Защитная среда для изготовления вирус-вакцин в птицеводстве

Изобретение относится к области биотехнологии. В качестве защитной среды используют липоферол - липосомальный препарат антиоксидантного действия для внутривенного введения. В состав липоферола входят фосфолипиды сои, DL-альфа-токоферол, сорбит-фосфатный буфер. Данная защитная среда исключает возможность заражения губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота и одновременно способствует получению высококачественных, высокоиммунных и биологически активных вакцин. 1 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области вирусологии и касается изготовления препаратов, используемых в ветеринарии, в частности может найти применение при изготовлении средств специфической защиты от инфекционного ларинготрахеита птиц и ньюкаслской болезни и др.

Известно применение защитной среды СПЛФ - 20% при изготовлении комбинированной вакцины против ньюкаслской болезни (НБ) и инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ) путем смешивания с ней вируссодержащих материалов вируса НБ из штамма "Ла-Сота" и вируса ИЛТ из штамма "ВНИИБП" [1].

Известно также применение защитной среды, содержащей пептон, пищевой желатин и сахарозу, взятые в соотношении 2:5:5, или пептон с сахарозой, или лактозу с пептоном и обезжиренное коровье молоко при получении средства для профилактики ИЛТ на основе штамма "ВНИИБП" [2].

Известно применение липосом в качестве защитной среды высушивания при изготовлении сухой вирус-вакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ [3].

Известная липосомальная защитная среда включает соевый лецитин (СЛ), кислые фосфолипиды сои (КФ), холестерин (ХС) и α-токоферол в соотношении 67,4:9,5:22,0:1,1.

Однако использование при производстве вирус-вакцин защитных сред, имеющих в своем составе пептон либо холестеринсодержащие компоненты, в настоящее время нежелательно в связи с возможной контаминацией их возбудителем губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота, опасного для здоровья человека [4].

Задачей заявляемого изобретения является создание защитной среды, используемой при производстве вирус-вакцин, исключающей возможность заражения губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота и одновременно способствующей получению высококачественных, высокоиммунных и биологически активных вакцин.

Поставленная задача решается тем, что в качестве защитной среды для вирус-вакцины применяют липоферол - липосомальный препарат антиоксидантного действия для внутривенного введения.

Липоферол - липосомальный препарат с DL-альфа-токоферолом для внутривенного введения.

Основные липидные компоненты липоферола выделены из отечественного сырья - фосфолипидов сои. Препарат получен пленочно-дисперсионным методом с последующим гомогенизированием компонентов под высоким давлением. В состав препарата входят фосфолипиды сои, DL-альфа-токоферол, сорбит-фосфатный буфер. Липоферол обладает антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, безвреден, нетоксичен, не вызывает аллергических реакций, не накапливается в организме вследствие полного метаболизма.

Применяется самостоятельно и в схемах комплексной терапии при ожоговом шоке, шокогенной травме, токсемиях различного происхождения, токсических и инфекционных гепатитах.

Разработчик и изготовитель препарата - Российский НИИ гематологии и трансфузиологии [5].

Для определения возможности использования липоферола в качестве защитной среды при производстве вирус-вакцин в птицеводстве были наработаны опытные партии липосомальной вирус-вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ) и ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ) и ньюкаслской болезни (НБ).

Для наработки опытных серий вирус-вакцин сухих липосомальных против ИЛТ использовали штамм "ВНИИБП", а для ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины - сухой штамм "Ла-Сота" против НБ и штамм "ВНИИБП" против ИЛТ. Для получения вакцин вирусную суспензию указанных штаммов инокулировали в аллантоисную полость 9-суточным куриным эмбрионам (КЭ). На шестые сутки у эмбрионов, зараженных штаммом "ВНИИБП", собирали хориоаллантоисные оболочки (ХАО), а у эмбрионов, зараженных штаммом "Ла-Сота", - экстраэмбриональную жидкость.

Вируссодержащий материал штамма "ВНИИБП" и липосомальную эмульсию смешивали в соотношении 2:1, а аналогичный материал штаммов "ВНИИБП", "Ла-Сота" и липосомальную эмульсию - в соотношении 1:1:1.

Масса липосомальных вакцин после лиофильной сушки была однородной, пористой, беловато-розового цвета, при растворении в дистиллированной воде в течение 2-3 минут образовывала гомогенную взвесь. Вакцины были стерильны, не контаминированы чужеродными вирусами, биологически активны и иммуногенны. Десятикратные иммунизирующие дозы вакцин при окулярном применении оказались безвредными.

Пример 1.

В целях всесторонней оценки вирус-вакцины сухой липосомальной для специфической профилактики ИЛТ птиц была проведена ее комиссионная проверка в условиях производства на ЗАО "Птицефабрика "Синявинская", где выращивается птица яичного кросса "Хайсекс белый".

Вирус-вакцину сухую липосомальную против ИЛТ и коммерческую вакцину против ИЛТ применяли аэрозольным методом двукратно: в первый раз - в возрасте 34-35 дней в дозе 2,5 ЭИД_50/гол, второй раз - в возрасте 52-53 дня в дозе 7,5 ЭИД_50/гол, и одновременно с ней назначали вакцину из штамма "Ла-Сота" против ньюкаслской болезни в дозе 1100 ЭИД_50/гол.

В этот же день методом "спрей" проводилась иммунизация вакциной из штамма "Н-120" против ИБК.

Для испытаний было образовано две партии цыплят: опытная - для испытания липосомальной вакцины (серия 1), в количестве 37300 голов, и контрольная, где испытывалась коммерческая вакцина (серия №58), - в количестве 38000 голов.

Для вакцинации применена вирус-вакцина сухая липосомальная против ИЛТ птиц из штамма "ВНИИБП " серия №1 с биологической активностью 5,88 lg ЭИД_50/см ³ и коммерческая из этого же штамма вирус-вакцина сухая серии №58-5,7 lg ЭИД_50/см ³.

Эффективность аэрозольной иммунизации этих вакцин установлена путем определения титра антител в сыворотке крови цыплят методом ИФА в наборах фирмы "Биочек".

Средний титр антител во всех пробах сывороток крови до применения вакцин принадлежал к нулевой титрогруппе. После первой и второй иммунизации вирус-вакциной сухой липосомальной и коммерческой средний титр увеличился в 3-5 раз. Достоверной разницы в титрах антител после второй вакцинации между биопрепаратами не установлено. Испытания вирус-вакцины сухой липосомальной против ИЛТ показали, что она обеспечивает эффективную защиту при контрольном заражении патогенным вирусом ИЛТ (штамм "24а") и не уступает по этому показателю (94,4%) коммерческой вакцине (88,8%), в которой в качестве защитной среды используется пептон (ТУ 9384-001-00495674-96).

Пример 2.

Биологическая активность ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ (штамм "Ла-Сота") и ИЛТ (штамм "ВНИИБП") определена сразу после изготовления и через 10 месяцев хранения. Результаты титрации сравнивали с контрольной комбинированной вакциной, приготовленной со стандартной защитной средой (среда ВНИВИП, содержащая пептон КРС).

Данные опыта по титрации вакцин, приготовленных на различных защитных средах, представлены в таблице.

Таблица
Сравнительные показатели биологической активности вирусов ИЛТ и НБ
при использовании различных защитных сред.
Защитная среда	Биологический титр lg ЭИД50/см 3
После изготовления	Через 10 мес.
	ИЛТ	НБ	ИЛТ	НБ
Липосомальная эмульсия	6,03	10,5	5,58	9,92
Среда «ВНИВИП» на основе пептона	6,03	10,5	5,98	9,50

Как видно из данной таблицы, титр вируса ИЛТ и НБ в вакцине, приготовленной на основе различных защитных сред, был равнозначным. После 10 месяцев хранения титр вируса ИЛТ в липосомальной суспензии стал ниже на 0,4 lg ЭИД_50/см ³, а титр вируса НБ на среде с пептоном - на 0,42 lg ЭИД_50/см ³, что допустимо в пределах ошибки метода.

Таким образом, состав среды практически не влиял на титр вирусов, т.е. обе защитные среды могут быть использованы при производстве ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ и ИЛТ.

Полученная ассоциированная сухая липосомальная вирус-вакцина против ИЛТ и НБ была стерильной. Введение цыплятам интраназально 10-кратной дозы этой вакцины не вызывало у них клинических признаков переболевания, угнетения в течение 10 дней наблюдения, т.е. вакцина была безвредной. При определении иммуногенности вакцины цыплят вакцинировали дважды в 20- и 40-суточном возрасте энтеральным и назальным методами.

При контрольном заражении вирулентным вирусом ИЛТ в группе невакцинированного контроля заболело 19 из 19 цыплят (100%) с клиникой ИЛТ (угнетение, отказ от корма, затрудненное дыхание, хрипы). В то время как, в группе цыплят, иммунизированных ассоциированной сухой липосомальной и коммерческой вирус-вакциной энтеральным методом, заболело по 2 головы (11,7%). При назальном методе вакцинации заболевших цыплят не было, а в группе привитых коммерческой вакциной заболел 1 цыпленок. Коэффициент корреляции (r) для иммунизированных цыплят составил 0,89-1,0, что указывает на тесную корреляционную связь с зараженным невакцинированным контролем. Эффективность иммунизации для ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины составляла 88,3-100%, а для коммерческой - 88,39-94,1%.

При определении иммуногенных свойств ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ в РЗГА титр равнялся 7,0-7,5 log₂, а коммерческой - 6,0 log₂. После второй вакцинации титр антигемагглютининов во всех группах цыплят был сравнительно одинаковым и колебался от 5,8 до 6,5 log₂, т.е. создавался надежный уровень защиты.

Таким образом, предлагаемые защитные среды могут быть использованы при производстве ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ и ИЛТ, однако при применении в качестве защитной среды липосомальной эмульсии - липоферола - есть преимущества, поскольку она не содержит потенциального источника контаминации губкоообразной энцефалопатии крупного рогатого скота, опасного для человека.

Источники информации

1. Патент РФ №2106152, А61К 39/17, 39/245, 1998 г.

2. Малушко В.В., Соколов В.Д., Быков В.Ф., Чабанова Л.П., Шорников В.В. "Птицеводство", №12, 1983, с.21-23.

3. Новосадюк Т.В. "Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук " Липосомальная форма вакцины против ИЛТ птиц", СПб., 1998, с.10.

4. Костенко Ю.Г, Лисицын А.Б., Шагова Т.С., Тимошенко Н.В., Кобзев А.Н. «Проблема губкообразной энцефалопатии и производство кормов животного происхождения», «БИО», июль 2002 г., стр.26-28.

5. Патент РФ №2071765, А61К 9/127, 1997.

Применение липоферола - липосомального препарата антиоксидантного действия в качестве защитной среды для изготовления вирус-вакцин в птицеводстве.