Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемагглютинин/протеазы vibrio cholerae, и штамм escherichia coli - продуцент гемагглютинин/протеазы vibrio cholerae

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду рНР61, экспрессирующую клонированный ген hapA (гемагглютинин/протеазы) Vibrio cholerae, а также штамм E.coli KM 192 Государстенной коллекции патогенных бактерий «Микроб», несущий рекомбинантную плазмиду рНР61, - продуцент гемагглютинин/протеазы (НА/Р) Vibrio cholerae. Изобретение позволяет получать гемагглютинин/протеазу без использования возбудителей особо опасных болезней, а также получать высокоочищенную НА/Р. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения свойств, биохимической и биологической активности гемагглютинин/протеазы (НА/Р) Vibrio cholerae.

Гемагглютинин/протеаза - ключевая протеаза холерных вибрионов, роль которой в патогенезе холеры и в выживаемости холерных вибрионов во внешней среде изучена далеко не достаточно. Исследования НА/Р требуют наличия ее препаратов, наиболее перспективным способом получения которых является использование продуцентов - рекомбинантных штаммов кишечной палочки, содержащих клонированный ген hapA.

Известен штамм Vibrio cholerae CA401 (см. статью Finkelstein R.A., Hanne L.F. Purification and characterization of the soluble hemagglutinin (cholera lectin) produced by Vibrio cholerae: Infection and Immunity, 36, 1982, 1199-1208), из культуральной жидкости которого был выделен препарат НА/Р, представляющий собой термолабильный белок с молекулярной массой (ММ) 32 кДа, обладающий протеолитической активностью и способностью вызывать агглютинацию куриных эритроцитов.

Недостатком известного продуцента является то, что холерные вибрионы образуют несколько типов протеаз, что значительно затрудняет отбор фракций, содержащих НА/Р, по ферментативной активности, а также необходимость соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций, что возможно только в специализированных лабораториях учреждений противочумной системы.

Известен штамм Vibrio cholerae nonO1 TH81 (см. статью Honda Т., Lertpocasombat К., Hata A. et al. Purification and characterization of a protease produced by Vibrio cholerae non-О1 and comparison with a protease of V.cholerae O1: Infection and Immunity, 57, 1989, 2799-2803), из культуральной жидкости которого была выделена НА/Р, полностью идентичная НА/Р холерных вибрионов O1 группы.

Однако использование этого продуцента также связано с необходимостью достижения высокой степени очистки НА/Р от других протеаз, что требует проведения многоступенчатого процесса с применением дорогостоящего оборудования.

За прототип выбран способ (см. статью Häse С.С., Finkelstein R.A. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain: Journal of Bacteriology, 173, 1991, 3311-3317), заключающийся в клонировании гена hapA холерного вибриона в Escherichia coli DH5α в составе векторной плазмиды pACY184 и последующей его экспрессии в НА/Р-негативном штамме Vibrio cholerae HAP-1, трансформированном рекомбинантной плазмидой рСН2.

Недостатком прототипа является то, что клонированный ген hapA не экспрессируется в штаммах кишечной палочки, что не позволяет использовать рекомбинантные штаммы E.coli в качестве продуцентов НА/Р.

Техническая задача изобретения - создание рекомбинантной плазмиды и штамма Escherichia coli, экспрессирующего клонированный ген гемагглютинин/протеазы (hapA) Vibrio cholerae под контролем Т5-промотора.

Задача решается путем создания:

- новой рекомбинантной плазмиды рНР61, экспрессирующей клонированный ген hapA (НА/Р) холерного вибриона в штаммах кишечной палочки;

- штамма Escherichia coli Jm103pHP61 - продуцента НА/Р холерных вибрионов посредством трансформации штамма Е.coli Jm103 рекомбинантной плазмидой рНР61.

На фиг.1 приведена схема векторной плазмиды pQE30 (QIAGEN), являющейся исходной для получения рекомбинантной плазмиды рНР61.

На фиг.2 представлена схема конструирования рекомбинантной плазмиды рНР61.

Плазмида pQE30 (см. фиг.1) несет ген устойчивости к ампициллину (bla) и содержит промоторно-операторную область, включающую Т5-промотор и два расположенных тандемом lac-оператора, обеспечивающих максимальную репрессию синтеза НА/Р в присутствии глюкозы, а также синтетический сайт связывания рибосомальной РНК, старт-кодон, последовательность триплетов, кодирующих синтез гексагистидина (6-His), полилинкер (MCS) и два терминатора транскрипции (t0 фага лямбда и Т1 из rrnB-оперона Е.coli). Экспрессия клонированных генов происходит при индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ) и начинается с плазмидного старт-кодона, при этом образуется гибридный белок, перед первой аминокислотой которого располагается гексагистидиновый блок.

Плазмида рНР61 представляет собой генно-инженерный вариант, полученный путем встраивания в вектор pQE30 гена hapA V.cholerae O1 биовара eltor (см. фиг.2).

Будучи трансформирована в штаммы кишечной палочки Jm103, HB101 либо M15, рекомбинантная плазмида экспрессирует клонированный ген под контролем Т5-промотора. Экспрессия гена подавляется в присутствии глюкозы и индуцируется ИПТГ.

Штамм E.coli Jm103pHP61 представляет собой генно-инженерный вариант, полученный путем трансформации рекомбинантной плазмиды рНР61 в штамм E.coli Jm103, и является продуцентом плазмидной ДНК и НА/Р V.cholerae. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" под номером КМ 192.

Полученный штамм-продуцент характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические свойства

В жидких питательных средах (бульоне Хоттингера, мясо-пептонном бульоне) образует равномерную муть, на плотных - круглые, выпуклые, гладкие, белые полупрозрачные колонии с ровным краем, тестообразной консистенции.

Физиолого-биохимические свойства

Штамм разлагает с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу и маннозу, не разлагает сахарозу, на среде Эндо образует лактозонегативные колонии. Ауксотроф. При индукции ИПТГ проявляет протеолитическую активность на молочном агаре.

Устойчивость к антибиотикам

Штамм устойчив к 50 мкг/мл стрептомицина, что является свойством исходного штамма Jm103, и к 50-100 мкг/мл ампициллина за счет присутствия гена bla в составе векторной плазмиды pQE30.

Способ получения и использования рекомбинантной плазмиды и штамма-продуцента иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клонирование гена hapA и получение рекомбинантной плазмиды

Для ПЦР-синтеза гена hapA используют праймеры, сконструированные заявителями на основе анализа нуклеотидной последовательности гена hapA VCA0865 (АЕ004414):

прямой - и

обратный -

Поскольку амплификаты необходимо встроить в плазмидный вектор pQE30 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Т5-промотора, на 5′-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: BamHI для прямого праймера и HindIII - для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) в соответствии с порядком расположения сайтов рестрикции в полилинкере векторной плазмиды.

Из штамма V.cholerae eltor P-9961 фенольным методом выделяют хромосомную ДНК, которая служит матрицей для синтеза искомого гена.

300 мкл реакционной смеси для полимеразной цепной реакции содержат 0,5 нг ДНК-матрицы и следующие компоненты в указанных концентрациях: по 2,5 мкл каждого праймера, по 2,5 мМ всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 3 ед. Taq-полимеразы и 0,1 объема прилагаемого к ней 10-кратного буфера. Смесь разливают по 30 мкл в 0,5-мл пластиковые пробирки и осуществляют реакцию по следующей схеме: 94°С - денатурация (1 мин), 63°С - отжиг (40 сек), 72°С - синтез (1 мин). Всего проводят 30 циклов амплификации, в последнем цикле время синтеза увеличивают до 30 минут. По окончании реакции смесь подвергают электрофорезу в 0,7% арагозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия, затем просматривают в ультрафиолетовом свете, вырезают участок геля с амплифицированным фрагментом размером 1847 т.п.н., выделяют последний элюцией, очищают смесью фенол: хлороформ: изопропанол в соотношении 25:24:1 и осаждают этиловым спиртом.

Полученный таким образом ПЦР-амплификат и ДНК векторной плазмиды pQE30 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII согласно рекомендациям фирмы-изготовителя ферментов, очищают в агарозном геле и лигируют с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и прилагаемого к ней буфера согласно рекомендациям изготовителя.

Лигазными смесями трансформируют компетентные клетки Е.coli Jm103, приготовленные накануне обработкой хлористым кальцием. После стандартной процедуры трансформации (0°С - 40 мин, 42°С - 2 мин, 0°С - 5 мин) клетки разводят в 10 раз средой LB с 0,5% глюкозы, подращивают в течение 1 ч и высевают на агар LB, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 0,5% глюкозы. Добавление глюкозы существенно для репрессии синтеза продукта гена hapA, который может оказать токсическое действие на клетки кишечной палочки. Посевы инкубируют при 37°С.

На следующие сутки выросшие ампициллинрезистентые колонии тестируют с помощью следующих праймеров для детекции гена hapA:

прямой - 5′-TCAACTACAACACCGCAGAC-3′ и

обратный - 5′-GACGACAATCCCAAGAAGAG-3′ и отбирают позитивные клоны, из которых выделяют плазмидную ДНК и подтверждают наличие вставок длиной 1,8 т.п.н. гидролизом этих плазмид эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Для выявления способности рекомбинантов к синтезу НА/Р культуры рекомбинантных клонов, а также контрольный штамм, содержащий векторную плазмиду pQE30 без вставки, выращивают в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 3-4 ч при 37°С с шуттелированием при 150 об/мин и затем индуцируют 1 мМ ИПТГ в течение 1-2 ч. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в забуференном физиологическом растворе (PBS) и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе PG-100 MSE 150 W (Англия) с помощью конического стержня при частоте колебаний 20 кГц и амплитуде 12-16 мкм в течение 1 мин. Остатки клеток отделяют центрифугированием, а прозрачные супернатанты используют для тестирования. Содержание белка определяют методом Лоури.

Пример 2. Изучение ферментативной активности препарата рекомбинантного белка НА/Р, полученного по примеру 1

Ферментативную активность осветленных дезинтегратов клеток штамма Е.coli Jm103pHP61 (KM 192) определяют азоказеиновым методом. Пробы титруют двукратно в 50 мкл PBS, добавляют к каждому разведению 50 мкл раствора азоказеина (5 мг/мл 100 мМ трисHCl-буфера рН 8,0) и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Затем добавляют по 200 мкл 10% трихлоруксусной кислоты, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин и отбирают по 100 мкл супернатантов в лунки пластикового планшета со 100 мкл 525 мМ NaOH. Оптическую плотность (OD) измеряют при 450 нм (00450) с помощью спектрофотометра Titertek Multiscan PLUS MKII (Labsistems, Finland). За единицу активности принимают количество фермента, увеличивающее OD₄₅₀ на 0,01 за 1 ч.

В 1 мг общего белка E.coli Jm103pHP61 содержится 5-10 тысяч единиц протеолитической активности. Дезинтеграт контрольного штамма E.coli Jm103pQE30 не вызывает увеличения OD₄₅₀, то есть не обладает протеолитической активностью.

Пример 3. Изучение гемагглютинирующей активности препарата рекомбинантного белка НА/Р, полученного по примеру 1

Гемагглютинирующую активность дезинтеграта E.coli Jm103pHP61 (KM 192) определяют по отношению к куриным эритроцитам, отмытым в буфере для гемагглютинации (Difco). Поскольку из литературных данных известно, что эритроциты не всех кур даже одной породы агглютинируются НА/Р, следует использовать эритроциты нескольких индивидуумов, способность которых к агглютинации предварительно проверяют в реакции на стекле. Осветленные дезинтеграты титруют двукратно в 96-луночном планшете в 50 мкл того же буфера и добавляют к разведениям по 50 мкл 1,5% взвеси эритроцитов, которые показали положительный результат на стекле.

Через 1-2 часа инкубации при комнатной температуре наблюдают агглютинацию эритроцитов дезинтегратом штамма E.coli Jm103pHP61 ("зонтики") в разведениях с содержанием общего белка 40 мкг/мл и выше и отсутствие агглютинации дезинтегратом контрольного штамма E.coli Jm103pQE30 ("пуговки").

Пример 4. Изучение биологической активности препарата рекомбинантного белка НА/Р, полученного по примеру 1, in vitro

Биологическую активность осветленных дезинтегратов рекомбинантного штамма E.coli Jm103pHP61 (KM 192) изучают in vitro на модели клеточных культур линий СНО-К1 и L-929, которые вносят в 96-луночные планшеты в количестве 10³ клеток на 90 мкл среды RPMI-1640 (Sigma), содержащей 1% сыворотки плода коровы, добавляют по 10 мкл испытуемых препаратов в разведениях 1:10-1:800 в той же среде и инкубируют в СО₂-инкубаторе (Sanjo) при 37°С. Морфологическое изучение культур проводят в течение 2-х дней с помощью инвертированного микроскопа (Reichert).

Через сутки после внесения разведении осветленного дезинтеграта клеток E.coli JM103pHP61 происходит округление клеток в разведениях опытных образцов с концентрацией общего белка ≥ 40 мкг/мл, тогда как в контрольных лунках (E.coli JM103pQE30) округление клеток отсутствует.

Таким образом, рекомбинантный белок НА/Р обладает протеолитической, гемагглютинирующей и биологической активностью.

Использование рекомбинантной плазмиды рНР61 и штамма КМ 192 позволит проводить широкомасштабные исследования биологической активности НА/Р Vibrio cholerae с целью изучения ее свойств. Дальнейшие исследования НА/Р с помощью продуцента, полученного заявителями, имеет принципиальное значение для оценки ее роли в вирулентности, выяснения механизма ее действия на эукариотические клетки и эволюционных связей с протеазами других возбудителей. Кроме того, плазмида является перспективной для создания более активных продуцентов на основе других штаммов кишечной палочки.

Рекомбинантный штамм E.coli является перспективным в качестве продуцента НА/Р холерных вибрионов для изучения ее биологического действия и влияния на активность других факторов вирулентности. НА/Р является единственной протеазой, синтезируемой данным штаммом, поэтому в качестве препаратов могут быть использованы неочищенные лизаты или дезинтеграты бактериальных клеток.

Преимуществом предлагаемого продуцента по сравнению с холерными вибрионами является также то, что его культивирование не требует соблюдения режима работы с возбудителями ООИ.

1. Рекомбинантная плазмида рНР61, экспрессирующая клонированный ген hapA (гемагглютинин/протеазы) Vibrio cholerae, встроенный по сайтам BamHI-HindIII в полилинкер векторной плазмиды pQE30, под контролем Т5-промотора.

2. Штамм Escherichia coli КМ 192 Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб", несущий рекомбинантную плазмиду рНР61 по п.1 - продуцент гемагглютинин/протеазы (НА/Р) Vibrio cholerae.