Способ получения иммунного лактоглобулина

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в производстве лактоглобулина для иммунотерапии. Способ заключается в том, что ультрафильтрацию проводят в два этапа в циркулирующем под давлением потоке перпендикулярно току фильтрата, при этом на первом этапе фильтрацию осуществляют на мембранном кассетном модуле, производя осветление лактосыворотки, очищая ее от остатков жира и казеина, а второй этап проводят на модуле с полыми волокнами, осуществляя отмывание рабочей смеси от низкомолекулярных компонентов 0,4% раствором хлорида натрия рН 5,0-6,0 и концентрирование белка в пределах 4,5-5,5%, причем полученный фильтрат подвергают стерилизации и в жидком виде разливают во флаконы. При этом отмывание концентрата лактоглобулина, полученного по второму этапу, от низкомолекулярных компонентов проводят трижды, фильтруя его на волоконном модуле с добавлением трехкратного объема 0,4% раствора хлорида натрия рН 5,0-6,0. Кроме того, необходимую концентрацию белка в лактоглобулине получают из расчета конечного объема раствора лактоглобулина. Изобретение обеспечивает упрощение технологии. 2 табл., 2 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в производстве лактоглобулина для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний, а именно кишечных инфекционных заболеваний и дисбактериозов кишечника.

Известен способ получения лактоглобулина противоколипротейного коровьего для перорального применения (см. СССР авт.св. №1743025, кл. А61К 35/20, 06.06.1989 г.), заключающийся в выделении молозивной лактосывотки, фракционировании ее на холоде этанолом, отделении осадка центрифугированием, разведении осадка, осветляющей и стерилизующей фильтрации, причем после осветляющей фильтрации в раствор лактоглобулина добавляют трилон Б и сорбит до концентрации 0,05-0,15% и 0,5-1,5% соответственно.

Недостатком известного способа является то, что на этапе спиртового осаждения используют метод Кона, который неблагоприятно влияет на конечный продукт, а процесс лиофилизации приводит к уменьшению биологически активных веществ ферментативной природы, которые обеспечивают бактерицидные свойства лактоглобулинов, что снижает его качество.

Кроме того, технология получения лактоглобулина очень трудоемка, непроизводительна, требует дорогостоящего оборудования, холодильных установок и большого количества спирта.

За прототип выбран способ получения иммуноглобулинового препарата (см. RU, пат.№2108794, кл. А61К 35/20, 20.04.1998 г.), включающего использование в качестве исходного продукта молока или молозива иммунных коров с последующим удалением жира и казеина путем кислотной коагуляции, при этом полученную сыворотку обрабатывают каприловой кислотой из расчета 2-10 мл кислоты на 100 мл сыворотки, коагулируя белки неиммуноглобулиновой природы и липиды, после чего удаляют осадок.

Однако проведение осаждения компонентов каприловой кислотой также не даст возможности получать высококачественный препарат ввиду того, что идет отрицательное влияние самой кислоты на ферментативную активность лактоглобулина, в частности лактопероксидазы, обеспечивающией неспецефическое защитное действие лактоглобулинов.

Кроме того, известный способ может быть использован только в лабораторных условиях и требует большого количества каприловой кислоты, а именно на 100 литров сыворотки необходимо 10 литров кислоты.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в упрощении технологии производства иммунного лактоглобулина с высоким качеством конечного продукта.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения иммунного лактоглобулина, включающем получение лактосыворотки из молока или молозива от иммунных коров с последующим осветлением лактосыворотки и ее концентрированием путем ультрафильтрации, последнюю проводят в два этапа в циркулирующем под давлением потоке перпендикулярно току фильтрата, при этом на первом этапе фильтрацию осуществляют на мембранном кассетном модуле, производя осветление лактосыворотки, очищая ее от остатков жира и казеина, а второй этап проводят на модуле с полыми волокнами, осуществляя отмывание рабочей смеси от низкомолекулярных компонентов 0,4% раствором хлорида натрия рН 5,0-6,0 и концентрирование белка в пределах 4,5-5,5%, причем полученный фильтрат подвергают стерилизации и в жидком виде разливают во флаконы.

При этом отмывание концентрата лактоглобулина, полученного по второму этапу, от низкомолекулярных компонентов проводят трижды, фильтруя его на волоконном модуле с добавлением трехкратного объема 0,4% раствора хлорида натрия.

Кроме того, необходимую концентрацию белка в лактоглобулине получают из расчета конечного объема раствора лактоглобулина по формуле:

где

V₀ - конечный объем раствора лактоглобулина, в литрах;

x₁ - концентрация белка, полученная в растворе, в %;

x₂ - необходимое количество белка, в %;

V₁ - объем концентрата лактоглобулина, в литрах,

а из разницы объемов конечного продукта V₀ и концентрата V₁ получают объем необходимого раствора 0,4% хлорида натрия.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежом, где на

фиг.1 изображена установка для реализации способа получения иммунного лактоглобулина;

фиг.2 - схема прохождения рабочей жидкости через кассетный модуль;

фиг.3 - схема прохождения рабочей жидкости через модуль с полыми волокнами.

Установка состоит (см. фиг.1) из емкости 1 для лактосыворотки 2. Посредством гибких шлангов 3, 4 из селиконовой резины емкость 1 связана соответственно с перестальтическим насосом 5 и с ультрафильтрационным мембранным кассетным модулем 6. Последний снабжен шлангом 7, взаимодействующим с перестальтическим насосом 5, и шлангом 8, связанным с емкостью 9.

Кассетный модуль 6 представляет собой набор из десяти мембранных кассет 10, каждая из которых представляет собой пластину с порами диаметром 0,22 мкм (см. фиг.2), установленных в модуле горизонтально. Емкость 9 с помощью гибкого шланга 11 взимодействует с ультрафильтрационным модулем 12 с полыми волокнами 13 (см. фиг.1, 3), установленным вертикально для подачи перерабатываемой лактосыворотки 2.

Между емкостью 9 и модулем 12 размещен второй перестальтический насос 14, который связан шлангом 15 с упомянутой емкостью 9, а шлангом 16 с модулем 12. При этом за модулем 12 установлена емкость 17, которая связана с ним шлангом 18.

Для создания давления в системе используются вентили шланговые (на чертеже не показаны), которые установлены на выходе ультрафильтрационных модулей 6, 12. Давление контролируется посредством манометров. Соединение шлангов с элементами установки осуществляется посредством быстросъемных зажимов.

Кроме того, управление технологическим процессом осуществляется с блоков управления, размещенных на передней панели перестальтических насосов 5, 14.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Молоко или молозиво от иммунных коров подвергают сепарированию и производят его пепсинизацию, получая лактосыворотку 2. Лактосыворотку 2 с остатками жира и казеина заливают в емкость 1 (см. фиг.1) и включают перестальтический насос 5.

Рабочая смесь (лактосыворотка 2) поступает под давлением в поры мембранных кассет 10 перпендикулярно току фильтрата (см. фиг.2) и по шлангам 3, 4, 7 начинает циркулировать несколько раз по замкнутому контуру. Фильтрат, выходящий из модуля 10 через шланг 8, после прогонки через ультрафильтрационный модуль 10 собирается в емкости 9.

Таким образом после проведения первого этапа ультрафильтрации получают осветленную лактосыворотку с рН 5,0-6,0 без остатка жира и казеина.

Второй этап ультрафильтрации заключается в очищении рабочей смеси от низкомолекулярных компонентов. Для этого из емкости 9 (см. фиг.1) рабочую жидкость по шлангам 15, 16 перестальтическим насосом 14 подают в модуль 12. Подачу смеси проводят под давлением через полые волокна 13 (см. фиг.3), разделяя при этом вещество по молекулярным параметрам. Используя перепады давления, по обе стороны волокон создается движущая сила для переноса вещества через поры полых волокон. Низкомолекулярный фильтрат поступает по шлангу 18 (см. фиг.1) в емкость 17, а очищеннный концентрат в емкость 9.

Отмывание рабочей смеси от низкомолекулярных компонентов проводят трижды трехкратным объемом 0,4% раствора хлорида натрия, который добавляют в емкость 9. Причем после каждой отмывки в полученном концентрате определяют наличие белка, а затем проводят расчет по формуле:

где

V₀ - конечный объем раствора лактоглобулина, в литрах;

x₁ - концентрация белка, полученная в растворе, в %;

x₂ - необходимое количество белка, в %;

V₁ - объем концентрата лактоглобулина, в литрах.

Затем из выражения:

где

V₀ - конечный объем раствора лактоглобулина, в литрах;

V₁ - объем концентрата лактоглобулина, в литрах;

V - объем необходимого раствора хлорида натрия, в литрах,

определяют, сколько нужно влить 0,4% раствора хлорида натрия для получения заданной концентрации белка в готовом продукте. Содержание белка определяют биуретовым реактивом по ФС 42-3874-99.

Следующей стадией технологии получения иммунного лактоглобулина является проведение стерилизующей фильтрации и стерильный розлив во флаконы.

Пример.

Лактосыворотку, полученную от иммунных коров, в количестве 15 литров подвергают фильтрации на мембранном кассетном модуле в циркулирующем под давлением потоке до осветления.

После этого осветленный фильтрат (15 литров) пропускают через ультрафильтрационный волоконный модуль УПВ-6 и концентрируют его, получая 5 литров концентрата. Затем проводят отмывку концентрата, к нему добавляют до 15 литров 0,4% раствора хлорида натрия рН 5,0-6,0 и повторно фильтруют на модуле с полыми волокнами.

Отмывку концентрата проводят еще дважды, причем после каждой отмывки определяют количество белка.

Для соблюдения количества белка от 4,5-5,5% (вес/объем) проводят расчет по формуле:

где

V₀ - конечный объем раствора лактоглобулина, в литрах;

x₁ - концентрация белка, полученная в растворе, в %;

x₂ - необходимое количество белка, в %;

V₁ - объем концентрата лактоглобулина, в литрах.

В 5-и литрах концентрата белок составил 10,2%. Для того чтобы лактоглобулин имел концентрацию белка 5,0%, необходимо провести расчет:

Следовательно, необходимо добавить в концентрат (10,2-5)=5,2 литра 0,4% раствора хлорида натрия.

Полученный раствор стерилизуют методом фильтрации на низкомолекулярных пластинчатых фильтрах с размером пор 0,22 мкм и стерильно разливают во флаконы по 20 мл (2 дозы).

Готовый препарат контролируют по ФС 42-3496-98.

В результате экспериментальных данных нового способа получения иммунного лактоглабулина специалистами Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии было выявлено (см. таблицу 1), что полученный лактоглобулин в сравнении с ранее разработанной технологией обеспечивает высокую специфическую иммуннологическую активность препарата по содержанию защитных антител против микроорганизмов.

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что замена операции спиртового фракционирования по Кону ультрафильтрацией, ведение процесса при рН 5,5 и исключение лиофилизации приводит к сохранению лактопероксидазной активности лактоглобулина как неспецифического фактора, повышающего резистентность макроорганизма против условно-патогенных бактерий и сальмонелл.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет проведения двойной ультрафильтрации лактосыворотки вначале на мембранном кассетном модуле, а затем на волоконном модуле в циркулирующем под давлением потоке перепендикулярно току фильтрата упростить технологию производства иммунного лактоглобулина, т.к. сокращается ряд операций по осаждению, лиофилизации и не требуется дополнителного дорогостоящего оборудования.

Кроме того, данный способ позволяет:

- улучшить качество жидкого лактоглобулина за счет повышения стабильности и сохранения неспецифических факторов защиты препарата,

- предотвратить образование "вторичной мембраны" на фильтрующей поверхности, что существенно повышает производительность и качество фильтрации;

- снизить себестоимость получения лактоглобулина;

- использовать низкомолекулярный фильтрат, обогащенный активными компонентами лактосыворотки для производства новых медицинских препаратов.

Таблица 1
наименование диагностикумов к штаммам	специфическая активность лактоглабулина по предлагаемому способу, мкг/10 мкл	специфическая активность лактоглабулина по технологии РНИИМП (а.с. №1743025), мкг/10 мкл
СОП	сер 10-0404
Salmonella групп В-1,4,12	15,6	31,2	31,2
Salmonella групп D-1,9,12	31,2	15,6	62,5
Proteus mirabilis серогрупп 0-35	15,6	15,6	15,6
Proteus vulgaris серогрупп 0-43	7,8	15,6	15,6
Klebsiellapneumonia	15,6	31,2	31,2
Pseudomonas aeruginosa	7,8	31,2	31,2

Таблица 2
серия препарата (наименование операции)	температура инкубирования, t град С	активность лактопероксидазы (условные единицы активности)
0 суток	7 суток	14 суток	28 суток
лактоглабулин (спиртовое осаживание) до лиофилизации по технологии РНИИМП (а.с. №1743025)	4	4134+1,6	2071+5,5	1010+2,2	490+1,2
35	4134+1,6	0	0	0
лактоглабулин (спиртовое осаживание) после лиофилизации по технологии РНИИМП (а.с. №1743025)	4	168+4,5	165+2,2	154+3,1	98+6,4
35	168+4,5	110+1,3	81+2,3	59+3,1
лактоглабулин по предлагаемому способу (операция ультрафильтрации при рН 7,0)	4	4632+3,4	2090+4,1	1045+2,6	540+3,2
35	4632+3,4	0	0	0
лактоглабулин по предлагаемому способу (операция ультрафильтрации при рН 5,5)	4	19904+107	18909+114	17715+105	15753+110
35	19904+107	15127+111	8957+51	828+13

1. Способ получения иммунного лактоглобулина, включающий получение лактосыворотки из молока или молозива от иммунных коров с последующим осветлением лактосыворотки и ее концентрированием путем ультрафильтрации, отличающийся тем, что ультрафильтрацию проводят в два этапа в циркулирующем под давлением потоке перпендикулярно току фильтрата, при этом на первом этапе фильтрацию осуществляют на мембранном кассетном модуле, производя осветление лактосыворотки, очищая ее от остатков жира и казеина, а второй этап проводят на модуле с полыми волокнами, осуществляя отмывание рабочей смеси от низкомолекулярных компонентов 0,4%-ным раствором хлорида натрия рН 5,0-6,0 и концентрирование белка в пределах 4,5-5,5%, причем полученный фильтрат подвергают стерилизации и в жидком виде разливают во флаконы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отмывание концентрата лактоглобулина, полученного по второму этапу, от низкомолекулярных компонентов проводят трижды, фильтруя его на волоконном модуле с добавлением трехкратного объема 0,4%-ным раствора хлорида натрия рН 5,0-6,0.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что необходимую концентрацию белка в лактоглобулине получают из расчета конечного объема раствора лактоглобулина по формуле

,

где V₀ - конечный объем раствора лактоглобулина, л;

x₁ - концентрация белка, полученная в растворе, %;

x₂ - необходимое количество белка, %;

V₁ - объем концентрата лактоглобулина, %,

а из разницы объемов конечного продукта V₀ и концентрата V₁ получают объем необходимого раствора 0,4%-ного хлорида натрия.