Дипептиды, содержащие на n-концевом аминокислотном остатке 2-тиоацильную группу, в качестве ингибиторов вазопептидазы

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)

где R означает водород, R₁ означает карбоциклический арил, необязательно замещенный галогеном, или (карбоциклический арил или биарил)(низш.)алкил, необязательно замещенный трифторметилом или галогеном; alk означает (низш.)алкилен, R₃ означает водород или ацил, необязательно замещенный алкокси, морфолинилом, триазолилом или пиперазинилом; R₄ означает водород, необязательно замещенный метокси(низш.)алкил или оксациклоалкил; R₅ означает водород или (низш.)алкил; R₆ означает (низш.)алкил; R₇ означает (низш.)алкил или R₆ и R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают 3-10-членный циклоалкилиден, Х означает -O-, -S(O)_n-, -NHCO-; n равно 0 или 2; COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира, где R₂ выбирают из (низш.)алкила, морфолинкарбонилметила, диметиламинокарбонилметила или диэтиламинокарбонилметила, или к их фармацевтически приемлемым солям. Соединения используются в качестве двойных ингибиторов ангиотензинконвертирующего фермента и нейтральной эндопептидазы, а также в качестве ингибитора эндотелинконвертирующего фермента. 5 н. и 3 з.п. ф-лы.

 

Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам вазопептидазы, описанным ниже, которые используются в качестве двойных ингибиторов как ангиотензинконвертирующего фермента (АСЕ), так и нейтральной эндопептидазы (NEP, КФ 3.4.24.11). Соединения по изобретению прежде всего используются для лечения и/или профилактики состояний, чувствительных к ингибированию АСЕ и NEP, прежде всего сердечно-сосудистых нарушений, таких, как гипертензия, изолированная систолическая гипертензия, почечная недостаточность (включая отек и удерживание солей), отек легких, гипертрофию левого желудочка, сердечную недостаточность (включая застойную сердечную недостаточность) и атеросклероз. Кроме того, соединения по изобретению применяются для снижения повышенного уровня холестерина в плазме крови у млекопитающих. Кроме того, эти соединения ингибируют также эндотелинконвертирующий фермент (ЕСЕ) и используются для лечения и/или профилактики состояний, чувствительных к ингибированию ЕСЕ.

Благодаря ингибированию нейтральной эндопептидазы соединения по изобретению можно также использовать для лечения боли, депрессии, некоторых психотических состояний и расстройств умственных способностей. Другие возможные показания включают лечение стенокардии, предменструального синдрома, болезни Меньера, гиперальдостеронизма, гиперкальциурии, асцитов, глаукомы, астмы и нарушений в желудочно-кишечном тракте, таких, как диарея, слизистый колит и повышенная кислотность желудочного сока.

Благодаря ингибированию ЕСЕ соединения по изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики эндотелин-зависимых состояний и заболеваний, включая церебральную ишемию (инсульт), субарахноидальное кровотечение, травматические повреждения мозга, церебральный вазоспазм, артериальную гипертрофию, рестеноз, болезнь Рейно, инфаркт миокарда, ожирение, а также гипертрофию предстательной железы, мигрень, сахарный диабет (диабетическая нефропатия), преэклампсию, глаукому и отторжение транплантата, такого, как аорта или целый орган, а также эректильную дисфункцию.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I

где R означает водород, (низш.)алкил, карбоциклический или гетероциклический арил(низш.)алкил или циклоалкил(низш.)алкил,

R₁ означает (низш.)алкил, циклоалкил, карбоциклический или гетероциклический арил, или R₁ означает (циклоалкил, карбоциклический арил или биарил, гетероциклический арил или биарил)(низш.)алкил,

alk означает (низш.)алкилен,

R₃ означает водород или ацил,

R₄ означает водород, необязательно замещенный (низш.)алкил, карбоциклический или гетероциклический арил, (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.) алкил, циклоалкил, циклоалкил (низш.)алкил, биарил, биарил(низш.)алкил, оксациклоалкил, тиациклоалкил, азациклоалкил или (оксациклоалкил, тиациклоалкил или азациклоалкил)(низш.)алкил,

R₅ означает водород или (низш.)алкил или

R₄ и R₅ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают циклоалкилиден, конденсированный бензоциклоалкилиден или 5- или 6-членный (оксациклоалкилиден, тиациклоалкилиден или азациклоалкилиден), каждый из которых необязательно замещен (низш.)алкилом или арил(низш.)алкилом,

R₆ означает (низш.)алкил, карбоциклический или гетероциклический арил, (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, циклоалкил, циклоалкил (низш.)алкил, биарил или биарил(низш.)алкил,

R₇ означает (низш.)алкил, (карбоциклический или гетероциклический арил) (низш.)алкил, циклоалкил (низш.)алкил или биарил(низш.)алкил или

R₆ и R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают 3-10-членный циклоалкилиден, который необязательно замещен (низш.)алкилом или арил(низш.)алкилом, или конденсирован с насыщенным или ненасыщенным карбоциклическим 5-7-членным циклом, или 5- или 6-членный (оксациклоалкилиден, тиациклоалкилиден или азациклоалкилиден), каждый из которых необязательно замещен (низш.)алкилом или арил (низш.)алкилом, или 2,2-норборнилиден,

Х означает -О-, -S(О)_n-, -NHSO₂- или -NHCO-,

n равно 0, 1 или 2, а

COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира,

и к дисульфидным производным указанных соединений, где R₃ означает водород, и к их фармацевтически приемлемым солям.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим указанные соединения, способам получения указанных соединений, промежуточным соединениям и способам лечения нарушений у млекопитающих, которые чувствительны к ингибированию АСЕ и NEP при введении указанных соединений млекопитающим, нуждающимся в таком лечении.

Кроме того, настоящее изобретение включает любые пролекарства соединений по изобретению, содержащих свободный карбоксил, сульфгидрильную или гидроксильную группу, причем указанные пролекарства при сольволизе или в физиологических условиях превращаются в соединения, содержащие свободные карбоксильную, сульфгидрильную и/или гидроксильную группу. Пролекарствами являются, например, сложные эфиры карбоновых кислот и S-ацил- и O-ацилпроизводные тиолов, спиртов или фенолов, в которых ацил имеет значения, указанные в тексте заявки.

Фармацевтически приемлемыми сложными эфирами предпочтительно являются такие пролекарства в виде сложных эфиров, которые при сольволизе или в физиологических условиях превращаются в свободные карбоновые кислоты формулы I.

Фармацевтически приемлемые сложные эфиры, используемые в качестве пролекарств, предпочтительно означают, например, (низш.)алкильные, арил(низш.)алкильные, α-((низш.)алканоилокси)(низш.)алкильные сложные эфиры, такие, как пивалоилоксиметиловый эфир и α-((низш.)алкоксикарбонил, морфолинокарбонил, пиперидинокарбонил, пирролидинокарбонил или ди(низш.) алкиламинокарбонил)(низш.)алкильные сложные эфиры.

Фармацевтически приемлемые соли означают соли фармацевтически приемлемых оснований любых кислотных соединений по изобретению, например, таких соединений, в которых COOR₂ означает карбоксил. Такие соли включают, например, соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочно-земельных металлов (например, соли магния и кальция), соли аминов (например, соли трометамина).

В зависимости от природы заместителя соединения формулы I могут содержать два или более асимметрических атома углерода. Настоящее изобретение включает диастереомеры и оптические антиподы соединений по изобретению. Предпочтительная конфигурация показана на формуле Ia

где асимметрические атомы углерода, содержащие заместители -alk-X-R₁ и R₄ обычно находятся в S-конфигурации.

Предпочтительными являются соединения формул I и Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает (низш.)алкил, С₅- или С₆циклоалкил, карбоциклический или гетероциклический арил или (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, alk означает (низш.)алкилен, Х означает -О- или -S(O)_n-, где n равно 0 или 2, R₃ означает водород или ацил, R₄ означает необязательно замещенный (низш.)алкил, оксациклоалкил, оксациклоалкил(низш.)алкил или (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, R₅ означает водород или R₄ и R₅ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают С₅- или С₆циклоалкилиден, R₆ и R₇ означают (низш.)алкил, или R₆ и R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают С₅- или С₆циклоалкилиден, COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира, и дисульфидные производные указанных соединений, в которых R₃ означает водород и их фармацевтически приемлемые соли.

Кроме того, предпочтительными являются соединения формул I и Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает карбоциклический или гетероциклический арил или (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, R₃ означает водород или необязательно замещенный (низш.)алканоил, R₄ означает (низш.)алкил, циклоалкил, тетрагидропиранил или С₁-С₄(низш.)алкокси(низш.)алкил, R₆ и R₇ оба означают С₁-С₄алкил и являются идентичными, Х означает -О- или -S-, alk означает метилен, COOR₂ означает карбоксил, (низш.)алкоксикарбонил, (ди(низш.)алкиламинокарбонил)(низш.) алкоксикарбонил или (морфолинокарбонил, пиперидинокарбонил, пирролидинокарбонил)(низш.)алкоксикарбонил, и их фармацевтически приемлемые соли.

Предпочтительными прежде всего являются соединения формул I или Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает карбоциклический арил или карбоциклический арил(низш.)алкил, в котором карбоциклический арил означает фенил или фенил, замещенный одной или двумя гидроксигруппами, (низш.)алканоилокси, (низш.)алкил, (низш.)алкокси, трифторметил, трифторметокси или галоген, R₃ означает водород, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, необязательно замещенный (низш.)алкоксигруппой, R₄ означает (низш.)алкил, 4-тетрагидропиранил или С₁-С₄(низш.)алкокси(С₁-С₄)(низш.)алкил, R₆ и R₇ означают метил, Х означает -О-, alk означает метилен или этилен, a COOR₂ означает карбоксил или (низш.)алкоксикарбонил, и их фармацевтически приемлемые соли. Одим из вариантов являются соединения, в которых R₃ означает водород или (низш.)алканоил.

Кроме того, предпочтительными являются указанные выше соединения формулы I или Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает фенил, фторфенил, бензил или фторбензил, R₃ означает водород, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, замещенный (низш.)алкоксигруппой, R₄ означает изопропил, трет-бутил, 1-метоксиэтил или 4-тетрагидропиранил, R₆ и R₇ означают метил, Х означает -О-, alk означает метилен, a COOR₂ означает карбоксил или (низш.)алкоксикарбонил, и их фармацевтически приемлемые соли. Одим из вариантов являются соединения, в которых R₃ означает водород или (низш.)алканоил.

Предпочтительными являются прежде всего соединения формул I или Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает бензил, R₃ означает водород, ацетил или мстоксиацетил, R₄ означает изопропил или трет-бутил, R₆ и R₇ означают метил, Х означает -О-, alk означает метилен, а COOR₂ означает карбоксил или этоксикарбонил, или их фармацевтически приемлемые соли.

Если не указано иное, термины в объеме настоящего изобретения имеют следующие значения независимо от того, используются эти термины отдельно или в различных сочетаниях.

Арил означает карбоциклический или гетероциклический арил, как моноциклический, так и бициклический.

Моноциклический карбоциклический арил означает необязательно замещенный фенил, предпочтительно фенил или фенил, замещенный одним или тремя заместителями, предпочтительно такими, как (низш.)алкил, гидрокси, (низш.)алкокси, ацилокси, галоген, циано, трифторметил, трифторметокси, амино, (низш.)алканоиламино, (низш.)алкил(тио, сульфинил или сульфонил), (низш.)алкоксикарбонил, моно- или ди(низш.) алкилкарбамоил или моно- или ди(низш.)алкиламино, или фенил, замещенный (низш.)алкилендиокси.

Бициклический карбоциклический арил означает 1- или 2-нафтил или 1- или 2-нафтил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкоксигруппой или галогеном.

Моноциклический гетероциклический арил предпочтительно означает необязательно замещенный тиазолил, пиримидил, триазолил, тиенил, фуранил или пиридил.

Необязательно замещенный фуранил означает 2- или 3-фуранил или 2- или 3-фуранил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный пиридил означает 2-, 3- или 4-пиридил или 2-, 3- или 4-пиридил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом, галогеном или цианогруппой.

Необязательно замещенный тиенил означает 2- или 3-тиенил или 2- или 3-тиенил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный пиримидил означает, например, 2-пиримидил или 2-пиримидил, замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный тиазолил означает, например, 2-тиазолил или 2-тиазолил, замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный триазолил означает, например, 1,2,4-триазолил или 1,2,4-триазолил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом.

Бициклический гетероциклический арил предпочтительно означает индолил, бензотиазолил, хинолинил или изохинолинил, необязательно замещенный гидроксигруппой, (низш.)алкилом, (низш.)алкоксигруппой или галогеном, предпочтительно 3-индолил, 2-бензотиазолил или 2- или 4-хинолинил.

Арил в группе арил(низш.)алкил предпочтительно означает фенил или фенил, замещенный одним или двумя группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, гидрокси, (низш.)алканоилокси, галоген, трифторметил, циано, (низш.)алканоиламино или (низш.)алкоксикарбонил, а также необязательно замещенный нафтил.

Арил(низш.)алкил предпочтительно означает бензил или 1- или 2-фенетил, необязательно замещенный в группе фенил одной или двумя группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, гидрокси, (низш.)алканоилокси, галоген или трифторметил.

Термин «низш.», используемый в тексте в связи с органическими радикалами или соединениями, соответственно означает радикалы или соединения, содержащие включительно до 7, предпочтительно включительно до 4 и предпочтительно один или два атома углерода. Такие радикалы или соединения могут иметь прямую или разветвленную углеродную цепь.

Необязательно замещенный (низш.)алкил означает (низш.)алкил или (низш.)алкил, замещенный, например, группами ряда галоген, гидрокси, (низш.)алкокси, амино, (моно- или ди(низш.)алкил)амино, ациламино, 1-(низш.)алкилпиперазино, морфолино, пиперидино, пирролидино и т.п.

(Низш.)алкилен означает прямую или разветвленную углеродную цепь, предпочтительно содержащую от 1 до 4 атомов углерода, замещенную, например, (низш.)алкоксигруппой, например, -СН₂-, -СН(СН₃)-, -СН₂СН₂- и т.п.

(Низш.)алкил предпочтительно содержит 1-4 атома углерода, является прямым или разветвленным и означает, например, этил, пропил, бутил или предпочтительно метил.

(Низш.)алкоксигруппа предпочтительно содержит 1-4 атома углерода, является прямой или разветвленной и означает, например, метокси, пропокси, изопропокси или предпочтительно этокси.

Циклоалкил означает насыщенный циклический углеводородный радикал, который предпочтительно содержит в цикле от 5 до 7 атомов углерода, предпочтительно циклопентил или циклогексил.

Оксациклоалкил предпочтительно означает 5-7-членный оксациклоалкил, например, тетрагидропиранил, такой, как 4-тетрагидропиранил.

Тиациклоалкил предпочтительно означает 5-7-членный тиациклоалкил, например, тетрагидротиапиранил, такой, как 4-тетрагидротиапиранил.

Азациклоалкил предпочтительно означает 5-7-членный азациклоалкил, например пирролидинил или пиперидинил, в котором атом азота замещен группой (низш.)алкил или арил(низш.)алкил.

Термин циклоалкил(низш.)алкил предпочтительно означает (циклопентил или циклогексил)метил, 1- или 2-(циклопентил или циклогексил)этил, 1-, 2- или 3-(циклопентил или циклогексил)пропил или 1-, 2-, 3- или 4-(циклопентил или циклогексил)бутил. То же самое относится к (оксациклил, тиациклоалкил или азациклоалкил)(низш.)алкилу.

(Низш.)алкоксикарбонильная группа предпочтительно содержит в группе алкокси от 1 до 4 атомов углерода и означает, например, метоксикарбонил, пропоксикарбонил, изопропоксикарбонил или предпочтительно этоксикарбонил.

Циклоалкилиден является 3-10-членным, предпочтительно 5- или 6-членным, и означает циклоалкановую связывающую группу, к которой по одному и тому же атому циклоалканового кольца присоединены две группы;

5- или 6-членный оксациклоалкилиден означает тетрагидрофурановую или тетрагидропирановую связывающую группу, например тетрагидрофуранилиден или тетрагидропиранилиден, к которой по одному и тому же атому углерода соответствующего цикла, например, по положению 3 или 4, присоединены две группы;

5- или 6-членный тиациклоалкилиден означает тетрагидротиофеновую или тетрагидротиопирановую связывающую группу, к которой по одному и тому же атому углерода соответствующего цикла, например, по положению 3 или 4, присоединены две группы;

5- или 6-членный азациклоалкилиден означает пирролидиновую или пиперидиновую связывающую группу, к которой по одному и тому же атому углерода соответствующего цикла, например, по положению 3 или 4, присоединены две группы, а атом азота замещен (низш.)алкилом, например метилом, или арил(низш.)алкилом, например бензилом.

Конденсированный бензоциклоалкилиден означает, например, 1,1- или 2,2-тетралинилиден или 1,1- или 2,2-инданилиден.

Галоген (гало) предпочтительно означает фтор или хлор, а также бром или иод.

Ацил образуется из карбоновой кислоты и предпочтительно означает необязательно замещенный (низш.)алканоил, карбоциклический арил(низш.)алканоил, ароил, (низш.)алкоксикарбонил или арил(низш.)алкоксикарбонил, преимущественно необязательно замещенный (низш.)алканоил, или ароил.

(Низш.)алканоил предпочтительно означает ацетил, пропионил, бутирил или пивалоил.

Необязательно замещенный (низш.)алканоил означает, например, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, замещенный, например, группами ряда (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоилокси, (низш.)алканоилтио, (низш.)алкокси, (низш.)алкилтио, гидрокси, ди(низш.)алкиламино, (низш.)алканоиламино, морфолино, пиперидино, пирролидино, 1-(низш.)алкилпиперазино, арил или гетероарил.

Ароил означает карбоциклический или гетероциклический ароил, предпочтительно моноциклический карбоциклический или моноциклический гетероциклический ароил.

Моноциклический карбоциклический ароил предпочтительно означает бензоил или бензоил, замещенный группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, галоген или трифторметил.

Моноцикличсский гетероциклический ароил предпочтительно означает пиридилкарбонил или тиенилкарбонил.

Ацилокси предпочтительно означает необязательно замещенный группами ряда (низш.)алканоилокси, (низш.)алкоксикарбонилокси, моноциклический карбоциклический ароилокси или моноциклический гетероциклический ароилокси.

Арил(низш.)алкоксикарбонил предпочтительно означает моноциклический карбоциклический (низш.)алкоксикарбонил, предпочтительно бензилоксикарбонил.

Биарил означает монокарбоциклический арил, замещенный моноциклическим карбоциклическим или моноциклическим гетероциклическим арилом, и предпочтительно означает бифенилил, предпочтительно 4-бифенилил, необязательно замещенный в одном или двух бензольных циклах группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, галоген или трифторметил.

Биарил(низш.)алкил предпочтительно означает 4-бифенилил(низш.)алкил, предпочтительно 4-бифенилилметил.

Новые соединения по изобретению являются ингибиторами АСЕ, ингибирующими конверсию ангиотензина I с образованием вазопрессорного (сосудосуживающего) соединения ангиотензина II и, таким образом, снижают кровяное давление в организме млекопитающих. Кроме того, соединения по изобретению ингибируют NEP и, таким образом, стимулируют сердечно-сосудистое действие (например, диуретическое и натрийуретическое) атриальных натрийуретических факторов (ANF). Комбинированное действие является полезным при лечении сердечно-сосудистых нарушений у млекопитающих, прежде всего гипертензии, сердечно-сосудистых нарушений, таких, как застойная сердечная недостаточность, и почечная недостаточность. Другим полезным действием соединений по изобретению при терапии указанных сердечно-сосудистых нарушений является ингибирование ECE.

Указанные свойства подтверждаются при испытаниях in vitro и in vivo, предпочтительно с использованием млекопитающих, например мышей, крыс, собак, обезьян, или при испытании на изолированных органах, тканях и их препаратах. Указанные соединения можно применять in vitro в форме растворов, например, предпочтительно водных растворов, и in vivo при энтеральном, парентеральном, предпочтительно при оральном (пероральном) и внутривенном способе введении, например, в виде суспензии или водного раствора. Дозы при испытаниях in vitro составляют от приблизительно 10^-6 до 10^-9 молярных концентраций. Дозы при испытаниях in vivo в зависимости от способа введения составляют от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,1 до 25 мг/кг.

Для испытаний in vitro наиболее пригодны свободные карбоновые кислоты соединений по изобретению. Анализируемое соединение растворяют в диметилсульфоксиде, этаноле или 0,25 М растворе бикарбоната натрия, а затем разбавляют буферным раствором до необходимой концентрации.

Ингибирование АСЕ соединениями по изобретению в условиях in vitro определяют по методу, описанному в Biochem. Pharmacol, 20, 1637 (1971). Буферный раствор для анализа ингибирования АСЕ имеет следующий состав: 300 мМ NaCl, 100 мМ КН₂PO₄ (рН 8,3). Для инициирования реакции в пробирку, содержащую фермент и лекарственное средство в объеме 150 мкл, добавляют 100 мкл гиппурил-гистидил-лейцина (2 мг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 0,75 мл 0,6 н. NaOH. Затем в пробирки добавляют 100 мкл свежеприготовленного раствора орто-фталевого альдегида (2 мг/мл в метаноле), перемешивают, выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин и добавляют 100 мкл 6 н. HCl. Пробирки центрифугируют и в супернатанте определяют оптическую плотность при 360 нм. Для определения величины IC₅₀ строят график зависимости оптической плотности от концентрации лекарственного средства. IC₅₀ означает концентрацию лекарственного средства, при которой наблюдается ингибирование ферментативной активности на 50% по сравнению с контрольными образцами, не содержащими лекарственного средства.

Обычно при ингибировании АСЕ соединениями по изобретению значения IC₅₀ составляют от приблизительно 0,1 до 50 нМ.

При испытании in vitro типичное соединение по изобретению (пример 6(а)) характеризуется значением IC₅₀ приблизительно 20 нМ.

Ингибирование АСЕ можно продемонстрировать in vivo при пероральном или внутривенном введении по ингибированию прессорной ответной реакции, индуцированной ангиотензином I у крыс с нормальным артериальным давлением.

Испытания in vivo при внутривенном введении проводят на находящихся в сознании самцах крыс с нормальным артериальным давлением. В бедренную артерию и бедренную вену вводят катетеры соответственно для прямого измерения кровяного давления при внутривенном введении ангиотензина I и внутривенном или пероральном введении соединения по настоящему изобретению. После стабилизации артериального базального кровяного давления регистрировали прессорные ответные реакции на 3 или 4 стимуляции ангиотезином I (300 нг/кг, внутривенно, с интервалами 15 мин). Такие ответные реакции обычно регистрировали повторно через 15, 30, 60 и 90 мин, а затем каждый час вплоть до 6 ч после внутривенного или перорального введения анализируемого соединения, и сравнивали с исходными ответными реакциями. Любое наблюдаемое снижение указанной прессорной ответной реакции является признаком ингибирования АСЕ.

Типичное соединение по изобретению (пример 6(а)) ингибирует ответную прессорную реакцию, индуцированную ангиотензином I, через 3 ч при внутривенном введении в дозе 10 мг/кг. Аналогичным образом соединение, описанное в примере 1(а), ингибирует прессорную ответную реакцию, индуцированную ангиотензином I, через 6 ч при пероральном введении в дозе 11,8 мг/кг.

Ингибирование NEP (КФ 3.4.24.11) в условиях in vitro определяют по следующеей методике.

Активность NEP (КФ 3.4.24.11) определяют по гидролизу субстрата глутарил-ала-ала-фен-2-нафтиламида (GAAP) по модифицированной методике Orlowski и Wilk (1981). Реакционная смесь (общим объемом 125 мкл) имеет следующий состав: 4,5 мкл белка (мембраны коркового вещества почки крысы, полученные по методу Maeda и др. (1983)), 50 мМ трис-буферный раствор, рН 7,4 при 25°С, 500 мкМ субстрат (конечная концентрация) и лейцинаминопептидаза М (2,5 мкг). Смесь инкубируют при 25°С в течение 10 мин и добавляют 100 мкл раствора красителя прочно-темно-красный (гранатовый) (250 мкг/мл в 1 М ацетате натрия, рН 4,2, содержащем 10% твин 20). Активность фермента измеряют спектрофотомеричсским способом при 540 нм. Одна единица активности NEP 24.11 означает образование 2-нафтиламина со скоростью 1 нмоль/мин при 25°С и рН 7,4. Величина IC₅₀ означает концентрацию анализируемого соединения, необходимую для ингибирования образования 2-нафтиламина на 50%.

Кроме того, активность NEP определяют с использованием в качестве субстрата ANF. Активность гидролиза ANF определяют, измеряя скорость потребления ANF крысы (r-ANF) методом обращенно-фазовой ЖХВР (в течение 3 мин). Аликвотные части раствора фермента в 50 мМ трис-HCl буферном растворе (рН 7,4) предварительно инкубируют при 37°С в течение 2 мин и реакцию инициируют добавлением в общий объем 50 мкл 4 нмолей ANF крысы. Через 4 мин реакцию останавливают добавлением 30 мкл 0,27% трифторуксусной кислоты (ТФУ). Одна единица активности означает гидролиз ANF крысы со скоростью 1 нмоль/мин при 37°С и рН 7,4. Величина IC₅₀ означает концентрацию анализируемого соединения, необходимую для ингибирования гидролиза ANF на 50%.

Обычно при ингибировании NEP соединениями по изобретению значения IC₅₀ составляют от приблизительно от 0,1 до 50 нМ.

У типичного соединения по изобретению (пример 6(а)) при испытании in vitro по скорости гидролиза GAAP значение IC₅₀ составляет приблизительно 5 нМ.

Действие соединений по изобретению на концентрацию ANF в плазме крови крысы определяют по следующей методике.

Самцов крыс Sprague-Dawley (массой 275-390 г) анестезируют кетамином (150 мг/кг)/ацепромазином (10%) и в бедренные артерию и вену вводят катетеры для отбора образцов крови и вливания ANF соответственно. Крыс фиксируют в шарнирном устройстве и оставляют в покое на 24 ч, чтобы привести в сознание и свободное состояние перед проведением испытаний.

При проведении испытаний в плазме определяют уровень ANF в присутствие и в отсутствии ингибирования NEP. В первый день испытаний всем животным проводят непрерывное вливание ANF со скоростью 450 нг/кг/мин внутривенно в течение всех 5 ч проведения эксперимента. Через 60 мин после начала вливания отбирают образцы крови для определения базового уровня ANF (время 0), а затем крыс произвольно разделяют на группы для введения анализируемого соединения или носителя. Дополнительные образцы крови отбирают через 30, 60, 120, 180 и 240 мин после введения анализируемого соединения.

Концентрацию ANF в плазме определяют специфичным радиоиммунным методом. Плазму разбавляют (в 12,5, 25 и 50 раз) буферным раствором следующего состава: 50 мМ трис (рН 6,8), 154 мМ NaCl, 0,3% бычий сывороточный альбумин, 0,01% ЭДТА. Затем к 100 мкл кроличьей сыворотки анти-rANF добавляют по 100 мкл стандартных растворов (rANF (99-126)) или образцов и инкубируют при 4°С в течение 16 ч. В реакционную смесь добавляют [¹²⁵I]rANF(10⁴ имп./мин) и инкубируют при 4°С в течение еще 24 ч. Затем в реакционную смесь добавляют козью сыворотку, содержащую коньюгат антикроличьего IgG на парамагнитных частицах, и связанный [¹²⁵I]rANF осаждают, помещая смесь на магнитную подставку. Супернатант декантируют, в осадке определяют радиоактивность на счетчике γ-излучения. Все анализы дублируют. Уровень ANF в плазме выражают в процентах от содержанию ANF в плазме животных, обработанных носителем и получавших лишь один ANF (450 нг/кг/мин внутривенно).

Типичное соединение по изобретению (пример 1(а)) в дозе 11,8 мг/кг (внутривенно) вызывает увеличение уровня ANF в плазме приблизительно на 70%.

Антигипертензивную активность определяют, например, с использованием спонтанно гипертензивных крыс (СГК) и гипертензивных крыс, получавших соль ацетата дезоксикортикостерона (DOCA), например, по методике, описанной Bazil и др., J.Cardiovasc. PharmacoL, 22, 897-905 (1993), и Trapani и др., J.Cardiovasc. PharmacoL, 14, 419-424 (1989) соответственно.

Типичное соединение по изобретению (пример 1(а)) приводит к снижению среднего значения артериального давления у СГК в сознании при однократном суточном введении 11,8 мг/кг (перорально).

Антигипертензивное дейстие определяют у гипертензивных крыс, получавших соль ацетата дезоксикортикостерона (DOCA), по следующей методике

Гипертензивных крыс (массой 280-380 г), получавших соль ацетата дезоксикортикостерона (DOCA), готовили к испытаниям стандартным способом. Крыс подвергали односторонней нефрэктомии (удаление одной почки) и через неделю имплантировали кремнийорганические гранулы, содержащие 100 мг/кг DOCA. В течении от трех до пяти недель крысам давали воду, содержащую 1% NaCl/0,2% KCl до появления у животных достоверной гипертензии. Затем проводили анализ гипертензивной активности.

За двое суток до начала эксперимента крыс анестезировалии метоксифлураном и в бедренную артерию вводили катетеры для измерения артериального давления. Через 48 ч регистрировали фоновое артериальное давление и частоту сердечных сокращений в течение 1 ч. Затем вводили анализируемое соединение или носитель и регистрировали указанные параметры в течение 5 ч.

Диуретическую (салуретическую) активность определяли стандартным диуретическим методом анализа, например, как описано в книге "New Antihypertensive Drugs, Spectrum Publications, 307-321 (1976), или измерением потенцирования ANF-индуцированного натрийуреза и диуреза у крыс.

Потенцирование натрийуретического действия ANF определяют по следующей методике.

Самцов крыс Sprague-Dawley (массой 280-390 г) анестезируют инактином (100 мг/кг, внутривенно) и в бедренную артерию, бедренную вену и в мочевой пузырь вводят катетеры для измерения артериального давления, введения ANF и сбора мочи соответственно. Непрерывное вливание обычного солевого раствора (33 мкл/мин) осуществляют в течение всего эксперимента для стимуляции диуреза и экскреции натрия. Протокол эксперимента включает сбор мочи в течение первых 15 мин (обозначенные как предварительный контроль) и последующие три периода дополнительного сбора мочи. Сразу после завершения периода предварительного контроля животным вводят анализируемое соединение или носитель и оставляют в покое в течение 45 мин. Затем в течение второго периода (обозначаемого как контроль в течение 15 мин) регистрируют кровяное давление и почечные параметры. По завершению этого периода всем животным вводят ANF (1 мкг/кг, внутривенное вливание) и в течение двух последующих 15-минутных периодов регистрируют артериальное давление и почечные параметры. В течение всех периодов сбора мочи определяют среднее артериальное давление, скорость потока мочи и экскрецию натрия в моче. Кровяное давление измеряют с использованием датчика кровяного давления (Gould p50), поток мочи определяют гравиметрическим методом, концентрацию натрия определяют пламенной фотометрией, а экскрецию натрия в моче рассчитывают по скорости потока мочи и концентрации натрия.

Ингибирование ЕСЕ in vitro определяют по следующей методике.

ЕСЕ выделяют в виде частично очищенного препарата из первичных эндотелиальных клеток аорты свиньи хроматографией на колонке с анионитом DE52, а активность определяют радиоиммунным методом, как описано в Anal. Biochem., 212, 434-436 (1993). В другом варианте нативный фермент заменяют рекомбинантной формой ЕСЕ, как описано, например, в Cell, 78, 478-485 (1994). Рядом авторов описан ЕСЕ-1 человека (Schmidt и др., FEBS Letters, 356, 238-243 (1994), Kaw и др., 4^th Conf.on Endothelin, April 23-25, London (UK) (1995) C6, Valdenaire и др., J.Biol. Chem., 270, 29794-29798 (1995), Shimada и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 207, 807-812 (1995)). Ингибирование ЕСЕ определяют по методике, описанной в Biochem. Mol. Biol. Int., 31, №5, 861-867 (1993), измеряя радиоиммунным методом количество ЕТ-1, образующееся из большого ЕТ-1.

В другом варианте используют рекомбинантный ЕСЕ-1 человека (rhECE-1), а анализ проводят по следующей методике.

Яйцеклетки китайского хомячка, экспрессирующие rhECE-1 (Kaw и др., 4^th Int Conf. on Endothelin, April 23-25, London (UK) (1995) C6), культивируют в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотик с фунгицидным действием (1х). Клетки соскребают сборщиком клеток, осаждают центрифугированием и гомогенизируют при 4°С в буферном растворе следующего состава: 5 мМ MgCl₂, 1 мкМ пепстатин А, 100 мкМ лейпептин, 1 мМ PMSF и 20 мМ трис, рН 7,0, в соотношении 2 мл буферного раствора/1 мл млеточной массы. Клеточный дебрис удаляют коротким центрифугированием, а супернатант центрифугируют посторно при 100000g в течение 30 мин. Полученный осадок ресуспендируют в буферном растворе, содержащем 200 мМ NaCl и 50 мМ TES, рН 7,0, при концентрации белка приблизительно 15 мг/мл и хранят в виде аликвотных частей при -80°С.

Для определения действия ингибитора на активность ЕСЕ - 1 10 мкг белка предварительно инкубируют с анализируемым соединением при необходимой концентрации при комнатной температуре в течение 20 мин в 50 мМ TES, рН 7,0, содержащем 0,005% тритона Х-100, в объеме 10 мкл. Затем добавляют большой ЕТ-1 человека (5 мкл) до конечной концентрации 0,2 мкМ и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение еще 2 ч. Реакцию останавливают добавлением 500 мкл буферного раствора для радиоиммунного анализа, содержащего 0,1% тритона Х-100, 0,2% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% NaN₃ в фосфатно-солевом буферном растворе.

Разбавленные образцы (200 мкл), полученные при указанном выше анализе ферментативной активности, в смеси с 25 мкл [¹²⁵I]ET-1 (10⁴ имп./пробирку) и 25 мкл разбавленного (1:20000) раствора кроличьих антител, специфичных в отношении С-концевого остатка триптофана ЕТ-1, инкубируют при 4°С в течение ночи. Затем в каждую пробирку добавляют конъюгат козьих антикроличьих антител на магнитных гранулах (70 мкг) и реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Гранулы осаждают на магнитной подставке, супернатант декантируют, в осадке определяют радиоактивность на счетчике γ-излучения. Общее и неспецифичсское связывание определяют в отсутствие нерадиоактивного ЕТ-1 и анти-ЕТ антител соответственно. В этих условиях ЕТ-1 и большой ЕТ-1 блокируют связывание [¹²⁵I]ET-1 с антителами, причем величина IC₅₀ составляет 21±2 и 260000±66000 (среднее значение ± средняя ошибка измерения, n=3-5) соответственно.

Для определения значений IC₅₀ для каждого ингибитора строят график зависимости ингибирующей активности от концентрации ингибитора. Для анализа данных по однофакторной модели используют программное обеспечение ALLFIT, совместимое с IBM.

Ингибирование ЕСЕ можно также определять in vivo при измерении ингибирования прессорной ответной реакции, индуцированной большим ЕТ-1 у анестезированных или находящихся в сознании крыс, как описано ниже. Действие ингибиторов на прессорную ответную реакцию, стимулированную введением большого ЕТ-1, измеряют на крысах Sprague-Dawley, как описано в Biochem. Mol. Biol. Int., 31, №5, 861-867 (1993). Результаты представляют в виде процента ингибирования прессорной ответной реакции, индуцированной большим ЕТ-1, по сравнению с введением носителя.

Самцов крыс Sprague-Dawley анестезируют инактином (100 мг/кг, внутрибрюшинно) и в бедренную артерию, и вену вводят катетеры для измерения среднего артериального давления (САД) и введения соединений соответственно. Затем проводят трахеотомию и в трахею вводят трубочку, чтобы обеспечить животному свободное дыхание. Температуру тела животных поддерживают на уровне 37±1°С с использованием обогреваемого покрытия. После проведения операции животных выдерживают до стабилизации САД, а затем блокируют вегетативную передачу нервного импульса введением хлоризондамина (3 мг/кг, внутривенно). Затем крысам вводят анализируемое соединение в дозе 10 мг/кг (внутривенно) или носитель и через 15 и 90 мин стимулируют введением большого ЕТ-1 (1 нмоль/кг, внутривенно). Обычно результаты представляют в виде максимального увеличения САД, вызванного введением большого ЕТ-1, у животных, обработанных анализируемым соединением или носителем.

Самцов крыс Sprague-Dawley анестезируют метогекситалом натрия (75 мг/кг, внутрибрюшинно) и в бедренные артерию и вену вводят катетеры для измерения среднего артериального давления (САД) и введения лекарственных средств соответственно. Катетеры фиксируют через шарнирную систему, которая обеспечивает свободное движение крыс после реабилитации. Крыс оставляют в покое в течение 24 ч до начала эксперимента. На следующией день через катетер бедренной артерии регистрируют САД и через бедренную вену вводят анализируемое соединение или носитель. Затем животных стимулируют введением большого ЕТ-1 (1 нмоль/кг, внутривенно) через различные промежутки времени после введения анализируемого соединения. После соответствующей промывки организма в зависимости от дозы и схемы введения, животных можно использовать снова для введения другой дозы анализируемого соединения или носителя. Обычно результаты представляют в виде изменения САД, вызванного большим ЕТ-1 в течение двухминутмых интервалов у животных, обработанных анализируемым соединением, по сравнению с животным, обработанным носителем.

Ингибирование ЕСЕ можно также определять in vivo, измеряя ингибирование прессорной ответной реакции, индуцированной большим ЕТ-1 у пришедших в сознание СГК, например, как описано в Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, 407-412 (1994).

Самцам СГК (возраст 16-18-недель) вводят либо анализируемое соединение, либо носитель (1 М NaHCO₃) с использованием осмотического мининасоса, имплантированного подкожно. На пятые сутки анестезированным крысам в бедренные артерию и вену вводят катетеры для измерения среднего артериального давления (САД) и введения анализируемого соединения соответственно. Через 48 ч реабилитации регистрируют САД (7 сутки) через артериальный катетер, соединенный с датчиком давления. У крыс стабилизируют кровяное давление и частоту середечных сокращений в течение 30 мин, а затем блокируют ганглии введением хлоризондамина (10 мг/кг, внутривенно). Через приблизительно 15 мин двум группам животных (обработанных носителем или анлизируемым соединением) вводят вливанием дозу большого ЕТ-1 (0,25 мг/кг, внутривенно). Затем сравнивают изменение кровяного давления в ответ на введение большого ЕТ-1 в двух указанных группах животных.

Ингибирование церебрального сужения кровеносных сосудов демонстрируется при измерении ингибирования экспериментально индуцированного сужения базилярной церебральной артерии у кролика (см. Caner и др., J.Neurosurg., 85, 917-922 (1996).

Степень нежелательной иммуностимулирующей активности или ее отсутствие у соединений по изобретению можно определить анализом с использованием подколенных лимфатических узлов мыши, как описано в Toxicology Letters, 112/113, 453-459 (2000).

Соединения по изобретению можно получить, например,

а) конденсацией соединения формулы II

где alk, X, R, R₁, R₆ и R₇ имеют значения, указанные выше, a COOR₂ означает сложноэфирную группу,

с карбоновой кислотой формулы III

или ее реакционноспособным производным по функциональной группе, где R₄ и R₅ имеют значения, указанные выше, R₃ ^' означает водород или лабильную S-защитную группу, например ацил, трет-бутил или необязательно замещенный бензил, или

б) конденсацией соединения формулы IV

или его реакционнспособного производного по функциональной группе, где R₃ ^', R₄-R₅ и R₆-R₇ имеют значения, указанные выше, с эфиром аминокислоты формулы V

где alk, X, R и R₁ имеют значения, указанные выше, a COOR₂ означает сложноэфирную группу, или

в) конденсацией в основной среде соединения формулы VI

где R, R₁, COOR₂, R₄-R₇, alk и Х имеют значения, указанные выше, а Y означает реакционноспособную этерифицированную гидроксильную группу, выполняющую функцию уходящей группы, (например, хлор или бром), с соединением формулы

или его солью, где R₃ ^' означает лабильную S-защитную группу, например ацил, трет-бутил или необязательно замещенный бензил, и превращение полученного продукта в соединение формулы I, где R₃ означает водород, причем вышеуказанный способ включает удаление защитной группы (или групп), если для преотвращения побочной реакции была временно защищена реакционноспособная группа (группы), последующее выделение полученного соединения по изобретению, и при необходимости превращение любого соединения по изобретению в другое соединение по изобретению, и/или, если необходимо, превращение свободной карбоксильной группы в фармацевтически приемлемую сложноэфирную группу или превращение полученной сложноэфирной группы в свободную карбоксильную группу или в другую сложноэфирную группу, и/или, если необходимо, превращение полученного свободного соединения в его соль или полученной соли в свободное соединение или в другую соль, и/или, если необходимо, разделение смеси изомеров или рацематов, и/или, если необходимо, разделение полученного рацемата на оптические антиподы.

В исходных соединениях и промежуточных соединениях, которые используют для получения соединений по изобретению способом, описанным в заявке, присутствующие функциональные группы, такие, как тиольная, карбоксильная, амино и гидроксигруппа, необязательно защищают соответствующими защитными группами, которые известны в препаративной органической химии. Защищенные тиольная, карбоксильная, амино и гидроксигруппа означают такие группы, которые в мягких условиях легко превращаются в свободные тиольную, карбоксильную, амино и гидроксигруппу, не вызывая при этом нежелательных побочных реакций.

Основное назначение защитных групп состоит в защите функциональных групп от нежелательных реакций с реакционноспособными компонентами в условиях проведения необходимых химических реакций. Необходимость и выбор защитных групп для проведения конкретной реакции очевидна для специалиста в данной области и зависит от природы защищаемой функциональной группы (тиол, карбоксил, аминогруппа и т.п.), строения и устойчивости молекулы, в которую вводят заместитель, и условий проведения реакции.

Общеизвестные защитные группы, которые соответствуют этим требованиям, способы их введения и удаления описаны, например, в монографиях J.F.W.McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, London, N.Y. (1973), T.W.Greene и P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y., 3 ed (1999), а также в монографии The peptides, v.l, Schroeder и Luebke, Academic Press, London, N.Y. (1965).

Получение соединений по изобретению по способу (а), включающее конденсацию амина формулы II с кислотой формулы III или ее реакционноспособным производным по функциональной группе, проводят по методике, хорошо известной в синтезе пептидов.

Конденсацию по способу (а) сложного эфира аминокислоты формулы II со свободной карбоновой кислотой формулы III предпочтительно проводят в присутствии конденсирующего агента, такого, как дициклогексилкарбодиимид или N-(3-диметиламинопропил)-N^'-этилкарбодиимид, и гидроксибензотриазола, 1-гидрокси-7-азабензотриазола, хлордиметокситриазина, гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония (ВОР) или гексафосфата O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N^',N^'-тетраметилурония (HATU), и триэтиламина или N-метилморфолина, в инертном полярном растворителе, таком, как диметилформамид или хлористый метилен, предпочтительно при комнатной температуре.

Конденсацию сложного эфира аминокислоты формулы II с реакционноспособным производным кислоты формулы III в форме галоидангидрида, предпочтительно хлорангидрида, или смешанного ангидрида, проводят в инертном растворителе, таком, как толуол или хлористый метилен, предпочтительно в присутствии основания, например, неорганического основания, такого, как карбонат калия, или органического основания, такого, как триэтиламин, N-метилморфолин или пиридин, предпочтительно при комнатной температуре.

Реакционноспособными производными карбоновых кислот формулы III предпочтительно являются галоидангидриды (например, хлорангидрид) и смешанные ангидриды, такие, как пивалоил или изобутилоксикарбонилангидрид, или активированные эфиры, такие, как сложный эфир бензотриазола, 7-азабензотриазола или гексафторфенила.

Исходный материал формулы II можно получить методами, описанными в заявке, или приведенными в примерах.

Получение исходного материала формулы II включает ацилирование сложного эфира формулы VIII

где alk, X, R и R₁ имеют значения, указанные выше, а COOR₂ означает сложноэфирную группу (например, где R₂ означает (низш.)алкил или бензил), соответственно N-защищенной аминокислоты (или ее реакционноспособным производным) формулы IX

где R₆ и R₇ имеют значения, указанные выше, a R₈ означает лабильную аминозащитную группу, например трет-бутоксикарбонил, с образованием соответствующего N-защищенного соединения формулы II.

Конденсацию соединения формулы VIII с соединением формулы IX проводят по методике, известной в синтезе пептидов, например, как описано выше для конденсации соединения формулы II с соединением формулы III. N-Защитную группу удаляют методами, известными в данной области техники, например трет-бутоксикарбонил удаляют безводной кислотой, такой, как трифторуксусная кислота или HCl.

Исходные сложные эфиры аминокислот и кислот формул VIII и IX соответственно либо известны в данной области техники, либо, если они являются новыми соединениями, их можно получить методами, известными в данной области, или, как описано в тексте заявки. Сложные эфиры аминокислот формулы VIII предпочтительно являются S-энантиомерами.

Исходные материалы формулы III известны, или, если они являются новыми соединениями, их можно получить соответствующими методами. Исходные материалы получают, например, из соответствующих рацемических или оптически активных α-аминокислот, превращением их в α-бромпроизводное с последующей заменой брома и обращением конфигурации с использованием соответствующего тиольного производного формулы VII, в основных условиях, например, как описано в Европейской заявке №524553, опубликованной 27 января 1993 г. Реакцию S-дебензилирования полученных конечных продуктов проводят восстановительным расщеплением, например, никелем Ренея в этаноле. Реакцию S-деацилирования проводят, например, гидролизом в присутствии основания, например, в разбавленном растворе гидроксида натрия. Циклические исходные материалы формулы III можно получить обработкой циклической карбоновой кислоты (например, циклопентанкарбоновой кислоты) серой в присутствии сильного основания, такого, как диэтиламид лития.

Получение соединений по изобретению по способу (б), включающему конденсацию кислоты формулы IV со сложным эфиром аминокислоты формулы V, проводят аналогично тому, как описано в способе (а). Аналогичным образом исходные материалы формулы IV получают конденсацией кислоты формулы III с сложными эфирами соответствующих гем-дизамещенных аминокислот формулы IX (где R₈ в данном случае означает водород) в условиях, аналогичных описанным выше, и последующим удалением карбоксизащитной группы.

Получение соединений по изобретению по способу (в), включающее замещение уходящей группы Y в соединении формулы VI тиолом R₃ ^'SH в виде соли, проводят известными в данной области методами.

Реакционноспособной этерифицированной гидроксильной группой, обозначаемой Y, является гидроксильная группа, этерифицированная сильной неорганической или органической кислотой. Соответствующими группами Y являются прежде всего галоген, например хлор, бром или иод, а также сульфонилоксигруппы, такие, как (низш.)алкил- или арилсульфонилоксигруппы, например, (метан-, этан-, бензол- или толуол-)сульфонилоксигруппы, а также трифторметилсульфонилоксигруппа.

Замещение проводят в инертном растворителе, таком, как диметилформамид или хлористый метилен, в присутствии основания, такого, как карбонат калия, триэтиламин, диизопропилэтиламин, N-метилморфолин и т.п., при комнатной или повышенной температуре.

При использовании солевой формы R₃ ^'SH (например, тиоацетата калия) реакцию проводят в отсутствие основания в инертном растворителе, таком, как тетрагидрофуран или диметилформамид.

Аналогичным образом исходные материалы формулы VI можно получить взаимодействием производного дипептида формулы II с кислотой формулы Х

где R₄, R₅ и Y имеют значения, указанные выше, в условиях, описанных в способе (а).

Соединения формулы X, где Y означает галоген, такие, как α-бромкарбоновые кислоты, известны или их получают, например, как описано в международной заявке WO 99/55726, опубликованной 4 ноября 1999 г.

Соединения по изобретению и промежуточные соединения, например, формул II, V и VI, содержащие боковую цепь alk-X-R₁, получают из соответствующих соединений, содержащих боковую цепь alk-X^', где X^' означает амино, гидрокси, тиол или соответствующую уходящую группу, по известной методике, описанной в данной заявке. Например, кислоты и сложные эфиры формулы V можно получить из серина, гомосерина, треонина, цистеина и т.п., предпочтительно в оптически активной форме.

Некоторые соединения по изобретению и промежуточные соединения можно превратить в другие соединения по известным в данной области общим реакциям.

Свободные меркаптаны можно превратить в S-ацилпроизводные при взаимодействии с реакционноспособным производным карбоновой кислоты (если R₃ в формуле I означает ацил), таким, как ангидрид или указанный хлорангидрид, предпочтительно в присутствии основания, такого, как триэтиламин, в инертном растворителе, таком, как ацетонитрил или хлористый метилен.

Свободные спирты и фенолы можно превратить в соответствующие ацилпроизводные, например, при взаимодействии с соответствующим хлорангидридом, в присутствии основания, такого, как триэтиламин.

Свободные меркаптаны, в которых R₃ означает водород, можно окислить в соответствующие дисульфиды, например, окислением кислородом воздуха или с использованием мягкого окислителя, такого, как спиртовый раствор иода. И наоборот, дисульфиды можно восстановить в соответствующие меркаптаны, например, восстановителями, такими, как борогидрид натрия, цинк в уксусной кислоте или трибутилфосфин.

Сложные эфиры карбоновых кислот можно получить из карбоновых кислот, например, конденсацией с галогенидами соответствующих спиртов R₂-OH в присутствии основания или с избытком спирта в присутствии кислотного катализатора, известными в данной области методами.

Сложные эфиры карбоновых кислот и S-ацилпроизводные можно гидролизовать, например, водными растворами оснований, такими, как карбонаты или гидроксиды щелочных металлов. S-Ацильную и сложноэфирную группы можно удалить избирательно, как описано в тексте заявки.

Предпочтительно и если возможно предпочтительные изомеры по изобретению формулы Ia получают из чистых энантиомеров.

В случае получения смесей стереизомеров (например, диастереомеров) их можно разделить известными способами, такими, как фракционная кристаллизация и хроматография (например, тонкослойная хроматография, хроматография на колонке, экспресс-хроматография). Рацемические свободные кислоты можно разделить на оптические антиподы фракционной кристаллизацией d- или l-солей (α-метилбензиламина, цинхонидина, цинхонина, хинина, хинидина, дегидроабиетиламина, бруцина или стрихнина) и т.п. Рацемические продукты (не диастереоизомеры) можно сначала превратить в диастереоизомеры взаимодействием с оптически активными реагентами (такими, как оптически активные спирты, с образованием сложных эфиров), которые затем разделяют, как описано выше, и, например, гидролизуют в индивидуальый энантиомер. Рацемические продукты можно также разделить хиральной хроматографией, например, методом ЖХВР на хиральном сорбенте, а также с использованием ферментативного гидролиза, например сложные эфиры гидролизуют алкалазой.

Вышеуказанные реакции проводят по стандартным методикам в присутствии или отсутствие разбавителей, предпочтительно таких, которые инертны в отношении реагентов и являются для них растворителями, в присутствии или отсутствие катализаторов, щелочных или кислотных конденсирующих или других агентов, которые соответственно и/или инертны в отношении реагентов и являются для них растворителями, катализаторов, щелочных или кислотных конденсирующих или указанных других агентов, соответственно, и/или в атмосфере инертного газа, при низкой, комнатной или повышенной температуре, предпочтительно около температуры кипения растворителя при атмосферном или повышенном давлении.

Кроме того, изобретение включает любой вариант указанных способов, в котором в качестве исходного материала используется промежуточный продукт, получаемый на любой стадии способа, и далее проводятся любые последующие стадии, или способ прерывается на любой его стадии, или изобретение включает способ, в котором исходные материалы получают в указанных условиях реакции или в котором компоненты реакции используются в форме солей или оптически чистых антиподов. В указанных реакциях следует использовать главным образом те исходные материалы, которые приводят к образованию указанных выше предпочтительных соединений.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых нетоксичных кислотно-аддитивных солей или их фармацевтических композиций в качестве лекарственных препаратов для введения млекопитающим с целью ингибирования АСЕ и NEP, и, например, для профилактики или лечения сердечно-сосудистых нарушений, таких, как гипертензия, отек, удерживание солей и застойная сердечная недостаточность, причем соединения по изобретению используются отдельно или в комбинации с одним или более других агентов, которые используются при терапии таких нарушений. Такие агенты включают антигипертензивные агенты, антиатеросклеротические агенты, кардиологические агенты, диуретические агенты, антидиабетические агенты, агенты, снижающие уровень холестерина и т.п. При использовании в комбинации с другими терапевтическими агентами соединения по изобретению вводят отдельно или в стандартной комбинации.

Примеры терапевтических агентов, которые можно использовать в комбинации, включают антагонисты рецептора ангиотензина II, такие, как валсартан, лосартан, кандесартан, эпросартан, ирбесартан и телмисартан; β-блокаторы, такие, как бисопролол, пропанолол, атенолол, соталол и метопролол; ингибиторы ренина, блокаторы кальциевых каналов, такие, как амлодипин, верапамил, дилтиазем, бепридил, фелодипин, исрадипин, никардипин, нифедипин, нимодипин и нисолдипин; ингибиторы альдостеронсинтазы/антагонисты альдостерона, такие, как эплеренон, (+)-фадрозол (WO 01/76574), спиронолактон и канренон; диуретики, такие, как фуросемид, гидрохлортиазид, индапамид, метазолон, амилорид и триамтерен; антагонисты рецептора вазопрессина, такие, как ОРС 21268, SR 49059, SR 121463А, SR 49059, VPA 985, ОРС 31260 и YM 087; кардиотонические средства, такие, как эноксимон и левосимендан; антагонисты эндотелина и ингибиторы ЕСЕ, такие, как босентан, BMS 193884, ТВС 3711 и соединения, заявленные в WO 99/55726; антиатеросклеротические агенты, прежде всего агенты, снижающие уровень холестерина, такие, как секвестранты желчных кислот (например, холестирамин и колестипол); ингибиторы абсорбции холестерина, такие, как эзетимиб; фибраты, такие, как фенофибрат и гемфиброзил; ингибиторы статин HMG СоА Редуктазы, такие, как аторвастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин, симвастатин и питавастатин, и производные никотиновой кислоты; тиромиметические агенты, такие, как заявленные в USP 5569674 и WO 00/58279, а также антидиабетические агенты, такие, как репаглинид, натеглинид, метформин, росиглитазон, пиоглитазон, глибурид, глипизид, глимепирид, DPP 728, LAP 237, NH 622 и DRF 4158.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению соединений по изобретению для получения фармацевтических композиций, прежде всего фармацевтических композиций, обладающих ингибирующей активностью в отношении АСЕ и NEP, и, например, антигипертензивной активностью.

Фармацевтические композиции по изобретению пригодны для энтерального введения, такого, как пероральное или ректальное введение, трансдермального и парентерального введения млекопитающим, включая человека, при лечении сердечно-сосудистых нарушений, таких, как гипертензия, причем фармацевтические композиции включают эффективное количество фармакологически активного соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, отдельно или в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых носителей, а также в комбинации с другими терапевтическими агентами, которые используются для лечения сердечно-сосудистых нарушений, как описано выше.

Фармакологически активные соединения по изобретению могут применяться для получения фармацевтических композиций, включающих эффективное количество фармакологически активного соединения по изобретению в сочетании или в смеси с эксципиентами или носителями, пригодными для энтерального или парентерального введения. Предпочтительными являются таблетки и желатиновые капсулы, включающие активный ингредиент в смеси а) с разбавителями, например лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином, б) с замасливателями, например оксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью, и/или полиэтиленгликолем, а таблетки кроме того включают в) связующие агенты, например силикаты магния и алюминия, пастообразный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон, а при необходимости г) дезинтегрирующие агенты, например крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль или шипучие смеси, и при необходимости абсорбенты, красители, ароматизаторы и подсластители. Композиции для инъекций предпочтительно представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, а суппозитории предпочтительно получают из жирных эмульсий или суспензий. Указанные композиции можно получать стерильными и/или в смеси с адъювантами, такими, как консерванты, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, стимуляторы, повышающие растворимость, соли для регуляции осмотического давления и/или буферные соли. Кроме того, композиции могут также содержать другие терапевтически полезные соединения. Указанные композиции получают с использованием обычных операций смешивания, гранулирования или нанесения покрытия соответственно. Композиции обычно содержат приблизительно 0,1-75%, предпочтительно приблизительно 1-50% активного ингредиента.

Пригодные составы для трансдермального введения включают эффективное количество соединения по изобретению в смеси с носителем. Предпочтительные носители включают абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители, способствующие проникновению через кожу. Обычно трансдермальные системы представляют собой повязку, включающую пленочное покрытие, резервуар, содержащий активное соединение необязательно в смеси с носителями, необязательно мембрану, регулирующую высвобождение лекарственного средства на кожу пациента с регулируемой или заданной скоростью в течение продолжительного времени, и средства закрепления системы на коже пациента.

Стандартная доза для млекопитающего массой 50-70 кг может содержать приблизительно от 10 до 200 мг активного ингредиента. Доза активного соединения зависит от вида теплокровного животного (млекопитающего), массы тела, возраста, состояния организма и формы введения.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем. Если не указанного иное, упаривание проводят при пониженном давлении, предпочтительно при 15-100 мм рт. ст. Величину оптического вращения (в градусах) измеряют при комнатной температуре при 589 нм (D линия натрия) или при других длинах волн, указанных в примерах. Строение соединений подтверждают стандартными аналитическими характеристиками, такими, как масс-спектр, элементный анализ, спектр ЯМР, ИК-спектр и т.п.

R и S означают абсолютную конфигурацию каждого асимметрического центра.

Пример 1

(а) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина

Этиловый эфир N-[2-[(R)-3-бром-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина (4,96 г, 10,5 ммоля) растворяли в тетрагидрофуране (100 мл) и добавляли тиоацетат калия (6,00 г, 52,5 ммоля). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, затем разбавляли этилацетатом (500 мл) и промывали водой (100 мл), раствором бикарбоната натрия (2×100 мл), водой (2×100 мл) и солевым раствором (50 мл). Затем раствор сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Неочищенный материал очищали экспресс-хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат, 3:2), при этом получали указанное в заголовке соединение. t_пл. 55-57°С. [α]²⁰ _D-63,5° (с 0,99, СН₃ОН). МС: 467 (М+Н).

Исходный материал получали по следующей методике.

Раствор О-бензил-L-серина (9,75 г, 50 ммолей) в этаноле (200 мл) насыщали газообразным HCl в течение 8 мин. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрировали в вакууме. Твердое вещество промывали диэтиловым эфиром и отделяли фильтрованием, при этом получали гидрохлорид этилового эфира О-бензил-L-серина в виде твердого вещества белого цвета.

К раствору ВОС-α-метилаланина (3,05 г, 15 ммолей), гидрохлорида этилового эфира О-бензил-L-серина (3,89 г, 15 ммолей), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDCI, 2,88 г, 15 ммолей) и 1-гидрокси-7-азабензотриазола (НОАТ, 2,04 г, 15 ммолей) в хлористом метилене (150 мл) добавляли триэтиламин (1,52 г, 15 ммолей). Смесь перемешивали в течение ночи и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате, промывали водой, 1 н. HCl, водой и солевым раствором. Затем раствор сушили над сульфатом натрия и концентрировали, при этом получали этиловый эфир N-[2-(ВОС-амино)-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина формулы

Вышеуказанный карбамат (6,12 г, 15 ммолей) растворяли в хлористом метилене (200 мл) и охлаждали на ледяной бане. Затем раствор насыщали газообразным HCl в течение 10 мин, перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и концентрировали. К концентрату добавляли хлористый метилен и снова концентрировали, при этом получали гидрохлорид этилового эфира N-(2-амино-2-метилпропионил)-O-бензил-L-серина в виде пены. МС: 309 (М+Н).

К раствору вышеуказанного гидрохлорида амина (4,90 г, 14 ммолей) в хлористом метилене (150 мл) добавляли соль (R)-2-бром-3-метилбутановой кислоты с диизопропиламином (4,03 г, 14 ммолей), гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDCI, 2,70 г, 14 ммолей) и 1-гидрокси-7-азабензотриазол (НОАТ, 1,90 г, 14 ммолей). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате, промывали водой, разбавленным раствором бикарбоната натрия, водой, 1 н. HCl и солевым раствором. Затем раствор сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Полученное твердое вещество очищали экспресс-хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат, 2:1), при этом получали этиловый эфир N-[2-[(R)-2-бром-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-О-бензил-L-серина формулы

Аналогичным образом получали следующие соединения.

(б) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3,3-диметилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина

(в) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-треонина. t_пл. 121-122°С.

(г) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метоксибутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. [α]²⁰ _D +14,9° (с 1,04, ДМСО).

(д) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилпентаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. [α]²⁰ _D - 6,93° (с 1,09, СН₃ОН).

(е) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(3-трифторметилбензил)-L-серина

Исходное соединение, гидрохлорид этилового эфира O-(3-фторметилбензил)-L-серина, получали по следующей методике.

К суспензии гидрида натрия (60% в масле, 3,04 г, 76 ммолей) в N,N-диметилформамиде (60 мл) при 0°С добавляли BOC-L-серин (7,80 г, 38 ммолей), смесь перемешивали в течение 1 ч, а затем добавляли мета-трифторметилбензилхлорид (7,39 г, 38 ммолей). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Затем реакцию останавливали добавлением воды, добавляли этилацетат, промывали солевым раствором, сушили над MgSO₄ и концентрировали. Полученное масло желтого цвета очищали экспресс-хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат), при этом получали прозрачное масло. Масло растворяли в этаноле (120 мл), раствор охлаждали до 0°С и насыщали газообразным HCl в течение 5 мин. Затем смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. После концентрирования получали гидрохлорид этилового эфира O-(4-трифторметилбензил)-L-серина.

(ж) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(4-фторбензил)-L-серина (в виде масла)

(з) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(4-фторфенил)-L-гомосерина (в виде масла)

Исходное соединение, гидрохлорид этилового эфира O-(4-фторфенил)-L-гомосерина, получали по следующей методике.

К раствору трет-бутилового эфира BOC-L-гомосерина (3,2 г, 11,6 ммоля) в тетрагидрофуране добавляли трифенилфосфин (7,59 г, 29 ммолей), пара-фторфенол (2,08 г, 18,6 ммоля) и 1,1^'-азобис(N,N-диметилформамид) (3,2 г, 18,6 ммоля). Смесь перемешивали в течение ночи, промывали солевым раствором, сушили над MgSO₄ и растворитель удаляли. Полученное масло оранжевого цвета очищали экспресс-хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат, 85%: 15%), при этом получали прозрачное масло. Масло растворяли в этаноле (100 мл), раствор насыщали газообразным HCl и перемешивали в течение ночи. После концентрирования получали гидрохлорид этилового эфира O-(4-фторфенил)-L-гомосерина в виде твердого вещества белого цвета.

(и) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(3-фторфенил)-L-гомосерина

(к) Морфолинокарбонилметиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина получали после очистки продукта реакции хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат/метанол, 20:70:10) в виде твердого вещества белого цвета.

Исходный материал получали по следующей методике.

О-Бензил-L-серин (10,0 г, 51,3 ммоля), ди-трет-бутилдикарбонат (11,2 г, 51,4 ммоля) и 1 н. гидроксид натрия (103 мл, 103 ммоля) в 100 мл диоксана перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем смесь концентрировали в вакууме, переносили в воду, подкисляли 6 н. HCl до рН 1 и экстрагировали этилацетатом. Экстракт промывали водой, солевым раствором и сушили над безводным сульфатом магния. Смесь фильтровали и концентрировали в вакууме, при этом получали ВОС-О-бензил-L-серин в виде масла. К раствору ВОС-О-бензил-L-серина (2,20 г, 7,46 ммоля), триэтиламина (0,75 г, 7,43 ммоля) и иодида натрия (0,11 г, 0,73 ммоля) в 5 мл N,N-диметилформамида добавляли 4-(2-хлорацетил)морфолин (1,22 г, 7,48 ммоля) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем смесь разбавляли этилацетатом, промывали водой, солевым раствором и сушили над безводным сульфатом магния. Смесь фильтровали и концентрировали в вакууме, при этом получали масло желтого цвета. Полученное масло очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат/метанол, 35:60:5), при этом получали морфолинокарбонилметиловый эфир ВОС-О-бензил-L-серина в виде бесцветного масла. Через раствор эфира карбамата (1,72 г, 4,08 ммоля) в хлористом метилене (50 мл) в течение 5 мин пропускали газообразный HCl и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После концентрирования в вакууме получали морфолинокарбонилметиловый эфир O-бензил-L-серина в виде пены.

(л) Диметиламинокарбонилметиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-О-бензил-L-серина получали и очищали, как описано в примере 1(к)

(м) Диэтиламинокарбонилметиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина получали, как описано в примере 1(к), и очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат/метанол, 35:60:5).

(н) Этиловый эфир N-[2-[(3)-2-[(метоксиацетил)тио]-3- метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. [α]²⁰ _D -55,27° (с 1,084, СН₃ОН).

(о) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-[(морфолиноацетил)тио]-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. [α]_D - 48,61° (с 1,098, СН₃ОН).

(п) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-2-(4-тетрагидропиранил)ацетиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. [α]_D -55,4° (с 0,83, ДМСО).

Исходную (D)-α-бром-α-(4-тетрагидропиранил)уксусную кислоту можно получить по следующей методике.

К охлажденному раствору (0°С) (D)-α-бром-α-(4-тетрагидропиранил)глицина (см. J. Am. Chem. Soc., 117, 9375-9378 (1995)) (7,05 г, 44,3 ммоля) и 48% HBr (водн.) (70 мл) в 35 мл воды добавляли по каплям раствор нитрита натрия (4,71 г, 68,3 ммоля) в 35 мл воды. После завершения добавления реагента смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем смесь экстрагировали этилацетатом, органический слой последовательно промывали водой, 5% водным раствором тиосульфата натрия, солевым раствором и сушили над безводным сульфатом магния. Смесь фильтровали и концентрировали в вакууме, при этом получали (D)-α-бром-α-(4-тетрагидропиранил)уксусную кислоту в виде твердого вещества.

(р) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-[(1-(1,2,4)триазолил)ацетилтио]-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. t_пл. 106-107°С. [α]_D -61,46° (с 1,09, СН₃ОН).

(с) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-[(4-метилпиперазино)ацетилтио]-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. t_пл. 95-96°C. [α]_D -48,5° (с 0,935, СН₃ОН).

(т) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-этилбутаноил]-O-бензил-L-серина. [α]_D -83,6° (с 1,07, СН₃ОН).

(у) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-(морфолиноацетилтио)-3,3-диметилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. [α]_D -55,5° (с 1,008, ДМСО).

(ф) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-[(метоксиацетил)тио]-3,3-диметилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. [α]_D -61,67° (с 1,024, ДМСО).

(х) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-(ацетилтио)пентаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина

(ц) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(4-бифенилилметил)-L-серина

Пример 2

Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-S-бензил-L-цистеина

Указанное в заголовке соединение получали аналогично тому, как описано в примере 1, и перекристаллизовывали из метил-трет-бутилового эфира/гексана. t_пл. 69-71°C.

Исходный материал получали по следующей методике.

Через раствор ВОС-S-бензил-L-цистеина (9,33 г, 30 ммолей) в этаноле (200 мл) в течение 15 мин пропускали газообразный HCl. Емкость закрывали и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали в вакууме, остаток перемешивали в диэтиловом эфире (150 мл) в течение 1,5 ч, при этом получали гидрохлорид этилового эфира S-бензил-L-цистеина в виде твердого вещества.

Смесь гидрохлорида этилового эфира S-бензил-L-цистеина (7,98 г, 29 ммолей), ВОС-α-метилаланина (5,89 г, 29 ммолей), триэтиламина (2,93 г, 29 ммолей), 1-гидроксибензотриазола (НОВТ, 3,92 г, 29 ммолей) и EDCI (5,57 г, 29 ммолей) в хлористом метилене (200 мл) перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь упаривали досуха, остаток растворяли в этилацетате (200 мл), раствор промывали водой (50 мл), 1 н. HCl (50 мл), водой (50 мл), 5% раствором бикарбоната натрия (50 мл), водой (50 мл) и, наконец, солевым раствором (25 мл). Затем раствор сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха, при этом получали этиловый эфир N-[2-(ВОС-амино)-2-метилпропионил]-S-бензил-L-цистеина.

Пример 3

Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-(S)-2-амино-3 -(бензилсульфонил)пропионовой кислоты

Указанное соединение получали аналогично тому, как описано в примере 1.

Исходный материал получали по следующей методике.

К раствору этилового эфира N-[2-(ВОС-амино)-2-метилпропионил]-S-бензил-L-цистеина (7,21 г, 17 ммолей) в хлористом метилене (250 мл) в атмосфере аргона добавляли мета-хлорпербензойную кислоту (8,77 г, 51 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем смесь упаривали досуха и остаток растворяли в этилацетате (300 мл). Раствор промывали 5% раствором бикарбоната натрия (3×50 мл), водой (50 мл) и солевым раствором (25 мл). Затем раствор сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали в вакууме, при этом получали этиловый эфир N-[2-(ВОС-амино)-2-метилпропионил]-(S)-2-амино-3-(бензилсульфонил)пропионовой кислоты.

Пример 4

(а) Метиловый эфир N²-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-(S)-2-амино-3-(бензоиламино)пропионовой кислоты

Смесь бензоилхлорида (0,085 мл, 0,73 ммоля), гидрохлорида метилового эфира N²-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-(S)-2,3-диаминопропионовой кислоты (0,29 г, 0,73 ммоля) и триэтиламина (0,15 мл, 1,49 ммоля) в хлористом метилене (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь упаривали в вакууме досуха, остаток растворяли в этилацетате и полученный раствор промывали водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором, сушили над безводным сульфатом магния и упаривали досуха, при этом получали масло. Масло очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат, 50:50), при этом получали указанное в заголовке соединение в виде пены белого цвета, t_пл. 48-54°C.

(б) Аналогичным образом получали метиловый эфир N²-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-(S)-2-амино-3-(бензолсульфонамидо)пропионовой кислоты. t_пл. 47-51°С. [α]_D ²⁰ - 41,72° (с 1,03, СН₃ОН).

Исходный материал получали по следующей методике.

Смесь гидрохлорида метилового эфира (S)-2-амино-3-(ВОС-амино)пропионовой кислоты (4,6 г, 2,1 ммоля), N-CBZ-α-метилаланина (5,0 г, 2,1 ммоля), НОАТ (2,87 г, 2,1 ммоля), EDCI (4,02 г, 2,1 ммоля) и триэтиламина (2,93 г, 2,1 ммоля) в хлористом метилене (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь промывали солевым раствором, сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали в вакууме.

Полученное масло очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат, 1:1), при этом получали метиловый эфир N²-[2-(CBZ-амино)-2-метилпропионил]-(S)-2-амино-3-(ВОС-амино)пропионовой кислоты в виде пены белого цвета. t_пл. 100-101°С.

Смесь полученного продукта (2,14 г, 4,90 ммоля) и 10% палладия на угле (0,27 г) в этаноле (50 мл) гидрировали при давлении 45 фунт./кв.дюйм в сосуде Парра в течение 4 ч. Смесь фильтровали через слой целита и концентрировали в вакууме, при этом получали гидрохлорид метилового эфира N²-[2-амино-2-метилпропионил]-(S)-2-амино-3-(ВОС-амино)пропионовой кислоты в виде масла.

Раствор полученного продукта (2,28 г, 8,09 ммоля), соли (R)-2-бром-3-метилбутановой кислоты с диизопропиламином (2,16 г, 7,13 ммоля), EDCI (1,43 г, 7,49 ммоля) и НОАТ (1,15 г, 8,52 ммоля) в хлористом метилене (75 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь упаривали досуха в вакууме и остаток переносили в этилацетат. Раствор в этилацетате промывали водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором, а затем сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали в вакууме. Полученное масло очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат, 40:60), при этом получали метиловый эфир N²-[2-[(R)-2-бром-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-(S)-2-амино-3-(ВОС-амино)пропионовой кислоты в виде пены белого цвета.

Смесь полученного продукта (1,31 г, 2,82 ммоля) и тиоацетата калия (1,28 г, 11,2 ммоля) в тетрагидрофуране (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч и разбавляли этилацетатом. Смесь промывали водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия, солевым раствором, а затем сушили над сульфатом магния. Реакционную смесь концентрировали досуха в вакууме и полученное масло очищали хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат, 40:60), при этом получали метиловый эфир N-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-(3)-2-амино-3-(ВОС-амино)пропионовой кислоты.

Через раствор полученного соединения (1,01 г, 2,19 ммоля) в 50 мл хлористого метилена в течение 5 мин пропускали газообразный HCl. Затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и концентрировали в вакууме, при этом получали гидрохлорид метилового эфира N²-[2-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-(S)-2,3-диаминопропионовой кислоты.

Пример 5

К раствору 1-[(R)-2-бром-3-метилбутаноиламино]циклопентанкарбоновой кислоты (1 г, 3,42 ммоля), гидрохлорида этилового эфира О-бензил-L-серина (0,89 г, 3,42 ммоля), дициклогексилкарбодиимида (0,7 г, 3,42 ммоля) и 1-гидрокси-7-азабензотриазола (0,47 г, 3,42 ммоля) в хлористом метилене добаляли триэтиламин (0,48 мл, 3,42 ммоля), полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем промывали солевым раствором и концентрировали в вакууме, при этом получали масло светло-желтого цвета. Остаток очищали экспресс-хроматографией на силикагеле (элюент: гсксан/этилацетат), при этом получали этиловый эфир N-[1-(R)-2-бром-3-метилбутаноиламино]циклопентанкарбонил]-O-бензил-L-серина формулы

Полученное бромпроизводное (0,7 г, 1,41 ммоля) растворяли в тетрагидрофуране (50 мл) и добавляли тиоацетат калия (0,19 г, 1,69 ммоля). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч, разбавляли этилацетатом, промывали солевым раствором, сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме. Полученное масло желтого цвета очищали экспресс-хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/этилацетат), при этом получали полутвердое вещество, которое растирали в гексане, при этом получали этиловый эфир N-[1-[(S)-2-ацетилтио-3-метилбутаноиламино]циклопентанкарбонил]-O-бензил-L-серина формулы

Исходный материал, 1-[(R)-2-бром-3-метилбутаноиламино]циклопентанкарбоновую кислоту, получали по методике, описанной в WO 99/55726, конденсацией соли (R)-2-бром-3-метилбутановой кислоты и диизопропиламина (полученной из L-валина) с гидрохлоридом метилового эфира циклолейцина.

Пример 6

(а) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серин

К раствору S-ацетилэтилового эфира, полученного, как описано в примере 1, (0,47 г, 1 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляли 1 н. гидроксид натрия (5,0 мл, 5 ммолей), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, подкисляли 1 н. HCl до рН 1 и концентрировали в вакууме. К остатку добавляли этилацетат и смесь промывали 1 н. NaOH. Затем объединенную водную фазу подкисляли и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия и концетрировали в вакууме. Остаток растирали в гексане, при этом получали продукт в виде пены белого цвета. t_пл. 57-70°C. [α]_D ²⁰ -16,8° (с 1,032, ДМСО). МС: 397 (М+Н).

По аналогичной методике получали следующие соединения.

(б) N-[1-[(3)-2-Меркапто-3-метилбутаноиламино]циклопентанкарбонил]-O-бензил-L-серин (кристаллизован из гексана/трет-бутилметилового эфира). t_пл. 132-136°С.

(в) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-S-бензил-L-циетеин. t_пл. 81-87°C. [α]_D ²⁰ -37,87° (с 0,545, ДМСО).

(г) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-треонин. t_пл. 61-64°С.

(д) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3,3-диметилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-О-бензил-L-серин. t_пл. 128-130°С. [α]_D -2,46° (с 1,06, ДМСО).

(е) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(4-фторбензил)-L-серин. t_пл. 50-54°C.

(ж) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(4-фторфенил)-L-гомосерин. t_пл. 127-128°C.

(з) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-(3-фторфенил)-L-гомосерин. t_пл. 50-56°С.

(и) N-[2-[(S)-2-Меркапто-3-метоксибутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серин. [α]_D ²⁰ +18,85° (с 0,997, ДМСО).

(к) N-[2-[(S)-2-Меркапто-2-(4-тетрагидропиранил)ацетиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серин. t_пл. 184-189°С. [α]_D ²⁰ -24,94° (с 1,013, ДМСО).

Пример 7

(а) Этиловый эфир N-[2-[(S)-2-меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-S-бензил-L-цистеина

Тиоацетил, полученный, как описано в примере 2, (0,48 г, 1,00 ммоль) растворяли в абсолютном EtOH (5 мл) в атмосфере аргона и обрабатывали 1 н. NaOH (1,0 мл, 1,0 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, а затем добавляли 1 н. HCl до рН 3. Смесь упаривали, удаляя большую часть EtOH, водный остаток экстрагировали AcOEt (2×10 мл). Объединенные экстракты промывали водой (5 мл) и солевым раствором (5 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Продукт обрабатывали трет-бутилметиловым эфиром/гексаном, при этом получали указанное соединение в виде твердого вещества. t_пл. 87-91°C.

(б) Аналогичным образом получали этиловый эфир N-[2-[(S)-2-меркапто-2-(4-тетрагидропиранил)ацетиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина. t_пл. 85-93°C. [α]_D -37,21° (с 1,012, ДМСО).

(в) Аналогичным образом получали этиловый эфир N-[2-[(S)-2-меркапто-3,3-диметилбутаноиламино]-2-метилпропионил]-O-бензил-L-серина в виде масла. [α]_D -20,9° (с 1,025, ДМСО).

(г) Аналогичным образом получали этиловый эфир N-[2-[(S)-2-меркапто-3-метилбутаноиламино]-2-этилбутаноил]-O-бензил-L-серина. [α]_D -31,48° (с 0,955, СН₃ОН).

1. Соединение формулы (I)

где R означает водород,

R₁ означает карбоциклический арил, необязательно замещенный галогеном, или (карбоциклический арил или биарил)(низш.)алкил, необязательно замещенный трифторметилом или галогеном;

alk означает (низш.)алкилен,

R₃ означает водород или ацил, необязательно замещенный алкокси, морфолинилом, триазолилом или пиперазинилом;

R₄ означает водород, необязательно замещенный метокси (низш.)алкил или оксациклоалкил;

R₅ означает водород или (низш.)алкил;

R₆ означает (низш.)алкил;

R₇ означает (низш.)алкил; или

R₆ и R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают 3-10-членный циклоалкилиден,

Х означает -O-, -S(O)_n-, -NHCO-;

n равно 0 или 2;

COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира, где R₂ выбирают из (низш.)алкила, морфолинкарбонилметила, диметиламинокарбонилметила или диэтиламинокарбонилметила, или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение формулы (Ia)

где R означает водород,

R₁ означает карбоциклический арил, необязательно замещенный галогеном, или (карбоциклический арил или биарил)(низш.)алкил, необязательно замещенный трифторметилом или галогеном;

alk означает (низш.)алкилен,

R₃ означает водород или ацил, необязательно замещенный алкокси, морфолинилом, триазолилом или пиперазинилом;

R₄ означает водород, необязательно замещенный метокси (низш.)алкил или оксациклоалкил;

R₅ означает водород или (низш.)алкил;

R₆ означает (низш.)алкил;

R₇ означает (низш.)алкил; или

R₆ и R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают 3-10-членный циклоалкилиден,

Х означает -O-, -S(O)_n-, -NHCO-;

n равно 0 или 2;

COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира, где R₂ выбирают из (низш.)алкила, морфолинкарбонилметила, диметиламинокарбонилметила или диэтиламинокарбонилметила, или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по п.1, где R и R₅ означают водород; R₁ означает фенил, фторфенил, бензил или фторбензил; R₃ означает водород, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, замещенный (низш.)алкоксигруппой; R₄ означает водород или 1-метоксиэтил; R₆ и R₇ означают метил; Х означает -O-; alk означает метилен; COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира, где R₂ выбирают из (низш.)алкила, морфолинкарбонилметила, диметиламинокарбонилметила или диэтиламинокарбонилметила, или его фармацевтически приемлемая соль.

4. Соединение по п.2, где R и R₅ означают водород; R₁ означает фенил, фторфенил, бензил или фторбензил; R₃ означает водород, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, замещенный (низш.)алкоксигруппой; R₄ означает водород или 1-метоксиэтил; R₆ и R₇ означают метил; Х означает -O-; alk означает метилен; COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира, где R₂ выбирают из (низш.)алкила, морфолинкарбонилметила, диметиламинокарбонилметила или диэтиламинокарбонилметила, или его фармацевтически приемлемая соль.

5. Способ ингибирования ангиотензинконвертирующего фермента и нейтральной эндопептидазы у млекопитающих, включающий введение млекопитающему в случае необходимости эффективного количества соединения по п.1.

6. Применение соединения формулы (I) по п.1 для получения лекарственного средства для введения млекопитающему для ингибирования ангиотензинконвертирующего фермента и нейтральной эндопептидазы для профилактики или лечения сердечно-сосудистых нарушений.

7. Применение по п.6, где сердечно-сосудистое нарушение представляет собой гипертензию, отек, удержание соли или застойную сердечную недостаточность.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении ангиотензинконвертирующего фермента и нейтральной эндопептидазы, включающая эффективное количество соединения по п.1 в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемым носителем.