Способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы при получении трансгенных кур

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам получения трансгенной птицы. Для получения трансгенных кур введение ретровирусных векторов в клетки бластодермы осуществляют через пробой в скорлупе неинкубированного яйца со стороны тупого конца. С помощью инсулинового шприца вводят генные конструкции на глубину 2-3 см вблизи зародышевого диска. Способ позволяет упростить процедуру введения генных конструкций в клетки-мишени при сохранении общей эффективности трансгенеза, что способствует снижению эмбриональной смертности.

 

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам получения трансгенной птицы.

Известен способ получения трансгенных кур посредством микроинъекции ДНК в зиготу [Love J., Gribbin С, Mother С., Sang H. Transgenic birds by DNA microinjection // Biotechnology, 1994, - 12, 60-63]. Введение генных конструкций осуществляют в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки, после чего микроинъецированную зиготу культивируют in vitro в течение 18-24 часов в синтетической среде яйцевода. По окончании культивирования эмбрион переносят в суррогатное яйцо и инкубируют до вылупа при стандартных режимах инкубации. Недостатками данного метода являются необходимость забоя птицы для получения зигот, высокая трудоемкость метода, низкая эффективность интеграции, а также потребность в дорогостоящем оборудовании для культивирования клеток.

Известен способ получения трансгенных кур посредством введения трансформированных примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) кур в дорзальную аорту 2,5-дневных эмбрионов [Naito M., Tajima A., Yasuda Y., Kuwana T. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells // Mol Reprod Dev., 1994. - 39 (2), 153-161; Chang I.K., Jeong D.K., Hong Y.H., Park T.S. et al. Production of germline chimeric chikens by transfer of cultured primordial germ cells // Cell Biol. Int., 1997, - 21 (8), 495-499]. Использование примордиальных зародышевых клеток позволяет получать трансгенную птицу, несущую чужеродную ДНК в половых клетках. Однако процесс выделения, культивирования и трансформации ПЗК является достаточно трудоемким и сложным, требует высокой квалификации персонала и сопряжен с большими материальными затратами.

Известен способ получения трансгенных кур путем введения трансформированных клеток бластодермы в субзародышевую полость бластодиска неинкубированного яйца. Введение клеток бластодермы в клетки-мишени осуществляют посредством микроманипулятора через окно, вырезанное в скорлупе [Pettite J.N., Clark M.E., Liu G., Verrinder Gibbins A.M., Etches R.J. Production of comatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells // Development, 1990, - 108 (1), 185-189]. Для повышения химиризма получаемой трансгенной птицы используют также предварительное облучение УФ реципиентных клеток бластодермы, что позволяет сократить долю этих клеток по отношению к вводимым донорским клеткам [Thoraval P., Lassere F., Coudert F., Dambrine G. Somatic and germline chicken chimeras obtained from brown and white Leghorns by transfer of early blastodermal cells // Poult Sci., 1994, - 73 (12), 1897-1905; Carsience R.S., Clark M.E., Verrinder Gibbins A.M., Etches R.J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos // Development, 1993, - 117 (2), 669-675]. К недостаткам данного метода следует отнести высокую трудоемкость, повышенные требования к квалификации персонала, а также высокие материальные затраты.

Известен способ получения трансгенных кур посредством использования ретровирусных векторов, взятый в качестве прототипа. В данном случае раствор генных конструкций вводят в субзародышевую полость бластодиска неинкубированного яйца через окно диаметром 10-20 мм, вырезанное в экваториальной области яйца [Mazurei S., Ono К., Yamaguchi К., Nishijima К., Kamichira M., Iijima S. Production of transgenic quails with high frequency of germline transmission using VSV-G pseudotyped retroviral vector // Biochemical Biophysical Research Communications, 2001, - 286 (3), 456-463]. Использование ретровирусных векторов позволяет значительно повысить эффективность трансформации клеток-мишеней, однако применяемый способ введения генных конструкций является достаточно трудоемким и требует наличия специальной манипуляционной техники. К тому же вырезание окна в экваториальной области яйца с целью визуализации зародышевого диска оказывает сильное негативное влияние на развитие эмбриона, что выражается высокой эмбриональной смертностью.

Задача изобретения заключалась в разработке усовершенствованного способа получения трансгенной птицы, позволяющего снизить эмбриональную смертность и упростить процедуру введения генных конструкций в клетки-мишени при сохранении общей эффективности трансгенеза.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ получения трансгенных кур, включающий введение ретровирусных векторов в желток яйца вблизи бластодиска, особенностью которого является то, что введение генных конструкций осуществляют до инкубации с помощью инсулинового шприца через пробой в скорлупе яйца со стороны тупого конца, что, с одной стороны, не требует наличия специальной манипуляционной техники, с другой стороны, - не оказывает сильного негативного влияния на развитие эмбриона ввиду введения генных конструкций через тупой конец яйца без необходимости вырезания окошка в скорлупе.

Пример. Контрольное использование усовершенствованного способа получения трансгенных кур было проведено на курах кросса ППЗ «Смена». В качестве источника генных конструкций применяли вирусный препарат, представляющий собой среду культивирования клеток-упаковщиц. Для получения инъекционного раствора в вирусный препарат добавляли полибрен в концентрации 8 мкг/мл. Введение генных конструкций осуществляли в асептических условиях под ламинаром. Яйца перед инъекцией кратковременно фламбировали, после чего в тупом конце яйца делали прокол диаметром 1-2 мм, через который с помощью инсулинового шприца вводили раствор генных конструкций в объеме 50-100 мкл. При этом иглу шприца опускали на 2-3 см. После проведения необходимых манипуляций сделанное окно заливали расплавленным парафином. Микроинъецированные яйца инкубировали в течение 21 дня в специальных инкубаторах с соблюдением стандартных режимов инкубации. Из 50 проинъецированных яиц был получен 1 трансгенный петух, несущий рекомбинантную ДНК в клетках крови, печени, сердца и кишечника. Общая эффективность трансгенеза составила 4%. При этом развитие эмбрионов отмечалось в 54% случаев.

Изобретение применимо в биотехнологии, в частности в биоинженерии животных.

Способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы при получении трансгенных кур, отличающийся тем, что введение генных конструкций осуществляют через пробой в скорлупе неинкубированного яйца со стороны тупого конца с помощью инсулинового шприца на глубину 2-3 см вблизи зародышевого диска.