Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, перенаправляющие антитела к рецепторам на патогене
Настоящее изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается обменивателей специфичности лиганда/рецептора, перенаправляющих антитела к рецепторам на патогене. В частности, описанные здесь варианты выполнения относятся к производству и использованию обменивателей специфичности лиганда/рецептора, включающих, по меньшей мере, один домен специфичности, содержащий лиганд для рецептора, при этом лиганд не является антителом или его частью, и по меньшей мере, один антигенный домен, соединенный с упомянутым доменом специфичности, в котором антигенный домен содержит эпитоп патогена или токсина. Преимущество изобретения заключается в повышении специфичности доставки лекарства. 8 н. и 22 з.п. ф-лы, 5 табл.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится в целом к составам и способам для предотвращения и лечения заболеваний человека, в том числе, но не в порядке ограничения, таких патогенов, как бактерии, дрожжи, паразиты, грибок, вирусы и рак. В частности, описанные здесь варианты выполнения относятся к производству и использованию обменивателей специфичности лиганда/рецептора, которые перенаправляют существующие у субъекта антитела к рецепторам, имеющимся на патогенах.
Существующий уровень техники
Инфекции, вызванные такими патогенами, как бактерии, дрожжи, паразиты, грибки, а также появление и распространение рака, представляют серьезные проблемы для здоровья всех животных, включая людей, сельскохозяйственных и домашних животных. Эта опасность для здоровья усиливается за счет появления штаммов, устойчивых к вакцинации и/или лечению. В прошлом практикующие фармакологи опирались на традиционные способы разработки медикаментов для выработки безопасных и эффективных соединений для лечения этих заболеваний. Традиционные способы разработки медикаментов обычно содержали слепое тестирование молекул-кандидатов потенциального медикамента, зачастую выбранного случайным образом, в надежде, что какой-либо из потенциальных медикаментов может оказаться эффективным лечением для некоторого заболевания. Однако с приходом молекулярной биологии фокус разработки медикаментов сместился к идентификации молекулярных мишеней, связанных с этиологическим агентом, и к конструированию соединений, которые взаимодействуют с этими молекулярными мишенями.
Одним многообещающим классом молекулярных мишеней являются рецепторы, находящиеся на поверхности бактерий, дрожжей, паразитов, грибков, вирусов и раковых клеток, особенно те рецепторы, которые обеспечивают прикрепление к клетке хозяина или к белку хозяина (например, внеклеточному матричному белку). Исследования в этой области в первую очередь сосредотачиваются на идентификации рецептора и его лиганда и на обнаружении молекул, которые прерывают взаимодействие лиганда с рецептором и, тем самым, блокируют адгезию к клетке или белку хозяина.
Например, многие патогенные бактерии (к примеру, Staphylococcus aureus) вырабатывают адгезионные рецепторы (например, ClfA, Efb и FnBPA), которые способны связываться с внеклеточными матричными белками хозяина (например, фибриногеном, фибронектином и ламинином). (Flock, Mol. Med. Today 5:532-533 (1999)). Исследователи показали, что приверженность некоторых бактерий к внеклеточным матричным белкам хозяина может быть блокирована с помощью пептидов, соответствующих участкам внеклеточного матричного белка хозяина. (Pei et al., Infection and Immunity 67(9):4525-4530 (1999)). Подобным же образом, у многих вирусов есть рецепторы, взаимодействующие с белками, присутствующими на поверхности клеток хозяина. (См., например, патенты США №5942606 и 5929220). Исследователи показали, что фрагмент гликопротеина Т4 (белок клетки хозяина) может взаимодействовать с gp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и пептид Т4 может использоваться для предотвращения или лечения ВИЧ-инфекции. (См., например, патент США №6093539). Дополнительно, многие типы раковых клеток экспрессируют рецепторы, которые взаимодействуют с внеклеточными матричными белками хозяина, и исследователи показали, что молекулы, блокирующие рецепторы интегрина, могут использоваться для ингибирования присоединения ткани, метастаза, ангиогенеза и роста опухоли. (См., например, патенты США №6066648, 6087330, 5846536, 5766591 и 5627263). Хотя эти ингибирующие пептиды имеют многообещающий терапевтический потенциал, все еще остается необходимость в новых составах и способах для лечения и предотвращения инфекции, вызванной патогенами, и прочих заболеваний.
Сущность изобретения
Описанное здесь изобретение относится к производству, характеризации и использованию новых агентов, связывающих рецепторы на патогенах и перенаправляющих антитела, имеющиеся у субъекта, к патогену. К вариантам выполнения относятся обмениватель специфичности лиганда/рецептора, имеющий по меньшей мере один домен специфичности, содержащий лиганд для рецептора, и по меньшей мере один антигенный домен, соединенный с упомянутым доменом специфичности, причем упомянутый антигенный домен содержит эпитоп патогена или токсина.
Некоторые варианты выполнения обменивателя специфичности лиганда/рецептора имеют домен специфичности, содержащий по меньшей мере три последовательные аминокислоты пептида, выбранного из группы, состоящей из внеклеточного матричного белка, лиганда для рецептора на вирусе и лиганда для рецептора на раковой клетке. В некоторых аспектах данного варианта выполнения, например, пептид является внеклеточным матричным белком, выбранным из группы, состоящей из фибриногена, коллагена, витронектина, ламинина, плазминогена, тромбоспондина и фибронектина. Предпочтительно, внеклеточный матричный белок содержит по меньшей мере 3 аминокислоты альфа-цепочки фибриногена, а в наиболее предпочтительных вариантах выполнения лиганд содержит последовательность аргинин-глицин-ас партат (RGD).
В прочих вариантах выполнения описанный выше пептид является лигандом для рецептора на вирусе, выбранном из группы, состоящей из гликопротеина Т4 и белка оболочки вируса гепатита Б. В прочих аспектах данного варианта выполнения пептид является лигандом для рецептора на раковой клетке, выбранной из группы, состоящей из лиганда для HER-2/neu и лиганда для интегринового рецептора. Предпочтительные варианты выполнения содержат домен специфичности, содержащий последовательность, обеспечиваемую одной из ИД. ПОСЛ. №1-42.
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, описанные здесь, взаимодействуют с рецептором, находящимся на патогене. В некоторых вариантах выполнения рецептор является бактериальным адгезионным рецептором, например бактериальным адгезионным рецептором, выбранным из группы, состоящей из белка, связывающего внеклеточный фибриноген (Efb), белка, связывающего коллаген, белка, связывающего витронектин, белка, связывающего ламинин, белка, связывающего плазминоген, белка, связывающего тромбоспондин, агрегирующего фактора A (ClfA), агрегирующего фактора Б (ClfB), белка, связывающего фибронектин, коагулазы и белка внеклеточного прилипания.
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, описанные здесь, также взаимодействуют с антителом, присутствующим у субъекта. В некоторых вариантах выполнения, например, антигенный домен содержит по меньшей мере три аминокислоты пептида, выбранного из группы, состоящей из белка вируса простого герпеса, белка вируса гепатита Б, белка вируса ТТ и белка вируса полиомиелита. В желательных вариантах выполнения обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит антигенный домен, являющийся белком вируса простого герпеса, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №53 и ИД. ПОСЛ. №54. В прочих желательных вариантах выполнения антигенный домен является белком вируса гепатита Б, содержащим последовательность, обеспечиваемую одной из ИД. ПОСЛ. №49, ИД. ПОСЛ. №50, ИД. ПОСЛ. №52 и ИД. ПОСЛ. №59.
Некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора также содержат антигенный домен, который является белком вируса ТТ, содержащим последовательность, обеспечиваемую одной из ИД. ПОСЛ. №43-47 и ИД. ПОСЛ. №55-58. Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут также иметь антегенный домен, который является белком вируса полиомиелита, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №48 и ИД. ПОСЛ. №51. Предпочтительно, обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит антигенный домен, взаимодействующий с антителом с высоким титром. В некоторых вариантах выполнения, например, антигенный домен специфически связывается с антителом, находящимся в животной сыворотке, которая была разбавлена приблизительно до 1:100-1:1000 или более. Обмениватели специфичности с ИД. ПОСЛ. №60-105 являются вариантами выполнения изобретения.
Аспекты изобретения также относятся к способам лечения или предотвращения инфекции или пролиферации патогена. Например, один подход содержит способ лечения и предотвращения бактериальной инфекции. Этот способ осуществляется путем снабжения субъекта терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, причем упомянутый обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит домен специфичности, имеющий лиганд, который взаимодействует с рецептором на бактериях, и антигенный домен, содержащий эпитоп для патогена или токсина. Также вариантом выполнения является способ лечения или предотвращения вирусной инфекции. Соответственно, способ лечения или предотвращения вирусной инфекции осуществляется путем снабжения субъекта терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, причем упомянутый обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит домен специфичности, содержащий лиганд, который взаимодействует с рецептором на вирусе, и антигенный домен, содержащий эпитоп для патогена или токсина. Подобным же образом, вариантом выполнением является способ лечения или предотвращения рака, и этот способ может осуществляться путем снабжения субъекта терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, причем упомянутый обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит домен специфичности, содержащий лиганд, который взаимодействует с рецептором на раковой клетке, и антигенный домен, содержащий эпитоп для патогена или токсина.
Подробное описание изобретения
Ниже описываются производство, характеризация и использование новых агентов, которые связывают рецепторы на патогенах и перенаправляют антитела, имеющиеся у субъекта, к патогену. Термин «обмениватель специфичности антигена/антитела» известен из уровня техники и обозначает молекулу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела (например, участка, определяющего комплементарность), связанной с аминокислотной последовательностью, с которой связывается определенное антитело (например, эпитоп патогена). (См., например, Sällberg et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 205:1386-90 (1994) и патенты США №5869232 и 6040137). Обмениватели специфичности антигена/антитела могут перенаправлять антитела, имеющиеся у субъекта, к патогену, и эти обменивающие агенты имеют терапевтическое и диагностическое использование. (Там же).
Описанные здесь варианты выполнения относятся ко второму поколению обменивающих агентов, названных «обмениватели специфичности лиганда/рецептора». В отличие от обменивателей специфичности антигена/антитела, обмениватели специфичности лиганда/рецептора не содержат последовательности, находимой в антителе. Вместо этого обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат первый домен, содержащий лиганд для рецептора, и второй домен, содержащий эпитоп патогена или токсина. Таким образом, для целей данного раскрытия термин «обмениватели специфичности лиганда/рецептора» относится к обменивающему агенту, содержащему «домен специфичности», имеющий по меньшей мере один лиганд для рецептора («лиганд» не является антителом или его частью), соединенный с «антигенным доменом», имеющим по меньшей мере один эпитоп патогена или токсина (например, токсина коклюша или токсина холеры).
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать больше, чем домен специфичности и антигенный домен. Например, некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат множество доменов специфичности и/или антигенных доменов. Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, имеющие несколько доменов специфичности и/или несколько антигенных доменов, называются «мультимеризованными», поскольку более чем один домен специфичности и/или антигенный домен, объединены в тандеме. Прочие варианты выполнения относятся к обменивателям специфичности лиганда/рецептора, которые содержат, в дополнение к домену специфичности и антигенному домену, последовательности, облегчающие очистку (например, полигистидиновый хвост), линкеры (например, биотин и/или авидин, или стрептавидин, или гибкие отростки фага 8 (8-линкеры)) и последовательности или модификации, которые либо обеспечивают стабильность обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, модификации, обеспечивающие сопротивляемость поглощению протеазой), либо помогают разложению обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, сайты протеазного расщепления). Хотя домен специфичности и антигенный домен предпочтительно являются пептидами, некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат домен специфичности и антигенный домен, выполненные из модифицированных или производных пептидов, пептидомиметиков или химикатов.
Разнообразие обменивателей специфичности лиганда/рецептора велико, поскольку описанные здесь выполнения могут связываться со многими различными рецепторами на многих различных патогенах. Таким образом, термин «патоген» используется здесь в общем значении, обозначая этиологический агент заболевания у животных, в том числе, но не в порядке ограничения, бактерии, паразиты, грибок, плесень, вирусы и раковые клетки. Подобным же образом термин «рецептор» используется в общем значении, обозначая молекулу (обычно пептид, отличный от последовательности, обнаруживаемой в антителе, но может быть углеводородом, липидом или нуклеиновой кислотой), взаимодействующую с «лигандом» (обычно пептидом, отличным от последовательности, обнаруживаемой в антителе, или углеводородом, липидом, нуклеиновой кислотой или их комбинацией). «Рецептор», в используемом здесь значении, не обязательно подвергается сигнальной трансдукции и может быть вовлечен во множество молекулярных взаимодействий, в том числе, но не в порядке ограничения, адгезию (например, интегрины) и молекулярную сигнализацию (например, рецепторы фактора роста). Например, желательные домены специфичности содержат лиганд, имеющий пептидную последовательность, представленную во внеклеточном матричном белке (например, фибриногене, коллагене, витронектине, ламинине, плазминогене, тромбоспондине и фибронектине), а некоторые домены специфичности содержат лиганд, взаимодействующий с бактериальным адгезионным рецептором (например, внеклеточным белком, связывающим фибриноген (Efb), белком, связывающим коллаген, белком, связывающим витронектин, белком, связывающим ламинин, белком, связывающим плазминоген, белком, связывающим тромбоспондин, агрегирующим фактором A (ClfA), агрегирующим фактором Б (ClfB), белком, связывающим фибронектин, коагулазой и белком внеклеточного прилипания).
В прочих вариантах выполнения домен специфичности содержит лиганд, имеющий пептидную последовательность, которая взаимодействует с вирусным рецептором (например, фрагмент гликопротеина Т4, который связывает gp120, или фрагмент домена preS, который связывает gp170 семейства гепаднавирус). В прочих вариантах выполнения домен специфичности содержит лиганд, взаимодействующий с рецептором на раковой клетке (например, HER-2/neu (C-erbB2)) или таким интегриновым рецептором, как витро-нектиновый рецептор, ламининовый рецептор, фибронектиновый рецептор, коллагеновый рецептор, фибриногеновый рецептор, рецептор α4β1, рецептор α6β1, рецептор α3β1, рецептор α5β1, и рецептор αvβ3. Однако в предпочтительных вариантах выполнения домен специфичности содержит по меньшей мере 8 аминокислот альфа-цепочки фибриногена и/или последовательности аргинин-глицин-аспартовой кислоты (RGD), а наиболее предпочтительные варианты выполнения имеют домен специфичности, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №60-105.
Желательные антигенные домены содержат эпитоп, который распознается антителом, которое уже существует в субъекте. Например, многие люди иммунизированы против детских заболеваний, в том числе, но не в порядке ограничения, от оспы, кори, свинки, коревой краснухи и полиомиелита. Таким образом, антитела для эпитопов этих патогенов могут вырабатываться иммунизированным человеком. Желательные антигенные домены содержат эпитоп, который обнаруживается на этих этиологических агентах.
В некоторых вариантах выполнения антигенные домены взаимодействуют с антителом, которое было введено субъекту. Например, антитело, взаимодействующее с антигенным доменом на обменивателе специфичности лиганда/рецептора, может вводиться вместе с обменивателем специфичности лиганда/рецептора. Далее, антитело, взаимодействующее с обменивателем специфичности лиганда/рецептора, может в обычном состоянии не существовать в субъекте, но субъект приобрел это антитело путем введения биологического материала (например, сыворотки, крови или ткани). Например, субъекты, подвергавшиеся переливанию крови, получают многочисленные антитела, некоторые из которых могут взаимодействовать с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора.
Наиболее желательные антигенные домены содержат эпитоп, который распознается антителом с высоким титром. Под «антителом с высоким титром» понимается антитело, имеющее высокое сродство для антигена (например, эпитопом на антигенном домене). Например, в ферментносвязанном иммуносорбентном анализе (ELISA) антитело с высоким титром соответствует антителу, присутствующему в образце сыворотки, которое остается положительным при анализе после разбавления сыворотки до диапазона приблизительно 1:100-1:1000 в подходящем разбавляющем буфере, предпочтительно до приблизительно 1:500. Однако предпочтительные антигенные домены содержат эпитоп, обнаруживаемый на белке gG2 вируса простого герпеса, s-антигене вируса гепатита Б (HbsAg), е-антигене вируса гепатита (HBeAg), c-антигене вируса гепатита Б (HBcAg), вирусе ТТ и вирусе полиомиелита или их комбинации, либо содержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из ИД. ПОСЛ. №43-59.
Описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут быть выполнены путем общепринятых в рекомбинантной инженерии и/или в пептидной химии технологий. В некоторых вариантах выполнения домены специфичности и антигенные домены выполняются отдельно, а затем соединяются между собой (например, через линкеры или посредством связывания с общей несущей молекулой). В других вариантах выполнения домен специфичности и антигенный домен выполняются в виде частей одной и той же молекулы. В соответствии с одним из подходов обмениватель специфичности лиганда/рецептора, имеющий домен специфичности, связанный с антигенным доменом, изготавливается с помощью пептидного синтезатора. В соответствии с еще одним подходом нуклеиновая кислота, кодирующая домен специфичности, сращенный с антигенным доменом, клонируется в экспрессионный конструкт, трансфецируется в клетки, и обмениватель специфичности лиганда/рецептора очищается или изолируется из клеток или всплывшей части клеток.
Когда обмениватель специфичности лиганда/рецептора получен, он может исследоваться для определения его способности взаимодействовать с рецептором на патогене и/или антителом, специфичным для антигенного домена. Таким образом, термин «характеристический анализ» используется для обозначения эксперимента или оценки способности обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с рецептором на патогене или раковой клетке или его фрагментом и/или антителом, специфичным для антигенного домена. Некоторые характеристические тесты, например, оценивают способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора связываться с основой, содержащей рецептор патогена или его фрагмент, расположенный на ней, или наоборот. Другие характеристические тесты оценивают способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора связываться с антителом, специфичным для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Прочие характеристические тесты оценивают способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора воздействовать на инфекцию патогеном или пролиферацией раковых клеток в культивируемых клеточных линиях или у заболевших животных.
Описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут использоваться в качестве активных ингредиентов в медикаментах для лечения и предотвращения патогенной инфекции, а также рака у животных, в том числе, у людей. Фармацевтические варианты выполнения могут быть сформулированы многими способами и могут содержать наполнители, связыватели, эмульгаторы, носители и прочие вспомогательные агенты в дополнение к обменивателю специфичности лиганда/рецептора. Медикаменты, содержащие обмениватель специфичности лиганда/рецептора, могут вводиться различными способами, в том числе, но не в порядке ограничения, местно, чрескожно, парентерально, желудочно-кишечным путем, чрезбронхиально и чрезальвеолярно. Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут также использоваться в виде покрытия для медицинского оборудования и протезов для предотвращения инфекции или распространения заболевания. Количество обменивателя специфичности лиганда/рецептора, обеспечиваемого в виде медикамента в терапевтическом протоколе или наносимого на медицинское устройство, варьируется в зависимости от намеченного использования, пациента и частоты введения.
Некоторые из раскрываемых способов касаются введения обменивателя специфичности лиганда/рецептора субъекту, нуждающемуся в лечении и/или предотвращении бактериальной инфекции, грибковой инфекции, вирусной инфекции и рака. В соответствии с одним из подходов, субъекту, страдающему от бактериальной инфекции, вводят обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий домен специфичности, взаимодействующий с бактериальным рецептором. Подобным же образом субъекту, страдающему от вирусной инфекции, могут вводить обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий домен специфичности, взаимодействующий с вирусным рецептором, а субъекту, страдающему от рака, вводят обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий домен специфичности, взаимодействующий с рецептором на раковых клетках. Когда сформирован комплекс рецептор/обмениватель специфичности, предполагается, что патоген или раковая клетка выводятся из организма путем комплементарной фиксации и/или разрушения макрофагами.
Обеспечиваются способы лечения и предотвращения заболевания (например, бактериальной, грибковой и вирусной инфекции, и рака), в которых субъект, страдающий от заболевания, или субъект с риском заболевания идентифицируется, а затем обеспечивается терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, который взаимодействует с рецептором, присутствующим на этиологическом агенте. Соответственно, субъекты, страдающие от бактериальной инфекции, грибковой инфекции, вирусной инфекции или рака, идентифицируются с помощью общепринятого клинического и диагностического обследования и снабжаются терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, который взаимодействует с конкретным патогеном или раковой клеткой. Хотя описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут вводиться всем животным с риском заболевания в профилактических целях, может быть желательным вводить обмениватели специфичности лиганда/рецептора только тем индивидам, которые относятся к категории высокого риска (например, детям, пожилым людям, и тем, кто имеет тесный контакт с патогенами). Как отмечено выше, индивиды с высокой степенью риска идентифицируются с помощью доступных в настоящее время клинических и диагностических технологий.
Следующий раздел подробнее описывает различные типы обменивателей специфичности лиганда/рецептора, которые взаимодействуют с рецепторами на бактериях, паразитах, грибках, плесени, вирусах и раковых клетках.
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующие с рецепторами на патогене
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующие с рецепторами на патогене, имеют различные химические структуры, но, в целом, они характеризуются тем, что содержат по меньшей мере один участок, который связывается с рецептором (домен специфичности), и по меньшей мере один участок, который взаимодействует с антителом, специфичным для эпитопа патогена или токсина (антигенный домен). Предпочтительно обмениватели специфичности лиганда/рецептора являются пептидами, но некоторые варианты выполнения содержат производные или модифицированные пептиды или пептидомиметическую структуру. Например, типичный основанный на пептиде обмениватель специфичности лиганда/рецептора может быть модифицирован так, чтобы иметь заместители, которые обычно не встречаются в пептиде, или иметь заместители, которые обычно находятся в пептиде, но внедрены в участки, которые не являются обычными. В этом смысле основанный на пептиде обмениватель специфичности лиганда/рецептора может быть ацетилирован, ацилирован или аминирован, а к заместителям, которые могут быть внедрены в пептид для его модификации, относятся, не в порядке ограничения, Н, алкил, арил, алкенил, алкинил, ароматические соединения, эфир, сложный эфир, незамещенный или замещенный амин, амид, галоген либо незамещенный или замещенный сульфонил или 5- или 6-членное алифатическое или ароматическое кольцо. Таким образом, термин «обмениватель специфичности лиганда/рецептора» является широким и охватывает модифицированные или немодифицированные пептидные структуры, а также пептидомиметики и химические структуры.
Существует множество способов изготовления пептидомиметика, который напоминает основанный на пептиде обмениватель специфичности лиганда/рецептора. Все встречающиеся в природе аминокислоты, используемые в биологическом производстве пептидов, имеют L-конфигурацию. Синтетические пептиды могут быть приготовлены с помощью общепринятых способов синтеза, использующих L-аминокислоты, D-аминокислоты или различные комбинации аминокислот этих двух различных конфигураций. Синтетические соединения, копирующие строение и желательные характеристики пептида, но не имеющие нежелательных характеристик, например гибкости (потери структуры) и разрыва связи, известны как «пептидомиметики». (См., например, Spatola A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins (Weistein, В., ed.), Vol.7, pp.267-357, Marcel Dekker, New York (1983), где описано использование метилентио биоизостера [CH2S] в качестве амидного замещения в энкефалиновых аналогах; и Szelke et al., In peptides: Structure and Function, Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium, (Hruby and Rich, Eds.): pp.579-582, Pierce Chemical Co., Rockford, I11. (1983), где описываются рениновые ингибиторы, содержащие и метиленамино-[CH2NH], и гидроксиэтилен-[СНОНСН2] биоизостеры у амидной связи Лей-Вал в 6-13 октапептиде, производном от ангиотенсиногена).
В целом, конструирование и синтез пептидомиметика, который напоминает обмениватель специфичности лиганда/рецептора, начинается с последовательности обменивателя специфичности лиганда/рецептора и данных о структуре (например, данных о геометрии, таких как длины связей и углы между ними) желательного обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, наиболее вероятно симулируемого пептида), и использования таких данных для определения геометрий, которые должны быть воплощены в пептидомиметике. Для выполнения этого шага в уровне техники известны многочисленные методы и способы, любой из которых может использоваться. (См., например. Farmer, P.S.Drug Design, (Ariens, E.J. ed.), Vol.10, pp.119-143 (Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney and San Francisco) (1980); Farmer, et al., в TIPS, 9/82, pp.362-365; Verber et al., в TINS, 9/85, pp.392-396; Kaltenbronn et al., bj. Med Chem. 33: 838-845 (1990); и Spatola A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Vol.7, pp.267-357, Chapter 5, «Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Analysis of Peptide Containing Amide Bond Surrogates. Conformational Constraints and Relations» (Weistein, В., ed.; Marcel Dekker New York, pub.) (1983); Kemp, D.S., «Peptidomimetics and the Template Approach to Nucleation of 3-sheets and ∀-helices in Peptides», Tibech, Vol.8, pp.249-255 (1990)). Дополнительные материалы можно найти в патентах США №5288707; 5552534; 5811515; 5817626; 5817879; 5821231 и 5874529. Когда пептидомиметик сконструирован, он может быть получен с помощью общепринятых в пептидной химии и/или органической химии технологий.
Некоторые варианты выполнения содержат несколько доменов специфичности и/или несколько антигенных доменов. Один из типов обменивателей специфичности лиганда/рецептора, имеющих несколько доменов специфичности и/или антигенных доменов, называется «мультимеризованные обмениватели специфичности лиганда/рецептора», поскольку они имеют несколько доменов специфичности и/или антигенных доменов, которые появляются в тандеме на одной и той же молекуле. Например, мультимеризованный домен специфичности может содержать два или более лигандов, которые взаимодействуют с одним типом рецептора, два или более лигандов, которые взаимодействуют с различными типами рецепторов на патогене, и два или более лигандов, которые взаимодействуют с различными типами рецепторов на различных патогенах.
Подобным образом, мультимеризованный антигенный домен может быть сконструирован так, чтобы содержать мультимеры одного и того же эпитопа патогена или различные эпитопы патогена, которые также могут быть мультимеризованы. То есть, некоторые мультимеризованные антигенные домены являются многовалентными, поскольку один и тот же эпитоп повторяется. Напротив, некоторые мультимеризованные антигенные домены имеют более одного эпитопа, присутствующего на одной и той же молекуле в тандеме, но эпитопы различны. Данные антигенные домены являются мультимеризованными, но не многовалентными. Дополнительно, некоторые мультимеризованные антигенные домены конструируются так, чтобы иметь различные эпитопы, но сами эти различные эпитопы являются многовалентными, поскольку каждый тип эпитопа повторяется.
Некоторые обмениватели специфичности лиганда/рецептора содержат прочие элементы в дополнение к домену специфичности и антигенному домену, такие, как последовательности, упрощающие очистку, линкеры, обеспечивающие большую гибкость и уменьшающие объемные препятствия, и последовательности, которые либо обеспечивают большую стабильность обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, сопротивляемость протеазному разрушению), либо способствуют разрушению (например, сайты распознавания протеазы). Например, обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать расщепляемые сигнальные последовательности, способствующие цитоплазменному экспорту пептида, и/или расщепляемые метки последовательности, упрощающие очистку в антительных колоннах, глутатионовых колоннах и металлических колоннах.
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать элементы, способствующие гибкости молекулы, уменьшающие объемные препятствия или позволяющие обменивателю специфичности лиганда/рецептора прикрепляться к основе или другой молекуле. Эти элементы совместно называются «линкерами». Одним из типов линкеров, которые могут внедряться в обмениватель специфичности лиганда/рецептора, является, к примеру, авидин или стрептавидин (или их лиганд - биотин). Посредством биотин-авидин/стрептавидинового соединения несколько обменивателей специфичности лиганда/рецептора могут соединяться друг с другом (например, через основу, такую как смола, или непосредственно), либо могут соединяться отдельные домены специфичности и антигенные домены. Еще один пример линкера, который может быть включен в обмениватель специфичности лиганда/рецептора, называется «8-линкер», поскольку он имеет последовательность, обнаруживаемую в фаге 8. Предпочтительными 8-последовательностями являются такие, которые соответствуют гибким ветвям фага. Эти последовательности могут вводиться в обмениватель специфичности лиганда/рецептора (например, между доменом специфичности и антигенным доменом или между мультимерами доменов специфичности и/или антигенных доменов) так, чтобы обеспечивать большую гибкость и уменьшать объемные препятствия.
Дополнительно, обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут содержать последовательности, которые либо обеспечивают сопротивляемость протеазному разрушению, либо способствуют протеазному разрушению. Путем внедрения нескольких цистеинов в обмениватель специфичности лиганда/рецептора может достигаться, например, большая сопротивляемость протеазному разрушению. Ожидается, что данные варианты выполнения обменивателя специфичности лиганда/рецептора остаются в организме на длительные периоды, что может быть выгодным для некоторых терапевтических применений. Напротив, обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут также содержать последовательности, которые способствуют быстрому разрушению, чтобы способствовать быстрому выводу из организма. Многие последовательности, которые служат в качестве сайтов распознавания для сериновой, цистеиновой и аспартовой протеаз, известны и могут вводиться в обмениватель специфичности лиганда/рецептора.
Следующий раздел описывает более подробно домены специфичности.
Домены специфичности
Типы доменов специфичности, которые могут использоваться в обменивателе специфичности лиганда/рецептора, разнообразны, поскольку известно большое количество лигандов, взаимодействующих с рецепторами на бактериях, паразитах, грибке, плесени, вирусах и раковых клетках. Многие типы бактерий, паразитов, грибка, плесени, вирусов и раковых клеток, например, взаимодействуют с внеклеточными матричными белками. Таким образом, желательные домены специфичности содержат по меньшей мере один лиганд, который имеет пептидную последовательность, присутствующую во внеклеточном матричном белке. То есть домен специфичности может содержать лиганд, имеющий пептидную последовательность, обнаруживаемую, например, в фибриногене, коллагене, витронектине, ламинине, плазмичогене, тромбоспондине и фибронектине.
Исследователи выделили участки внеклеточных матричных белков, которые взаимодействуют с несколькими рецепторами. (См., например, McDev-vit et al., Eur. J. Biochem., 247:416-424 (1997); Flock, Molecular Med. Today, 5:532 (1999); и Pei et al., Infect and Immun. 67:4525 (1999)). Некоторые рецепторы связываются с одним и тем же участком внеклеточного матричного белка, некоторые имеют перекрывающиеся домены связывания, а некоторые связываются вместе различными участками. Предпочтительно, лиганды, составляющие домен специфичности, имеют аминокислотную последовательность, которая была идентифицирована как участвующая в адгезии к внеклеточному матричному белку. Следует, однако, понимать, что случайные фрагменты известных лигандов для любого рецептора на патогене могут использоваться для выработки обменивателей специфичности лиганда/рецептора, и эти обмениватели-кандидаты специфичности лиганда/рецептора могут исследоваться в ходе характеристических анализов, описанных ниже, для идентификации молекул, которые взаимодействуют с рецепторами на патогене.
Некоторые домены специфичности содержат лиганд, взаимодействующий с бактериальным адгезионным рецептором, в том числе, не в порядке ограничения, внеклеточным связывающим фибриноген белком (Efb), связывающим коллаген белком, связывающим витронектин белком, связывающим ламинин белком, связывающим плазминоген белком, связывающим тромбоспондин белком, агрегирующим фактором A (ClfA), агрегирующим фактором Б (ClfB), связывающим фибронектин белком, коагулазой и внеклеточным белком прилипания. Показано, что лиганды, имеющие аминокислотную последовательность, соответствующую С-терминальной части гамма-цепочки фибриногена, конкурентно ингибируют связывание фибриногена с ClfA, рецептором адгезии Staphylococcus aureus. (McDevvit et al., Eur. J. Biochem., 247:416-424 (1997)). Далее, организмы Staphylococcus вырабатывают гораздо больше таких адгезионных рецепторов, как Efb, которые связываются с фибриногеном альфа-цепочки, ClfB, который взаимодействует и с α, и с β цепочками фибриногена, и Fbe, который связывается с β цепочкой фибриногена. (Pei et al., Infect. And lmmun. 67:4525 (1999)). Соответственно, предпочтительные домены специфичности содержат по меньшей мере 3 аминокислоты из последовательности, присутствующей в молекуле (например, фибриногене), которая может связываться с бактериальным адгезионным рецептором.
Домены специфичности могут также содержать лиганд, взаимодействующий с вирусным рецептором. Известны несколько вирусных рецепторов и соответствующих лигандов, и эти лиганды или их фрагменты могут быть внедрены в обмениватель специфичности лиганда/рецептора. Например, Tong et al., идентифицировали рецептор гепаднавируса, 170-kd-гликопротеин клеточной поверхности, взаимодействующий с доменом pre-S оболочечного белка вируса утиного гепатита Б (Патент США №5929220), a Maddon et al., определили, что поверхностный белок CD4 Т-клетки (или растворимая форма, называемая Т4) взаимодействует с gp120 ВИЧ (Патент США №6093539). Таким образом, домены специфичности, взаимодействующие с вирусным рецептором, содержат участки домена pre-S оболочечного белка вируса утиного гепатита Б (например, аминокислотные остатки 80-102 или 80-104) или участки поверхностного белка CD4 Т-клетки (или растворимой формы, называемой Т4), взаимодействующие с gp120 ВИЧ (например, внеклеточный домен CD4/T4 или его фрагменты). Существует еще много лигандов для вирусных рецепторов, и эти молекулы или их фрагменты могут использоваться в качестве домена специфичности.
Домены специфичности могут также содержать лиганд, взаимодействующий с рецептором, присутствующим на раковой клетке. Протоонкогенный HER-2/neu (C-erbB2) кодирует рецептор фактора поверхностного роста семейства тирозин-киназы, p185HER2. От двадцати до тридцати процентов пациентов с раком груди переэкспрессируют ген, кодирующий HER-2/neu (C-erbB2), путем генного усиления. Таким образом, обмениватели специфичности лиганда/рецептора, содержащие домен специфичности, который кодирует лиганд для HER-2/neu (C-erbB2), являются желательными вариантами выполнения. Многие типы раковых клеток также переэкспрессируют или дифференциально экспрессируют интегриновые рецепторы. Многие предпочтительные варианты выполнения содержат домен специфичности, который взаимодействует с интегриновым рецептором. Хотя интегрины в наибольшей степени взаимодействуют с внеклеточными матричными белками, известно, что эти рецепторы взаимодействуют с прочими лигандами, такими как инвазины, пептиды, содержащие RGD (то есть аргинин-глицин-аспартат) и химикаты. (См., например, патенты США №6090944 и 6090388; и Brett et al., Eur J Immunol, 23:1608 (1993)). Лиганды для интегриновых рецепторов содержат, не в порядке ограничения, молекулы, реагирующие с витронектиновым рецептором, ламининовым рецептором, фибронектиновым рецептором, коллагеновым рецептором, фибриногеновым рецептором, рецептором α4β1, рецептором α6β1, рецептором α3β1, рецептором α5β1 и рецептором αvβ3. Таблица 1 также показывает несколько предпочтительных доменов специфичности. Описанные выше домены специфичности обеспечиваются только в иллюстративных целях, и никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема доменов специфичности, которые могут использоваться в описанных здесь вариантах выполнения.
Следующий раздел более подробно описывает антигенные домены.
| Таблица 1 ДОМЕНЫ СПЕЦИФИЧНОСТИ | |
| YGEGQQHHLGGAKQAGDV | (SEQ.ID.No.1) |
| MSWSLHPRNLILYFYALLFL | (SEQ.ID.No.2) |
| ILYFYALLFLSTCVAYVAT | (SEQ.ID.No.3) |
| SSTCVAYVATRDNCCILDER | (SEQ.ID.No.4) |
| RDNCCILDERFGSYCPTTCG | (SEQ.ID.No.5) |
| FGSYCPTTCGIADFLSTYQT | (SEQ.ID.No.6) |
| LADFLSTYQTKVDKDLQSLE | (SEQ.ID.No.7) |
| KVDKDLQSLEDILHQVENKT | (SEQ.ID.No.8) |
| DILHQVENKTSEVKQLIKAI | (SEQ.ID.No.9) |
| SEVKQLIKAIQLTYNPDESS | (SEQ.ID.No.10) |
| QLTYNPDESSKPNMIDAATL | (SEQ.ID.No.11) |
| KPNMIDAATLKSRIMLEEIM | (SEQ.ID.No.12) |
| KSRIMLEEIMKYEASILTHD | (SEQ.ID.No.13) |
| KYEASILTHDSSIRYLQEIY | (SEQ.ID.No.14) |
| SSIRYLQEIYNSNNQKIVNL | (SEQ.ID.No.15) |
| NSNNQKIVNLKEKVAQLEAQ | (SEQ.ID.No.16) |
| CQEPCKDTVQIHDITGKDCQ | (SEQ.ID.No.17) |
| IHDITGKDCQDIANKGAKQS | (SEQ.ID.No.18) |
| DIANKGAKQSGLYFIKPLKA | (SEQ.ID.No.19) |
| GLYFIKPLKANQQFLVYCEI | (SEQ.ID.No.20) |
| NQQFLVYCEIDGSGNGWTVF | (SEQ.ID.No.21) |
| DGSGNGWTVFQKRLDGSVDF | (SEQ.ID.No.22) |
| QKRLDGSVDFKKNWIQYKEG | (SEQ.ID.No.23) |
| KKNWIQYKEGFGHLSPTGTT | (SEQ.ID.No.24) |
| FGHLSPTGTTEFWLGNEKIH | (SEQ.ID.No.25) |
| EFWLGNEKIHLISTQSAIPY | (SEQ.ID.No.26) |
| LISTQSAIPYALRVELEDWN | (SEQ.ID.No.27) |
| ALRVELE DWNGRTSTADYAM | (SEQ.ID.No.28) |
| GRTSTADYAMFKVGPEADKY | (SEQ.ID.No.29) |
| FKVGPEADKYRLTYAYFAGG | (SEQ.ID.No.30) |
| RLTYAYFAGGDAGDAFDGFD | (SEQ.ID.No.31) |
| DAGDAFDGFDFGDDPSDKFF | (SEQ.ID.No.32) |
| FGDDPSDKFFTSHNGMQFST | (SEQ.ID.No.33) |
| TSHNGMQFSTWDNDNDKFEG | (SEQ.ID.No.34) |
| WDNDNDKFEGNCAEQDGSGW | (SEQ.ID.No.35) |
| NCAEQDGSGWWMNKCHAGHL | (SEQ.ID.No.36) |
| WMNKCHAGHLNGVYYQGGTY | (SEQ.ID.No.37) |
| NGVYYQGGTYSKASTPNGYD | (SEQ.ID.No.38) |
| SKASTPNGYDNGIIWATWKT | (SEQ.ID.No.39) |
| NGIIWATWKTRWYSMKKTTM | (SEQ.ID.No.40) |
| RWYSMKKTTMKIIPFNRLTI | (SEQ.ID.No.41) |
| KIIPFNRLTIGEGQQHHLGGAKQAGDV | (SEQ.ID.No.42) |
Антигенные домены
Разнообразие антигенных доменов, которые могут использоваться в обменивателях специфичности лиганда/рецептора, также весьма велико, поскольку патоген или токсин могут иметь множество различных эпигонов. То есть антигенные домены, которые могут быть внедрены в обмениватель специфичности лиганда/рецептора, включают в себя эпитопы, наличествующие у бактерий, грибков, растений, плесени, вирусов, раковых клеток и токсинов. Желательные антигенные домены содержат эпитоп патогена, который уже присутствует в субъекте вследствие приобретенного естественным образом иммунитета или вакцинации. Эпитопы патогенов, вызывающих, например, детские заболевания, могут использоваться в качестве антигенных доменов.
Некоторые выполнения содержат антигенные домены, взаимодействующие с антителом, которое было введено субъекту. Например, антитело, взаимодействующее с антигенным доменом на обменивателе специфичности, может вводиться совместно с обменивателем специфичности. Далее, антитело, взаимодействующее с обменивателем специфичности лиганда/рецептора, может в обычном состоянии не существовать в субъекте, но субъект приобретает это антитело путем введения биологического материала (например, сыворотки, крови или ткани). Например, субъекты, которым производили переливание крови, приобретают многочисленные антитела, некоторые из которых могут взаимодействовать с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Некоторые предпочтительные антигенные домены для использования в обменивателе специфичности лиганда/рецептора содержат вирусные эпитопы, в том числе, не в порядке ограничения, вируса простого герпеса, вируса гепатита Б, вируса ТТ и вируса полиомиелита.
В некоторых вариантах выполнения также предпочтительно, чтобы антигенные домены содержали эпитоп патогена или токсина, который распознается «антителом с высоким титром». Подходы к определению распознаваемости эпитопа патогена или токсина антителом с высоким титром описаны ниже. К эпитопам патогена, которые могут быть включены в антигенный домен обменивателя специфичности лиганда/рецептора, относятся эпитопы на пептидных последовательностях, раскрываемые в патенте Швеции №9901601-6; патенте США №5869232; Mol. Immunol. 28:719-726 (1991); и J. Med. Virol. 33:248-252 (1991). Таблица II показывает аминокислотные последовательности нескольких предпочтительных антигенных доменов.
Раздел после Таблицы II описывает приготовление обменивателей специфичности лиганда/рецептора более подробно.
| Таблица II АНТИГЕННЫЕ ДОМЕНЫ |
| GLYSSIWLSPGRSYFET (SEQ.ID.No.43) |
| YTDIKYNPFTDRGE6NM (SEQ.ID.No.44) |
| DQNIHMNARLLIRSPFT (SEQ.ID.No.45) |
| LIRSPFTDPQLLVHTDP (SEQ.ID.No.46) |
| QKESLLFPPVKLLRRVP (SEQ.ID.No.47) |
| PALTAVETGAT (SEQ.ID.No.48) |
| STLVPETT (SEQ.ID.No.49) |
| TPPAYRPPNAPIL (SEQ.ID.No.50) |
| EIPALTAVE (SEQ.ID.No.51) |
| LEDPASRDLV (SEQ.ID.No.52) |
| HRGGPEEF (SEQ.ID.No.53) |
| HRGGPEE (SEQ.ID.No.54) |
| VLICGENTVSRNYATHS (SEQ.ID.No.55) |
| KINTMPPFLDTELTAPS (SEQ.ID.No.56) |
| PDEKSQREILLNKIASY (SEQ.ID.No.57) |
| TATTTTYAYPGTNRPPV (SEQ.ID.No.58) |
| STPLPETT (SEQ.ID.No.59 |
Способы изготовления обменивателей специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующих с рецепторами на бактериях, паразитах, грибках, плесени, вирусах и раковых клетках
В некоторых вариантах выполнения домены специфичности и антигенные домены изготавливаются по отдельности, а затем соединяются друг с другом (например, посредством линкеров или за счет связывания с общей несущей молекулой), а в других вариантах выполнения домен специфичности и антигенный домен изготавливаются в виде частей одной и той же молекулы. Например, любой из доменов специфичности, перечисленных в Таблице I, может соединяться с любым из антигенных доменов в Таблице II. Хотя домены специфичности и антигенные домены могут изготавливаться по отдельности и соединяться друг с другом посредством линкера или несущей молекулы (например, комплекс, содержащий биотинилированный домен специфичности, стрептавидин и биотинилированный антигенный домен), предпочтительно, чтобы обмениватель специфичности лиганда/рецептора изготавливался в виде фузионного белка. Таким образом, к предпочтительным вариантам выполнения относятся фузионные белки, содержащие любой из доменов специфичности, перечисленных в Таблице I, соединенный с любым из антигенных доменов из Таблицы II.
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут вырабатываться в соответствии с общепринятыми способами белковой инженерии, белковой химии, органической химии и молекулярной биологии. Дополнительно, некоторые коммерческие предприятия производят сделанные на заказ пептиды, и обмениватель специфичности лиганда/рецептора может быть получен путем предоставления такой компании последовательности желательного обменивателя специфичности лиганда/рецептора и использования их услуг для производства агента в соответствии с конкретными спецификациями (например, Bachem AG, Швейцария). Предпочтительно, обмениватели специфичности лиганда/рецептора приготавливаются с помощью способов химического синтеза (таких, как твердофазный пептидный синтез) посредством известных из уровня техники методов, таких, как описанные в Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:51:32 (1985), Stewart and Young (Solid Phase peptide synthesis. Pierce Chem Co., Rock-ford, IL (1984) и Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y.
В соответствии с одним из подходов твердофазный пептидный синтез выполняется с помощью пептидного синтезатора Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Каждый синтез использует р-метилбензилгидриламиновую твердофазную несущую смолу (Peptide International, Louisville, KY), выдающую карбоксил-терминальный амид при отщеплении пептидов от твердой основы с помощью кислотного гидролиза. Перед использованием карбоксил-терминальный амид может удаляться, и обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут очищаться путем высокопроизводительной жидкостной хроматографии (например, обратнофазной высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ОФ-ВПЖХ) с помощью колонны PepS-15 С 18 (Pharmacia, Уппсала, Швеция)), и последовательность определяется на определителе пептидной последовательности Applied Biosystems 473A. Альтернативный синтетический подход использует автоматизированный пептидный синтезатор (Syro, Multisyntech, Тюбинген, Германия) и защищенные 9-фторэнилметоксикарбонилом (фмок) аминокислоты (Milligen, Bedford, MA).
Хотя обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут синтезироваться химически, может быть более эффективным получать данные полипептиды путем технологии рекомбинантной ДНК с помощью общеизвестных в уровне техники методов. Такие способы могут использоваться для конструирования экспрессионных векторов, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие обмениватель специфичности лиганда/рецептора и подходящие транскрипционные и трансляционные управляющие сигналы. К этим способам относятся, например, методы in vitro рекомбинантной ДНК, синтетические методы и генетическая рекомбинация in vivo. Альтернативно, РНК, способная кодировать обмениватель специфичности лиганда/рецептора, может синтезироваться химически с помощью, например, синтезаторов. См., например, методы, описанные в Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford.
Множество векторных систем экспресии в хозяине могут использоваться для экспрессии обменивателей специфичности лиганда/рецептора. Если обмениватель специфичности лиганда/рецептора является растворимой молекулой, он может быть восстановлен из культуры, то есть из клетки хозяина, в случаях, когда пептид или полипептид не секрецируется, и из культурной среды в случаях, когда пептид или полипептид секрецируется клетками. Однако экспрессионные системы также охватывают сконструированные клетки хозяина, которые экспрессируют связанные с мембраной обмениватели специфичности лиганда/рецептора. Очистка или обогащение обменивателей специфичности лиганда/рецептора из таких экспрессионных систем могут выполняться с помощью подходящих детергентов и липидных мицелл, а также способов, хорошо известных специалистам.
К экспрессионным системам, которые могут использоваться, относятся, не в порядке ограничения, такие микроорганизмы, как бактерии (например, Е.coli или В.subtilis), преобразованные с помощью экспрессионных векторов рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или козмидной ДНК, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие обмениватель специфичности лиганда/рецептора; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia}, преобразованные с помощью рекомбинантных дрожжевых экспрессионных векторов, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие обмениватели специфичности лиганда/рецептора; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, Baculovirus), содержащими нуклеиновые кислоты, кодирующие обмениватели специфичности лиганда/рецептора; или клеточные системы млекопитающих (например, COS, СНО, ВНК, 293, 3T3), содержащие рекомбинантные экспрессионные конструкты, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие обмениватели специфичности лиганда/рецептора.
В бактериальных системах количество экспрессионных векторов может выгодным образом выбираться в зависимости от намеченного для обменивателя специфичности лиганда/рецептора использования. Например, когда желательно большое количество (например, для выработки фармацевтического состава обменивателей специфичности лиганда/рецептора), могут быть желательны векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней фузионно-белковых продуктов, которые уже являются очищенными. К таким векторам относятся, не в порядке ограничения, экспрессионный вектор pUR278 E.coli (Ruther et al., EMBO J., 2:1791 (1983), в котором кодирующая последовательность обменивателя специфичности лиганда/рецептора может индивидуально лигироваться в вектор в кадре с кодирующим участком lacZ так, чтобы получался фузионный белок; векторы pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509 (1989)); и тому подобные. Векторы ЗПУЧ также могут использоваться для экспрессирования чуждых полипептидов в виде фузионных белков с помощью глутатион S-трансферазы (ГСТ). В целом, такие фузионные белки растворимы и могут очищаться из лизированных клеток путем адсорбции на глутатион-агарозных шариках с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы ЗПУЧ сконструированы так, чтобы содержать протеазные сайты расщепления тромбина или фактора Ха, так, чтобы клонированный целевой генный продукт мог быть высвобожден из доли ГСТ.
В насекомой системе используется вирус ядерного полигедроза Autographa californica (AcNPV) в качестве вектора для экспрессии чуждых генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Генная кодирующая последовательность обменивателя специфичности лиганда/рецептора может клонироваться отдельно в необязательные участки (например, в ген полигедрина) вируса и попадает под управление промотера AcNPV (например, полигендринового промотера). Удачная вставка генной кодирующей последовательности обменивателя специфичности лиганда/рецептора приведет к дезактивации гена полигедрина и получению незакрытого рекомбинантного вируса (то есть вируса, у которого отсутствует белковое покрытие, кодируемое геном полигедрина). Эти рекомбинантные вирусы затем используются для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda, в которых экспрессируется вставленный ген. (Например, см. Smith et al., J. Virol. 46:584 (1983); и Smith, патент США №4215051).
В клетках млекопитающего хозяина может использоваться множество основанных на вирусах экспрессионных систем. В тех случаях, когда в качестве экспрессионного вектора используется аденовирус, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая обмениватель специфичности лиганда/рецептора, может быть лигирована с аденовирусным транскрипционным/трансляционным управляющим комплексом, например поздним промотером и трехчастной ведущей последовательностью. Этот химерический ген затем может вставляться в геном аденовируса путем рекомбинации in vitro или in vivo. Вставление в необязательный участок вирусного генома (например, участок Е1 или E3) приведет к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать генный продукт обменивателя специфичности лиганда/рецептора в инфицированных хозяевах. (См., например, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 (1984)). Специфические инициирующие сигналы также могут потребоваться для эффективной трансляции вставленных нуклеотидных последовательностей обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, инициирующий кодон АТГ и смежные последовательности). В большинстве случаев должен обеспечиваться экзогенный трансляционный управляющий сигнал, в том числе, инициирующий кодон АТГ. Более того, инициирующий кодон должен быть в фазе с кадром считывания желательной кодирующей последовательности для обеспечения трансляции всей вставки. Эти экзогенные трансляционные управляющие сигналы и инициирующие кодоны могут быть различной природы как естественные, так и синтетические. Эффективность экспрессии также можно усилить посредством внедрения подходящих улучшающих транскрипцию элементов, прерывателей транскрипции и т.д. (См. Bittner et al., Methods in Enzymol., 153:516-544 (1987)).
Вдобавок, может выбираться штамм клеток хозяина, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и обрабатывает генный продукт желательным специфическим образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными в некоторых вариантах выполнения. Различные клетки хозяина имеют отличительные и специфические механизмы для послетрансляционной обработки и модифицирования белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы хозяина могут выбираться для обеспечения корректного модифицирования и обработки экспрессированного чуждого белка. Для этого могут использоваться эукариотические клетки хозяина, обладающие клеточными механизмами для правильной обработки первичного транскрипта, гликозилирование и фосфорилирование генного продукта. К таким клеткам млекопитающих хозяев относятся, не в порядке ограничения, СНО, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 и WI38.
Для долгосрочного высокопроизводительного производства рекомбинантных белков предпочтительна стабильная экспрессия. Например, могут быть разработаны клеточные линии, которые стабильно экспрессируют описанные выше обмениватели специфичности лиганда/рецептора. Вместо использования экспрессионных векторов, содержащих вирусные источники репликации, клетки хозяина могут преобразовываться с помощью ДНК, управляемой подходящими элементами управления экспрессией (например, промотером, усиливающими последовательностями, прерывателями транскрипции сайтами полиадениляции и т.д.), и избирательного маркера. После введения чуждой ДНК сконструированным клеткам позволяют расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде, а затем их переводят в избирательную среду. Избирательный маркер в рекомбинантном плазмиде придает сопротивляемость выбору и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмид в свои хромосомы и расти, формируя очаги, которые, в свою очередь, клонируются и распространяются в клеточные линии. Этот способ предпочтительно используется для разработки линий, экспрессирующих обмениватель специфичности лиганда/рецептора.
Можно использовать множество систем выбора, в том числе, не в порядке ограничения, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler, et al., Cell 11:223 (1977)), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowy, et al., Cell, 22:817 (1980)) могут использоваться соответственно в клетках tk. sup-, hgprt. sup- или aprt. sup-. Антиметаболитная сопротивляемость также может использоваться в качестве основы выбора для следующих генов: dhfr, который придает сопротивляемость метотрексату (Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1980)); O'Hare, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, который придает сопротивляемость микофенольной кислоте (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, который придает сопротивляемость аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin, et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); и hygro, который придает сопротивляемость гигромицину (Santerre, et al., Gene 30:147 (1984)).
Следующий раздел описывает характеристические тесты обменивателя специфичности лиганда/рецептора более подробно.
Характеристические тесты обменивателя специфичности лиганда/рецептора
Предпочтительно обмениватели специфичности лиганда/рецептора анализируются на способность взаимодействовать с рецептором и/или способность взаимодействовать с антителом, которое может присутствовать в субъекте. Термин «характеристический тест» обозначает анализ, эксперимент или тест, выполняемый над обменивателем специфичности лиганда/рецептора, который оценивает способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с рецептором (например, поверхностным рецептором, присутствующим у бактерий, вирусов, плесени или грибков) или антителом (например, антителом, распознающим эпитоп на патогене), либо оказывать воздействие на пролиферацию патогена. Термином «характеристический тест» охватываются исследования связывания (например, ферментные иммунотесты (ФИТ), ферментно-связанные иммунные тесты (ELISA), тесты конкурентного связывания, компьютерно разработанные тесты связывания, тесты связывания с основой и одно- и двухгибридные системы) и исследования инфекционности (например, уменьшения вирусной инфекции, пропагации и прикрепления к клетке хозяина).
Предпочтительные тесты связывания используют мультимерные агенты. Одна из форм мультимерного агента связана с составом, содержащим обмениватель специфичности лиганда/рецептора или его фрагменты, расположенные на основе. Еще одна форма мультимерного агента включает в себя состав, содержащий рецептор или антитело, специфические для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора, расположенные на основе. «Основа» может представлять собой носитель, белок, смолу, клеточную мембрану или любую макромолекулярную структуру, используемую для соединения или иммобилизации таких молекул. К твердым основам относятся, не в порядке ограничения, стенки ячеек реакционного лотка, тестовые трубки, полистиреновые шарики, магнитные шарики, нитроцеллюлозные полоски, мембраны, такие микрочастицы, как частицы латекса, животные клетки, Duracyte®, искусственные клетки и прочее. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора может также соединяться с такими неорганическими основами, как кремниево-оксидный материал (например, силикагель, цеолит, диатомовая земля или аминированное стекло) посредством, например, ковалентного связывания через гидрокси-, карбокси- или аминогруппу и реактивную группу на основе.
В некоторых мультимерных агентах макромолекулярная основа имеет гидрофобную поверхность, которая взаимодействует с частью обменивателя специфичности лиганда/рецептора, рецептором или лигандом посредством гидрофобного нековалентного взаимодействия. В некоторых случаях гидрофобная поверхность основы является таким полимером, как пластик, или любым другим полимером, в котором гидрофобные группы связаны, таким как полистирен, полиэтилен или поливинил. Дополнительно, обмениватель специфичности лиганда/рецептора, рецептор или антитело, специфические для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора, могут быть ковалентно связаны с основами, в том числе белками и олиго/полисахаридами (например, целлюлозой, крахмалом, гликогеном, хитозаном или аминированной сефарозой). В этих последних мультимерных агентах реактивная группа на молекуле, такая, как гидрокси- или аминогруппа, используется для соединения с реактивной группой на носителе для создания ковалентной связи. Дополнительные мультимерные агенты содержат основу, имеющую другие реактивные группы, которые химически активируются так, чтобы прикреплять обмениватель специфичности лиганда/рецептора, рецептор или антитело, специфическое для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Могут, например, использоваться цианоген-бромид-активируемые матрицы, эпокси-активируемые матрицы, тио- и тио-пропиловые гели, нитрофенилхлорформатные и N-гидрокси- сукцинимид-хлорформатные связки или оксиранакриловые основы. (Sigma). Далее, в некоторых вариантах выполнения в качестве основы предполагается липосома или липидный бислой (естественный или синтетический), и обмениватель специфичности лиганда/рецептора, рецептор или антитело, специфическое для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора, может прикрепляться к поверхности мембраны или внедряться в мембрану с помощью методов липосомной инженерии. В соответствии с одним из подходов липосомные мультимерные основы содержат обмениватель специфичности лиганда/рецептора, рецептор или антитело, специфическое для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора, открытые на поверхности.
Также подразумевается вставка линкеров (например, «λ-линкеров», разработанных так, чтобы они напоминали гибкие участки фага) подходящей длины между обменивателем специфичности лиганда/рецептора, рецептором или антителом, специфическим для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора и основой, чтобы обеспечить большую гибкость и преодолеть любые объемные препятствия, которые предполагает основа. Определение подходящей длины линкера, обеспечивающей оптимальное связывание, может производиться путем скрининга прикрепляемой молекулы с помощью различных линкеров в подробно описываемых здесь характеристических тестах.
Несколько подходов к характеризации обменивателей специфичности лиганда/рецептора используют мультимеры, описанные выше. Например, связанный с основой обмениватель специфичности лиганда/рецептора может контактировать со «свободными» адгезионными рецепторами, и связь может определяться напрямую (например, путем использования маркировяттнмх адгезионных рецепторов) или косвенно (например, с помощью маркированного лиганда, направленного на адгезионный рецептор). Таким образом, кандидатные обмениватели специфичности лиганда/рецептора идентифицируются в качестве настоящих обменивателей специфичности лиганда/рецептора посредством связывания рецепторов со связанным с основой кандидатным обменивателем специфичности лиганда/рецептора. Альтернативно, связанные с основой адгезионные рецепторы могут контактировать со «свободными» обменивателями специфичности лиганда/рецептора, и количество связанного обменивателя специфичности лиганда/рецептора может определяться напрямую (например, с помощью маркированного обменивателя специфичности лиганда/рецептора) или косвенно (например, с помощью маркированного антитела, направленного на антигенный домен обменивателя специфичности лиганда/рецептора). Подобным же образом, с помощью антитела, специфичного для антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора, расположенного на основе, и маркированного обменивателя специфичности лиганда/рецептора (или вторичного детекционного реагента, например, маркированного рецептора или антитела к обменивателю специфичности лиганда/рецептора), может быть определена способность антитела связываться с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора.
Некоторые характеристические тесты оценивают способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с целевым рецептором и перенаправляющим антителом, в то время, как другие характеристические тесты разработаны для определения того, может ли обмениватель специфичности лиганда/рецептора связываться и с целевым рецептором, и с перенаправляющим антителом. В целом, характеристические тесты могут быть классифицированы как (1) характеристические тесты in vitro, (2) клеточные характеристические тесты и (3) характеристические тесты in vivo.
Обсуждение каждого типа характеристических тестов приводится в последующих разделах.
Характеристические тесты in vitro
Существует множество типов тестов in vitro, которые могут использоваться, чтобы определить, связывается ли обмениватель специфичности лиганда/рецептора с конкретным рецептором, и может ли антитело, находящееся в субъекте, связываться с обменивателем специфичности лиганда/рецептора. В самом простом варианте рецептор связывается с основой (например, чашкой Петри), и это связывание обменивателя специфичности лиганда/рецептора с рецептором отслеживается напрямую или косвенно, как описано выше. Подобным же образом, первичное антитело, направленное на антигенный домен обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, антитело, находящееся в субъекте), может быть связано с основой, и связывание обменивателя специфичности лиганда/рецептора с первичным антителом может определяться напрямую (например, с помощью маркированного обменивателя специфичности лиганда/рецептора) или косвенно (например, с помощью маркированного рецептора или маркированного вторичного антитела, взаимодействующего с эпитопом на обменивателе специфичности лиганда/рецептора, который не конкурирует с эпитопом, распознаваемым первичным антителом).
Еще один подход содержит тест по принципу сэндвича, когда рецептор связывается с основой, обмениватель специфичности лиганда/рецептора связывается с рецептором, а первичное антитело связывается с обменивателем специфичности лиганда/рецептора. Если используется маркированное первичное антитело, наличие комплекса рецептор/обмениватель специфичности/первичное антитело может определяться напрямую. Наличие комплекса рецептор/обмениватель специфичности/первичное антитело может также определяться косвенно с помощью, например, маркированного вторичного антитела, которое реагирует с первичным антителом на эпитопе, который не вмешивается в связывание первичного антитела с обменивателем специфичности лиганда/рецептора. В некоторых случаях может быть желательным использовать маркированное третичное антитело, реагирующее с немаркированным вторичным антителом с образованием таким образом комплекса рецептор/обмениватель специфичности/первичное антитело/вторичное антитело/маркированное третичное антитело.
Приводимый ниже пример описывает характеристический тест, который был выполнен, чтобы определить, ингибирует ли домен специфичности, производный от С-терминального домена фибриногена, связывание агрегирующего фактора (Clf) с фибриногеном.
ПРИМЕР 1
В данном примере несколько пептидов, соответствующих С-терминальному домену фибриногена (Fib), анализировались с точки зрения их способности блокировать связывание агрегирующего фактора (Clf) с фибриногеном. (См. Таблицу III). Эти пептиды были произведены с помощью стандартных для пептидного синтеза методов с использованием fmoc-химии (Syro, MultiSynTech, Германия). Предпочтительно, пептиды очищаются путем обратнофазного ВПЖХ. Затем производился конкурентный ферментный иммунный анализ, чтобы определить, были ли пептиды способны блокировать взаимодействие между Clf и фибриногеном. Результаты этих экспериментов показаны в Таблице III. Наименьшим пептидом из фибриногена, который оказался способен ингибировать взаимодействие между Clf и фибриногеном, был HLGGAKQAGDV (ИД. ПОСЛ. №124).
| Таблица III | ||
| SEQ ID NO. (Fib) пептид | Ингибирование взаимодействия (Fib/Clf) | |
| 106 | LTIGEGQQHHLGGAKQAGDV | + |
| 107 | GEGQQHHLGGAKQAGDV | + |
| 108 | QQHHLGGAKQAGDV | + |
| 109 | QHHbGGAKQAGDV | + |
| 110 | HHLGGAKQAGDV | + |
| 111 | HLGGAKQAGDV | + |
| 112 | LGGAKQAGDV | - |
| 113 | GGAKQAGDV | - |
| 114 | GAKQAGDV | - |
| 115 | QHHLGGAKQAGD | + |
| 116 | QHHLGGAKQAG | + |
| 117 | QHHLGGAKQA | - |
| 118 | QHHLGGAKQ | - |
| 119 | QHHLGGAK | +/- |
| 120 | QHHLGGA | - |
| 121 | HHLGGAKQAGDV | + |
| 122 | HHLGGAKQAGD | + |
| 123 | HHLGGAKQAG | + |
| 124 | HLGGAKQAGDV | + |
| 125 | HLGGAKQAGD | 4- |
| 126 | ALGGAKQAG | - |
| 127 | HAGGAKQAG | + |
| 128 | HLAGAKQAG | + |
| 129 | HLGAAKQAG | + |
| 130 | HLGGGKQAG | + |
| 131 | HLGGAAQAG | +/- |
| 132 | HLGGAKAAG | + |
| 133 | HLGGAKQGG | + |
| 134 | HLGGAKQAA | + |
Следующий пример описывает характеристический тест, который был выполнен, чтобы определить, взаимодействует ли обмениватель специфичности лиганда/рецептора с бактериями, имеющими рецептор ClfA.
ПРИМЕР 2
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, имеющие домены специфичности (длиной приблизительно 20 аминокислот), соответствующие различным участкам последовательности гамма-цепочки фибриногена, были получены с помощью стандартных в пептидном синтезе методов с помощью fmoc-химии (Syro, MultiSynTech, Германия), и данные обмениватели специфичности лиганда/рецептора анализировались на предмет их способности связывать рецептор ClfA и антитело, специфическое для их антигенных доменов. Последовательности этих обменивателей специфичности лиганда/рецептора перечислены в Таблице IV, а также в листинге последовательностей (ИД. ПОСЛ. №60-103). Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, использованные в данном тесте, имеют антигенный домен, который представляет эпитоп белка gG2 вируса простого герпеса, который распознается моноклональным антителом к белкам gG2 вируса простого герпеса. Выполнялись последовательные разбавления этих обменивателей специфичности лиганда/рецептора в фосфатном буферном солевом растворе (ФБС), содержащем 2:г/мл козлиной сыворотки. (Sigma Chemicals, St. Louis, МО) и 0,5% Tween 20 (ФБС-GT). Рецептор ClfA пассивно адсорбировался при 10 мкг/мл в 96-ячеечные пластины микротитра в 50-мМоль натриево-карбонатном буфере, рН 9,6, в течение ночи при +4°С.
Разбавленные обмениватели специфичности лиганда/рецептора затем инкубировались на пластинах в течение 60 минут. Способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с рецептором определялась путем добавления на пластину первичного антитела и инкубирования в течение 60 минут (разбавление mAb 1:1000 для белков gG2 вируса простого герпеса). Связанное первичное mAb затем опознавалось с помощью кроличьего антимышиного IgG (Sigma) вторичного антитела и маркированного пероксидазой козлиного антикроличьего IgG (Sigma) третичного антитела. Пластинки проявлялись путем инкубации с динитрофенилендиамином (Sigma), и анализировалось поглощение при 405 нм.
Все обмениватели специфичности лиганда/рецептора, приведенные в Таблице IV (ИД. ПОСЛ. №60-103), заметно связывали иммобилизованный ClfA, а также обеспечивали связывание mAb, специфического для белка gG2 вируса простого герпеса. Описанный выше способ определения сродства обменивателя специфичности лиганда/рецептора для адгезионного рецептора и первичного антитела может быть выполнен для любого кандидатного обменивателя специфичности лиганда/рецептора, содержащего любой домен специфичности и любой антигенный домен, при условии, что будут использованы подходящие последовательности и адгезионные рецепторы.
Пример после Таблицы IV описывает еще один характеристический тест, который был выполнен, чтобы определить, взаимодействует ли обмениватель специфичности лиганда/рецептора с бактериями, имеющими рецептор ClfA.
ПРИМЕР 3
Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, имеющие домены специфичности, которые связываются с агрегирующим фактором (Clf), и антигенные домены, которые соответствуют эпитопу, производному от вируса полиомиелита, были получены с помощью стандартных в пептидном синтезе методов с помощью fmoc-химии (Syro, MultiSynTech, Германия). См. Таблицу V. Эти обмениватели специфичности лиганда/рецептора анализировались на предмет их способности ингибировать взаимодействие между CLF и фибриногеном. В данных экспериментах производились описанные в Таблице V обмениватели специфичности лиганда/рецептора, и различные концентрации этих молекул добавлялись в ферментный конкурентный иммуноанализ, содержащий Clf и фибриноген. Устанавливалась самая низкая ингибирующая концентрация, являющаяся самой низкой концентрацией пептида, необходимой для ингибирования взаимодействия Clf/Fib. Соответственно, чем ниже концентрация, необходимая для ингибирования взаимодействия Clf/Fib, тем более эффективен ингибитор. Дополнительно определялась самая низкая концентрация твердофазного связанного пептида, являющаяся самой низкой протестированной концентрацией пептида, распознаваемой антителами к вирусу полиомиелита, в иммунотесте. Некоторые из использованных пептидов (например, CPALTAVETGCTNPLAAHHLGGAKQAG (ИД. ПОСЛ. №135), HHLGGAKQAGAACPALTAVETGCTNPL (ИД. ПОСЛ. №137), CPALTAVETGCTNPLHHLGGAKQAG (ИД. ПОСЛ. №139) и HHLGGAKQAGCPALTAVETGCTNPL (ИД. ПОСЛ. №141)), обозначенные в Таблице V звездочками, были зациклены между двумя искусственно введенными цистеиновыми остатками. Данные эксперименты показали, что HHLGGAKQAG-AA-CPALTAVETGCTNPL (ИД. ПОСЛ. №137) и HHLGGAKQAG-CPALTAVETGCTNPL (ИД. ПОСЛ. №142) эффективно ингибировали взаимодействие Clf с фибриногеном и удерживали функциональные эпитопы вируса полиомиелита.
| Таблица V | ||
| Самая низкая ингибирующая конц. | Самый низкий эпитоп на твердой фазе | |
| ИД Пептидная последовательность | (мкг/мл) | (мкг/мл) |
| 135 CPALTAVETGCTNPL-AA-HHLGGAKQAG* | >625 | 1,6 |
| 136 CPALTAVETGCTNPL-AA-HHLGGAKQAG | 625 | 1,6 |
| 137 HHLGGAKQAG-AA-CPALTAVETGCTNPL* | 69 | 8 |
| 138 HHLGGAKQAG-AA-CPALTAVETGCTNPL | 625 | >200 |
| 139 CPALTAVETGC-TNPLHHLGGAKQAG* | 625 | 1,6 |
| 140 CPALTAVETGC-TNPLHHLGGAKQAG | 208 | 1,6 |
| 141 HHLGGAKQAG-CPALTAVETGCTNPL* | 208 | >200 |
| 142 HHLGGAKQAG-CPALTAVETGCTNPL | 23 | 1,6 |
| 143 PALTAVETGATNPL-HHLGGAKQAG | >625 | 1,6 |
| 144 HHLGGAKQAG-PALTAVETGATNPL | >625 | >200 |
Следующий раздел описывает несколько основанных на клетках характеристических тестов, которые могут выполняться, чтобы определить, оказывает ли обмениватель специфичности лиганда/рецептора воздействие на пролиферацию патогена.
Характеристические тесты, основанные на патогене
В еще одном типе характеристического теста используется основанный на патогене подход к оценке способности обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с патогеном и антителом, направленным на антигенный домен обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Этот тест также раскрывает способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора воздействовать на пролиферацию патогена, поскольку в организме субъекта взаимодействие обменивателя специфичности лиганда/рецептора с патогеном и антителом, направленным на антигенный домен обменивателя специфичности лиганда/рецептора, сопровождается гуморальной и клеточной реакциями, которые выводят патоген из субъекта (например, комплементарная фиксация или разрушение макрофагами). В целом, основанные на патогене характеристические тесты содержат введение обменивателей специфичности лиганда/рецептора в культивированные патогены и отслеживание связывания обменивателя специфичности лиганда/рецептора с клеткой или вирусом. Может использоваться несколько видов основанных на патогене характеристических тестов, и приводимый ниже пример описывает некоторые из предпочтительных характеристических тестов более подробно.
ПРИМЕР 4
Один тип основанного на патогене характеристического теста содержит связывания обменивателя специфичности лиганда/рецептора с бактериями, расположенными на основе. Соответственно, бактерии, производящие Clfa, (например, Staphylococcus aureus или Escherichia coli) выращиваются в культуре или на агаровой пластине в подходящей среде роста (например, бульон LB, кровяной бульон, агар LB или кровяной агар). Затем клетки переносятся на мембрану (например, нитроцеллюлозу или нейлон) либо путем помещения культуры на мембрану под вакуумом (например, с помощью дотблоттингового коллекторного устройства), либо путем размещения мембраны на колониях на период, достаточный для переноса. К клеткам, которые связываются с мембраной, затем подается последовательное разбавление обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, 500 нг, 1:г, 5:г, 10:г, 25:г и 50:г обменивателя специфичности лиганда/рецептора в общем объеме 200: л ФБС). В одном эксперименте использовались обмениватели специфичности лиганда/рецептора, перечисленные в Таблице IV или V. Затем разбавленные обмениватели специфичности лиганда/рецептора инкубировались на мембранах в течение 60 минут. После этого несвязанные обмениватели специфичности лиганда/рецептора удаляются, и мембрана промывается с помощью ФБС (например, 3 промывания по 2 мл ФБС). Затем подается разбавление 1:100-1:1000 первичного антитела, взаимодействующего с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, mAb для белка gG2 вируса простого герпеса), и реакции связывания позволяют протекать в течение 60 минут. Мембрана снова промывается с помощью ФБС (например, 3 промывания по 2 мл ФБС) для удаления несвязанного первичного антитела. Подходящие контрольные агенты включают в себя саму мембрану, бактерии на мембране без обменивателя специфичности лиганда/рецептора и бактерии на мембране с обменивателем специфичности лиганда/рецептора, но без первичного антитела.
Чтобы определить количество обменивателя специфичности лиганда/рецептора, связанного с бактериями на мембране, используются вторичное антитело (например, кроличий антимышиный IgG (Sigma)) и третичное антитело (например, маркированный пероксидазой козлиный антикроличий IgG (Sigma)). Разумеется, маркированное вторичное антитело, взаимодействующее с первичным антителом, также может использоваться. Как было отмечено выше, вторичное антитело контактирует с мембраной в течение 60 минут, и несвязанные вторичные антитела вымываются из мембраны с помощью ФБС (например, 3 промывания по 2 мл ФБС). Затем третичное антитело контактирует с мембраной в течение 60 минут, а несвязанные антитела вымываются из мембраны с помощью ФБС (например, 3 промывания по 2 мл ФБС). Связанные третичные антитела могут обнаруживаться путем инкубирования мембраны с динитрофенилендиамином (Sigma).
Еще один подход содержит использование иммобилизированного обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Соответственно, первичное антитело (например, mAb для белка gG2 вируса простого герпеса) связывается с чашкой Петри. Когда первичное антитело связано, на покрытую чашку вводятся различные разбавления обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, обменивателя специфичности лиганда/рецептора, описанного в Таблице IV или V). Обменивателю специфичности лиганда/рецептора позволяют связываться с первичным антителом в течение 60 минут, а несвязанный обмениватель специфичности лиганда/рецептора вымывается (например, 3 промывания по 2 мл ФБС). Подходящие контрольные агенты включают в себя чашки Петри без первичного антитела или обменивателя специфичности лиганда/рецептора.
После этого в чашки Петри добавляется мутный раствор бактерий (например, Е.coli), и бактериям позволяют взаимодействовать с иммобилизированным обменивателем специфичности лиганда/рецептора в течение 60 минут. Затем несвязанные бактерии удаляются путем промывания с помощью ФБС (например, 3 промывания по 2 мл ФБС). Затем среда роста (например, бульон LB) подается в чашку Петри, и культура инкубируется в течение ночи. Альтернативно в чашку Петри добавляется агар LB, и культура инкубируется в течение ночи. Взаимодействие между обменивателем специфичности лиганда/рецептора и бактериями может наблюдаться визуально (например, мутная среда роста, которая может быть измерена с помощью спектрофотометрического анализа, или появление колоний на агаре).
Модифицируя вышеописанные подходы, специалист может оценить способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с вирусом. Например, показано, что растворимые фрагменты гликопротеина Т4 взаимодействуют с оболочечным гликопротеином вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). (См., например, патент США №6093539). Обмениватели специфичности лиганда/рецептора, содержащие домен специфичности, содержащий фрагмент гликопротеина Т4, взаимодействующий с оболочечным гликопротеином ВИЧ (например, аминокислоты 1-419 последовательности гликопротеина Т4, описанной в патенте США №6093539, или ее части), может быть изготовлен посредством синтеза фузионного белка, имеющего домен специфичности, соединенный с антигенным доменом (например, антигенным доменом из Таблицы II). Хотя для получения обменивателя специфичности лиганда/рецептора может использоваться пептидная химия, предпочтительно, чтобы экспрессионный конструкт, содержащий фрагмент гликопротеина Т4, соединенный с антигенным доменом, изготавливался и трансфецировался в подходящую клетку. Стратегии экспрессии и очистки, описанные выше и в патенте США №6093539, также могут использоваться.
Когда обмениватель специфичности лиганда/рецептора сконструирован, выполняется тест связывания с фильтром. Соответственно, последовательные десятикратные разбавления инокулята ВИЧ вводятся на мембрану (например, нитроцеллюлозу или нейлон) в дот-блоттинговом устройстве при постоянном вакууме. Затем последовательные десятикратные разбавления обменивателя специфичности лиганда/рецептора вводятся на связанные частицы ВИЧ. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора контактирует с частицами в течение 60 минут перед подачей вакуума и промыванием с помощью ФБС (например, 3 промывания по 2 мл ФБС). Когда несвязанный обмениватель специфичности лиганда/рецептора удален, последовательные десятикратные разбавления первичного антитела, которое связывается с антигенным доменом, добавляются к образцам, и реакции связывания позволяют идти в течение 60 минут. Затем подается вакуум, и несвязанные первичные антитела вымываются с помощью ФБС (например, 3 промывания по 2 мл ФБС). Связанные первичные антитела могут обнаруживаться, как описано выше.
Способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с вирусом также может быть оценена в анализе по принципу сэндвича. Соответственно, первичное антитело, взаимодействующее с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора, иммобилизируется в ячейках микротитра, и последовательные разбавления обменивателя специфичности лиганда/рецептора добавляются к первичному антителу, чтобы создать комплекс первичное антитело/обмениватель специфичности лиганда/рецептора, как описано выше. Затем добавляются последовательные десятикратные разбавления инокулята ВИЧ, и реакции связывания позволяют идти в течение 60 минут. Несвязанные частицы ВИЧ удаляются посредством последовательных промываний в ФБС. Обнаружение связанных частиц ВИЧ может выполняться с помощью радиомаркированного антитела к ВИЧ (например, антитела, полученного из сывороток человека, страдающего ВИЧ-инфекцией).
Хотя вышеприведенные примеры описывают основанные на патогене тесты с помощью бактерий и вируса, могут быть выполнены модификации этих подходов для изучения взаимодействия обменивателей специфичности лиганда/рецептора с клетками млекопитающих. Например, способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора взаимодействовать с интегриновым рецептором, присутствующим на раковой клетке, может быть определена следующим образом. Меланомные клетки, экспрессирующие рецептор ∀v∃3 (например, меланомные клетки М21 человека) связывают фибриноген, и это взаимодействие может быть блокировано подачей пептида, содержащего RGD (См., например, Katada et al., J. Biol. Chem. 272:7720 (1997) и Felding-Habermann et al., J. Biol. Chem. 271:5892-5900 (1996)). Подобным же образом многие другие типы раковых клеток экспрессируют интегрины, которые взаимодействуют с RGD-пептидами. В соответствии с одним из подходов раковые клетки, экспрессирующие реагирующий на RGD интегрин (например, меланомные клетки М21 человека), культивируются до слияния. Клетки М21 могут выращиваться в среде DMEM с 10% сывороткой бычьего плода, 20 мМоль Hepes и 1 мМоль пирувата.
Предпочтительно, клетки окрашиваются гидроэтидином (Polysciences, Inc., Warrington, PA) с конечной концентрацией 20 мкг/мл (2×106 клеток/мл) в течение 30 минут при 37°С, а затем дважды промываются для удаления избыточного красителя. Гидроэтидин внедряется в ДНК, давая красное флюоресцентное маркирование клеток, и не портит адгезивные функции клетки. Окрашивание обеспечивает способ подсчета связывания обменивателя специфичности лиганда/рецептора с клетками. То есть общее количество окрашенных гидроэтидином клеток можно сравнить с количеством клеток, связанных с флюоресцентно маркированным комплексом первичное антитело/обмениватель специфичности лиганда/рецептора, для определения эффективности связывания.
Соответственно, окрашенные клетки инкубируются с различными разбавлениями обменивателя специфичности лиганда/рецептора, содержащего последовательность RGD (например, GRGDSPHRGGPEE (ИД. ПОСЛ. №104) или WSRGDWHRGGPEE (ИД. ПОСЛ. №105)). После 60 минут инкубации несвязанный обмениватель специфичности лиганда/рецептора удаляется путем нескольких промываний в среде DMEM с 10% сыворотки бычьего плода 20 мМоль Hepes и 1 мМоль пирувата (например, три промывания по 5 мл среды). Затем подается разбавление 1:100-1:1000 первичного антитела, взаимодействующего с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора (например, mAb для белка gG2 вируса простого герпеса), и реакции связывания позволяют идти в течение 60 минут. После этого выполняются несколько промываний в среде для удаления несвязанных первичных антител. Подходящие контрольные агенты включают в себя окрашенные клетки без обменивателя специфичности лиганда/рецептора или окрашенные клетки без первичного антитела.
После связывания первичного антитела добавляется козлиное антимышиное ПТС-маркированное антитело (разбавление 1:100) (Sigma), и связывание допускается в течение 60 минут. Снова выполняется несколько промываний для удаления несвязанных вторичных антител. Производится тест посредством цитометрии потока с установкой фильтра на 543/590 нм для гидроэтидина и на 495/525 нм для флюоресцина. Можно наблюдать значительное связывание первичного антитела с комплексом обмениватель специфичности лиганда/рецептора/клетка, что демонстрирует тот факт, что обмениватель специфичности лиганда/рецептора оказывает воздействие на клетку.
Приводимый ниже пример описывает характеристический тест, который подтверждает, что RGD-содержащие обмениватели специфичности лиганда/рецептора эффективно связываются с клетками млекопитающих и перенаправляют антитела на эти клетки.
ПРИМЕР 5
Пептид RGDSAATPPAYR (ИД. ПОСЛ. №145) был приготовлен с помощью стандартных в пептидном синтезе методов, использующих fmoc-химию (Syro, MultiSynTech, Германия). Этот пептид имеет домен специфичности, который связывает интегриновые рецепторы, спейсер (АА) и антигенный домен, имеющий эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом 57/8, эпитоп, присутствующий на е-антигене вируса гепатита Б (HbeAg).
Мышиные миеломные клетки (клетки SP2/0) промывались в бессывороточной среде, а затем инкубировались с пептидом RGDSAATPPAYR (ИД. ПОСЛ. №145) или контрольным пептидом, производным от домена NS3 вируса гепатита Ц (ВГЦ) при концентрации 50 мкг/мл. Затем клетки промывались, и количество связанного на поверхности пептида определялось путем маркирования клеток с помощью антитела 57/8. Связанные на поверхности антитела отмечались по маркированному FITC конъюгату антимышиного IgG, разбавленному 1/500, а уровень поверхностного окрашивания определялся с помощью флюоресцентной микроскопии.
Эксперимент показал, что клетки, инкубированные с контрольным пептидом, не проявили окрашивания. Напротив, клетки, инкубированные с пептидом RGDSAATPPAYR (ИД. ПОСЛ. №145), проявили значительное поверхностное окрашивание, соответствующее расположению поверхностно-экспрессированных интегринов. Соответственно, RGD-содержащие обмениватели специфичности лиганда/рецептора эффективно связывают вырабатывающие интегрин клетки млекопитающего, и эти молекулы могут использоваться для перенаправления и нацеливания антител на опухолевые клетки.
Следующий раздел описывает характеристические тесты, которые проводятся на животных.
Характеристические тесты in vivo
К характеристическим тестам относятся также эксперименты, оценивающие обмениватели специфичности лиганда/рецептора in vivo. Существует множество животных моделей, пригодных для оценки способности обменивателя специфичности лиганда/рецептора ингибировать патогенную инфекцию. Мыши являются предпочтительными, поскольку их легко содержать, и они подвержены бактериальной инфекции, вирусной инфекции и раку. Шимпанзе также предпочтительны из-за своего близкого генетического родства с людьми.
Подход к оцениванию эффективности обменивателя специфичности лиганда/рецептора для мышей приведен в следующем примере.
ПРИМЕР 6
Чтобы протестировать способность обменивателя специфичности лиганда/рецептора лечить бактериальную инфекцию, может быть выполнен следующий характеристический анализ. Несколько самок аутбридинговых мышей CF-1 (Charles Rivers Laboratories) в возрасте приблизительно 8 недель и с массой тела 25 грамм вакцинировались с помощью антигенных доменов тестируемых обменивателей специфичности лиганда/рецептора. Антигенные домены предпочтительно соединялись с носителем и вводились с адъювантом. Например, антигенные домены могут быть сращены с «замочно-скважинным» гемоцианином или альбумином бычьей сыворотки, который выступает как в роли носителя, так и в роли адъюванта, либо может использоваться такой адъювант, как адъювант Фройнда, гидроксид алюминия или лизолецитин. Как только высокий титр антитела к антигенным доменам может быть подтвержден с помощью, например, иммунодиффузии или ФИТ, иммунизированные мыши инокулируются внутрибрюшинно с помощью выращенных в течение ночи культур Staphylococcus aureus NTCC 10649. Инокуляты подбираются так, чтобы давать приблизительно 100×СД50 или log 6,6 для S.aureus.
Последовательные разбавления обменивателей специфичности лиганда/рецептора (например, обменивателей специфичности лиганда/рецептора, приведенных в Таблице IV) формулируются в стерильной воде для инъекции и вводятся по подкожному (ПК) или пероральному (ПО) маршруту через один и пять часов после инфицирования. Одновременно с каждой попыткой контрольное заражение СД50 подтверждалось инокулированием необработанных мышей с помощью логарифмических разбавлений бактериального инокулята. Предпочтительно, диапазон из пяти логарифмических разбавлений бактериальной инфекции инокулируются пяти группам по десять мышей в каждой (по десять мышей на логарифмическое разбавление). Смертность 100% будет вызвана во всех группах необработанных мышей при контрольном заражении инокулятом 100×СД50. Мыши ежедневно отслеживаются на предмет смертности в течение семи дней. Средняя эффективная доза для защиты 50% мышей (ЭД50) может быть вычислена из суммарной смертности путем логарифмического пробит-анализа вычерченной кривой выживаемости в зависимости от дозы, как описано в Antimicrob. Agents Chemother. 31:1768-1774 и Proc. Soc. Exp.Biol. Med. 1994, 57, 261-264. Как отметит специалист, подобные подходы могут использоваться для тестирования способности обменивателей специфичности лиганда/рецептора ингибировать вирусную инфекцию и рак.
Описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора могут быть сформулированы в виде фармацевтических препаратов и вводиться субъектам, нуждающимся в агенте, ингибирующем пролиферацию патогена. Следующий раздел описывает несколько фармацевтических препаратов, содержащих обмениватели специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующие с рецептором на патогене.
Фармацевтические препараты, содержащие обмениватель специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующий с рецептором на патогене
Описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора пригодны для внедрения в фармацевтические препараты для введения субъектам, нуждающимся в соединении, которое лечит или предотвращает инфицирование патогеном. Эти фармацевтически активные соединения могут обрабатываться в соответствии с общепринятыми способами галеновой фармакологии для получения медицинских агентов для введения млекопитающим, в том числе людям. Активные ингредиенты могут внедряться в фармацевтический продукт с модифицированием и без него. Далее, производство фармацевтических препаратов или терапевтических агентов, доставляющих фармакологически активные соединения по настоящему изобретению по нескольким маршрутам, является аспектом настоящего изобретения. Например, и не в порядке ограничения, ДНК, РНК и вирусные векторы, имеющие последовательности, кодирующие обмениватель специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующий с рецептором на патогене, используются с вариантами выполнения изобретения. Нуклеиновые кислоты, кодирующие обмениватель специфичности лиганда/рецептора, могут вводиться отдельно или в комбинации с прочими активными ингредиентами.
Соединения могут использоваться в смеси с общепринятыми наполнителями, то есть фармакологически приемлемыми органическими или неорганическими веществами-носителями, пригодными для парентерального, энтерального (например, перорального) или местного введения, чтобы не реагировать ухудшающим образом с описанными здесь фармакологически активными ингредиентами. Подходящие фармакологически приемлемые носители включат в себя, не в порядке ограничения, воду, солевые растворы, спирты, гуммиарабик, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, такие углеводы, как лактоза, амилоза или крахмал, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, косметическое масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, пентаэритритоловые сложные эфиры жирной кислоты, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.д. Еще больше возможных носителей описано в Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton:Mack Publishing Company, pp.1405-1412 и 1461-1487 (1975) и в The National Formulary XIV, 14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association (1975). Фармацевтические препараты могут быть стерилизованы и, по желанию, смешаны со вспомогательными агентами, например лубрикантами, консервантами, стабилизаторами, смачивателями, эмульгаторами, солями для воздействия на осмотическое давление, буферами, красящими, вкусовыми и/или ароматическими веществами и тому подобным, если вспомогательные агенты не реагируют ухудшающим образом с обменивателями специфичности лиганда/рецептора.
Эффективная дозировка и способ введения конкретного фармацевтического препарата, содержащего обмениватель специфичности лиганда/рецептора, могут варьироваться в зависимости от индивидуальных нужд пациента и желательных лечебных или профилактических нужд. Терапевтическая эффективность и токсичность таких соединений может определяться посредством стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например ЭД50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Например, эффективная доза обменивателя специфичности лиганда/рецептора может быть оценена с помощью описанных выше характеристических тестов. Данные, полученные в этих анализах, используются затем при формулировании диапазона дозировок для использования с прочими организмами, в том числе людьми. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, в том числе ЭД50 без токсичности. Дозировка варьируется в данном диапазоне в зависимости от типа обменивателя специфичности лиганда/рецептора, используемой формы дозировки, чувствительности организма и маршрута введения.
Нормальные дозировки обменивателя специфичности лиганда/рецептора могут варьироваться от приблизительно 1 до 100000 микрограммов, вплоть до общей дозы приблизительно 10 граммов, в зависимости от маршрута введения. Желательные дозы содержат приблизительно 250:г - 1 мг, приблизительно 50 мг - 200 мг и приблизительно 250 мг - 500 мг.
В некоторых вариантах выполнения доза обменивателя специфичности лиганда/рецептора предпочтительно дает концентрацию в ткани или крови или и там, и там, равную приблизительно от 0,1:Моль до 500 мМоль. Желательные дозы дают концентрацию в ткани или крови или и там, и там, равные приблизительно от 1 до 800 мкМоль. Предпочтительные дозы дают концентрацию в ткани или кров, большие, чем от приблизительно 10 мкМоль до приблизительно 500:Моль. Несмотря на то, что дозы, дающие концентрацию в ткани больше, чем 800:Моль, не являются предпочтительными, они могут использоваться. Также может обеспечиваться постоянная инфузия обменивателя специфичности лиганда/рецептора, чтобы поддерживать стабильную концентрацию в тканях по измерениям уровней в крови.
Точная дозировка выбирается конкретным врачом в зависимости от лечащегося пациента. Дозирование и введение регулируются так, чтобы обеспечивать достаточные уровни активной доли или поддерживать желательное воздействие. В расчет могут приниматься дополнительные факторы, такие, как тяжесть заболевания, возраст организма и вес или размер организма; питание, время и частота введения, комбинации медикаментов, реакционные чувствительности и переносимость/реакция на терапию. Краткосрочно действующие фармацевтические составы вводятся ежедневно или более часто, в то время как долгосрочно действующие фармацевтические составы вводятся каждые 2 или более дней, раз в неделю или раз в две недели, или даже еще реже.
К маршрутам введения фармацевтических препаратов относятся, не в порядке ограничения, местный, чрескожный, парентеральный, желудочно-кишечный, чрезбронхиальный и чрезальвеолярный. Чрескожное введение выполняется путем нанесения крема, полоскания, геля и т.д., способных вызывать проникание обменивателей специфичности лиганда/рецептора через кожу. К парентеральным маршрутам введения относятся, не в порядке ограничения, электрическая или прямая инъекция, такая как прямая инъекция в центральную венозную линию, внутривенная, внутримышечная, внутрибрюшинная, внутрикожная или подкожная инъекции. К желудочно-кишечным маршрутам введения относятся, не в порядке ограничения, проглатывание и ректальное введение. К чрезбронхиальным и чрезальвеолярным маршрутам введения относится, не в порядке ограничения, ингаляция через рот или через нос.
Составы, содержащие описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора, пригодные для чрескожного или местного введения, включают в себя, не в порядке ограничения, фармацевтически приемлемые суспензии, масла, кремы и мази, наносимые прямо на кожу или внедряемые в защитный носитель, такой, как чрескожное устройство («чрескожная заплатка»). Примеры подходящих кремов, мазей и т.д. можно найти, например, в Physician's Desk Reference. Примеры подходящих чрескожных устройств описаны, к примеру, в патенте США №4818540, выданном 4 апреля 1989 Чайнену и пр.
Составы, содержащие описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора, пригодные для парентеральной введения, включают в себя, не в порядке ограничения, фармацевтически приемлемые стерильные изотонические растворы. К таким растворам относятся, не в порядке ограничения, солевые растворы и фосфатно-буферный солевой раствор для инъекции в центральную венозную линию, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной, внутрикожной и подкожной инъекций.
Составы, содержащие описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора, пригодные для чрезбронхиального и чрезальвеолярного введения, включают в себя, не в порядке ограничения, различные типы аэрозолей для ингаляции. Устройства, пригодные для их чрезбронхиального и чрезальвеолярного введения, также являются вариантами выполнения. К таким устройствам относятся, не в порядке ограничения, атомизаторы и вапоризаторы. Многие формы уже доступных атомизаторов и вапоризаторов могут быть легко адаптированы для доставки описанных здесь соединений, содержащих обмениватели специфичности лиганда/рецептора.
Составы, содержащие описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора, пригодные для желудочно-кишечного введения, включают в себя, не в порядке ограничения, фармацевтически приемлемые порошки, пилюли или жидкости для проглатывания, а также суппозитории для ректального введения. Из-за простоты использования желудочно-кишечное введение, в особенности пероральное, является предпочтительным выполнением. Когда фармацевтический препарат, содержащий обмениватель специфичности лиганда/рецептора, получен, он может вводиться в нуждающийся организм для лечения или предотвращения патогенной инфекции.
К аспектам изобретения относится также покрывание такого медицинского оборудования, как протезы, имплантаты и инструменты. Покрытия, пригодные для использования на медицинских устройствах, могут обеспечиваться с помощью геля или порошка, содержащего обмениватель специфичности лиганда/рецептора, или с помощью полимерного покрытия, в котором суспендирован обмениватель специфичности лиганда/рецептора. Подходящими для покрывания устройств являются те полимерные материалы, которые являются физиологически приемлемыми и через которые может диффундировать терапевтически приемлемое количество обменивателя специфичности лиганда/рецептора. К подходящим полимерам относятся, не в порядке ограничения, полиуретан, полиметакрилат, полиамид, полиэстер, полиэтилен, полипропилен, полистирен, политетрафторэтилен, поливинилхлорид, ацетат целлюлозы, кремниевые эластомеры, коллаген, щелк и т.д. Такие покрытия описаны, например, в патенте США №4612337.
Следующий раздел описывает способы лечения и предотвращения заболевания с помощью описанных здесь обменивателей специфичности лиганда/рецептора.
Лечение и предотвращение заболевания с помощью обменивателя специфичности лиганда/рецептора
Фармацевтические препараты, содержащие обмениватель специфичности лиганда/рецептора, могут вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении и/или предотвращении инфицирования патогеном, имеющим рецептор. Такие нуждающиеся субъекты могут включать в себя индивидов с риском контактирования с патогеном или индивидов, уже инфицированных патогеном. Эти индивиды могут идентифицироваться с помощью стандартных клинических или диагностических методов.
В соответствии с одним из подходов субъект, страдающий от бактериальной инфекции, идентифицируется в качестве субъекта, нуждающегося в агенте, который ингибирует пролиферацию патогена. Затем этот субъект снабжается терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Используемый в данном способе обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит домен специфичности, взаимодействующий с присутствующим на бактериях рецептором (например, внеклеточным связывающим фибриноген белком (Efb), связывающим коллаген белком, связывающим витронектин белком, связывающим ламинин белком, связывающим плазминоген белком, связывающим тромбоспондин белком, агрегирующим фактором A (ClfA), агрегирующим фактором Б (ClfB), связывающим фибронектин белком, коагулазой и внеклеточным белком прилипания). Обмениватель специфичности лиганда/рецептора содержит также антигенный домен, имеющий эпитоп патогена или токсина, предпочтительно, эпитоп, распознаваемый антителами с высоким титром, наличествующими у нуждающегося субъекта. Может быть также желательным проанализировать нуждающегося субъекта на наличие антител с высоким титром, распознающих антигенный домен, перед предоставлением субъекту обменивателя специфичности лиганда/рецептора. Этот тест может быть выполнен посредством ФИТ или ELISA с помощью иммобилизированного антигенного домена обменивателя специфичности лиганда/рецептора, как описано выше.
Подобным образом субъекту, нуждающемуся в агенте, ингибирующем вирусную инфекцию, может быть введен обмениватель специфичности лиганда/рецептора, распознающий рецептор, присутствующий на конкретном этиологическом агенте. Соответственно, субъект, нуждающийся в агенте, ингибирующем вирусную инфекцию, идентифицируется посредством стандартных клинических или диагностических процедур. Затем нуждающийся субъект снабжается терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, который взаимодействует с рецептором, присутствующим на вирусе, инфицировавшем индивида. Как и ранее, может быть желательным определить, имеет ли субъект достаточный титр антитела для взаимодействия с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора, перед введением обменивателя специфичности лиганда/рецептора.
Точно так же субъекту, нуждающемуся в агенте, ингибирующем пролиферацию рака, может вводиться обмениватель специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующий с рецептором, присутствующем на раковой клетке. Например, субъект, нуждающийся в агенте, ингибирующем пролиферацию рака, идентифицируется с помощью стандартных клинических или диагностических процедур; затем нуждающийся субъект снабжается терапевтически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующего с рецептором, присутствующим на раковых клетках, инфицирующих субъекта. Как отмечено выше, может быть желательно определить, имеет ли субъект достаточный антительный титр для взаимодействия с антигенным доменом обменивателя специфичности лиганда/рецептора, до введения обменивателя специфичности лиганда/рецептора.
Описанные здесь обмениватели специфичности лиганда/рецептора также могут вводиться субъектам в качестве профилактического средства для предотвращения начала заболевания. Описанный здесь обмениватель специфичности лиганда/рецептора может вводиться практически любому в профилактических целях (например, для предотвращения бактериальной инфекции, вирусной инфекции или рака). Однако желательно, чтобы субъекты с высокой степенью риска заражения конкретным заболеванием идентифицировались и снабжались обменивателем специфичности лиганда/рецептора. К субъектам с высоким риском заражения заболеванием относятся индивиды с семейной историей заболевания, старшего возраста или молодые, или индивиды, часто контактирующие с патогеном (например, практикующие медики). Соответственно, субъекты с риском инфицирования патогеном, имеющим рецептор, идентифицируются, а затем снабжаются профилактически эффективным количеством обменивателя специфичности лиганда/рецептора.
Одно из описанных здесь профилактических применений для обменивателей специфичности лиганда/рецептора относится к покрыванию или нанесению обменивателя специфичности лиганда/рецептора на медицинское устройство или имплантат. Имплантируемые медицинские устройства служат очагами инфицирования для некоторых видов бактерий. Такие связанные с устройствами инфекции поддерживаются тенденцией этих организмов прилипать к поверхности устройства и колонизировать ее. Следовательно, существует существенная необходимость разработать такие поверхности, которые меньше подвержены обратным биологическим реакциям, которые обычно сопровождают имплантацию медицинского устройства.
В соответствии с одним из подходов, медицинское устройство покрывается раствором, содержащим обмениватель специфичности лиганда/рецептора. Перед имплантацией медицинские устройства (например, клапан-протез) могут храниться, например, в растворе обменивателей специфичности лиганда/рецептора. Медицинские устройства могут также покрываться порошком или гелем, содержащим обмениватель специфичности лиганда/рецептора. К примеру, перчатки, презервативы и внутриматочные устройства могут покрываться порошком или гелем, содержащим обмениватель специфичности лиганда/рецептора, взаимодействующий с бактериальным или вирусным рецептором. Будучи имплантированными в организм, эти обмениватели специфичности лиганда/рецептора обеспечивают профилактический барьер инфицированию патогеном.
В некоторых вариантах выполнения обмениватель специфичности лиганда/рецептора иммобилизируется на медицинском устройстве. Как описано выше, медицинское устройство является основой, к которой может прикрепляться обмениватель специфичности лиганда/рецептора. Иммобилизация может происходить путем гидрофобного взаимодействия между обменивателем специфичности лиганда/рецептора и медицинским устройством, но предпочтительным способом иммобилизации обменивателя специфичности лиганда/рецептора на медицинском устройстве является ковалентное присоединение. Например, медицинские устройства могут производиться с реактивной группой, взаимодействующей с реактивной группой, расположенной на обменивателе специфичности.
В соответствии с одним из вариантов выполнения периодат комбинируется с обменивателем специфичности лиганда/рецептора, содержащим 2-аминоспиртовую долю, формируя альдегид-функциональный обмениватель в водном растворе, имеющем рН приблизительно от 4 до 9 и температуру приблизительно от 0 до 50 градусов Цельсия. Затем альдегид-функциональный обмениватель комбинируется с содержащей биоматериал поверхностью медицинского устройства, которая содержит первичную аминную долю, чтобы иммобилизировать обмениватель специфичности лиганда/рецептора на поверхности основы через иминную долю. Затем иминная доля реагирует с восстанавливающим агентом, формируя иммобилизованный обмениватель специфичности лиганда/рецептора на содержащей биоматериал поверхности через вторичную аминную связь. Другие подходы для связывания молекул с медицинскими устройствами (такие, как описанный в патенте США №6017741) могут быть модифицированы для иммобилизации описанного здесь обменивателя специфичности лиганда/рецептора.
Хотя изобретение описано со ссылками на варианты выполнения и примеры, следует понимать, что могут быть сделаны различные модификации без отхода от существа изобретения. Соответственно, изобретение ограничено только нижеследующей формулой изобретения.
1. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора, включающий
по меньшей мере один домен специфичности, содержащий лиганд для рецептора, при этом лиганд не является антителом или его частью, и
по меньшей мере один антигенный домен, соединенный с упомянутым доменом специфичности, в котором упомянутый антигенный домен содержит эпитоп патогена или токсина.
2. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый домен специфичности содержит по меньшей мере три последовательные аминокислоты пептида, выбранного из группы, состоящей из внеклеточного матричного белка, лиганда для рецептора на вирусе и лиганда для рецептора на раковой клетке.
3. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.2, в котором упомянутый пептид является внеклеточным матричным белком, выбранным из группы, состоящей из фибриногена, коллагена, витронектина, ламинина, плазминогена, тромбоспондина и фибронектина.
4. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.2, в котором упомянутый пептид является лигандом для рецептора на вирусе, выбранным из группы, состоящей из гликопротеина Т4 и оболочечного белка вируса гепатита В.
5. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.2, в котором упомянутый пептид является лигандом для рецептора на раковой клетке, выбранным из группы, состоящей из лиганда для HER-2/neu и лиганда для интегринового рецептора.
6. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый домен специфичности содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ.ID.NO.:1, SEQ.ID.NO.:2, SEQ.ID.NO.:3, SEQ.ID.NO.:4, SEQ.ID.NO.:5, SEQ.ID.NO.:6, SEQ.ID.NO.:7, SEQ.ID.NO.:8, SEQ.ID.NO.:9, SEQ.ID.NO.:10, SEQ.ID.NO.:11, SEQ.ID.NO.:12, SEQ.ID.NO.:13, SEQ.ID.NO.:14, SEQ.ID.NO.:15, SEQ.ID.NO.:16, SEQ.ID.NO.:17, SEQ.ID.NO.:18, SEQ.ID.NO.:19, SEQ.ID.NO.:20, SEQ.ID.NO.:21, SEQ.ID.NO.:22, SEQ.ID.NO.:23, SEQ.ID.NO.:24, SEQ.ID.NO.:25, SEQ.ID.NO.:26, SEQ.ID.NO.:27, SEQ.ID.NO.:28, SEQ.ID.NO.:29, SEQ.ID.NO.:30, SEQ.ID.NO.:31, SEQ.ID.NO.:32, SEQ.ID.NO.:33, SEQ.ID.NO.:34, SEQ.ID.NO.:35, SEQ.ID.NO.:36, SEQ.ID.NO.:37, SEQ.ID.NO.:38, SEQ.ID.NO.:39, SEQ.ID.NO.:40, SEQ.ID.NO.:41, SEQ.ID.NO.:42 и SEQ.ID.NO.:124.
7. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.3, в котором упомянутый внеклеточный матричный белок содержит по меньшей мере 3 аминокислоты альфа-цепочки фибриногена.
8. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый лиганд содержит последовательность аргинин-глицин-аспартат (RGD).
9. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый рецептор находится в патогене.
10. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый рецептор является бактериальным адгезионным рецептором.
11. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.10, в котором упомянутый бактериальный адгезионный рецептор выбирается из группы, состоящей из внеклеточного связывающего фибриноген белка (Efb), связывающего коллаген белка, связывающего витронектин белка, связывающего ламинин белка, связывающего плазминоген белка, связывающего тромбоспондин белка, агрегирующего фактора A (ClfA), агрегирующего фактора В (ClfB), связывающего фибронектин белка, коагулазы и белка внеклеточного прилипания.
12. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый антигенный домен содержит по меньшей мере три аминокислоты пептида, выбранного из группы, состоящей из белка вируса простого герпеса, белка вируса гепатита В, белка вируса ТТ и белка вируса полиомиелита.
13. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.12, в котором упомянутый антигенный домен является белком вируса простого герпеса, содержащим по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ.ID.NO.:53 и SEQ.ID.NO.:54.
14. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.12, в котором упомянутый антигенный домен является белком вируса гепатита В, содержащим по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ.ID.NO.:49, SEQ.ID.NO.:50, SEQ.ID.NO.:52 и SEQ.ID.NO.:59.
15. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.12, в котором упомянутый антигенный домен является белком вируса ТТ, содержащим по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ.ID.NO.:43, SEQ.ID.NO.:44, SEQ.ID.NO.:45, SEQ.ID.NO.:46, SEQ.ID.NO.:47, SEQ.ID.NO.:55, SEQ.ID.NO.:56, SEQ.ID.NO.:57 и SEQ.ID.NO.:58.
16. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.12, в котором упомянутый антигенный домен является белком вируса полиомиелита, содержащим по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ.ID.NO.:48 и SEQ.ID.NO.:51.
17. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый антигенный домен взаимодействует с антителом, имеющим высокий титр.
18. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.17, в котором упомянутый антигенный домен специфически связывается с антителом, присутствующим в сыворотке животного, которая была разбавлена до приблизительно 1:100-1:1000 или сильнее.
19. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором последовательность упомянутого обменивателя специфичности лиганда/рецептора выбирается из группы, состоящей из SEQ.ID.NO.:60, SEQ.ID.NO.:61, SEQ.ID.NO.:62, SEQ.ID.NO.:63, SEQ.ID.NO.:64, SEQ.ID.NO.:65, SEQ.ID.NO.:66, SEQ.ID.NO.:67, SEQ.ID.NO.:68, SEQ.ID.NO.:69, SEQ.ID.NO.:70, SEQ.ID.NO.:71, SEQ.ID.NO.:72, SEQ.ID.NO.:73, SEQ.ID.NO.:74, SEQ.ID.NO.:75, SEQ.ID.NO.:76, SEQ.ID.NO.:77, SEQ.ID.NO.:78, SEQ.ID.NO.:79, SEQ.ID.NO.:80, SEQ.ID.NO.:81, SEQ.ID.NO.:82, SEQ.ID.NO.:83, SEQ.ID.NO.:84, SEQ.ID.NO.:85, SEQ.ID.NO.:86, SEQ.ID.NO.:87, SEQ.ID.NO.:88, SEQ.ID.NO.:89, SEQ.ID.NO.:90, SEQ.ID.NO.:91, SEQ.ID.NO.:92, SEQ.ID.NO.:93, SEQ.ID.NO.:94, SEQ.ID.NO.:95, SEQ.ID.NO.:96, SEQ.ID.NO.:97, SEQ.ID.NO.:98, SEQ.ID.NO.:99, SEQ.ID.NO.:100, SEQ.ID.NO.:101, SEQ.ID.NO.:102, SEQ.ID.NO.:103, SEQ.ID.NO.:104, SEQ.ID.NO.:105, SEQ.ID.NO.:137 и SEQ.ID.NO.:142.
20. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый домен специфичности имеет длину по меньшей мере 3 аминокислоты.
21. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый домен специфичности имеет длину по меньшей мере 8 аминокислот.
22. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый домен специфичности имеет длину по меньшей мере 20 аминокислот.
23. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый домен специфичности содержит лиганд для бактериального адгезионного рецептора.
24. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.1, в котором упомянутый домен специфичности содержит по меньшей мере 3 последовательные аминокислоты фибриногена.
25. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.23, в котором упомянутый бактериальный адгезионный рецептор является адгезионным рецептором стафилококка.
26. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора по п.9, в котором упомянутый патоген является стафилококком (Staphylococcus).
27. Гликозилированный обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий
по меньшей мере один домен специфичности, содержащий по меньшей мере 3 последовательные аминокислоты фибриногена, которые связываются с бактериальным адгезионным рецептором; и
по меньшей мере один антигенный домен, соединенный с упомянутым доменом специфичности, причем упомянутый антигенный домен содержит эпитоп патогена или токсина и при этом упомянутый обмениватель специфичности лиганда/рецептора гликолизирован.
28. Обмениватель специфичности лиганда/рецептора, содержащий сахарид и по меньшей мере один домен специфичности, содержащий по меньшей мере 3 последовательные аминокислоты фибриногена, которые связывают бактериальный адгезионный рецептор, соединенный с антигенным доменом, который содержит эпитоп патогена или токсина.
29. Домен специфичности, содержащий лиганд для рецептора, в котором упомянутый лиганд выбирается из группы, состоящей из SEQ.ID.NO.:106, SEQ.ID.NO.:107, SEQ.ID.NO.:108, SEQ.ID.NO.:109, SEQ.ID.NO.:110, SEQ.ID.NO.:111, SEQ.ID.NO.:115, SEQ.ID.NO.:116, SEQ.ID.NO.:119, SEQ.ID.NO.:121, SEQ.ID.NO.:122, SEQ.ID.NO.:123, SEQ.ID.NO.:124, SEQ.ID.NO.:125, SEQ.ID.NO.:127, SEQ.ID.NO.:128, SEQ.ID.NO.:129, SEQ.ID.NO.:130, SEQ.ID.NO.:131, SEQ.ID.NO.:132, SEQ.ID.NO.:133, SEQ.ID.NO.:134, связанной с полисахаридом.
30. Домен специфичности лиганда/рецептора, включающий домен специфичности, содержащий лиганд для бактериального адгезивного рецептора и антигенный домен, соединенный с доменом специфичности, в котором антигенный домен содержит эпитоп бактериального патогена.
