Способ получения иммобилизованной липазы
Владельцы патента RU 2301830:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина" (RU)
Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для очистки животноводческих отходов и сточных вод. Способ предусматривает иммобилизацию липазы в смеси полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия, взятых в массовых соотношениях 1:0,3-1,0. Иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза: смесь полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия 1:50-200 и при рН 9,0-11,0, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. Способ позволяет получить целевой продукт с повышенной ферментативной активностью.
Предлагаемое изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для очистки животноводческих отходов и сточных вод.
Способ получения липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите (патент США №5667634, опубл. 16.09.1997, МКИ D21C 9/08).
Однако получения липазы путем иммобилизации ее в комплекс разнозаряженных полиэлектролитов неизвестно.
Техническим эффектом предлагаемого изобретения является повышение активности целевого продукта в комплексе из двух полимеров.
Технический эффект достигается в предлагаемом способе получения липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите тем, что в качестве полиэлектролита используют смесь полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия, взятых в массовых соотношениях равных 1:0,3-1,0, причем иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза:смесь полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия 1:50-200 и при рН 9-11, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут.
Известно использование пленки полистиролсульфоната натрия как селективной, ультратонкой перегородки для переноса анионов (Harris Jeremy J., Stair Jacqueline L., Bruening Merlin L. Layered polyelectrolyte films as selective, ultrathin barriers for anion transport // Chem. Mater. 2000. 12, №7, с.1941-1946).
Полидиаллилдиметиламмоний хлорид в качестве полимерного коагулянта используется для снижения солесодержания сточных вод (Гоголашвили Э.Л., Куренков В.Ф., Молгачева И.Е., Гайсина А.И. Влияние органических полимерных коагулянтов на эффективность процесса водоочистки // Структура и динамика молекулярных систем, вып.Х, ч.2, с.85-88, 2003)
В научно-технической литературе неизвестно техническое решение, аналогично заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию изобретения "новизна".
Полученная согласно предлагаемому способу иммобилизованная липаза может быть использована для очистки животноводческих отходов и сточных вод, т.е. "промышленно применима".
Впервые предложена смесь полиэлектролитов полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия при определенном авторами массовом соотношении для повышения активности липазы. Авторами впервые показано, что взаимодействие полиэлектролитов полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия и липазы приводит к изменению конформации липазы и, по-видимому, открытию активных центров фермента, т.е. предложение соответствует критерию "изобретательский уровень".
Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах.
Пример 1. Получают смесь полиэлектролитов при массовом соотношении полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия равном 1:0,6 путем смешивания 100 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 60 мг полистиролсульфоната натрия. Далее к 50 мг полученной смеси добавляют 1 мг липазы, полученной из бактерий Pseudomonas fluorescens /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полиэлектролит 1:50). Иммобилизацию проводят в течение 10 минут при рН 11 при температуре 18°С.
Полученную иммобилизованную липазу проверяли на ферментативную активность по отношению к субстрату триацетину. В результате активность иммобилизованной липазы составила 100% по отношению к контролю.
Пример 2. Получают смесь полиэлектролитов при массовом соотношении полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия равном 1:0,6 путем смешивания 100,0 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 60,0 мг полистиролсульфоната натрия. Далее к 100 мг полученной смеси добавляют 1 мг липазы, полученной из бактерий Pseudomonas fluorescens /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полиэлектролит 1:100). Иммобилизацию проводят в течение 20 минут при рН 11,0 при температуре 24°С.
Полученную иммобилизованную липазу проверяли на ферментативную активность по отношению к субстрату триацетину. В результате активность иммобилизованной липазы составила 104% по отношению к контролю.
Пример 3. Получают смесь полиэлектролитов при массовом соотношении полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия равном 1:0,6 путем смешивания 200,0 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 120,0 мг полистиролсульфоната натрия. Далее к 200 мг полученной смеси добавляют 1 мг липазы, полученной из бактерий Pseudomonas fluorescens /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полиэлектролит 1:200). Иммобилизацию проводят в течение 15 минут при рН 11,0 при температуре 21°С.
Полученную иммобилизованную липазу проверяли на ферментативную активность по отношению к субстрату триацетину. В результате активность иммобилизованной липазы составила 119% по отношению к контролю.
Пример 4. Получают смесь полиэлектролитов при массовом соотношении полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия равном 1:0,3 путем смешивания 100 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 30 мг полистиролсульфоната натрия. Далее к 100 мг полученной смеси добавляют 1 мг липазы, полученной из поджелудочной железы свиньи /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полиэлектролит 1:100). Иммобилизацию проводят в течение 10 минут при рН 9,0 при температуре 18°С.
Полученную иммобилизованную липазу проверяли на ферментативную активность по отношению к субстрату триацетину. В результате активность иммобилизованной липазы составила 180% по отношению к контролю.
Пример 5. Получают смесь полиэлектролитов при массовом соотношении полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия равном 1:0,6 путем смешивания 100,0 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 60,0 мг полистиролсульфоната натрия. Далее к 100 мг полученной смеси добавляют 1 мг липазы, полученной из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полиэлектролит 1:100). Иммобилизацию проводят в течение 20 минут при рН 9,0 при температуре 24°С.
Полученную иммобилизованную липазу проверяли на ферментативную активность по отношению к субстрату триацетину. В результате активность иммобилизованной липазы составила 180% по отношению к контролю.
Пример 6. Получают смесь полиэлектролитов при массовом соотношении полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия равном 1:1 путем смешивания 100 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 100 мг полистиролсульфоната натрия. Далее к 100 мг полученной смеси добавляют 1 мг липазы, полученной из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полиэлектролит 1:100). Иммобилизацию проводят в течение 15 минут при рН 9,0 при температуре 21°С.
Полученную иммобилизованную липазу проверяли на ферментативную активность по отношению к субстрату триацетину. В результате активность иммобилизованной липазы составила 177% по отношению к контролю.
Таким образом, заявленный способ получения липазы позволяет сохранить (100%) или увеличить в 1,04-1,8 раз ферментативную активность целевого продукта по отношению к исходной липазе.
Способ получения иммобилизованной липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите, отличающийся тем, что в качестве полиэлектролита используют смесь полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия, взятых в массовых соотношениях 1:0,3-1,0, причем иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза: смесь полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полистиролсульфоната натрия 1:50-200 и при рН 9,0-11,0, температуре 18-24°С в течение 10-20 мин.
