Антитело против остеопонтина и его применение
Владельцы патента RU 2299888:
ИММУНО-БАЙОЛОДЖИКАЛ ЛЭБОРЭТЭРИЗ КО., ЛТД. (JP)
АСТЕЛЛАС ФАРМА ИНК. (JP)
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Описывается антитело против остеопонтина, которое ингибирует связывание интегрина и остеопонтина или его фрагмента, где интегрин распознает RGD-последовательность или последовательность SVVYGLR, SVAYGLR, SLAYGLR, SVAYGLK или SVAYRLK остеопонтина. Антитело получают при использовании в качестве антигена пептида, содержащего аминокислотную последовательность RGDSVVYGLR или родственную RGDSVVYGLR последовательность. Предложены также лекарственное средство для лечения аутоиммунного заболевания и способ лечения аутоиммунного заболевания на основе указанного антитела, где аутоиммунное заболевание выбирают из группы ревматизм, ревматоидный артрит и остеоартрит. Описано применение антитела для производства лекарственного препарата для лечения аутоиммунного заболевания, выбранного из группы ревматизм, ревматоидный артрит, остеоартрит. Использование изобретения улучшает артритный коэффициент, задерживает развитие артрита и снижает отек ног в экспериментальном артрите на мыши и может найти применение в медицине. 4 н. и 21 з.п. ф-лы, 16 ил., 13 табл.
Область техники настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к антителу против человеческого остеопонтина и к способу терапевтического лечения аутоиммунных заболеваний, ревматизма и ревматоидного артрита с использованием данного антитела.
Предпосылки изобретения
Остеопонтин (обозначенный здесь и ниже как "OPN") представляет собой кислый кальцийсвязывающий гликопротеин, обильно представленный в кости. Известно, что в природе за счет альтернативного сплайсинга генерируются три типа изоформ человеческого OPN, а именно: остеопонтин-a (обозначенный здесь и ниже как "OPN-a"), остеопонтин-b (обозначенный здесь и ниже как "OPN-b") и остеопонтин-c (обозначенный здесь и ниже как "OPN-c") (Y. Saitoh et al., (1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63). Полагают, что среди них предшественник OPN-a характеризуется аминокислотной последовательностью, показанной ниже в списке последовательностей как SEQ ID NO.1, от которой при секреции отщепляется сигнальный пептид с образованием зрелой формы OPN-a, включающей в себя I17-N314. Кроме того, зрелый OPN расщепляется тромбином биологического организма с С-концевой стороны от 168 остатка аргинина на два фрагмента, N-концевой и C-концевой.
Описанный выше OPN имеет различные физиологически, патологически значимые функции, например участвует в клеточной адгезии, миграции клеток, развитии опухолей, иммунном ответе и ингибировании опосредованного комплементом цитолиза. Различные типы рецепторов на клеточной поверхности опосредуют различные функции. OPN включает в себя RGD-последовательность (например, OPN-a содержит данную последовательность от остатка в положении 159 до остатка в положении 161). Формы интегринов, распознающие RGD-последовательность, такие как αVβ3, αVβ1 и αVβ5, являются главными рецепторами OPN; более конкретно, формы интегринов αVβ3, αVβ1 и αVβ5 опосредуют клеточную адгезию в гладкомышечных клетках сосудов. Далее, αVβ3 участвует в миграциях макрофагов, лимфоцитов, эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток и тому подобное.
Далее, в ходе исследовательских работ к настоящему моменту выявлено, что OPN также связывается посредством последовательности SVVYGLR с видами интегрина α9β1, α4β1 и α4β7, и также обнаружено различие в способе связывания, так что α4β1 связывается со всеми OPN, пока не расщепленными тромбином (OPN нерасщепленного типа), и с N-концевым фрагментом расщепленного тромбином OPN (OPN расщепленного типа), в то время как α9β1 связывается только с OPN расщепленного тромбином типа (Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334/P. M. Green et al., (2001): FEBS Letters 503, 75-79/S. T. Barry et al., (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351). Данные интегриновые субъединицы α9 и α4 или интегриновые субъединицы β1 и β7 имеют весьма сходные аминокислотные последовательности. Кроме того, формы интегрина α4β1 и α4β7 главным образом обнаружены в лимфоцитах и моноцитах, тогда как в неитрофилах данные формы интегрина экспрессированы очень слабо. Альтернативно, α9β1 высоко избирательно экспрессирован в нейтрофилах и выполняет функции, существенные для миграции нейтрофилов посредством VCAM-1 и тенасцина-С. Кроме того, интегрин также различно экспрессируется в мышечных клетках, эпителиальных клетках и клетках печени. Как описано выше, цитоплазматические домены интегринозых субъединиц α4 и α9 совместно способствуют миграции лейкоцитов в направлении очагов воспаления и их агрегации в этих очагах посредством индивидуальных путей передачи сигнала в клетке, отличающихся друг от друга, с целью усиления их активности при инфильтрации. Таким же образом интегриновые субъединицы участвуют в различных воспалительных реакциях.
Как описано выше, различные типы форм интегрина способствуют миграции лейкоцитов и таким образом участвуют в воспалительных реакциях. Поэтому фармацевтические вещества, ингибирующие данные виды активности интегринов, могут потенциально являться возможными противовоспалительными средствами. Например, интегрин αVβ3 экспрессируется в клетках-остеокластах, сосудистых эндотелиальных клетках и гладкомышечных клетках и тому подобных. Антитело против αVβ3 в настоящее время находится в процессе разработки, и оно может работать в качестве ингибитора связывания интегрина αVβ3 с различными связывающими его лигандами с потенциальным действием, направленным, например, на подавление повреждения суставов.
Поскольку рецепторы интегринового семейства обычно обнаруживаются в различных тканях, обеспечивая контроль жизненно важных функций активности, использование антител против интегрина для терапевтического лечения ревматоидного артрита и остеоартрита, возможно, может вызвать подобное ингибирование в иных участках и также может быть причиной наличия побочных реакций.
Кроме того, в WO 01/71358 описан способ скрининга на предмет вещества, ингибирующего связывание между α4-интегрином и остеопонтином, и способ терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в котором используется вещество, полученное путем такого скрининга.
Было обнаружено, что в патогенез ревматоидного артрита вносят вклад различные факторы. Так, на эту тему было опубликовано много сообщений. Однако, не все из них достоверны. Кроме того, известные в настоящее время способы его лечения являются нозотропными и, по существу, не являются удовлетворительными.
Следовательно, существует большая потребность в окончательном прояснении патогенеза ревматоидного артрита и в обеспечении более эффективного лекарственного средства для его лечения. Целью настоящего изобретения является решение данных проблем.
Кроме того, ревматоидный артрит с трудом дифференцируют от остеоартрита. Поэтому другой целью изобретения является предоставление способа его диагностики.
Описание изобретения
Авторами изобретения обнаружено, что концентрация OPN в каждой суставной жидкости больных ревматизмом и больных остеоартритом принимала более высокое значение. Кроме того, авторами изобретения впервые обнаружено повышение отношения N-концевого фрагмента расщепляемого тромбином типа в общем OPN у больных ревматизмом. Таким образом, авторы изобретения предположили, что OPN может быть глубоко вовлеченным в развитие данных заболеваний. Как описано в следующем ссылочном примере, авторы изобретения затем подтвердили эти данные в экспериментах с использованием OPN-нокаут-мышей.
Далее авторы изобретения получили антитела, которые индивидуально и дискриминаторно распознавали N-концевой фрагмент и С-концевой фрагмент из расщепленного тромбином OPN. Затем авторы изобретения обнаружили в экспериментах с данными антителами, что N-концевой фрагмент расщепленного тромбином OPN находился в более высокой концентрации, в частности, в суставных жидкостях больных ревматоидным артритом.
Авторы изобретения сфокусировали свое внимание на одновременном присутствии RGD-последовательности и последовательности SVVYGLR, обе распознаваемые интегрином человеческого типа, в N-концевом фрагменте в такой высокой концентрации, как наблюдали у больных ревматоидным артритом. Затем авторы изобретения предположили, что антитело, одновременно блокирующее обе данных последовательности будет ингибировать связывание между OPN и интегрином настолько выраженно, что данное антитело будет эффективно для терапевтического лечения ревматоидного артрита и остеоартрита.
Кроме того, OPN распределен в почках, плаценте, яичниках, головном мозге, коже и тому подобном, но главным образом экспрессирован в костной ткани. Авторы изобретения предположили, что для терапевтического лечения ревматоидного артрита предпочтительно блокировать связывание между OPN и интегрином способом, более специфичным к OPN. Поскольку разные виды интегринов сочетанно участвуют в воспалении, то авторы изобретения считают, что будет эффективным шире блокировать связывание с данными различными видами интегрина.
Поэтому авторы изобретения получили антитело, ингибирующее связывание между RGD-последовательностью человеческого OPN и интегрина и связывание между последовательностью SVVYGLR человеческого OPN и интегрина, и подтверждали его эффекты в экспериментах по клеточной адгезии и миграции клеток и тому подобному. Кроме того, авторы изобретения получали антитело против синтетических пептидов, соответствующих таким внутренним последовательностям мышиного OPN для оценки эффективности такого антитела в качестве лекарственного средства с использованием экспериментального заболевания артритом у мыши.
Более конкретно, поскольку мышиный OPN содержит последовательности RGD и SLAYGLR, распознаваемые мышиным интегрином, которые локализованы в положениях, гомологичных человеческому OPN в плане аминокислотной последовательности, антитело M5 получали в качестве антитела, одновременно блокирующего данные последовательности. Подтверждали, что связывание антитела M5 с мышиным OPN и продуктами его расщепления тромбином ингибировалось пептидом GRGDSP, включающим участок RGD, и что антитело M5 ингибировало миграцию TNF-α-активированного моноцита, выделенного из мышиной селезенки. Также наблюдали, что антитело M5 оказывало действие по подавлению повреждения кости в системе органной культуры мышиного свода черепа. Кроме того, подтверждали, что антитело оказывало очевидное терапевтическое действие при введении в экспериментальный коллагеновый артрит мыши.
Указанные выше результаты явно указывают на то, что антитело, одновременно блокирующее связывание участков последовательностей RGD и SVVYGLR с интегринами человеческого типа, ингибирует связывание между OPN и интегрином и поэтому является эффективным для терапевтического лечения ревматоидного артрита, и что данное антитело может, возможно, быть эффективным не только при ревматизме, таком как ювенильный суставный ревматизм и хронический ревматизм, но также при псориатическом артрите и псориазе. Кроме того, в хроническом отторжении после трансплантации органа обычно участвуют нарушения, связанные с сосудистыми и бронхиальными окклюзивными нарушениями. Их гистологическая оценка указывает на то, что сосудистая окклюзия, возможно, происходит по причине запуска путем активации T-клеток и макрофагов выброса цитокинов и факторов роста и нарушений клеток эндотелия сосудов, и также потому, что пролиферация гладкомышечных клеток сосудов вызывает фиброгенез и тому подобное (P. Freese et al., (2001): Nephrol Dial Transplant, 16, 2401-2406/J.R.Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88, 1429-1441/S.R.Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72, 1138-1144). Одно из сообщений указывает на то, что OPN функционирует в качестве белка, существенного для активации макрофагов и фиброгенеза гладкомышечных клеток сосудов (A. O′Regan et al., (2000): Int J Exp Pathol, 81, 373-390). Таким образом, предложенное по изобретению антитело, ингибирующее OPN, подавляет миграцию моноцита и нейтрофила, таким образом, возможно, подавляя путь к такому фиброгенезу. Так, данное антитело подавляет хроническое отторжение после трансплантации органа, с участием в результате в адгезии органа. Кроме того, антитело эффективно при терапевтическом лечении аутоиммунных заболеваний, включая системные аутоиммунные заболевания, эритему, увеит, болезнь Бехчета, множественный миозит, пролиферативный гломерулонефрит, саркоидоз и тому подобное.
Другими словами, изобретение относится к антителу против остеопонтина, ингибирующему связывание между интегрином, распознающим последовательность RGD, и OPN или его фрагментом, и также широко ингибирующего связывание между интегрином, распознающим последовательность SVVYGLR или соответствующую последовательность, и остеопонтином или его фрагментом.
Далее изобретение относится к лекарственному средству от аутоиммунных заболеваний, лекарственному средству от ревматизма и лекарственному средству от ревматоидного артрита, и данные терапевтические средства содержат в качестве эффективных ингредиентов антитело против остеопонтина.
Кроме того, изобретение относится к способу терапевтического лечения аутоиммунных заболеваний, ревматизма и ревматоидного артрита, включающему введение антитела против остеопонтина больным ревматизмом и ревматоидным артритом для ингибирования связывания между последовательностью RGD остеопонтина и интегрином и/или ингибирования связывания между последовательностью SVVYGLR и интегрином.
Кроме того, изобретение относится к средству диагностики ревматизма и способу его диагностики, в котором задействуется антитело против остеопонтина.
Краткое описание фигур
На фиг.1 показаны графики, отображающие ингибирование RGD-зависимой клеточной адгезии к OPN.
На фиг.2 показаны графики, отображающие ингибирование RGD-зависимой и RGD-независимой клеточной адгезии между nOPN и α9-траснформированной SW480 клеткой за счет 2K1.
На фиг.3a показаны графики, отображающие OPN-индуцированную миграцию клеток.
На фиг.3b показаны графики, отображающие супрессию OPN-индуцированной миграции клеток за счет антител.
На фиг.4 показаны графики, отображающие изменение во времени артритного коэффициента при индивидуальном дозировании артритогенного коктейля антитела/LPS мыши, дефективной по гену OPN, и нормальной мыши.
На фиг.5 показаны графики, отображающие сравнение отека запястья при индивидуальном дозировании артритогенного коктейля антитела/LPS мыши, дефективной по гену OPN, и нормальной мыши.
На фиг.6 показаны графики, отображающие адгезию между мышиным OPN и NIH3T3 в концентрационно-зависимой манере.
На фиг.7 показаны графики, отображающие ингибирование адгезии между мышиным OPN и NIH3T3 за счет пептида GRGDSP.
На фиг.8 показаны графики, отображающие адгезию между мышиным OPN и NIH3T3 за счет антитела M5.
Способ осуществления изобретения
Антитело против остеопонтина (обозначенное здесь и ниже "антитело, ингибирующее OPN"), ингибирующее связывание между интегрином, распознающим последовательность RGD, и OPN или его фрагментом и также ингибирующее связывание между интегрином, распознающим последовательность SVVYGLR или соответствующую последовательность, и OPN или его фрагментом, может быть любым антителом, ингибирующим связывание интегрина, распознающего последовательность RGD, например αvβ1, αvβ3 и αvβ5, с OPN-a, OPN-b, OPN-c или их N-концевым фрагментом и также ингибирующих связывание интегрина, распознающего последовательность SVVYGLR, например α9β1, α4β1 и α4β7, с OPN-a, OPN-b, OPN-c или их N-концевым фрагментом. Последовательность SVVYGLR или соответствующая ей последовательность означает то, что описано ниже: последовательность SVVYGLR означает последовательность от серина в положении 162 до аргинина в положении 168 в человеческом OPN, в то время как соответствующая ей последовательность означает соответствующую SVVYGLR последовательность в OPN других млекопитающих, которая представляет собой, например, свиную SVVYGLR, идентичную данной последовательности у людей, SVAYGLR у обезьян, SLAYGLR у мыши и крысы, SVAYGLK у крупного рогатого скота и SVAYRLK у кролика. Антитело, ингибирующее OPN, по изобретению может быть любым из антител, сохраняющих такие свойства, и способ получения данного антитела конкретно не ограничен. Антитело, ингибирующее OPN, может быть получено, например, с использованием, OPN-a, OPN-b, OPN-c или их N-концевого фрагмента или пептида, содержащего аминокислотную последовательность RGDSVVYGLR или соответствующую ей последовательность (обозначенную здесь и ниже как "относящийся к OPN пептид") в качестве антигена. Указанный здесь фрагмент OPN включает фрагменты OPN, сгенерированные путем расщепления OPN протеиназами и тому подобным, и, например, представляет собой фрагмент, полученный путем расщепления тромбином.
Ингибирующее OPN антитело предпочтительно получают путем использования пептида, содержащего в качестве антигена последовательность RGDSVVYGLR. Более предпочтительно, ингибирующее OPN антитело получают, например, путем использования в качестве антигена (VDTYDGRGDSVVYGLRS), содержащего обе последовательности, которые следуют друг за другом и начинаются от валина в положении 153 и заканчиваются серином в положении 169 в случае OPN-a, и путем последовательной обработки данного пептида по общему способу. Для повышения антигенности предпочтительно применяют продукт относящегося к OPN пептида, связанный с биополимерным соединением.
Для работ по исследованию связанных с OPN заболеваний с использованием в качестве экспериментального животного мыши, предпочтительно, применяют антитело, ингибирующее OPN, против мышиного OPN. Такое антитело предпочтительно получают путем использования пептида, содержащего последовательность RGDSLAYGLR в качестве антигена.
Примеры биополимерного соединения, подлежащего связыванию с относящимся к OPN пептидом, включают, например, геомоцианин Macroschisma (обозначенный здесь и ниже как "KLH"), овальбумин (обозначенный здесь и ниже как "OVA"), бычий сывороточный альбумин (обозначенный здесь и ниже как "BSA"), кроличий сывороточный альбумин (обозначенный здесь и ниже, как "RSA") и тиреоглобулин. Среди них более предпочтительными являются KLH и тиреоглобулин.
Относящийся к OPN пептид и биополимерное соединение связывают друг с другом вместе известными способами, например способом смешанного ангидрида кислот (B.F.Erlanger et al., (1954): J. Biol. Chem. 234, 1090-1094) или способом активированного эфира (A.E.Karu et al., (1994): J. Agric. Food Chem. 42, 301-309).
Смешанный ангидрид кислот для применения по способу смешанного ангидрида кислот может быть получен путем участия относящегося к OPN пептида в общей реакции Шоттена-Бауманна, который затем способен взаимодействовать с биополимерным соединением для получения целевого связанного продукта соединения пептид-полимер. Галогенмуравьиный сложный эфир для применения по способу смешанного ангидрида кислот, например, включает метилхлорформиат, метилбромформиат, этилхлорформиат, этилбромформиат, изобутилхлорформиат и тому подобное. Отношения пептида, галогенмуравьиного сложного эфира и полимерного соединения, подлежащие использованию по данному способу, предпочтительно выбирают в широком диапазоне.
Здесь реакцию Шоттена-Бауманна проводят в присутствии основного соединения. Основное соединение для применения в данной реакции включает соединения для рутинного использования в реакции Шоттена-Бауманна, например, органические основания, такие как триэтиламин, триметиламин, пиридин, диметиланилин, N-метилморфолин, диазабициклононен (DBN), диазабициклоундецен (DBU), диазабициклооктан (DABCO) и тому подобное, и неорганические основания, такие как карбонат калия, карбонат натрия, гидрокарбонат калия, гидрокарбонат натрия и тому подобные.
Кроме того, реакцию в основном продолжают при температуре от -20°C до 100°C, предпочтительно, от 0°C до 50°C. Время реакции составляет примерно от 5 минут до 10 часов, предпочтительно от 5 минут до 2 часов.
Реакцию между полученным в результате смешанным ангидридом кислот и биополимерным соединением в основном осуществляют при температуре от -20°C до 150°C, предпочтительно от 0°C до 100°C, при времени реакции примерно от 5 минут до l0 часов, предпочтительно от 5 минут до 5 часов. Способ смешанного ангидрида кислот, в основном, осуществляют в растворителе. Растворитель, например, включает любой из растворителей, обычно используемых для способа смешанного ангидрида кислот, конкретно включая галогензамещенные углеводороды, такие как дихлорметан, хлороформ, и дихлорэтан; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диоксан, тетрагидрофуран и диметоксиэтан; сложные эфиры, такие как метилацетат и этилацетат; апротонные полярные растворители, такие как N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид и гексаметилфосфотриамид; и тому подобные.
Альтернативно, процесс активации сложного эфира в общем проводят следующим образом. Вначале растворяя относящийся к OPN пептид в органическом растворителе для взаимодействия с N-гидроксисукцинимидом в присутствии связывающего средства, продуцируют активированный N-гидроксисукцинимидом сложный эфир.
В качестве связывающего средства могут использоваться обычные связывающие средства для рутинного применения в реакции конденсации, включая, например, дициклогексилкарбодиимид, карбонилдиимидазол и водорастворимый карбодиимид. В качестве органического растворителя альтернативно могут, например, использоваться N,N-диметилформамид (DMF), диметилсульфоксид и диоксан. Молярное соотношение пептида и связывающего средства, такого как N-гидроксисукцинимид для применения в данной реакции, предпочтительно составляет от 1:10 до 10:1, наиболее предпочтительно 1:1. Температура реакции составляет от 0°C до 50°C, предпочтительно от 22°C до 27°C, в то время как время взаимодействия составляет от 5 минут до 24 часов, предпочтительно от одного часа до 2 часов. Удовлетворительная температура реакции представляет собой температуру выше индивидуальных температур плавления и ниже индивидуальных температур кипения.
После реакции связывания реакционный раствор добавляют к раствору, в котором растворено биополимерное соединение, для взаимодействия. В случае, когда биополимерное соединение имеет свободную аминогруппу, например образуется амидная связь с кислотой между аминогруппой и карбоксильной группой пептида, температура реакции составляет от 0°C до 60°C, предпочтительно от 5°C до 40°C, и более предпочтительно, от 22°C до 27°C, в то время как время реакции составляет от 5 минут до 24 часов, предпочтительно от одного часа до 16 часов и более предпочтительно от одного часа до 2 часов.
Продукт взаимодействия между относящимся к OPN пептидом и биополимерным соединением, полученный данным способом, очищают путем диализа или на обессоливающей колонке или другим подобным образом, с целью получения продукта относящегося к OPN пептида, связанного с биополимерным соединением (просто обозначенным здесь и ниже как "связанный продукт").
Ниже теперь следует описание способа получения антитела с использованием связанного продукта, полученного таким образом, в качестве антигена и способа иммунологического анализа с использованием данного антитела. Для получения антитела здесь могут подходящим образом использоваться известные способы, которые например, описаны в Zoku Seikagaku Jikken Koza (Серии лекций по экспериментальной биохимии) и Meneki Seikagaku Kenkyu Ho (Способ исследования в иммунобиохимии) (Nihon Seikagaku Gakkai hen (Japan Biochemical Association, ed.)).
Для получения поликлонального антитела с использованием связанного продукта по изобретению животное иммунизируют связанным продуктом для получения антитела от данного животного.
Более конкретно, например, связанный продукт, такой как относящийся к OPN пептид-тиреоглобулин, вначале растворяют в натрийфосфатном буфере (обозначенном здесь и ниже как "PBS"), который затем смешивают с полным адъювантом Фрейнда или неполным адъювантом Фрейнда, или вспомогательным средством, таким как алюминиевые квасцы. Полученную в результате смесь используют в качестве иммуногена для иммунизации млекопитающего.
Любое обычно используемое в данной области животное может применяться в качестве животного для иммунизации, включая, например, мышь, крысу, кролика, козу и лошадь. Кроме того, способ дозирования иммуногена для иммунизации может представлять собой подкожную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутривенную инъекцию и внутримышечную инъекцию. Предпочтительными являются подкожная инъекция или внутрибрюшинная инъекция. Иммунизация может осуществляться единожды или много раз с подходящим интервалом, предпочтительно с интервалом от одной недели до 5 недель.
Затем по общему способу кровь собирают от иммунизированных животных и отделяют от нее сыворотку. Путем очистки фракции поликлональных антител может быть получено ингибирующее OPN антитело.
Кроме того, полученную по общему способу иммунную клетку путем иммунизации животного связанным продуктом сливают с миеломной клеткой для получения гибридомы. Путем сбора антител из культуры гибридомы можно получить ингибирующее OPN антитело в виде моноклонального антитела.
Когда антитело по изобретению предполагается к применению при терапевтическом лечении животных, включая людей, предпочтение отдается использованию химерного антитела (см. публикацию Европейского патента EP 0125023), полученного посредством модификации при помощи генной инженерии, так что полученное в результате ингибирующее OPN антитело может характеризоваться той же константной областью, что и у антитела субъекта, человека или животного, которое подлежит лечению, или использованию антитело, подвергшегося анимализации (см. публикацию Европейского патента EP 0239400 или EP 045126). В другом случае предпочтительно используют моноклональное антитело (антитело животного типа для данного вида животного) (см. публикацию Европейского патента EP 0546073 или WO 97/07671), полученное с использованием трансгенного животного с искусственно введенным геном, участвующим в получении антитела у субъекта, человека или животного, которое подлежит лечению.
В случае, когда подлежащий лечению субъект является человеком и животное, генерирующее ингибирующее OPN антитело, представляет собой мышь, предпочтительно используют человеческие-мышиные химерные антитела или гуманизированные антитела. Более предпочтительно, трансгенному животному, такому как мышь, вводят ген человека, участвующий в генерировании антител, для получения моноклонального антитела человеческого типа для последующего применения. Кроме того, способ фагового дисплея может удовлетворительно применяться для получения антител.
Ингибирующее OPN антитело, полученное таким образом, может применяться в виде Fv, Fab или F(ab′)2 с участком распознавания антитела, вырезанным из ингибирующего OPN антитела протеазой и тому подобным.
Полученное таким образом ингибирующее OPN антитело очищают далее, если необходимо, и впоследствии его включают в дозированные формы по основному способу, для применения при терапевтическом лечении ревматоидного артрита, ревматизма, такого как ювенильный суставный ревматизм и хронический ревматизм, псориатический артрит и псориаз; при подавлении хронических отторжений после трансплантации органов; и при терапевтическом лечении аутоиммунных заболеваний, таких как системные аутоиммунные заболевания, эритемы, увеит, болезнь Бехчета, множественный миозит, клубочковый пролиферативный нефрит и саркоидоз.
Ингибирующее OPN антитело по изобретению предпочтительно может использоваться в качестве лекарственного средства от ревматизма или лекарственного средства от ревматоидного артрита. Примеры дозированных форм данных терапевтических средств от ревматизма и тому подобного включают парентеральные формы, такие как инъекции и инфузии, которые предпочтительно дозируют путем внутривенной инъекции и подкожной инъекции (для применения в качестве лекарственного средства от аутоиммунных заболеваний должны последовать описанные выше примеры). Для препарата также дополнительно могут применяться фармацевтически приемлемые носители и добавки в фармацевтически приемлемом интервале в зависимости от дозированной формы.
Количество ингибирующего OPN антитела, подлежащего добавлению в препарат, варьируется в зависимости от тяжести симптомов и возраста больного, используемой дозированной формы препарата или титра связывания ингибирующего OPN антитела или тому подобного. Например, удовлетворительно может быть использовано количество примерно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг.
Поскольку ингибирующее OPN антитело в качестве эффективного ингредиента полученного таким образом лекарственного средства по изобретению прочно связывается с последовательностями RGD и SVVYGLR в OPN, ингибирующее OPN антитело возможно ингибирует связывание между данными областями OPN и интегрином для последующего подавления обострения симптомов ревматизма и ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний.
Поскольку ингибирующее OPN антитело по изобретению специфично связывается со стороны OPN, а не со стороны интегрина, данное антитело в принципе не может ингибировать другие значимые функции интегрина, так что ожидается, что можно будет избежать неблагоприятных побочных эффектов.
Кроме того, ингибирующее OPN антитело по изобретению может также применяться для целей скрининга лекарственного средства против аутоиммунных заболеваний. Как описано здесь, соединение, ингибирующее связывание между RGD-последовательностью OPN и интегрином и ингибирующее связывание между SVVYGLR-последовательностью OPN и интегрином, возможно, является терапевтическим средством от аутоиммунных заболеваний. Таким образом, применимость вещества, подлежащего скринингу (тестовое вещество) в качестве лекарственного средства против аутоиммунных заболеваний может оцениваться в реакционной системе, полученной путем добавления тестового вещества и ингибирующего OPN антитела в конкурентной манере в систему анализа, в присутствии заданных количеств OPN и интегрина, с целью анализа степени ингибирования связывания между OPN и интегрином по сравнению с используемым количеством ингибирующего OPN антитела.
Сходным образом, соединение, ингибирующее связывание между RGD-последовательностью OPN и интегрином и ингибирующее связывание между SVVYGLR-последовательностью и интегрином, возможно, служит в качестве лекарственного средства от ревматизма и ревматоидного артрита. Раз ингибирующее OPN антитело применяют для составления той же реакционной системы, что описана выше, то данная реакционная система может использоваться для скрининга ревматизма и ревматоидного артрита.
Ингибирующее OPN антитело по изобретению может далее использоваться в качестве средства диагностики ревматизма. Как описано выше, было продемонстрировано, что высокая концентрация N-концевого фрагмента расщепленного тромбином OPN особо хорошо обнаруживается в артрозе больного ревматоидным артритом. Таким образом, тест на OPN или его N-концевой фрагмент в образце с использованием ингибирующего OPN антитела может служить для диагностики ревматизма. В качестве способа данного тестирования могут использоваться следующие различные способы для применения в качестве способов общего иммунохимического анализа [″Hybridoma Method and Monoclonal Antibody″, издано R&D Planning KK., с.30-53, март 5, 1982]: радиоиммунологический анализ (RIA), ELISA (E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439), способ флуоресцентного антитела, способ бляшкообразования, спот-способ, способ агрегации, тест по Оухтерлони и тому подобное.
Способ может быть подходящим образом выбран, исходя из различных положений. В плане чувствительности, простоты и тому подобного предпочтительным является ELISA. Данный способ более предпочтительно включает иммобилизацию ингибирующего OPN антитела по изобретению на носителе и мечение антитела, распознающего участок OPN, отличный от такового для ингибирующего OPN антитела по изобретению, с целью определения OPN или его N-концевого фрагмента. Таким образом, такой способ определения может использоваться для средства для диагностики ревматоидного артрита.
Вещество для мечения, применяемое при мечении антител, включает ферменты, такие как пероксидаза хрена (здесь и далее обозначенная "HRP"), щелочная фосфатаза (здесь и далее обозначенная "AP") и тому подобные, флуоресцентные вещества, такие как флуоресцеинизоцианат и родамин и подобные, радиоактивные вещества, такие как 32P, 125I и подобные, хемилюминесцентные вещества и тому подобное. Ниже описана процедура сэндвич-метода, как одного из более специфичных способов определения изоформ OPN. Конкретно, данная процедура включает первую стадию (a) иммобилизации антитела против изоформы OPN по изобретению на носителе, вторую стадию (b) блокирования поверхности носителя с иммобилизованным на ней антителом материалом, не относящимся к антигену, например белком. Процедура далее включает стадию (c) добавления к полученной в результате смеси образца, содержащего различные концентрации изоформы OPN, для получения комплекса изоформы OPN с антителом, стадию (d) последующего добавления меченого антитела против изоформы OPN для того, чтобы данное антитело могло связаться с иммобилизованным комплексом антиген-антитело, и конечную стадию (e) анализа количества метки, связанной с носителем для определения количества свободной изоформы OPN в образце, основанной на полученной ранее стандартной кривой.
Носитель, применяемый на стадии (a) для иммобилизации антитела, включает в качестве не ограниченных конкретно примеров любые носители для рутинного использования по способам иммунохимического анализа. Носитель может, например, включать полистирольные 96-луночные планшеты для микротитрования со связанными аминогруппами. Для дальнейшей иммобилизации антитела буфер, содержащий антитело, подходящим образом добавляют к носителю и инкубируют с ним. В качестве буфера могут использоваться известные буферы, одним из которых, например, является 10 мМ PBS. Концентрация антитела в буфере может быть выбрана из широкого интервала, но главным образом подходящая концентрация примерно составляет от 0,01 до 100 мкг/мл и предпочтительно от 0,1 до 20 мкг/мл. Кроме того, количество буфера составляет 300 мкл на лунку или менее и предпочтительно примерно от 20 до 150 мкл на лунку, где в качестве носителя используют 96-луночную планшету для микротитрования. Далее, условия инкубации включают в качестве неограниченных конкретно примеров инкубацию в течение ночи примерно при 4°C, что в общем является подходящим.
На стадии (b) блокирования блокирование далее осуществляется с целью предотвращения неспецифической адсорбции на носитель, поскольку часть веществ, возможно, способных адсорбироваться на носитель, несмотря на то, что они не имеют отношения к взаимодействию антиген-антитело, может потенциально существовать с OPN в образце, подлежащем добавлению на следующей стадии. В качестве блокирующего средства, например, могут использоваться раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) и сухого молока. С другой стороны, могут использоваться коммерчески доступные блокирующие средства, такие как Block-Ace (производимый Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.; Code No. UK-25B). В конкретном, но неограничивающем примере блокирование проводят путем добавления подходящего объема Block-Ace к части с иммобилизованным антигеном для инкубации в течение ночи примерно при 4°C и ополаскивания полученной в результате части буфером. Буфер включает в качестве конкретно не ограничивающего примера буфер с композицией 10 мМ PBS, pH 7,2, 0,8% (мас./об.) NaCl, 0,02% (мас./об.) KCl и 0,02% (об./об.) Tween 20.
Затем, на стадии (c), образцу, содержащему изоформу OPN, дают возможность контактировать с иммобилизованным антителом для захвата изоформы OPN иммобилизованным антителом и получения комплекса иммобилизованного антитела с изоформой OPN. Без ограничений, реакцию проводят примерно при 37°C примерно в течение одного часа. По окончании реакции носитель ополаскивают буфером для удаления непрореагировавшего белка и тому подобного. В качестве буфера, используемого в данной реакции, предпочтительным является 10 мМ PBS, pH 7,2 и 0,05% (об./об.) Tween 20.
Далее на стадии (d) комплекс иммобилизованное антитело-изоформа OPN-меченое антитело образуется путем добавления меченого антитела, распознающего другой эпитоп изоформы OPN, захваченной иммобилизованным антителом. По окончании реакции носитель предпочтительно ополаскивают буфером для удаления непрореагировавшего белка и тому подобного. Буфер, описанный для стадии (c), применяют в качестве буфера для реакции.
Меченое антитело, подлежащее использованию на стадии (d) требуется для распознавания эпитопа, отличного от эпитопа, распознаваемого иммобилизованным антителом на стадии (a). Когда, например, в качестве иммобилизованного антитела используется поликлональное антитело, распознающее домен первой половины изоформы OPN, в качестве антитела, меченного связанным ферментом (например, HRP или AP и тому подобным), применяют поликлональное антитело, распознающее домен второй половины изоформы OPN. Применение таких антител, распознающих различные участки, как описано выше, обеспечивает высокочувствительный, специфичный анализ изоформы OPN, сгенерированной путем альтернативного сплайсинга.
Количество подлежащего использованию на стадии меченого антитела предпочтительно примерно в 5000-10000 раз превышает количества иммобилизованного антитела, связанного с носителем. Желательно, чтобы для реакции применялось меченое антитело, разведенное предпочтительно до значения поглощения конечного пика от 1,5 до 2,0 в конечном анализе. Для такого разведения могут использоваться буферы, при этом реакция предпочтительно проводится примерно при 37°C примерно в течение 30 минут, с последующим ополаскиванием буферами по окончании реакции. Но реакция не ограничивается такими условиями. Описанные выше реакции способствуют связыванию комплекса антитело-изоформа OPN-меченое антитело с носителем.
Наконец, на стадии (e) раствор хромогенного субстрата, взаимодействующий с веществом-меткой в комплексе антитело-изоформа OPN-меченое антитело, добавляют для измерения поглощения с целью вычисления количества OPN на основе стандартной кривой.
Когда в качестве вещества-метки для мечения антитела используют фермент пероксидазу, может, например, применяться хромогенный субстрат, содержащий пероксид водорода и 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) или o-фенилендиамин (OPD). Без конкретных ограничений, хромогенную реакцию проводят путем добавления раствора хромогенного субстрата для взаимодействия примерно при 25°C примерно в течение 20 минут, и последующего добавления 1Н серной кислоты для окончания ферментативной реакции. В случае, когда используют TMB, развитие хромогенной реакции оценивают на основе поглощения при 450 нм. В случае, когда в качестве вещества-метки альтернативно используют фермент AP, подходящий способ включает хромогенную реакцию с использованием п-нитрофенилфосфорной кислоты (pNPP) в качестве субстрата, добавление 2Н NaOH для окончания ферментативной реакции и измерение поглощения при 415 нм.
С применением стандартной кривой, предварительно полученной на основе поглощения реакционного раствора с добавлением известных концентраций изоформы OPN, может быть рассчитана концентрация изоформы OPN в образце.
Способ определения изоформ OPN по изобретению применяют для выяснения функций OPN и для диагностики и терапевтического лечения заболеваний, за которые отвечает OPN. Один из примеров применения данного способа включает набор для определения воспалительных нарушений, по которым, например, могут отличаться ревматизм и ревматоидный артрит, набор, действующий для отдельного определения N-концевого фрагмента расщепленного тромбином OPN и OPN нерасщепленного типа, причем таким образом детектируется наличие или отсутствие любых воспалительных нарушений.
Как описано выше, N-концевой фрагмент расщепленного тромбином OPN вероятно наблюдается в высокой концентрации в суставных полостях больных, в частности, ревматоидным артритом. У больных остеоартритом данная тенденция, однако, выражена существенно меньше. Как описано выше, отношение N-концевого фрагмента к общему OPN в суставной полости варьируется у разных больных. Поэтому для дифференциальной диагностики ревматизма и остеоартрита подходящим может являться измерение отношения N-концевого фрагмента к общему OPN.
Как в более конкретном примере, должны быть получены антитела против индивидуальных пептидов всех трех изоформ OPN, а именно OPN-a, OPN-b и OPN-c.
CVDTYDGRGDSVVYGLRS
(C+от V153 до S169)(1)
KSKKFRRPDIQYPDATDEC
(от K170 до E187+C) (2)
IPVKQADSGSSEEKQC
(от I17 до Q31+C) (3)
Среди них последовательность (1) присутствует с N-концевой стороны от участка, расщепленного тромбином, и обычно присутствует в полноразмерном OPN не расщепленного тромбином типа и в N-концевом фрагменте. Альтернативно, последовательность (2) присутствует с С-концевой стороны от участка, расщепленного тромбином, и присутствует в полноразмерном OPN не расщепленного тромбином типа, но никогда не содержится в N-концевом фрагменте. Далее, последовательность (3) соответствует аминокислотным остаткам в положениях от 17 до 31 с N-концевой стороны OPN и обычно присутствует в полноразмерном OPN не расщепленного тромбином типа и в N-концевом фрагменте. Набор для дифференциальной диагностики больных ревматизмом и остеоартритом может состоять из двух типов реагентов для иммуноопределения, в которых используются антитела, соответствующие трем индивидуальным типам последовательностей. Другими словами, первый реагент иммуноопределения, в котором использованы два типа антител против пептидов, представленных последовательностями (3) и (2) действует при анализе OPN не расщепленного тромбином типа, обычно распознаваемого обоими антителами в образце. Тогда определение может осуществляться тем же способом, что при выполнении сэндвич-метода, который включает, например, иммобилизацию антитела против пептида последовательности (3) на носителе, взаимодействие антитела с образцом от больного, отмывку носителя и последующее добавление антитела против пептида последовательности (2) в качестве антитела-метки. Кроме того, в случае второго реагента иммуноопределения два антитела против пептидов, представленных последовательностями (1) и (3), используют для анализа общего OPN не расщепленного тромбином типа и N-концевого фрагмента, генерированного путем расщепления тромбином в образце, которые обычно распознаются обоими антителами. В таком случае определение можно осуществлять тем же способом, как и при сэндвич-методе, который включает, например, иммобилизацию антитела против пептида последовательности (2) на носителе, взаимодействие антитела с образцом от больного, отмывку носителя и последующее добавление антитела против пептида последовательности (3) в качестве антитела-метки. Впоследствии результаты анализа образца от того же больного с двумя типами реагентов для иммуноопределения сравнивают друг с другом для выяснения отношения генерированного путем расщепления тромбином N-концевого фрагмента к общему OPN больного, что позволяет отличать ревматизм от остеоартрита.
Примеры
Теперь данное изобретение будет более подробно описано следующими примерами и контрольным примером. Однако изобретение не ограничено данными примерами.
Пример 1
Клонирование, конструирование, очистка и реагенты для белка слияния GST-OPN
Клонирование и очистку по существу проводили по способу, описанному в ссылке (S. Kon et al., (2000): J. Cell. Biochem. 77: 487-498).
кДНК человеческих изоформ OPN, т.е., OPN-a и OPN-b, получали следующим образом. С использованием РНК, полученной из клеток клеточной линии рака почки человека NRC-12 в качестве матрицы синтетическим путем получали кДНК; с использованием кДНК в качестве матрицы проводили PCR с использованием праймеров OPN-5 и OPN-3 для получения кДНК, кодирующих полноразмерные OPN-a и OPN-b человека, отдельно включающие соответствующие сигнальные пептидные области.
Затем способом, описанным в ссылке, клонированные таким образом кДНК OPN-a и OPN-b встраивали в вектор pGEX4T (Amersham Pharmacia Biotech, Токио, Япония), так что кДНК могли находиться в той же рамке считывания, что и ген GST (глутатион-S-трансфераза; EC2.5.1.18) для экспрессии в виде белка слияния с GST с использованием Escherichia coli JM109 (полученные таким образом белки слияния обозначены здесь и ниже как "GST-OPN-a" и "GST-OPN-b").
OPN-5:
5'-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3'
OPN-3:
5'-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3'
кДНК, кодирующую человеческую изоформу OPN-c получали путем двухстадийной PCR с использованием кДНК OPN-a в качестве матрицы. На первой стадии PCR проводили индивидуально с использованием OPN-5 и следующего праймера OPNct-3 или следующего OPNct-5 и праймера OPN-3; полученные в результате два PCR-продукта смешивали, подвергали термической обработке и постепенно охлаждали для отжига с последующим добавлением фермента для продления. На второй стадии, впоследствии, проводили PCR с использованием праймеров OPN-5 и OPN-3 для получения кДНК, кодирующей полноразмерный человеческий OPN-c, включающий сигнальную пептидную область. кДНК изоформы c интегрировали в вектор pGEX4T тем же способом, что и для изоформ a и b для получения белка слияния с GST (описанным здесь и ниже как "GST-OPN-c").
OPNct-3:
5'-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3'
OPNct-5:
5'-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3'
кДНК, кодирующую половину с N-концевой стороны (M1-R168) от участка расщепления тромбином OPN-a, получали путем PCR с использованием кДНК OPN-a в качестве матрицы и OPN-5 вместе со следующим праймером OPNnh-3, описанным ниже. Тем же способом, что для изоформ a и b, полученная в результате кДНК была интегрирована в вектор pGEX4T для получения GST-белка (обозначен здесь и ниже как "GST-Nhalf").
OPNnh-3:
5'-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3'
Белок остеопонтин (С-концевая половина hOPN) с карбоксильной стороны от участка расщепления тромбином OPN-a получали путем двухстадийной PCR с использованием кДНК OPN-a в качестве матрицы. На первой стадии проводили PCR отдельно с использованием OPN-5, следующим праймером OPNch-3, следующим OPNch-5 и праймером OPN-3. На второй стадии PCR проводили с использованием праймеров OPN-5 и OPN-3 с получением белка OPN с карбоксильной стороны. Тем же способом, что и для изоформ a и b, рекомбинация в вектор pGEX4T позволяет получить GST-белок (обозначен здесь и ниже как "GST-Chalf").
OPNch-3:
5'-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3'
OPNch-5:
5'-CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3'
Различные рекомбинантные белки слияния GST-OPN получали в Escherichia coli обычным способом и затем их очищали с использованием колонки с глутатион-сефарозой по способу, описанному в ссылке. Среди них белок GST-Nhalf расщепляли в участке связывания посредством протеазы Prescission (PreScission; Amersham Pharmacia Biotech, Токио, Япония) для удаления группы белка GST и таким образом получали белок (обозначенный здесь и ниже как "nOPN"), состоящий только из N-концевой половины (I17-R168) одного OPN.
Альтернативно, кДНК, кодирующую полноразмерный OPN-a (M1-N314) далее встраивали в вектор pcDNA3.1 (+) (Invitrogen Corporation) для трансфекции в клетку CHO-K1 (производства Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (обозначена здесь и ниже как "клетка CHO/OPN-a"). OPN-a связанного с сахаром типа (обозначен здесь и ниже как "CHO/OPN-a"), полученный из клеток, очищали следующим образом. Конкретно, культуральную надосадочную жидкость клетки CHO/OPN-a подвергали ионообменной колоночной хроматографии с использованием колонки DEAE-Sepharose CL-6B (Amersham Pharmacia Biotech, Токио, Япония) и хроматографии гель-фильтрацией на колонке Ultrogel AcA44 (производства BioSepra SA), и длительно обращенно фазовой хроматографии на колонке RESOURCE RPC (Amersham Pharmacia Biotech, Токио, Япония). Таким образом завершали очистку.
Различные пептиды, полученные от Sigma Genosis-Япония, использовали для исследовательских работ по иммунологической сенситизации и связыванию; в других случаях, пептиды получали путем химического синтеза по способу с использованием Fmoc (N-(9-флуоренил)метоксикарбонила) на пептидном синтезаторе (модель 432 A; производства PerkinElmer Life Science, Inc.) и очистки путем обращенно фазовой хроматографии на колонке C18.
Пример 2
Продукция моноклонального антитела
Получали синтетические пептиды, соответствующие внутренним последовательностям человеческого OPN, как описано выше, и применяли их для иммунизации.
Пептид 1:
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C + от V153 до S169)
Пептид 2:
CIDSQELSKVSREFHSH (C + от I261 до H276)
Конкретно, пептид 1 содержит последовательности RGD и SVVYGLR, распознающие интегриновые рецепторы αvβ3 и α9β1, соответственно.
Данные пептиды связывали с тиреоглобулином и использовали результат для иммунизации мышей по основному способу. Затем из иммунизированных мышей выделяли клетки селезенки, которых затем подвергали клеточному слиянию с клетками мышиной миеломы P3-X63-Ag8-653 с использованием полиэтиленгликоля. По способу, описанному в ссылке (M. Kinebuchi et al., (1991): J. Immunol., 146, 3721-3728) отбирали гибридому, взаимодействующую с каждым из пептидов, использованных для иммунизации.
От мышей, иммунизированных пептидами 1 и 2, получали моноклональные антитела, обозначенные 2K1 и 4C1 соответственно. Гибридому, генерирующую моноклональное антитело 2K1, помещали как FERM BP-7883 в Patent Organism Depository Center, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Япония) 20 июня 2001 г. Кроме того, моноклональное антитело 53 (mAb53) получали путем иммунизации полноразмерным рекомбинантным человеческим OPN (D.S.Bautista et al., (1994): J. Biol. Chem., 269, 23280-23285).
Пример 3
Реактивность OPN и продуктов его расщепления тромбином с моноклональными антителами
Связывающие возможности моноклональных антител 2K1 и 4C1, полученных в примере 2 против OPN и продуктов его расщепления тромбином тестировали способом вестерн-блоттинга. Обнаружено, что антитело 2K1 взаимодействовало с GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c и GST-Nhalf. Антитело 4C1 взаимодействовало с GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c и GST-Chalf. Далее, данные моноклональные антитела связывались не только с рекомбинантными OPN не связанного с цепью сахарида типа, полученными в Escherichia coli, но также взаимодействовали и с белком CHO/OPN-a связанного с цепью сахарида типа и продуктами его расщепления тромбином (обозначены здесь и далее как "расщепленные тромбином OPN").
Пример 4
Ингибирование клеточной адгезии к OPN посредством моноклональных антител
Следующим способом оценивали, ингибируют или нет моноклональные антитела клеточную адгезию к OPN. Вначале 96-луночный планшет предварительно покрывали различными концентрациями CHO/OPN-a в течение ночи при 4°C и затем его обрабатывали 0,5% BSA в PBS при условиях 37°C в течение 10 минут так, чтобы заблокировать неспецифическую адгезию. Клетку человеческого фибробласта TIG-7 или SW480, трансформированную кДНК интегриновой субъединицы α9 (обозначена здесь и далее как "трансформированная α9 клетка SW480") суспендировали в D-MEM, содержащей 0,25% BSA; 200 мкл полученной в результате клеточной суспензии (в концентрации клеток 5×104 клеток на лунку) наносили на 96-луночный планшет, предварительно покрытый CHO/OPN-a или nOPN, в присутствии или отсутствии различных концентраций моноклональных антител или синтетических пептидов для инкубации при 37°C в течение одного часа.
Культуральную среду отбирали из планшета и все лунки дважды ополаскивали D-MEM, содержащей 0,25% BSA. Прилипшие клетки фиксировали и окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым в 20% метаноле в течение 30 минут.
Все лунки три раза ополаскивали водой и затем солюбилизировали прилипшие клетки 20% уксусной кислотой. Полученную в результате надосадочную жидкость, полученную из каждой лунки, анализировали устройством для считывания с иммунологических планшетов с целью измерения поглощения при 590 нм для определения относительного счета клеток, прилипших на лунку. Все данные анализы проводили в трех параллелях и осуществляли по крайней три независимых эксперимента. Показанные значения представляли среднее от трех независимых экспериментов.
Известно, что TIG-7 в высокой степени адгезируют к OPN, но, как показано на фиг.1A, адгезия явственно ингибировалась пептидом GRGDSP (100 мкг/мл), но не ингибировалась контрольным пептидом (C-концевая область K296-N314 в OPN) (100 мкг/мл). Таким образом, адгезия является зависимой от RGD. Как показано на фиг.1B далее, антитело 2K1 в концентрации 200 мкг/мл явственно ингибировало клеточную адгезию к OPN. Как показано еще далее на фиг.1С, действие 2K1 на ингибирование клеточной адгезии сравнимо с действием, проявляемым mAb53 и является концентрационнозависимым. Кроме того, 2K1 и mAb53 никогда не ингибировали адгезию клетки TIG-7 на витронектин (VN) или фибронектин (FN).
На фиг.2 обозначено ингибирование моноклональными антителами адгезии nOPN и витронектина на трансформированную α9 клетку SW480. Как показано на фиг.2A, адгезия между 1 мкг/мл витронектина и трансформированной α9 клеткой SW480 ингибировалась 200 мкМ пептида GRGDSP (RGD), так что адгезия зависела от RGD. Адгезия трансформированной α9 клетки SW480 на 3 мкг/мл nOPN ингибировалась комбинацией 200 мкМ GRGDSP и моноклонального антитела Y9A2 против α9β1 (A. Wang et al., (1996): Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15, 664-672), так что данная адгезия является RGD-зависимой и RGD-независимой. В дополнение, на фиг.2B показано действие 2K1 на адгезию трансформированной α9 клетки SW480 на nOPN и витронектин. Адгезия между трансформированной α9 клеткой SW480 и витронектином никогда не ингибировалась 2K1, но адгезия между клеткой SW480 и nOPN ингибировалась 2K1. Следовательно, это указывало на то, что 2K1 сохраняет эффективность в ингибировании RGD-зависимой адгезии.
Пример 5
Ингибирование индуцированной OPN миграции моноцитов моноклональными антителами
Тест миграции клеток с использованием клетки U937 проводили с использованием системы ChemoTx101-8 (Neuro Probe Inc.). Клетки доводили до 2×106 клеток/мл D-MEM, содержащей 0,1% BSA, и затем наносили их на верхний слой на фильтр (с размером пор 8 мкм), в то время как белок OPN добавляли на нижний слой.
Планшет ChemoTx оставляли инкубироваться в присутствии 5% CO2 при 37°C в течение 4 часов. После того, как планшет оставляли инкубироваться, фильтр фиксировали метанолом и затем окрашивали гематоксилином и эозином (H-E). Число клеток, мигрирующих на заднюю сторону фильтра подсчитывали под микроскопом (умножение ×400). Тест проводили в трех параллелях и среднее значения использовали в данных. Результаты показаны на фиг.3.
На фиг.3a показана миграция клетки U937 в направлении CHO/OPN-a, расщепленного тромбином OPN и GST-Nhalf, в показанных концентрациях. Кроме того, на фиг.3b показаны анализы ингибирования с использованием индивидуальных OPNs в концентрации 10 мкг/мл, в присутствии или отсутствии 50 мкг/мл 2K1, mAb53 или контрольного мышиного IgG после антигенспецифической очистки.
Как показано на фиг.3a и 3b, CHO/OPN-a, расщепленный тромбином OPN и GST-Nhalf индуцируют миграцию человеческого моноцита U937 в концентрационнозависимой манере (A). Антитело 2K1 явно ингибирует миграцию моноцитов, индуцированную CHO/OPN-a, расщепленным тромбином OPN и GST-Nhalf. Наоборот, только mAb53 ингибирует миграцию моноцитов, индуцированную полноразмерным OPN (B).
Контрольный пример 1
Индукция OPN и артрита
Для оценки функции OPN при артрите дефективную по гену OPN мышь (S. R. Rittling et al., (1998): J. Bone and Mminer. Res., 13 (7), 1101-1111) получали искусственно по основному способу для экспериментов сравнения с нормальной мышью.
Артритогенный коктейль моноклональных антител, коммерчески доступный в качестве вещества, вызывающего артрит (под торговым названием коктейля для артрита Arthrogen-CIA® mAb, коктейля артритогенных mAb; производство Iwai Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.), индивидуально вводили дефективной по гену OPN мыши (OPN-/-) и нормальной мыши (OPN+/+) по руководящей инструкции, прилагаемой к продукту для индукции артрита. Затем наблюдали тяжесть заболевания. Для контроля мышам двух типов вводили физиологический солевой раствор.
Сравнение тяжести артрита осуществляли на основе артритного коэффициента по следующему стандарту и отеку запястий на 10 сутки после дозирования. Результаты показаны на фиг.4 и 5.
Как ясно видно на фиг.4, нормальная мышь, получившая дозу коктейля артритогенных антител/липополисахарида (обозначен здесь и далее как "LPS"), характеризовалась повышением артритного коэффициента на 4 сутки и после этого, пока на 10 сутки коэффициент не достигал максимума (12 или более). Альтернативно, артритный коэффициент у мыши, дефективной по гену OPN, повышался на 5 сутки и после этого, однако данный коэффициент максимально составлял только 4 или менее. Кроме того, любая из групп, получавших дозу физиологического солевого раствора, не характеризовалась повышением артритного коэффициента.
Как показано далее на фиг.5, отек запястий является явственно слабым у мыши, дефективной по гену OPN, по сравнению с обычной мышью, что ясно указывает на участие OPN в развитии артрита.
Пример 6
Ингибиторная активность антитела 2K1 в отношении миграции человеческих периферических лейкоцитов
Следующим способом оценивали ингибиторную активность антитела 2K1 в отношении миграции активированных цитокинами периферических лейкоцитов. На таблице 1 показаны результаты ингибиторной активности в отношении миграции нейтрофилов, тогда как на таблице 2 показаны результаты ингибиторной активности на миграцию моноцитов.
<Экспериментальный способ>
По способу фиколла из нормальной периферической крови человека выделяли фракцию моноцитов и фракцию нейтрофилов (P.M.Daftarian et al., (1996): Journal of Immunology, 157, 12-20). Промежуточный слой между фиколлом и сывороткой собирали и культивировали во флаконе при 37°C в течение одного часа. Полученные в результате связанные клетки использовали в качестве моноцитов. К эритроцитарному слою, оставшемуся после сбора фракции моноцитов, добавляли 5-кратный объем 3% декстрана-PBS для агрегации эритроцитов с последующим центрифугированием при 150×g и 4°C в течение 5 минут.
Агрегированные эритроциты осаждали, в то время как в полученной в результате надосадочной жидкости существовали в суспендированном состоянии нейтрофилы. Затем данную фракцию центрифугировали при 500×g и комнатной температуре в течение 20 минут для получения нейтрофилов. Моноциты и нейтрофилы, полученные таким образом, культивировали в течение ночи с человеческим TNF-α(20 нг/мл) для активации. Затем полученные в результате активированные моноциты и нейтрофилы использовали для экспериментов по миграции.
Эксперименты по миграции проводили с использованием 48-луночной камеры для микрохемотаксиса (производства Neuro Probe Inc.). После того, как к расщепленному тромбином OPN добавляли различные концентрации антитела 2K1 и их предварительно оставляли инкубироваться при 37°C в течение 15 минут, данные смеси добавляли в нижнюю камеру (до конечной концентрации человеческого OPN, равной 10 мкг/мл). Поместив на него поликарбонатный фильтр (размер пор 5 мкм), далее добавляли суспензию клеток объемом 50 мкл в верхнюю камеру (2×106 клеток/мл).
После культивирования в присутствии 5% CO2 при 37°C в течение 2 часов, поликарбонатный фильтр удаляли с целью удаления клеток с верхней поверхности фильтра; впоследствии клетки, инфильтрировавшие заднюю поверхность фильтра, окрашивали Diff-Quick (производство Baxter, International Inc.). Окрашенные клетки подсчитывали при умножении × 40. Результаты показаны в виде среднего количества клеток (клеток/мм3) ± стандартное отклонение по 6 лункам.
<Результаты эксперимента>
Антитело 2K1 ингибировало миграцию активированных TNF-α(человеческих периферических нейтрофилов и моноцитов в направлении расщепленного тромбином OPN.
| Ингибирование миграции нейрофилов | ||
| Таблица 1 | ||
| Концентрация расщепленного тромбином OPN (мкг/мл) | Концентрация 2K1 (мкг/мл) | Среднее количество мигрирующих клеток на 1 мм3 |
| 0 | 0 | 400,0±67,8** |
| 10 | 0 | 581,7±67,1 |
| 10 | 0,4 | 566,7±60,2 |
| 10 | 2 | 550,0±49,0 |
| 10 | 10 | 450,0±90,8** |
| 10 | 50 | 426,7±30,8** |
| ** P<0,01(односторонний ANOVA, тест Dunnett). | ||
| Ингибирование миграции моноцитов | ||
| Таблица 2 | ||
| Концентрация расщепленного тромбином OPN (мкг/мл) | Концентрация 2K1 (мкг/мл) | Среднее количество мигрирующих клеток на 1 мм3 |
| 0 | 0 | 58,3±50,8** |
| 10 | 0 | 285,0±49,3 |
| 10 | 0,4 | 258,0±71,9 |
| 10 | 2 | 256,7±66,5 |
| 10 | 10 | 160,0±56,9** |
| 10 | 50 | 75,0±55,4** |
| ** P<0,01(односторонний ANOVA, тест Dunnett). |
Пример 7
Получение антитела M5
Следующий синтетический пептид, соответствующий внутренней последовательности (C + от V138 до R153) мышиного OPN получали для применения при иммунизации.
Пептид M5:
CVDVPNGRGDSLAYGLR
Пептид связывали с тиреоглобулином для последующего применения для иммунизации кроликов по основному способу. Антисыворотку собирали от иммунизированного кролика для получения антитела M5 с использованием колонки, упакованной гранулами тиолсефарозы со связанным посредством дисульфидной связи за N-концевой цистеин пептидом M5 (Amersham Pharmacia Biotech, Токио, Япония).
Пример 8
Реакционная способность антитела M5 с OPN и продуктами его расщепления тромбином
Связывающую способность антитела M5, полученного по примеру 7, с OPN и продуктами его расщепления тромбином тестировали способом вестерн-блоттинга. Рекомбинантный мышиный OPN в гликозилированной форме, сгенерированный в клетках CHO, использовали в качестве OPN. Антитело M5 взаимодействовало с OPN и продуктами его расщепления тромбином.
Пример 9
Ингибирование клеточной адгезии на OPN посредством антитела M5
Способом, описанным в ссылке (S. Kon et al., (2002): J. Cell. Biochem., 84(2), 420-432) оценивали, может или нет антитело M5 ингибировать клеточную адгезию на OPN. В качестве OPN использовали полноразмерный мышиный OPN, из которого предварительно удаляли группу GST посредством протеазы PreScission (Amersham Pharmacia Biotech, Токио, Япония) (обозначен здесь и далее как "mOPN/de-GST"). В качестве клетки использовали мышиную клетку NIH3T3.
Как показано на фиг.6, клетка NIH3T3 прилипала к mOPN/de-GST в концентрационнозависимой манере. Как показано на фиг.7 далее, адгезия явственно ингибировалась пептидом GRGDSP (100 мкг/мл), так что адгезия зависит от RGD. Как показано на фиг.8, антитело M5 в концентрации 200 мкг/мл явственно ингибировало клеточную адгезию к OPN.
Пример 10
Ингибиторная активность антитела M5 в отношении миграции моноцитов, выделенных из мышиной селезенки
Ингибиторную активность антитела M5 в отношении миграции активированных цитокином моноцитов, выделенных из мышиной селезенки, оценивали следующим способом. Результаты показаны в таблице 3.
<Экспериментальный способ>
Спленоциты из мыши C57BL/6 помещали путем предметного стекла в одну ячейку, которую затем культивировали во флаконе при 37°C в течение одного часа. Полученные в результате прилипающие клетки использовали в качестве моноцитов. Моноциты культивировали в течение ночи и активировали человеческим TNF-α (20 нг/мл). Полученные в результате активированные моноциты использовали в эксперименте по миграции. Эксперимент по миграции проводили тем же способом, что и для человеческого образца в примере 6 выше.
<Результаты эксперимента>
Антитело M5 ингибировало миграцию активированных TNF-α моноцитов, выделенных из мышиной селезенки в направлении мышиного OPN расщепленного тромбином типа, полученного путем расщепления полноразмерного мышиного OPN (производства Genzyme Corporation) бычьим тромбином (производства Sigma).
| Таблица 3 | ||
| Концентрация мышиного OPN расщепленного тромбином типа (мкг/мл) | Концентрация M5 (мкг/мл) | Среднее число мигрирующих клеток на 1 мм3 |
| 0 | 0 | 428,3±52,7** |
| 10 | 0 | 556,7±46,3 |
| 10 | 0,8 | 570,0±75,6 |
| 10 | 4 | 536,7±60,6 |
| 10 | 20 | 461,7±104,4 |
| 10 | 100 | 468,3±67,9 |
| ** P<0,05(односторонний ANOVA, тест Dunnett). |
Пример 11
Действие антитела M5 на подавление повреждения кости
Следующим способом оценивали действие антитела M5 на подавление повреждения кости в системе культуры свода черепа мыши. Результаты показаны в таблице 4.
<Экспериментальный способ>
Из новорожденной мыши на 1 сутки после рождения выделяли черепную кость; после доведения до определенного размера ее половину помещали в каждую лунку 24-луночного планшета. Затем к каждой лунке добавляли паратгормон человека (PTH) (1-34), и доводили культуральным бульоном D-MEM (с добавлением 10% бычьей сыворотки) до конечной концентрации PTH, равной 10 нМ, для индукции повреждения кости. Добавляли антитело M5 до конечной концентрации, равной 200 мкг/мл. После культивирования при 37°C в течение одной недели количество кальция, высвобождаемого из кости в культуральный бульон, тестировали путем Calcium E Test WAKO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
<Результаты эксперимента>
Без добавления PTH кальций находился в концентрации 7,02 мг/мл. Однако при добавлении PTH кальций находился в концентрации 9,11 мг/мл. Следовательно, это означало, что индуцировалось высвобождение кальция из кости. Когда антитело M5 добавляли в концентрации, равной 200 мкг/мл, подтверждалось, что абсорбция кости ингибировалась примерно на 70%.
| Таблица 4 | |
| Количество высвобожденного кальция (мг/дл) | |
| Среда | 7,02±0,18** |
| Контроль PTH | 9,11±0,17 |
| M5 | 7,65±0,25** |
| ** P<0,01(односторонний ANOVA, тест Dunnett). |
Пример 12
Эффект антитела M5 в экспериментальном коллагеновом артрите мыши
Следующим способом оценивали эффект антитела M5 в экспериментальном коллагеновом артрите мыши. В таблице 5 показаны результаты по артритному коэффициенту; в таблице 6 показаны результаты по отеку ног; в таблице 7 показаны результаты по изменению массы тела; и в таблице 8 показаны результаты по изменению в приеме пищи.
<Способ эксперимента>
Для индукции артрита использовали коктейль артритогенных антител (под торговой маркой коктейля для артрита Arthrogen-CIA® mAb, коктейль артритогенных mAb; производство Iwai Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.), распознающих четыре эпитопа, специфичных для коллагена. Мыши вводили внутривенно артритогенный коктейль; через 3 суток внутрибрюшинно вводили LPS (100 мкг), чтобы вызвать таким образом артрит. Артрит наблюдали на 3 сутки после введения дозы LPS, и он достигал максимума на 6 сутки.
Непосредственно перед введением дозы LPS и через 3 суток после этого внутривенно вводили антитело M5 в дозе, составляющей 40 мкг, 150 мкг или 400 мкг. В качестве контрольной группы приспосабливали группу, которой вводили дозу кроличьего IgG (в дозе 400 мкг). Кроме того, непосредственно перед введением дозы LPS и через 3 суток после этого вводили антитело против мышиного TNF-α в дозе, равной 200 мкг/мышь. В качестве контрольной группы приспосабливали группу, которой вводили дозу крысиного IgG (в дозе 200 мкг). Далее перорально давали MTX (в дозе 3,2 мг/кг) единожды, ежедневно на те самые сутки, в которые проводили введение дозы LPS и после этого. Затем MTX растворяли в 5 мл 0,5% раствора метилцеллюлозы. Для контрольной группы применяли 5 мл 0,5% раствора метилцеллюлозы.
Оценку проводили по группе в пять животных, учитывая четыре параметра, а именно: артритный коэффициент, отек ног, изменение массы тела и прием пищи.
<Результаты эксперимента>
Как показано в таблицах от 5 до 8, антитело M5 проявляло различные супрессивные типы действия в плане улучшения артритного коэффициента, задержки развития артрита и улучшения состояния отека ног в мышином экспериментальном артрите (терапевтический эффект). Развитие артрита супрессировалось в концентрационнозависимой манере на таком уровне, что данное действие превышало действие дозированного антитела против мышиного TNF-α (в дозе, равной 200 мкг/мышь). Наоборот, MTX почти не проявлял фармацевтической эффективности.
Более того, в нормальной группе данной модели наблюдали различное снижение массы тела примерно на 3 г в течение 3 суток после введения дозы LPS; и данная тенденция продолжалась с 3 суток до 6 суток, хотя скорость снижения более или менее уменьшалась. В группах, получавших дозу антитела M5 (150 мкг, 400 мкг), и группе, получавшей дозу антитела против мышиного TNF-α, альтернативно, наблюдали явственное улучшение ситуации со снижением массы тела. Более того, что касается приема пищи, то быстрое снижение массы тела наблюдали для любого из фармацевтических веществ до 3 суток после введения дозы LPS; однако с 3 по 6 сутки ситуация со снижением улучшалась в группах, получавших дозу антитела M5, и в группе, получавшей дозу антитела против мышиного TNF-α. На таблице 5 показано действие на артритный коэффициент; на таблице 6 - супрессивное действие на отек ноги; и на таблицах 7 и 8 показано действие на изменение массы тела и на изменение приема пищи соответственно.
| Таблица 5 | ||||
| Сутки | Группа, которой вводили кроличий IgG (доза; 400 мкг/мышь) | Группа, которой вводили антитело M5 (доза; мкг/мышь) | ||
| 40 | 150 | 400 | ||
| 3 | 1,2±1,1 | 2,4±1,7 | 1,0±1,2 | 0,0±0,0 |
| 4 | 1,8±1,3 | 3,4±1,1 | 1,4±0,5 | 0,2±0,4* |
| 5 | 5,0±1,6 | 6,0±2,0 | 3,0±1,2* | 1,8±0,4** |
| 6 | 5,4±1,3 | 7,2±1,3 | 4,6±1,5 | 3,0±1,0* |
| ** P<0,01, *P<0,05 (непараметрический тест Манна-Уитни). | ||||
| Сутки | Группа, которой вводили крысиный IgG (доза; 200 мкг/мышь) | Группа, которой вводили антитело против TNF-α (доза; 200 мкг/мышь) | ||
| 3 | 0,8±0,4 | 1,0±0,6 | ||
| 4 | 2,4±0,2 | 1,0±0,5 | ||
| 5 | 5,8±0,4 | 3,2±0,5* | ||
| 6 | 6,6±0,4 | 5,8±0,5 | ||
| *P<0,05 (непараметрический тест Манна-Уитни) | ||||
| Сутки | Контрольная группа | Группа, которой вводили MTX (доза; 3,2 мг/кг) | ||
| 3 | 1,0±0,3 | 0,8±0,4 | ||
| 4 | 1,8±0,6 | 1,8±0,7 | ||
| 5 | 4,0±0,9 | 6,0±0,6 | ||
| 6 | 5,2±0,9 | 6,0±0,6 | ||
Пример 13
Доступность пептидов относящихся к OPN фрагментов
Пептиды относящихся к OPN фрагментов в очищенном путем хроматографии ВЭЖХ состоянии приобретали у Auspep Inc., Parkiville, Австралия. Их аминокислотные последовательности показаны от (1) до (3).
hOPN5:
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C + от V153 до S169) (1)
hOPN3:
KSKKFRRPDIQYPDATDEC (от K170 до E187+C) (2)
hOPN1:
IPVKQADSGSSEEKQC (от I17 до Q31+C) (3)
Пример 14
Получение антигенов для иммунизации
Продукты пептидных фрагментов, относящихся к OPN, связанных с тиреоглобулином, получали по способу с применением EMCS (N-(6-малеимидокапроилокси)сукцинимида) следующим образом. Для получения таких продуктов молярное отношение тиреоглобулина, пептида относящегося к OPN фрагмента и EMCS составляло 1:300:400.
4 мг каждого из пептидов относящихся к OPN фрагментов по примеру 13 растворяли в дистиллированной воде объемом около 1 мл. Альтернативно в 1 мл 0,01 М фосфатного буфера растворяли 5 мг тиреоглобулина, pH 7,0, и смешивали вместе с EMCS, растворенным до концентрации 80 мкг/мкл в диметилформамиде, до количеств, соответствующих молярным концентрациям для получения комплексного раствора тиреоглобулина-EMCS. Комплексный раствор разделяли на три порции. К каждой порции добавляли раствор пептида относящегося к OPN фрагмента в количестве, соответствующем молярной концентрации, для получения таким образом раствора перекрестно связанного через EMCS продукта пептидного фрагмента, относящегося к OPN, связанного с тиреоглобулином.
Раствор такого связанного продукта диализовали с использованием PBS для доведения концентрации продукта до 10 мкг/мкл. Связанный продукт пептидного фрагмента, относящегося к OPN, и тиреоглобулина использовали в качестве антигена для иммунизации.
Пример 15
Получение антигенов для скрининга
В качестве белков OPN для скрининга по способу, описанному в примере 1, получали белки слияния между GST и изоформами человеческого OPN, а именно: GST-OPN-a, GST-OPN-b и GST-OPN-c - и белки слияния между GST и фрагментом OPN со стороны аминогруппы (GST-Nhalf) от участка расщепления тромбином, и фрагментом OPN со стороны карбоксильной группы (GST-Chalf) от того же участка расщепления тромбином для применения реактивности антисыворотки с OPN.
Пример 16
Активизация иммунитета
Кролика иммунизировали с использованием в качестве антигенов для иммунизации связанных продуктов пептидов относящихся к OPN фрагментов и тиреоглобулина, полученных по примеру 14. Иммунизацию проводили, загружая 100 мкл (100 мкг) раствора связанного продукта каждую неделю или каждые две недели. Антигены смешивали с полным адъювантом Фрейнда для первой иммунизации и затем смешивали с неполным адъювантом Фрейнда для второй иммунизации и последующих иммунизаций. После восьми иммунизаций сыворотку отделяли от собранной крови и затем использовали ее в качестве антисыворотки.
Пример 17
Реакционная способность антисыворотки в отношении OPN
Пептиды относящихся к OPN фрагментов, полученные по примеру 13, растворяли в 0,1 M карбонатном буфере, pH 9,5, до концентрации 10 мкг/мл и затем иммобилизовали их по 50 мкл на лунку 96-луночного планшета. После ополаскивания PBS и блокирования 0,1% BSA/PBS/0,05% раствором NaN3 2-кратное серийное разведение 100-кратного разведения антисыворотки, полученной по примеру 16, помещали по 50 мкл на лунку для взаимодействия при 37°C в течение 30 минут.
По окончании данной реакции лунки четырежды ополаскивали 0,05% Tween 20-PBS. Затем 50 мкл каждого из меченных HRP антител против кроличьих IgG (производства IBL Co., Ltd.) добавляли в каждую лунку для взаимодействия в течение 30 минут при 37°C. По окончании реакции в каждую лунку добавляли 0,05 M цитратный буфер, pH 4,5, содержащий 0,4 мг/мл ортофенилендиамина (OPD) и водный 0,03% раствор пероксида водорода, по 100 мкл каждого. Затем планшет оставляли инкубироваться в темноте при окружающей температуре в течение 15 минут для хромогенной реакции. После хромогенной реакции в каждую лунку добавляли 100 мкл 1 Н серной кислоты для окончания реакции и измеряли поглощение при 492 нм.
С использованием белков OPN, полученных по примеру 15, реакционную способность данной антисыворотки альтернативно оценивали путем вестерн-блоттинга. В результате, антисыворотки против относящихся к OPN пептидных фрагментов hOPN1 и hOPN5 взаимодействовали с GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c и GST-Nhalf, но никогда не взаимодействовали с GST-Chalf. Альтернативно, антисыворотка против относящегося к OPN пептидного фрагмента hOPN3 взаимодействовала с GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c и GST-Chalf, но никогда не взаимодействовала с GST-Nhalf.
Пример 18
Получение связанных с HRP продуктов антител против относящихся к OPN пептидных фрагментов
Связанные с HRP продукты антител против относящихся к OPN пептидных фрагментов hOPN3 и hOPN1 получали следующим образом. 20 мг каждого антитела против относящегося к OPN пептидного фрагмента расщепляли пепсином с последующей гель-фильтрацией с целью очистки F(ab′)2-фрагмента антитела против относящегося к OPN пептидного фрагмента. Затем F(ab′)2-фрагмент восстанавливали до Fab′-фрагмента путем использования 2-меркаптоэтанола. HRP подвергали взаимодействию с EMCS при 37°C в течение 60 минут с последующей гель-фильтрацией для получения связанного продукта HRP-EMCS, который далее подвергали взаимодействию с F(ab′)2-фрагментом антитела против относящегося к OPN пептидного фрагмента при 4°C в течение ночи с последующей гель-фильтрацией для получения перекрестно связанного за счет EMCS связанного с HRP продукта антитела против относящегося к OPN пептидного фрагмента.
Пример 19
Конструирование систем сэндвич-ELISA
Из комбинаций планшета для сэндвич-ELISA и меченых антител получали два типа систем, а именно 1-3 и 5-1. Конкретно, систему 1-3 получали следующим образом. 10 мкг/мл антитела против относящегося к OPN пептидного фрагмента hOPN1 добавляли в виде порции объемом 100 мкл в 96-луночный планшет для ELISA. После взаимодействия в течение ночи при 4°C проводили блокирование 10% раствором BSA/PBS/NaN3. Полученный в результате планшет в данном состоянии использовали в качестве планшета для сэндвич-ELISA. Связанный с HRP продукт антитела против относящегося к OPN пептидного фрагмента hOPN3, полученный по примеру 18 определяли как меченое антитело. Как описано выше, комбинация иммобилизующего планшета, в котором используется антитело против hOPN1, и меченого антитела, представляющего собой антитело против hOPN3, определена как система 1-3.
Тем же образом конструировали в качестве системы 5-1 комбинацию иммобилизующего планшета, в котором используется антитело против hOPN5, и меченого антитела, представляющего собой антитело против hOPN1.
Пример 20
Анализ остеопонтина в испытуемом субъекте посредством систем сэндвич-ELISA
Белок OPN анализировали следующим образом. 100 мкл раствора, содержащего образец плазмы или образец суставной жидкости от испытуемого субъекта, добавляли в планшеты для сэндвич-ELISA систем 1-3 и 5-1 для реакции при 37°C в течение одного часа. После реакции планшеты ополаскивали 0,05% Tween 20-PBS с последующим добавлением 100 мкл каждого из меченых антител, специфичных для отдельных систем для реакции при 4°C в течение 30 минут. После реакции планшеты ополаскивали шесть раз 0,05% Tween20-PBS с последующим добавлением 100 мкл раствора TMB (тетраметилбензидина). Затем полученные в результате планшеты оставляли инкубироваться в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.1Н серную кислоту использовали для окончания реакции и анализировали поглощение при 450 нм.
В таблице 9 показаны уровни OPN в суставной жидкости больных (13 случаев) с ревматизмом, измеренные данным способом; и в таблице 10 показаны значения OPN в суставной жидкости больных (12 случаев) с остеоартритом. Кроме того, в таблице 11 показаны уровни OPN в образцах плазмы от больных ревматизмом (16 случаев); в таблице 12 показаны уровни OPN в образцах плазмы от больных остеоартритом (7 случаев); и в таблице 13 показаны уровни OPN в плазмах от нормальных субъектов (6 случаев).
Как явственно показано в данных результатах, сравнение путем системы 1-3 уровня OPN в плазме больных ревматоидным артритом, больных остеоартритом и нормальных субъектов не выявило какого-либо значимого различия. Однако сравнение путем системы 5-1 уровня OPN в плазме больных ревматоидным артритом, больных остеоартритом и нормальных субъектов показало значимо более высокие концентрации OPN в плазме у больных ревматоидным артритом и у больных остеоартритом по отношению к значению OPN у обычных субъектов. Уровень значимости был выше у больных ревматоидным артритом. Это указывает на то, что отражение общего количества OPN посредством системы 5-1 эффективно для диагностики общей категории артрита.
Альтернативно, уровни OPN в суставной жидкости больных ревматоидным артритом и больных остеоартритом превышают уровни OPN в их плазме, что явственно указывает на местную продукцию OPN.
Кроме того, сравнение при помощи систем 1-3 и 5-1 уровня OPN в суставной жидкости у больных ревматоидным артритом и больных остеоартритом показало, что уровень OPN у больных ревматоидным артритом был значимо выше уровня OPN у больных остеоартритом при использовании любой из систем 1-3 и 5-1.
В качестве нового индикатора оценивали отношение уровней OPN, определенных при помощи систем 1-3 и 5-1. Данный индикатор может использоваться для сравнения доли расщепленного тромбином OPN. Уровни OPN в образцах плазмы и суставной жидкости от больных ревматоидным артритом составляли 1 или менее, а уровни OPN от больных остеоартритом составляли 2 или более, так что наблюдали значимое различие. Таким образом, значения OPN, определенные при помощи систем 1-3/5-1, могут использоваться в диагностическом способе для того, чтобы отличать больных ревматоидным артритом от больных остеоартритом на ранней стадии.
| Таблица 9 | |||
| Образец | Система 1-3 (нг/мл) | Система 5-1 (нг/мл) | Система 1-3/ система 5-1 |
| RA 1 | 8498 | 2932 | 2,898 |
| RA 2 | 22715 | 26223 | 0,866 |
| RA 3 | 2659 | 1905 | 1,396 |
| RA 4 | 20186 | 94430 | 0,214 |
| RA 5 | 1520 | 2002 | 0,759 |
| RA 6 | 5870 | 2238 | 2,623 |
| RA 7 | 7303 | 56753 | 0,129 |
| RA 8 | 2200 | 6268 | 0,351 |
| RA 9 | 18344 | 59873 | 0,306 |
| RA10 | 2133 | 2002 | 1,065 |
| RA11 | 26804 | 33036 | 0,811 |
| RA12 | 18868 | 32824 | 0,575 |
| RA13 | 3633 | 6067 | 0,599 |
| Среднее | 10825,6 | 25119,5 | 0,969 |
| Таблица 10 | |||
| Образец | Система 1-3 (нг/мл) | Система 5-1 (нг/мл) | Система 1-3/ система 5-1 |
| OA 1 | 1520 | 3471 | 0,438 |
| OA 2 | 9957 | 14374 | 0,693 |
| OA 3 | 6595 | 2932 | 2,249 |
| OA 4 | 3523 | 237 | 14,865 |
| OA 5 | 8619 | 28483 | 0,303 |
| OA 6 | 1926 | 896 | 2,150 |
| OA 7 | 653 | 850 | 0,768 |
| OA 8 | 6490 | 7814 | 0,831 |
| OA 9 | 4750 | 1987 | 2,391 |
| OA10 | 6830 | 2932 | 2,329 |
| OA11 | 386 | 181 | 2,133 |
| OA12 | 1621 | 356 | 4,553 |
| Среднее | 4405,8 | 5376,1 | 2,808 |
| Таблица 11 | |||
| Образец | Система 1-3 (нг/мл) | Система 5-1 (нг/мл) | Система 1-3/ система 5-1 |
| RA 1 | 1621 | 1379 | 1,175 |
| RA 2 | 532 | 845 | 0,630 |
| RA 3 | 132 | 617 | 0,214 |
| RA 4 | 142 | 1758 | 0,081 |
| RA 5 | 624 | 2089 | 0,299 |
| RA 6 | 341 | 1990 | 0,171 |
| RA 7 | 152 | 845 | 0,180 |
| RA 8 | 671 | 224 | 2,996 |
| RA 9 | 543 | 557 | 0,975 |
| RA10 | 947 | 431 | 2,197 |
| RA11 | 935 | 1794 | 0,521 |
| RA12 | 1008 | 1650 | 0,611 |
| RA13 | 636 | 678 | 0,938 |
| RA14 | 464 | 545 | 0,851 |
| RA15 | 683 | 488 | 1,400 |
| RA16 | 1057 | 597 | 1,771 |
| Среднее | 6555 | 1030,4 | 0,938 |
| Таблица 12 | |||
| Образец | Система 1-3 (нг/мл) | Система 5-1 (нг/мл) | Система 1-3/ система 5-1 |
| OA 1 | 695 | 302 | 2,301 |
| OA 2 | 1094 | 412 | 2,655 |
| OA 3 | 1070 | 557 | 1,921 |
| OA 4 | 75 | 1129 | 0,066 |
| OA 5 | 814 | 356 | 2,286 |
| OA 6 | 959 | 276 | 3,475 |
| OA 7 | 983 | 311 | 3,161 |
| Среднее | 812,9 | 477,6 | 2,267 |
| Таблица 13 | |||
| Образец | Система 1-3 (нг/мл) | Система 5-1 (нг/мл) | Система 1-3/ система 5-1 |
| Норма 1 | 475 | 199 | 2,387 |
| Норма 2 | 578 | 249 | 2,321 |
| Норма 3 | 802 | 232 | 3,457 |
| Норма 4 | 983 | 384 | 2,560 |
| Норма 5 | 520 | 284 | 1,831 |
| Норма 6 | 624 | 215 | 2,902 |
| Среднее | 663,7 | 260,5 | 2,576 |
1. Антитело против остеопонтина, которое ингибирует связывание между интегрином, распознающим участок аминокислотной последовательности RGD, и остеопонтином или его фрагментом, и которое ингибирует связывание между интегрином, распознающим участок аминокислотной последовательности SVVYGLR, SVAYGLR, SLAYGLR, SVAYGLK или SVAYRLK и остеопонтином или его фрагментом, где антитело получено против пептида, содержащего аминокислотную последовательность RGDSVVYGLR или родственную последовательность RGDSVVYGLR, в качестве антигена.
2. Антитело по п.1, где интегрином, распознающим участок аминокислотной последовательности SVVYGLR, SVAYGLR, SLAYGLR, SVAYGLK или SVAYRLK является интегрин α9β1.
3. Антитело по п.1, где интегрином, распознающим участок аминокислотной последовательности SVVYGLR, SVAYGLR, SLAYGLR, SVAYGLK или SVAYRLK является интегрин α4.
4. Антитело по любому из пп.1-3, где интегрином, распознающим участок аминокислотной последовательности SVVYGLR, SVAYGLR, SLAYGLR, SVAYGLK или SVAYRLK являются интегрин α9β1 и интегрин α4.
5. Антитело по любому из пп.1-3, где указанный фрагмент представляет собой N-концевой фрагмент остеопонтина.
6. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело получено против пептида, содержащего аминокислотную последовательность RGDSVVYGLR в качестве антигена.
7. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело получено против пептида, содержащего аминокислотную последовательность RGDSVVYGLRS в качестве антигена.
8. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело получено против пептида VDTYDGRGDSVVYGLRS в качестве антигена.
9. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело получено против пептида, содержащего аминокислотную последовательность RGDSLAYGLR в качестве антигена.
10. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело получено против пептида CVDVPNGRGDSLAYGLR в качестве антигена.
11. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
12. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело.
13. Антитело по любому из пп.1-3, где указанное антитело представляет собой антитело человеческого типа.
14. Лекарственное средство для лечения аутоиммунного заболевания, содержащее антитело по любому из пп.1-3 в качестве активного ингредиента, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы: ревматизм, ревматоидный артрит, остеоартрит.
15. Лекарственное средство по п.14, где указанным аутоиммунным заболеванием является ревматизм.
16. Лекарственное средство по п.14, где указанным аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит.
17. Лекарственное средство по п.14, где указанным аутоиммунным заболеванием является остеоартрит.
18. Способ лечения аутоиммунного заболевания, предусматривающий введение больному аутоиммунным заболеванием антитела по любому из пп.1-3, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы: ревматизм, ревматоидный артрит, остеоартрит.
19. Способ по п.18, где указанным аутоиммунным заболеванием является ревматизм.
20. Способ по п.18, где указанным аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит.
21. Способ по п.18, где указанным аутоиммунным заболеванием является остеоартрит.
22. Применение антитела по любому из пп.1-3 для производства лекарственного препарата для лечения аутоиммунного заболевания, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы: ревматизм, ревматоидный артрит, остеоартрит.
23. Применение по п.22, где указанным аутоиммунным заболеванием является ревматизм.
24. Применение по п.22, где указанным аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит.
25. Применение по п.22, где указанным аутоиммунным заболеванием является остеоартрит.
