Способ получения конъюгатов гепарина

Изобретение относится к области химии и биохимии, в частности, к способу получения новых веществ, производных гепарина, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии. Способ осуществляют путем взаимодействия его с аминосодержащими соединениями в присутствии конденсирующего реагента 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида в водной среде при комнатной температуре, рН 4.7-4.8. В качестве аминосодержащих соединений используют ряд фармакологически значимых аминов: n-аминофенол, n-аминобензойную и антраниловую кислоты, 4- и 5-аминосалициловые кислоты, стрептоцид, сульфацил-натрий, анестезин, новокаин, таурин (тауфон), 7-аминоцефалоспориновую кислоту, а также изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты). В зависимости от природы аминосодержащего соединения и соотношения реагентов получают водорастворимые модифицированные гепарины с различной конверсией карбоксильных групп. Преимуществами предлагаемого способа получения конъюгатов гепарина является осуществление реакции за короткий промежуток времени, позволяющий достигать высокой конверсии карбоксигрупп гепарина, использование при этом небольших избытков реагентов: гепарин: RNH₂:EDC=1:(1-3):(0.75-3.00). Варьирование соотношения реагентов позволяет получать модифицированные гепарины с заданной степенью конверсии карбоксигрупп. Следует отметить легкость очистки конъюгатов от низкомолекулярных примесей и хорошую растворимость продуктов в воде. 1 табл.

 

Изобретение относится к области химии и биохимии, в частности, к способу получения новых веществ, производных гепарина, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии.

Гепарин, природный сульфатированный полисахарид из класса гликозаминогликанов, состоит из повторяющихся единиц 6-сульфат-2-дезокси-2-сульфамино-D-глюкопиранозы и 2-сульфат-L-идопиранозилуроновой кислоты, находится в печени, легких, селезенке, слизистой оболочке кишечника и щитовидной железе высших животных. Молекулярная масса гепарина находится в пределах от 3000 до 40000 Да. Гепарин широко используется в медицине в качестве антикоагулянта и антитромботического средства. Кроме антикоагулянтных и антитромботических у гепарина выявлены антибактериальные, антивирусные, противовоспалительные [Бычков С.М. Новые данные о гепарине. // Вопросы медицинской химии. 1981. №6. С.726-735] и противоопухолевые свойства [Lapierre F., Holme К., Lam L. Chemical modification of heparin that diminish anticoagulant but preserve its heparanase-inhibitory, angiostatic, anti-tumor and anti-metastatic properties. // Glycobiology 1996. V.6(3). P.355-366]. Обнаружено также ингибирующее действие гепарина на рост и репликацию вируса иммунодефицита человека [Rider С.С. The potential for heparin and its derivatives in the therapy and prevention of HIV-1 infection. // Glycoconj. J. 1997. V.14(5). P.639-642].

Фармакопейные препараты гепарина для внутривенного введения выпускаются в виде натриевой и кальциевой солей. Гепариновую мазь применяют наружно при поверхностных тромбофлебитах и язвах конечностей, тромбозе геморроидальных вен: при этом уменьшаются воспалительные процессы. Низкомолекулярный гепарин (Фраксипарин, Эндоксапарин Натрия, Сулодексид; M_n=3000-4500 Да) применяется в хирургической и ортопедической практике и является, в отличие от гепарина с M_n=14-18 тыс. Да, препаратом пролонгированного действия [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг, 1997. - Т.1, 2. - 590 С.].

В последние годы проявляется большой интерес к получению и исследованию биологических свойств химически модифицированных аналогов гепарина. Функционализация гепарина позволяет изменить физико-химические и биологические свойства гепарина. Конъюгаты гепарина с лекарственными субстанциями могут обладать большей растворимостью или продолжительностью действия по сравнению с самими лекарствами, могут использоваться как препараты комбинированного действия.

Амфифильные производные гепарина, способные абсорбироваться желудочно-кишечным трактом, были синтезированы с участием N-гидроксисукцинимидных эфиров некоторых стеролов, желчных и алифатических кислот [Amphiphilic polysaccharide derivatives, US 6245753]. Также были получены нитропроизводные низкомолекулярного гепарина [Nitro-derivatives of low molecular weight heparin, EP 1340771] и эпоксигепарина [Nitro-derivatives of epoxyheparin, EP 1340772 A1], которые могут применяться в лечении патологий, связанных с дисфункцией сердечно-сосудистой системы. Известны различные десульфатированные [Process for producing desulfated polysaccharide, and desulfated heparin, US 6, 545, 136 B1] и суперсульфатированные [Yates E.A., Santini F., Guerrini M., Naggi A., Torri G., Casu B. ¹H and ¹³C NMR spectral assignments of the major sequences of twelve systematically modified heparin derivatives // Carbohydrate Res. 1996. V.294. P.15-27] аналоги гепарина, которые проявляют антипролиферативную и антикоагулянтную активность, отличающуюся от исходного гепарина.

При разработке гемосовместимых тромборезистентных материалов наиболее часто применяется ковалентное связывание гепарина с натуральной или искусственной полимерной матрицей. Например, карбоксильные группы гепарина при помощи водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида были ковалентно связаны с аминогруппами желатина или смеси желатина и альбумина, используемых для покрытия сосудистых протезов. При этом ковалентно связанный гепарин проявлял антипролиферативную активность [Laemmel E., Penhoat J., Warocquier-Clerout R., Sigot-Luizard M.F. Heparin immobilized on proteins usable for arterial prosthesis coating: growth inhibition of smooth-muscle cells // J. Biomed. Mater. Res. 1998. - V.39 (3). - Р.446-452].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения конъюгата гепарина с дигидразидом адипиновой кислоты, предназначенного для последующей реакции с некоторыми стероидами с глюкокортикоидной и минералокортикоидной активностью [Derbyshire E.J., Yang Y-C., Li Sh., Comin G.A., Belloir J., Thorpe F.E. Heparin-steroid conjugates lacking glucocorticoid or mineralocorticoid activities inhibit the proliferation of vascular endothelial cells // Biochimica et Biophysica Acta. 1996. V.1310. P.86-96]. Карбоксильные группы гепарина реагируют с аминогруппами дигидразида адипиновой кислоты (берется большой избыток) в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC) в водной среде при комнатной температуре (рН 4.75) с образованием соответствующего конъюгата (мольные отношения реагентов авторами не указаны), который очищали от низкомолекулярных примесей диализом и затем лиофилизировали. Удается ввести в молекулу гепарина не более 10 гидразидных остатков, что составляет ˜50% мольн. в расчете на дисахаридное звено гепарина. Далее свободные аминогруппы гидразида гепарина использовали в реакции с кортикостероидами.

Целью предлагаемого изобретения является способ получения фармакозначимых конъюгатов гепарина с соединениями, содержащими первичную аминогруппу, путем их взаимодействия с гепарином в водной среде (рН 4.7-4.8) в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC). В качестве аминосодержащих соединений были использованы фармакологически значимые n-аминофенол, 5- и 4-аминосалициловые, антраниловая и n-аминобензойная кислоты, этиловый эфир n-аминобензойной кислоты (анестезин), β-диэтиламиноэтиловый эфир n-аминобензойной кислоты (новокаин), гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид), 2-аминоэтансульфоновая кислота (таурин), 7-аминоцефалоспориновая кислота, а также сульфаниламидные препараты, содержащие свободную аминогруппу, такие как n-аминобензолсульфамид (стрептоцид), n-аминобензолсульфацетамид-натрий (сульфацил-натрий). Конъюгация перечисленных аминосодержащих соединений с гепарином позволяет расширить арсенал производных гепарина, придать ему дополнительные медикаментозные свойства: противовоспалительные, антимикробные, анестезирующие. Преимуществами предлагаемого способа получения конъюгатов гепарина также является осуществление реакции за короткий промежуток времени, позволяющий достигать высокой конверсии карбоксигрупп гепарина (в некоторых случаях до 100% мольн. в расчете на дисахаридное звено), использование при этом небольших избытков регентов: гепарин:RNH₂:EDC=1:(1-3):(0.75-3.00). Варьирование соотношения регентов позволяет получать модифицированные гепарины с заданной степенью конверсии карбоксигрупп. Следует отметить легкость очистки конъюгатов от низкомолекулярных примесей и хорошую растворимость продуктов в воде.

где R=С₆Н₄ОН (остаток п-аминофенола), С₆Н₄СООН (остатки п-аминобензойной и антраниловой кислот), С₆Н₃(ОН)СООН (остатки 4- и 5-аминосалициловых кислот), C₆H₄SO₂NH₂ (остаток п-бензолсульфамида), С₆Н₄SO₂N(Na)СОСН₃ (остаток п-аминобензолсульфацетамид-натрия), С₆Н₄СООС₂Н₅ (остаток этилового эфира п-аминобензойной кислоты), С₆Н₄COO(СН₂)₂N(С₂Н₅)₂ (остаток бета-диэтиламиноэтилового эфира п-аминобензойной кислоты), C₅H₄NCONHNH₂ (остаток гидразида изоникотиновой кислоты), Н₂NCH₂СН₂SO₃Н (остаток 2-аминоэтансульфоновой кислоты), C₉O₅NSH₁₀ (остаток 7-аминоцефалоспориновой кислоты),

R¹=NHSO₃ ^- или NHAc (20-30%)

Пример 1. К смеси 91,8 мг (0.15 ммоль) гепарина (ГЕП) и 0.15 ммоль соответствующего амина в 15 мл Н₂О добавляют 0.1 н. NaOH (или, если требуется, 0.1 н. HCl) до pH 4.7-4.8, затем при интенсивном перемешивании и температуре 20-22°С вносят 21.5 мг (0.11 ммоль) карбодиимида (соотношение реагентов ГЕП:амин:EDC=1:1:0.75), поддерживая pH 4.7-4.8 титрованием 0.1 н. HCl. Через 0.5 ч к охлажденной до 0°С реакционной смеси последовательно добавляют 0.1 н. NaOH (до pH 7), 2-3 мл насыщенного раствора NaCl и 60-65 мл охлажденного этанола, после чего оставляют на ночь при 0°С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл 6% NaCl, добавляют 40 мл этанола. Вновь выпавший осадок центрифугируют, промывают этанолом (10×3 мл), затем эфиром (10×3 мл) и сушат при температуре ≤60°С и пониженном давлении. Получают ˜100 мг соответствующих конъюгатов в виде белых порошков с розовым или желтым оттенком, растворимых в воде.

Пример 2. Реакцию гепарина с соответствующим амином проводят аналогично примеру 1, но при этом используют следующее соотношение реагентов: ГЕП:амин:EDC=1:1:1.5, т.е. к 91.3 мг (0.15 ммоль) гепарина прибавляют 0.15 ммоль соответствующего амина и 43 мг (0.22 ммоль) карбодиимида.

Пример 3. Реакцию гепарина с соответствующим амином проводят аналогично примеру 1, но при этом используют следующее соотношение реагентов: ГЕП:амин:EDC=1:3:3, т.е. к 91.3 мг (0.15 ммоль) гепарина прибавляют 0.45 ммоль соответствующего амина и 86.3 мг (0.45 ммоль) карбодиимида.

Конверсию карбоксильных групп гепарина определяют по данным ¹Н-ЯМР-спектроскопии, используя в качестве внутреннего стандарта интенсивность сигналов аномерных протонов исследуемого образца модифицированного гепарина в области 5.3-5.5 м.д.

Спектры ¹Н-ЯМР регистрировали для растворов в D₂О на спектрометре Bruker АМХ-300 (рабочая частота для ¹Н-ЯМР-300.13 МГц), в качестве внутреннего стандарта использовали натриевую соль 3-(триметилсилил)-1-пропансульфоновой кислоты. УФ-спектры получали на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра «рН-340».

Характеристика конъюгатов гепарина с рядом фармакологически значимых аминосодержащих соединений: n-аминофенолом, n-аминобензойной, антраниловой, 5-аминосалициловой и 4-аминосалициловой кислотами, анестезином и новокаином, стрептоцидом, таурином, 7-аминоцефалоспориновой кислотой, изониазидом, сульфацил-натрием приводится в таблице.

Таблица
RNH2	Конверсия карбоксильных групп ГЕП (%) при различных соотношениях реагентов	УФ-спектр: (H2O, λmax, нм)
ГЕП:амин:EDC=1:1:0.75	ГЕП:амин:EDC=1:1:1.5	ГЕП:амин:EDC=1:3:3
n-аминобензойная кислота	53*	83*	90*	298, 317 или 333 в зависимости от конверсии СООН-групп
антраниловая кислота	52	75	75	259 и 303
5-аминосалициловая кислота	39	64	86	317
4-аминосалициловая кислота	27	28	61	268 и 306
n-аминофенол	40	52	56	246
стрептоцид	36	48	86	258
сульфацил-натрий	51	80	100	263
анестезин	75	100	100	271
новокаин	66	93	100	273
изониазид	45	100	100	266
7-аминоцефалоспориновая кислота	24	50	100	264
таурин	15	29	44	-
*В конъюгатах гепарина обнаружены димерные и тримерные фрагменты n-аминобензойной кислоты (подтверждено данными 13С-ЯМР-спектроскопии).

Способ получения конъюгатов гепарина путем его взаимодействия с аминосодержащими соединениями в водной среде, рН 4,7-4,8, в присутствии конденсирующего реагента 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC), отличающийся тем, что в качестве аминосодержащих соединений (RNH₂) используют n-аминофенол, n-аминобензойную и антраниловую кислоты, 4- и 5-аминосалициловые кислоты, стрептоцид, сульфацил-натрий, анестезин, новокаин, изониазид, 2-аминоэтансульфоновую кислоту (таурин), 7-аминоцефалоспориновую кислоту при мольных соотношениях компонентов гепарин: RNH₂:EDC=1:(1-3):(0.75-3.00), смесь интенсивно перемешивают при 20-22°С в течение 30 мин, затем охлаждают до 0°С, доводят рН до 7, насыщают NaCl, добавляют охлажденный этанол, оставляют на ночь при 0°С, выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом и эфиром и сушат при температуре не выше 60°С и пониженном давлении.