Биотрансплантат и способ лечения задержки психического развития

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и может найти применение в клинической психиатрии при лечении больных с выраженным психическим недоразвитием и достоверными морфологическими изменениями в головном мозге. Способ лечения заключается во введении больному его собственных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из костного мозга и в дальнейшем культивируемых in vitro. Клетки имплантируют с помощью носителя в один из ранее определенных участков коры головного мозга, для чего МСК предварительно вводят в модифицированный стент (носитель), который впоследствии рассасывается. Количество вносимых клеток составляет 7-12 млн на одну зону Бродмана, выбранную для трансплантации аутологичных МСК. При выраженных анатомических изменениях зон мозга такое же количество клеток вводят внутрисосудисто (внутриартериально или внутривенно). В ряде случаев лечение осуществляют с помощью одновременного интрапаренхиматозного и внутрисосудистого введения МСК. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения выраженного снижения интеллектуально-мнестических функций, связанных с психическим недоразвитием, с нарушением связей ЦНС. 3 н. и 7 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использовано в клинической психиатрии при лечении поражения интеллектуально-мнестических функций различной этиологии. К этой большой группе расстройств относятся выраженные формы умственной отсталости.

Умственная отсталость детей регистрируется во всех странах, статистика говорит о 0,25-0,50% населения, имеющих интеллектуальный коэффициент (IQ) меньше 50, что характеризует тяжелую и выраженную умственную отсталость. Прогноз для них неблагоприятен. Врожденное слабоумие людей характеризуется двумя обязательными признаками: 1) общим психическим недоразвитием с преобладанием интеллектуальной недостаточности; 2) отсутствием прогредиентности, указывающей на патологический процесс (Сухарева Г.Е. Лекции по психиатрии детского возраста. - М.: Медицина. 1974 г. - 320 с.).

Одной из особенностей патогенеза олигофрении является то, что порок развития (дизонтогения) возникает в результате поражения организма, еще не закончившего развития. Этим он принципиально отличается от дефекта вследствие повреждения уже сформированного организма.

Клиническая картина дизонтогений, в том числе врожденных аномалий психического развития, существенно отличается от клиники поражений сформированных органов и систем. В первом случае имеется нарушение развития, а во втором - приобретенный дефект нормальных до того функций. Основной особенностью диффузного «тотального» недоразвития является нарушение психики в целом.

Отмечено, что у больных наблюдаются признаки недоразвитости интеллекта, мышления, других психических функций (восприятие, память, внимание, речь, моторика, эмоционально-волевая сфера и т.д.).

Картина поражения зависит не столько от природы и интенсивности повреждающего воздействия, сколько от особенностей того периода онтогенеза, в котором пострадал развивающийся орган и организм в целом, т.е. от хроногенного фактора. В зависимости от глубины психического недоразвития выделяют 3 степени умственной отсталости: идиотию (IQ<20), имбецильность (IQ=20-50), дебильность (IQ-50-70).

Лечение поражения интеллектуально-мнестических функций связано с воздействием на центральную нервную систему (ЦНС), на кору головного мозга. Известен способ лечения подобных расстройств с помощью нейропротективной, рассасывающей, дегидратационной, витаминной и общеукрепляющей терапии (Руководство по психиатрии./ Под ред. А.В.Снежневского. - М.: Медицина, 1983, т.2, с.496-507 - [1]).

Известен также метод нейротрансплантации эмбриональных стволовых клеток (НЭСК), который применяется при различных терапевтически резистентных поражениях ЦНС (А.С.Брюховецкий. Трансплантация нервных клеток и тканевая инженерия мозга при нервных болезнях. - М., 2003, с.398, В.В.Семченко и др. Нейротрансплантация, Омск, 2004, с.306. - [2, 3]).

Одним из современных и активно разрабатываемых способов лечения различных терапевтически резистентных, поражений центральной нервной системы (ЦНС) является интракраниальная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Это многообещающий способ восстановления нарушенных функций центральной нервной системы, в основе которого, помимо возможности целенаправленного влияния на определенные функциональные структуры головного мозга, лежит нормализующий эффект на дисбаланс нейротрансмиттерных систем мозга, что фактически является принципиально новым подходом к лечению большой группы заболеваний, связанных с поражением ЦНС.

В отличие от применения при нейротрансплантации в качестве донорского материала эмбриональных тканей, в частности эмбриональных нейробластов человека, полученные из костного мозга самого больного МСК (аутотрансплантация), позволяют избавиться от целого ряда проблем.

Прежде всего, полностью снимается проблема гематоэнцефалических и иммунных реакций, т.к. больному трансплантируются его собственные клетки. При этом аутоиммунные клетки не только не вызывают реакций отторжения, но и обладают иммуносупрессорными свойствами.

При применении аутотрансплантации МСК исчезают религиозные, этические и правовые проблемы, сопутствующие применению аллогенных нейробластов, которые в значительной степени затрудняют применение эмбриональных тканей или клеточных культур, полученных из них.

Помимо этого, в значительной степени упрощаются организационные проблемы, связанные с необходимостью (при проведении нейротрансплантации эмбриональных нейробластов) обследования донорских тканей на многочисленные вирусные инфекции или наследственные заболевания.

МСК являются клетками-предшественниками, из которых в процессе дальнейшей специализации формируются либо нервные клетки, либо клетки различных тканей. «Специализация» МСК зависит от непосредственного клеточного окружения, в которое попадает МСК. Таким образом, МСК, трансплантированные непосредственно в мозговую ткань или введенные в мозг через сосудистую систему, приобретают все функциональные особенности окружающих их нейронов. В дальнейшем часть из них приживается, дифференцируется и устанавливает связи с окружающими нервными клетками. Оказываемый ими на дисбаланс нейротрансмиттерных систем больного мозга нормализующий эффект является принципиально новым подходом в лечении целого ряда заболеваний, связанных с поражением ЦНС.

Трансплантация МСК в кору головного мозга связана с их способностью улучшить функцию недоразвитого (пораженного) мозга, образовывать связи в определенных отделах ЦНС за счет синтеза нейромедиаторов, что может способствовать развитию умственных и поведенческих способностей. Аутологичные МСК имеют преимущества перед донорскими МСК, в результате трансплантация проходит без осложнений, без иммунных реакций. В качестве носителя МСК используют фармацевтически приемлимые гемостатические губки, которые со временем рассасываются, выполнив свою функцию.

Развитию мозга способствует также введение аутологичных МСК внутрисосудисто (внутривенно или внутриартериально). Такая трансплантация МСК в мозг протекает за счет кровеносной системы мозга: током крови МСК переносятся в очаг поражения. Опробовано также одновременное введение аутологичных МСК: путем внутрисосудистого введения и интракортикальной трансплантации в мозг. В этом случае идет более полное насыщение клетками МСК коры головного мозга, обеспечивая ими очаг поражения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявленному, является способ лечения задержки психоречевого и интеллектуального развития различного происхождения путем нейротрансплантации эмбриональной нервной ткани в кору головного мозга (RU, патент № 2219937, 2003).

Техническая задача, на достижение которой направлено настоящее изобретение, заключается в повышении эффективности лечения выраженного снижения интеллектуально-мнестических функций, связанных с психическим недоразвитием, с нарушением связей ЦНС. Лечение осуществляют путем трансплантации аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в различные участки коры головного мозга, функциональные особенности которых в максимальной степени связаны с имеющейся патологией, и/или внутрисосудистым введением МСК.

Костный мозг пациента для получения аутологичных МСК забирали путем пунктирования под местной кратковременной анестезией из грудины или из крыла подвздошной кости таза. Затем пунктат обрабатывали гепарином, разводили питательной средой, центрифугировали, выделяли МСК и культивировали их в ростовой среде, содержащей питательную среду Игла в модификации Дюльбекко (ДМЕМ), получив в результате на 87-99% однородные по фенотипу живые клетки.

В качестве питательной среды при работе с аутологичными клетками была выбрана питательная среда ДМЕМ, которая позволила стабильно, с высокой скоростью роста получать высокооднородные МСК в достаточном для трансплантации количестве. Среда ДМЕМ доступна из-за своей распространенности и универсальности, но в зависимости от качества и источника посевного клеточного материала ее состав обычно модифицируют. В изобретении среду ДМЕМ использовали без каких-либо дополнений и изменений, так как при центрифугировании сразу были выделены жизнеспособные МСК высокой степени однородности. В результате использования таких клеток в качестве посевного материала на ростовой среде с применением ДМЕМ были получены необходимые для биотрансплантации клетки и их количество в десятки раз превышает их содержание в костном мозге. После пассирования и снятия с матрасов был получен концентрат с содержанием МСК 8-10×10⁶ в 1 мл.

Биотрасплантат для лечения задержки психического развития представляет собой суспензию клеток в 10% аутологичной сыворотке крови на физиологическом растворе, содержащую аутологичные мезенхимальные стволовые клетки (МСК), однородные по клеточным маркерам CD 44+, CD 90+, CD 105+, CD 106+, CD 45-, CD 34-. Вместо 10% аутологичной сыворотки крови на физиологическом растворе (растворителя в суспензии) можно использовать иные растворители, выбранные из фармацевтически приемлемых: аутоплазма в физрастворе, аутоплазма, аутосыворотка в любом % составе от 5 до 100, а также раствор глюкозы 10%, 5%, 7% на физрастворе. В 1 мл биотрасплантата содержится 0,7-1,2×10⁶ МСК.

Для нейротрансплантации используют собственные мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга больного и в дальнейшем культивируемые in vitro. Клетки вводят в зоны поражения, т.е. паренхиматозно, в виде указанной выше суспензии. Также для лечения клетки вводят внутрисосудисто: в/а - внутриартериально, в/в - внутривенно, причем общее количество вводимых МСК составляет от 7 до 25 млн.

Для проведения нейротрансплантации используют биотрасплантат, содержащий 40-45 млн юных МСК с концентрацией 0,7-1,2×10⁶ в 1 мл биотрасплантата, вводят в модифицированный стент, являющийся их носителем. В качестве носителя предпочтительно используют гемостатические губки. На стандартную гемостатическую губку 9×9 используют обычно 20 мл клеточной суспензии. Фрагменты насыщенного МСК стента с количеством МСК 7-12×10 на одну зону имплантируют в один или несколько из заранее определенных участков коры головного мозга. Это, в первую очередь, область функциональных полей Бродмана 44, 43, 46, 24, 25, 22, 41 и 42. В дальнейшем стент подвергается постепенному рассасыванию, а находившиеся в нем МСК вымываются током крови и интегрируют в паренхиму мозга. В некоторых случаях, для достижения большего эффекта, применяются одновременно интрапаренхиматозный и внутрисосудистый способы введения МСК, т.е. при операции совмещают оба способа введения клеток, причем дополнительное введение осуществляют дозировкой 0,5-0,7×10⁶ аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на 1 кг веса больного.

Так как наработка аутологичных МСК для использования их в качестве биотрансплантата протекает во времени, могут возникнуть ситуации, когда наработка (накопление) клеток произведена, а пациент по самочувствию не готов для лечения. В таких случаях клеточный материал подвергают криоконсервации, которая сохраняет МСК в неизменном виде. После разморозки клетки обладают всеми своими свойствами, имеют те же характеристики по фенотипу и остаются живыми. Криоконсервирование проводили с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида, так как он фармацевтически приемлем и совместим с применяемыми растворителями в суспензии вводимых при лечении аутологичных клеток.

Биотрасплантаты после криоконсервирования были использованы в лечении пациентов так же, как юные клетки, описанные выше. Результаты лечения сопоставимы с применением свежеприготовленных биотрансплантатов.

При выраженных анатомических изменениях (или отсутствии) функционально значимых зон мозга МСК вводят только внутрисосудисто (в/а - со скоростью 2 мл/мин, или в/в - со скоростью 6 мл в/мин), причем общее количество вводимых МСК составляет от 7 до 25 млн. Количество МСК рассчитывают исходя из 0,5-0,7×10⁶ клеток на 1 кг веса больного. Для трансплантации применяли свежеприготовленные клетки, если лечение производили с их помощью, или криоскопированные МСК, если в лечении участвовали они.

Одним из важных условий является сокращение временного интервала между извлечением МСК из культивируемой среды и их трансплантацией непосредственно в мозг больного. Это связано с тем, что в каждую минуту этого периода определенное количество клеток становится нежизнеспособным, а это, в конечном счете, влияет на конечный эффект. Способ поясняется на примере его конкретного осуществления.

Пример №1:

Больная К., 1981 года рождения, № истории болезни 1836. Беременность у матери протекала с токсикозом, роды с выраженной асфиксией. Первые 7 суток жизни больная находилась в реанимации. Раннее развитие с задержкой, села в 1,5 года, самостоятельно пошла в 5 лет. Выражена задержка психоречевого развития с раннего детства. Больная постоянно лечилась различными медикаментами амбулаторно и более 12 раз в различных стационарах. Необучаема, положительной динамики в состоянии больной не отмечалось.

При поступлении в отделение (возраст 24 года) больная продуктивному контакту недоступна, практически себя не обслуживает. Обращенную речь понимает частично. Количество правильно употребляемых слов не превышает 3-8, правильно выполняемых команд - не превышает 5-7. Речь нечленораздельная. Уровень IQ соответствует умственной отсталости в степени идиотии (<20). Выражен синдром двигательной гиперактивности с разрушительными тенденциями, внимание удерживается не более 2-3 секунд. Больная нуждается в постоянном уходе и наблюдении.

В связи с неэффективностью и бесперспективностью медикаментозного лечения рассматривался вопрос о проведении нейротрансплантации. После положительного заключения этической комиссии и получения письменного согласия родственников, было принято решение о проведении интрапаренхиматозной аутотрансплантации мезенхимальными стволовыми клетками, культивированными из костного мозга самой больной.

В процессе операции билатерально в лобную область (проекция точки Кохера) было интрапаренхиматозно введено по 7,5 млн клеток и внутрисосудисто 7 млн клеток. Операция прошла без осложнений, швы сняты на 8-й день.

Уже в первые дни после операции заметно уменьшились явления моторной расторможенности, практически полностью исчезла агрессивность. Отмечалась положительная динамика в рече-двигательной и эмоциональной сферах. Через 0,5 года, после аутотрансплантации МСК запас правильно употребляемых слов более 30, количество правильно выполняемых команд около 80. Больная полностью себя обслуживает, одевается, раздевается, убирает и стелит постель, самостоятельно пользуется туалетом. Может самостоятельно сварить себе кофе, убрать со стола и т.п. У больной появилась способность к обучаемости. Она с удовольствием, часами рассматривает (и правильно называет) картинки в книжках, смотрит телевизор, играет в куклы. Однако правильные, целенаправленные поступки совершаются больной только в отношении «интересных» для нее действий. Заставить что-либо сделать помимо ее желания крайне проблематично. При дальнейшем наблюдении состояние больной продолжает прогрессивно улучшаться.

Пример № 2:

Больной С.1995 года рождения, № истории болезни - 2584. Наследственность не отягощена. Беременность у матери протекала с токсикозом и отслойкой плаценты. Роды преждевременные (34 недели), кесаревым сечением. Через час после родов у ребенка развилась асфиксия, и он был переведен в реанимационное отделение, где находился на ИВЛ в течение месяца. В дальнейшем развитие с задержкой. Головку держал с 6 месяцев, сел в 11 месяцев, самостоятельно встал в 13. Лепетная речь с 1,5 лет, отдельные слова и короткие словосочетания с 3 лет. В дальнейшем полностью перестал разговаривать, обращенную речь понимал частично. С рождения наблюдался неврологом, ставился диагноз: перинатальная энцефалопатия, синдром двигательных нарушений. Постоянно принимает медикаментозную терапию. С возраста 6 мес. Регулярно лечится в различных стационарах (17 госпитализаций), с различными диагнозами: от ДЦП (спастико-астеническая форма), до синдрома раннего детского аутизма (церебро-органического генеза). Последний год посещал «Центр реабилитации ребенка» где отмечались реакции негативизма с агрессией в отношении педагогов и детей. Больной пытался обучаться по программе 1-го класса, однако программу не усваивал.

При поступлении: контакт формальный, продуктивному контакту не доступен, речь отсутствует. В поведении неадекватен, непоследователен, внимание крайне неустойчивое. Правильно выполняет 8-10 простых команд. Себя обслуживает частично, неопрятен. IQ снижен до уровня идиотии, способность к обучаемости отсутствует. В связи с отсутствием эффекта от лечения и продолжающимся ухудшением состояния больного было принято решение о проведении нейротрансплантации. После положительного решения этической комиссии и получения письменного согласия родственников была проведена аутотрансплантация мезенхимальных стволовых клеток. В ходе аутотрансплантации билатерально в область префронтальной коры больному было введено по 8 млн клеток и одновременно внутрисосудисто введено 53 млн мезенхимальных стволовых клеток со скоростью 6 млн клеток в минуту, введение внутривенное.

Уже в первые недели после трансплантации у больного значительно уменьшилась агрессивность по отношению к окружающим. В дальнейшем больной начал правильно произносить и использовать короткие слова и словосочетания. Значительно расширилась сфера самообслуживания, больной начал самостоятельно пользовать туалетом, одеваться-раздеваться, убирать постель и т.п. Последующий катамнез показал заметное улучшение вербальных и когнитивных функций, у больного появилась способность к обучаемости.

Пример № 3:

Больной А. 1992 года рождения. Беременность у матери протекала с токсикозом, роды с выраженной асфиксией. Развитие с задержкой. Отмечены прогрессирующая задержка психоречевого развития, агрессивность в общении, неустойчивость внимания и отсутствие памяти при обучении.

Уровень IQ<50. После заключения комиссии о бесперспективности медикаментозного лечения и получения письменного согласия родственников была проведена операция по трансплантации аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК). МСК выделены из костного мозга пациента путем обработки ткани до получения однородных по фенотипу клеток, культивированных затем in vitro. Трансплантат представлял собой модифицированный стент, являющийся носителем, насыщенный МСК, количество клеток, внесенных в зоны головного мозга, в сумме составило 42 млн.

В процессе операции интрапаренхиматозно билатерально в лобную область ввели биотрансплантат. Через 7 дней сняли швы. Отмечено улучшение состояния больного через 2 недели. Агрессивность не наблюдается. Наблюдение в течение года подтвердило правильность решения о проведении операции: больной стал обучаем, увеличился запас слов, отмечена положительная динамика в рече-двигательной и эмоциональной сферах.

Пример № 4:

Больная В. 1996 года рождения. Беременность у матери протекала с токсикозом. Роды без особенностей. С 2-х лет поставлен диагноз «задержка психоречевого развития», затем - «стереотипии у больной с задержкой развития». В возрасте 8 лет интеллектуальное развитие соответствовало возрасту 2-х лет (эмбецильность). После получения разрешения родителей больной были внутрисосудисто введены МСК. Введение осуществляли внутривенно со скоростью 6 млн клеток в минуту и внутриартериально со скоростью 2 млн/мин. МСК являлись аутологичными, они были получены из костного мозга пациентки и культивированы in vitro. Общее количество внесенных клеток составило 54 млн. Клетки были однородны по фенотипу и жизнеспособны.

Наблюдение за больной в течение первого месяца после введения МСК показало значительное улучшение состояния пациентки, что проявлялось как в поведении, так и в проявлении интереса при показе картинок в книжках, в устойчивости внимания. Наблюдение за ребенком продолжается, отмечен прогресс в психоречевом развитии.

Пример № 5:

Больная П. 1989 г.р. Находилась в отделении с Диагнозом: ДЦП, спастическая форма с выраженной задержкой развития (имбецильность). 24.02.05. был произведен забор костного мозга с последующим культивированием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток и хранением полученной культуры в условиях специального, глубокого замораживания. При повторной госпитализации (11.04.05) готовая культура МСК была разморожена и трансплантирована больной путем внутрисосудистого введения, причем общее количество вводимых МСК составило 25 млн клеток, введение осуществляли внутриартериально со скоростью 2 млн клеток в минуту.

До трансплантации состояние характеризовалось полным отсутствием речи, частичным самообслуживанием, тотальной расторможенностью, раздражительностью, отсутствием способности к обучаемости и необходимостью в постоянном уходе и наблюдении. Через год, при контрольной госпитализации, было зафиксировано значительное клиническое улучшение. Уровень невербального интеллекта значительно увеличился (р<0,03). Хотя речь и не сформировалась, больная начала произносить отдельные слоги и короткие слова. Запас слов достигает 50, количество правильно выполняемых команд >100. Может часами самостоятельно играть или смотреть телевизор. У больной появилась способность к обучаемости, она полностью себя обслуживает. Стала полностью себя обслуживать. Значительные, положительные изменения были получены по результатам социально-бытового тестирования (р<0,01).

Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность лечения выраженного снижения интеллектуально-мнестических функций, связанных с поражением ЦНС.

Предложенный нами способ был апробирован в НИПНИ им. В.М.Бехтерева, на отделении хирургии нервных и психических заболеваний.

Способ аутотрансплантации мезенхимальных стволовых клеток является принципиально новым методом лечения больных с поражением интеллектуально-мнестических функций различной этиологии.

1. Биотрасплантат для лечения задержки психического развития, характеризующийся тем, что представляет собой суспензию клеток в 10%-ной аутологичной сыворотке крови на физиологическом растворе или в фармацевтически приемлемом растворителе, содержащую однородные по клеточным маркерам CD 44+, CD 90+, CD 105+, CD 106+, CD 45-, CD 34-аутологичные мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из костного мозга, для чего ткань дезагрегируют гепарином, клеточную суспензию центрифугируют, однородные МСК культивируют на ростовой среде, содержащей питательную среду Игла в модификации Дюльбекко.

2. Биотрасплантат по п.1, отличающийся тем, что содержит свежеприготовленную культуру клеток.

3. Биотрасплантат по п.1, отличающийся тем, что содержит клеточную культуру, криоконсервированную с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида.

4. Биотрасплантат по п.2 или 3, отличающийся тем, что содержит 0,7-1,2·10⁶ МСК в 1 мл биотрасплантата.

5. Биотрасплантат п.2 или 3, отличающийся тем, что дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель при концентрация МСК 0,7-1,2·10⁶ в 1 мл биотрасплантата.

6. Способ лечения больных с выраженным психическим недоразвитием путем использования лечебных средств, отличающийся тем, что в качестве лечебного средства используют биотрансплантат по п.4 или 5, который вводят паренхиматозно в количестве 7-12 млн аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на одну из зон Бродмана 44, 43, 46, 24, 25, 22, 41 и 42.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что дополнительно вводят биотрасплантат по п.2 или 3 внутрисосудисто с дозировкой 0,5-0,7·10⁶ аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на 1 кг веса больного.

8. Способ лечения больных с выраженным психическим недоразвитием путем использования лечебных средств, отличающийся тем, что в качестве лечебного средства используют биотрасплантат по п.2 или 3, который вводят внутрисосудисто, причем общее количество вводимых МСК составляет от 7 до 25 млн.

9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что внутриартериальное введение биотрансплантата осуществляют со скоростью 2 мл/мин.

10. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что внутривенное введение биотрансплантата осуществляют со скоростью 6 мл/мин.