Физиологически активный полипептидный конъюгат, обладающий пролонгированным периодом полувыведения in vivo

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению белковых конъюгатов, и может быть использовано в медицине. Ковалентно присоединяют к одному концу непептидного полимера с двумя реакционноспособными концевыми группами иммуноглобулин или физиологически активный полипептид в присутствии восстанавливающего агента. Из полученной реакционной смеси выделяют комплекс, содержащий непептидный полимер, связанный с иммуноглобулином или физиологически активным полипептидом. Затем ковалентно присоединяют свободную реакционноспособную концевую группу непептидного полимера комплекса к иммуноглобулину или физиологически активному полипептиду в присутствии восстанавливающего агента с получением белкового конъюгата. Выделяют белковый конъюгат, содержащий физиологически активный полипептид, непептидный полимер и иммуноглобулин, которые ковалентно присоединены один к другому в указанном порядке. Изобретение позволяет получить белковый конъюгат, пригодный для производства полипептидного лекарства, благодаря его повышенной стабильности in vivo, пролонгированному времени полужизни в крови и сниженным иммуногенным свойствам. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 16 ил., 14 табл.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Белковый конъюгат, содержащий

i) физиологически активный полипептид;

ii) непептидный полимер, выбранный из группы, состоящей из поли(этиленгликоля), поли(пропиленгликоля), сополимера этиленгликоль-пропиленгликоль, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, поли(молочной-гликолевой) кислоты, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина и гиалуроновых кислот; и

iii) иммуноглобулин,

которые ковалентно связаны друг с другом в указанном порядке,

и обладающий пролонгированным временем полужизни in vivo физиологически активного полипептида.

2. Белковый конъюгат по п.1, где непептидный полимер содержит на обоих концах две реакционно-способные группы, через которые полимер ковалентно связан с физиологически активным полипептидом и иммуноглобулином.

3. Белковый конъюгат по п.2, где иммуноглобулин ковалентно связан по крайней мере с двумя комплексами физиологически активного полипептида с непептидным полимером.

4. Белковый конъюгат по п.1, где иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM и их смеси.

5. Белковый конъюгат по п.4, в котором иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их смеси.

6. Белковый конъюгат по п.4, где иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин человека.

7. Белковый конъюгат по п.1, где иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из иммуноглобулина с гликозилированием дикого типа, иммуноглобулина с повышенной или пониженной степенью гликозилирования, агликозилированного иммуноглобулина и их сочетания.

8. Белковый конъюгат по п.7, где повышение или понижение степени гликозилирования или агликозилирование иммуноглобулина осуществляют по методу, выбранному из группы, состоящей из химического метода, ферментативного метода, биотехнологического метода или их сочетания.

9. Белковый конъюгат по п.2, где реакционно-способная группа непептидного полимера выбрана из группы, состоящей из альдегида, пропионового альдегида, масляного альдегида, малеимида и производного сукцинимида.

10. Белковый конъюгат по п.9, где производное сукцинимида представляет собой сукцинимидилпропионат, сукцинимидилкарбоксиметил, гидроксисукцинимидил или сукцинимидилкарбонат.

11. Белковый конъюгат по п.9, где непептидный полимер содержит на обоих концах альдегидные группы.

12. Белковый конъюгат по п.1, где непептидный полимер ковалентно связан на концах с концевой аминогруппой, остатком лизина, остатком гистидина или остатком цистеина иммуноглобулина и с концевой аминогруппой, остатком лизина, остатком гистидина или остатком цистеина физиологически активного полипептида соответственно.

13. Белковый конъюгат по п.1, где непептидный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.

14. Белковый конъюгат по п.1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормона, цитокина, фермента, антитела, фактора роста, фактора регуляции транскрипции, фактора крови, вакцины, структурного белка, лигандного белка и рецептора.

15. Белковый конъюгат по п.14, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, гормона, высвобождающего гормон роста, пептида, высвобождающего гормон роста, интерферонов, колониестимулирующего фактора, интерлейкинов, глюкоцереброзидазы, фактора активации макрофагов, пептида макрофага, В-клеточного фактора, Т-клеточного фактора, белка А, аллергического супрессорного фактора, гликопротеина некроза клетки, иммунотоксина, лимфотоксина, фактора некроза опухоли, фактора, ингибирующего развитие опухоли, трансформирующего фактора роста, α-1-антитрипсина, альбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, гипергликозилированного эритропоэтина, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, активатора плазминогена, урокиназы, стрептокиназы, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, тромбоцитарного фактора роста, эпидермального фактора роста, остеогенного фактора роста, белка, стимулирующего остеогенез, кальцитонина, инсулина, атриопептина, фактора, индуцирующего рост хряща, белка-активатора роста соединительной ткани, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, FSH-высвобождающего гормона, фактора роста нервов, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулино-подобного фактора роста, адренокортикотропного гормона, глюкагона, холецистокинина, полипептида поджелудочной железы, гастрин-высвобождающего пептида, кортикотропин-высвобождающего фактора, тиреоидного гормона, рецептора, антагониста рецептора, поверхностного антигена клетки, моноклонального антитела, поликлонального антитела, фрагмента антитела, включая Fab, Fab', F(ab')2, Fd и scFv, и полученного из вируса антигена, используемого для изготовления вакцины.

16. Белковый конъюгат по п.15, где физиологически активный полипептид представляет собой фактор роста человека, α-интерферон, β-интерферон, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или эритропоэтин.

17. Способ получения белкового конъюгата по п.1, включающий

а. ковалентное присоединение к одному концу непептидного полимера с двумя реакционно-способными концевыми группами либо иммуноглобулина, либо физиологически активного полипептида в присутствии восстанавливающего агента;

b. выделение из полученной реакционной смеси комплекса, содержащего непептидный полимер, связанный с иммуноглобулином или физиологически активным полипептидом;

с. ковалентное присоединение свободной реакционно-способной концевой группы непептидного полимера комплекса иммуноглобулина или физиологически активного полипептида в присутствии восстанавливающего агента с получением белкового конъюгата; и

d. выделение белкового конъюгата, содержащего физиологически активный полипептид, непептидный полимер и иммуноглобулин, который ковалентно присоединен один к другому в указанном порядке.

18. Способ по п.17, где молярное отношение физиологически активного полипептида и непептидного полимера на стадии (а) выбрано из области от 1:2,5 до 1:5.

19. Способ по п.17, где молярное отношение иммуноглобулина и непептидного полимера на стадии (а) выбрано из области от 1:5 до 1:10.

20. Способ по п.17, где молярное отношение комплекса, полученного на стадии (b), и физиологически активного полипептида или иммуноглобулина на стадии (с) выбрано из области от 1:1 до 1:3.

21. Способ по п.17, где восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия, боргидрид натрия, диметиламинборат или пиридинборат.