Способ и набор для иммуноферментного определения активности и ингибирования iga1-протеазы
Владельцы патента RU 2310853:
Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способу и набору для определения функциональной активности и ингибирования IgAl-протеаз, которые предусматривают сорбцию на микропанели миеломного IgAl, инкубацию в ячейках микропанели растворов, содержащих IgAl-протеазу, и определения активности фермента по снижению количества сорбированного IgAl, определяемого конъюгатом с пероксидазой поликлональных антител к IgA. Определение активности IgAl-протеазы в присутствии различных концентраций ингибитора позволяет расчитать константы его ингибирования. Набор содержит микропанель с сорбированным препаратом миеломного IgAl, конъюгат пероксидазы с антителами против IgA человека и субстратный буфер. Изобретение обеспечивает разработку простого способа и набора для определения активности IgAl-протеазы и исследования ее ингибирования. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности и ингибирования IgAl-протеаз. IgAl-протеазы - бактериальные ферменты, обладающие исключительно узкой специфичностью. Они способны расщеплять только иммуноглобулины подкласса IgAl человека и некоторых приматов. Эти протеазы являются одним из основных факторов вирулентности ряда патогенов, таких как Hemophilus influenzae, Neisseria meningitides, Neisseria gonorrheoeae, Streptococcus pneumoniae и некоторых других бактерий, инфицирующих ротоглотку и верхние дыхательные пути. IgAl-протеазы используются в лабораторной практике для изотипирования иммуноглобулинов А. Определение наличия этих протеаз может быть использовано для характеристики вирулентности и патогенности бактериального возбудителя. Поиски ингибиторов IgAl-протеаз необходимы для создания лекарственных средств защиты от патогенных микроорганизмов. Для этих целей может быть использовано данное изобретение.
Наиболее близким прототипом является иммуноферментный метод определения активности IgAl-протеазы [1], в котором IgA субстрат сорбируют на полистироловом микропланшете, покрытом антителами к легким цепям антител для связывания IgA по его Fab-фрагментам.
Недостатками рассмотренного метода является необходимость использования двух типов антител: против легких цепей и против α-цепей.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности IgAl-протеазы и исследования ее ингибирования с применением только доступных антител против IgA, что упрощает и существенно удешевляет набор.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ предусматривает сорбцию на микропанели миеломного IgAl, инкубацию в ячейках микропанели растворов, содержащих IgAl-протеазу, и определение активности фермента по снижению количества сорбированного IgAl, определяемого конъюгатом с пероксидазой поликлональных антител к IgA. Определение активности IgAl-протеазы в присутствии различных концентраций ингибитора позволяет расчитать его константу ингибирования.
Набор содержит микропанель с сорбированным препаратом миеломного IgAl, конъюгат пероксидазы с антителами против IgA человека и субстратный буфер.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простых способа и набора для определения активности IgAl-протеазы и исследования ее ингибирования.
Пример 1. Определение ферментативной активности IgAl протеазы. В основу метода положено определение остаточного количества IgA методом иммуноферментного анализа. Для этого проводят сорбцию препарата миеломного IgAl на поверхности лунок микропанели в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5. В лунки вносят растворы фермента, полученного из культуральной жидкости Neisseria meningitides, в различных концентрациях. После инкубации в течение выбранного в зависимости от активности фермента времени и температуре отмывки лунок фосфатно-солевым буфером, рН 6,5, с твином в последние вносят раствор конъюгата анти-IgA с пероксидазой хрена. После инкубации в течение 1 ч и аналогичной промывки в лунки вносят субстратный буфер с тетраметилбензидином. После инкубации в течение 20 мин процесс останавливают подкислением серной кислотой и измеряют светопоглощение при 450 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. По разности оптических плотностей растворов в опыте и контроле (без фермента) рассчитывают количество гидролизованного за 1 ч IgA, которое характеризует активность IgAl-протеазы. На чертеже показано соответствие количества активного фермента разнице оптических плотностей.
Пример 2. Определение констант ингибирования ферментативной активности IgAl-протеиназы. Проводят аналогично примеру 1, внося в лунки IgAl-протеазу в одной концентрации, а ингибиторы (бензамидин, бацитрацин и специфический IgG против Neisseria meningitides) в различных концентрациях. Определяют разности оптических плотностей при 450 нм в каждой лунке опыта и контроля без фермента, принимая их за относительную активность IgAl-протеазы в каждой лунке опыта. По изменению активности фермента в зависимости от концентрации ингибитора рассчитывают константу ингибирования. Результаты приведены в табл.1.
Пример 3. Набор для определения ферментативной активности IgAl протеазы. Набор содержит микропанель с сорбированным препаратом миеломного IgAl, конъюгат пероксидазы с антителами против IgA человека и субстратный буфер. Данный набор используется в соответствии с примерами 1 и 2.
Как и следовало ожидать, наибольшее ингибирование наблюдалось для антител, специфичных к Neisseria meningitides, причем полученная константа типична для констант диссоциации специфических антител. Хорошее связывание проявлял бацитрацин, известный ингибитор протеолитических ферментов. Слабо ингибирует бензамидин - ингибитор протеиназ трипсинового типа.
| Таблица 1 | |||
| Определение констант ингибирования бацитрацином; бензамидином и IgG антителами против Neisseria meningitides по измерению активности lgAl-протеазы в присутствии различных концентраций ингибиторов | |||
| Ингибитор | |||
| Бацитрацин | IgG антитела против Neisseria meningitides | Бензамидин | |
| Концентрация ингибитора, мкг/мл | Относительная активность фермента, у.е. | ||
| 50 | 0.0045 | 0.0024 | 0.0054 |
| 10 | 0.0047 | 0.0109 | 0.0051 |
| 2 | 0.0243 | 0.0154 | 0.0063 |
| Кi, мкг/мл | 39.64 | 4.53 | 609.8 |
| Кi, М | 2.79·10-05 | 3.02·10-08 | 0.0039 |
ЛИТЕРАТУРА
1. Reinholdt J., Kilian M.A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for IgA protease activity // J. Immunol. Methods. 1983. V.63. P.367-376.
1. Способ иммуноферментного определения активности и ингибирования IgAl-протеазы, характеризующийся тем, что в лунках микропанели сорбируют препарат миеломного IgAl, затем в лунки вносят раствор тестируемой IgAl-протеазы, а также при изучении ингибирования ингибитор в различных концентрациях, проводят инкубацию для осуществления протеолиза и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат пероксидазы с антителами против IgA человека и после инкубации и отмывки субстратный буфер, после чего проводят расчет активности IgAl-протеазы по убыли определяемого IgA в опыте по сравнению с контролем, не содержащим IgAl-протеазы, а при изучении ингибирования рассчитанные активности IgAl-протеазы при разных концентрациях ингибитора используют для расчета константы ингибирования.
2. Набор для иммуноферментного определения активности и ингибирования IgAl-протеазы, характеризующийся тем, что он содержит микропанель с сорбированным препаратом миеломного IgAl, конъюгат пероксидазы с антителами против IgA человека и субстратный буфер.
