Жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза
Владельцы патента RU 2300559:
Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза. Питательная среда содержит в качестве минерально-солевой основы 1,5%-ную вытяжку древесной золы, глицерин, аспарагин, криалл, сыворотку крови лошадей. Изобретение позволяет повысить ростовые свойства питательной среды и сократить сроки выращивания патогенных микобактерий туберкулеза. 4 табл.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к культивированию патогенных штаммов микобактерий туберкулеза.
Известна жидкая питательная среда Моделя (Практикум по ветеринарной микробиологии. Москва, 1980, с.92) для выращивания микобактерий туберкулеза, содержащая калий фосфорнокислый двуосновной 0,5 г; аммоний лимоннокислый 1 г; магний сернокислый 0,05 г; железо сернокислое 0,005 г; глицерин 5 мл; дистиллированную воду 100 мл.
Однако при использовании этой среды рост первичных культур микобактерий и процесс накопления бактериальной массы замедленны, среда содержит много компонентов, что усложняет ее приготовление.
Наиболее близкой по сущности заявляемому решению является жидкая среда Сотона (Лабораторная диагностика туберкулеза. Рекомендации, Омск, 1988, с.59), которая применяется для культивирования микобактерий туберкулеза, состоящая из следующих компонентов: аспарагин, глицерин, а минерально-солевую основу данной среды составляют такие компоненты, как лимонная кислота, калий фосфорнокислый двуосновной, магний сернокислый, цитрат аммиачного железа.
Однако данная среда требует большого количества компонентов, и сроки роста микобактерий на ней не являются оптимальными.
Технической задачей заявляемого изобретения является введение в среду веществ, позволяющих улучшить ростовые свойства среды и сократить сроки выращивания патогенных микобактерий туберкулеза при посевах эталонных штаммов культур микобактерий.
Поставленная техническая задача решается тем, что известная жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза, включающая аспарагин, глицерин и минерально-солевую основу, согласно изобретению дополнительно содержит криалл и сыворотку крови лошадей, а в качестве минерально-солевой основы - вытяжку древесной золы при следующем соотношении компонентов:
| 1,5%-ная вытяжка древесной золы, мл | 100 |
| Глицерин | 6,0 г |
| Аспарагин | 0,4 г |
| Криалл | 1,0-1,2 г |
| Сыворотка крови лошади | 1,0-1,2 г |
Приготовление среды производят следующим образом.
В качестве минерально-солевой основы предлагаемой среды используют вытяжку древесной золы, при проведении спектрального анализа которой было обнаружено содержание в ней необходимых для питания микобактерий туберкулеза микроэлементов: серы, магния, железа, цинка, калия и фосфора. Приготовление вытяжки древесной золы и определение ее оптимальной концентрации производят следующим образом: берут 0,5 г (пример 1); 1,5 г (пример 2) и 3 г (пример 3) древесной золы, просеянной через сито, и доливают до 100 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин.
Сроки роста патогенных штаммов микобактерий туберкулеза на среде Сотона и средах с введением вытяжки древесной золы в различных концентрациях представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Среды | Патогенные штаммы микобактерий | |||
| М.bovis(шт.8,ВИЭВ) | M.tuberculosis (шт.H37Rv) | |||
| Рост, (сутки) | ||||
| появление | интенсивный | появление | интенсивный | |
| Сотона | 14 | 22 | 11 | 22 |
| Пример 1 (0, 5% вытяжка древесной золы) | 14 | 22 | 12 | 22 |
| Пример 2 (1, 5% вытяжка древесной золы) | 10 | 20 | 8 | 18 |
| Пример 3 (3% вытяжка древесной золы) | 13 | 22 | 11 | 20 |
Проведенные испытания показывают, что наиболее оптимальной для получения ускоренного роста патогенных штаммов микобактерий туберкулеза является вытяжка древесной золы 1,5%-ной концентрации, которую в дальнейшем используют в качестве минерально-солевой основы предлагаемой среды.
Далее предлагаемую среду готовят следующим образом. Растворяют каждый ингредиент среды в растворе 1,5%-ной вытяжки золы, причем последующий ингредиент добавляют после полного растворения предыдущего. Пропускают через бумажный фильтр и разливают по колбам. Устанавливают рН в пределах 7,0-7,2 при помощи 10%-ной ортофосфорной кислоты. Стерилизуют в автоклаве текучим паром при 120°С в течение 30 минут. В качестве биологически активных добавок в предлагаемую среду дополнительно вводят криалл (заявка на патент №94011513/15 «Способ получения торфогуминового удобрения», авторы Алексеев А.С., Кривопуцкий B.C., Кривопуцкая Л.М) и сыворотку крови лошадей.
Для контроля во всех примерах используют среду Сотона.
Для подтверждения оптимальной концентрации криалла в составе предлагаемой среды проводят следующие исследования.
Пример 4. В среду, состоящую из аспарагина 0,4 г, глицерина 6,0 г, 1,5% вытяжки древесной золы, добавляют криалл в количестве 0,5-0,7 г.
Пример 5. Для культивирования микобактерий туберкулеза готовят среду, состоящую из аспарагина, глицерина в известных количествах, вытяжки древесной золы в оптимальной концентрации 1,5% и криалла в количестве 1,0-1,2 г.
Пример 6. Для культивирования микобактерий туберкулеза готовят среду, состоящую из аспарагина, глицерина в известных количествах, вытяжки древесной золы в оптимальной концентрации 1,5% и криалла в количестве 1,5-1,7 г.
Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 4, 5 и 6, представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Среды | Патогенные штаммы микобактерий | |||
| M.bovis (шт.8, ВИЭВ) | M.tuberculosis (шт. H37Rv) | |||
| Рост, (сутки) | ||||
| появление | интенсивный | появление | интенсивный | |
| Сотона | 14 | 22 | 11 | 20 |
| Пример 4 (1,5% вытяжка древесной золы, криалл 0,5-0,7 г) | 14 | 24 | 15 | 22 |
| Пример 5 (1,5% вытяжка древесной золы, криалл 1,0-1,2 г) | 14 | 20 | 11 | 20 |
| Пример 6 (1, 5% вытяжка древесной золы, криалл 1,5-1,7 г) | 16 | 24 | 16 | 22 |
Для подтверждения оптимальной концентрации сыворотки крови лошадей в составе предлагаемой среды проводят следующие исследования.
Пример 7. Для культивирования микобактерий туберкулеза готовят среду, состоящую из аспарагина 0,4 г, глицерина 6,0 г, вытяжки древесной золы в оптимальной концентрации - 1,5% и сыворотки крови лошадей в количестве 0,5-0,7 г.
Пример 8. Для культивирования микобактерий туберкулеза готовят среду, состоящую из аспарагина, глицерина в известных количествах, вытяжки древесной золы в оптимальной концентрации - 1,5% и сыворотки крови лошадей в количестве 1,0-1,2 г.
Пример 9. Для культивирования микобактерий туберкулеза готовят среду, состоящую из аспарагина, глицерина в известных количествах, вытяжки древесной золы в оптимальной концентрации - 1,5% и сыворотки крови лошадей в количестве 1,5-1,7 г.
Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 7,8 и 9, представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||
| Среды | Патогенные штаммы микобактерий | |||
| M.bovis (шт. 8, ВИЭВ) | M.tuberculosis (шт. H37Rv) | |||
| Рост, (сутки) | ||||
| появление | интенсивный | появление | интенсивный | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Сотона | 14 | 22 | 11 | 20 |
| Пример 4 (1,5% вытяжка древесной золы, сыворотка крови лошадей 0,5-0,7 г) | 14 | 22 | 12 | 20 |
| Пример 5 (1,5% вытяжка древесной золы, сыворотка крови лошадей 1,0-1,2 г) | 12 | 19 | 9 | 15 |
| Пример 6 (1,5% вытяжка древесной золы, сыворотка крови лошадей 1,5-1,7 г) | 12 | 21 | 11 | 20 |
Для подтверждения оптимального соотношений заявленных ингредиентов в испытуемой среде проводят следующие исследования.
Пример 10. В среду, состоящую из аспарагина 0,4, глицерина 6,0, 1,5% вытяжки древесной золы, добавляют криалл в количестве 0,5-0,7 г и сыворотку крови лошадей в количестве 0,5-0,7 г.
Пример 11. Для культивирования микобактерий туберкулеза готовят среду, состоящую из аспарагина, глицерина в известных количествах, вытяжки древесной золы в оптимальной концентрации 1,5%, криалла в количестве 1,0 - 1,2 г и сыворотки крови лошадей в количестве 1,0 - 1,2 г.
Пример 12. Для культивирования микобактерий туберкулеза готовят среду, состоящую из аспарагина, глицерина в известных количествах, вытяжки древесной золы в оптимальной концентрации 1,5%, криалла в количестве 1,5-1,7 г и сыворотки крови лошадей в количестве 1,5 - 1,7 г.
Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 10, 11 и 12, представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||
| Среды | Патогенные штаммы микобактерий | |||
| M.bovis (шт.8, ВИЭВ) | M.tuberculosis (шт. H37Rv) | |||
| Рост, (сутки) | ||||
| появление | интенсивный | появление | Интенсивный | |
| Сотона | 14 | 22 | 11 | 20 |
| Пример 4 (1,5% вытяжка древесной золы, криалл 0,5-0,7 г, сыворотка крови лошадей 0,5-0,7 г) | 12 | 19 | 11 | 19 |
| Пример 5 (1,5% вытяжка древесной золы, криалл 1,0-1,2 г, сыворотка крови лошадей 1,0-1,2 г) | 8 | 14 | 6 | 12 |
| Пример 6 (1,5% вытяжка древесной золы, криалл 1,5-1,7 г, сыворотка крови лошадей 1,5-1,7 г) | 14 | 22 | 12 | 21 |
Из полученных данных следует, что сокращение сроков появления первичного и интенсивного роста микобактерий туберкулеза происходит при использовании в составе опытных сред вытяжки древесной золы 1,5%-ной концентрации, 1,0-1,2 г криалла и 1,0-1,2 г сыворотки крови лошадей.
На основании проведенных исследований установлено, что предлагаемая жидкая питательная среда, в состав которой входит минеральный комплекс и биологические добавки, позволяет стимулировать рост патогенных штаммов микобактерий туберкулеза.
Жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза, включающая аспарагин, глицерин и минерально-солевую основу, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит криалл и сыворотку крови лошадей, а в качестве минерально-солевой основы - вытяжку древесной золы при следующем соотношении компонентов:
| Вытяжка древесной золы 1,5% | 100 мл |
| Глицерин | 6,0 г |
| Аспарагин | 0,4 г |
| Криалл | 1,0-1,2 г |
| Сыворотка крови лошадей | 1,0-1,2 г |
