
17. Способ по любому из пп.1, 5, 11 или 13, отличающийся тем, что на этапе формирования капелек, каждая из которых содержит одну клетку спермы, скорость формирования капелек выбирают из группы, состоящей из, по меньшей мере, 10000 капелек в секунду, по меньшей мере, 20000 капелек в секунду, по меньшей мере, 30000 капелек в секунду, по меньшей мере, 40000 капелек в секунду, по меньшей мере, 50000 капелек в секунду, по меньшей мере, 60000 капелек в секунду, по меньшей мере, 70000 капелек в секунду, по меньшей мере, 80000 капелек в секунду, по меньшей мере, 90000 капелек в секунду, по меньшей мере, 100000 капелек в секунду.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве представителя вида млекопитающих выбирают быка.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что представителем вида млекопитающих является конь.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что представителем вида млекопитающих является баран.
