Способ и набор для иммуноферментного определения действия веществ на связывание субкомпонентов c1q комплемента
Владельцы патента RU 2313094:
Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской иммунологии. Способ осуществляется следующим образом: сорбируют в лунках микропанели субкомпонент C1q комплемента, затем в лунки вносят в выбранных концентрациях тестируемое вещество и конъюгат иммуноглобулина G с ферментом, после чего проводят определение количества связавшегося IgG по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося IgG в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в его отсутствие, определяют константу ингибирования этим веществом связывания субкомпонента C1q с IgG. Набор для иммуноферментного определения действия веществ на связывание субкомпонентов C1q комплемента содержит микропанель с сорбированным субкомпонентом C1q комплемента, конъюгат фермента с неспецифическим иммуноглобулином G человека и субстратный буфер. Использование способа позволяет определить действие веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента в одну стадию, при этом отсутствует необходимость использования специфических антител.
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности, к способам определения ингибирующего действия веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента с активатором классического пути активации комплемента агрегированным IgG.
Изобретение может быть использовано в медицине для определения механизма действия лекарственных веществ, для поиска потенциальных лекарственных соединений, изучения побочного действия лекарственных препаратов и воздействия экологически вредных веществ на организм.
Для определения способности веществ взаимодействовать с субкомпонентом C1q комплемента известен иммуноферментный метод [1], основанный на ингибировании исследуемыми веществами способности функционально активного субкомпонента C1q специфически связываться с иммуноглобулином G, сорбированным в лунках микропанели. В качестве источника субкомпонента C1q используют сыворотку крови человека. Определение проводят в отсутствие и в присутствии ряда концентраций тестируемого ингибитора. На второй стадии определяют количество связавшегося с иммуноглобулином в лунках субкомпонента C1q по продукту ферментативной реакции с помощью специфических антител против C1q, ковалентно связанных с ферментом. К недостаткам этого метода следует отнести использование сыворотки крови в качестве источника C1q.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять константы ингибирования связывания субкомпонента C1q в одну стадию в системе, содержащей только C1q и IgG в агрегированном состоянии и тестируемое вещество (ингибитор).
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ предусматривает сорбцию в лунках микропанели субкомпонента C1q, затем внесение в лунки микропанели тестируемого вещества и конъюгата неспецифического IgG с ферментом, играющего двоякую роль: агрегата IgG, взаимодействующего с C1q и метки (фермент) для определения произошедшей реакции связывания. Способ основан на ингибировании исследуемыми веществами способности функционально активного субкомпонента C1q специфически связываться с агрегированным иммуноглобулином G. Тем самым достигается определение действия изучаемых веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента с активатором (иммуноглобулином) иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.
Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным субкомпонентом C1q комплемента, конъюгат пероксидазы с неспецифическим иммуноглобулином G человека и субстратный буфер.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка одностадийного способа и набора для определения действия веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента с активатором на основе иммуноферментного метода, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования специфических антител.
Пример 1. Определение действия сурамина и гепарина на связывание C1q с иммуноглобулином G. Растворяют иммунохимически чистый C1q в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрации белка 10 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20 (далее просто ЗФР), затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. Готовят серии двукратных разведений ингибиторов в ЗФР, затем в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с неспецифическим иммуноглобулином G человека в том же буфере в подобранном разведении (конечный объем раствора во всех лунках 200 мкл). После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С и четырехкратной отмывки с детергентом и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при 450 нм. Функциональную активность C1q без ингибирования принимают за 100%-ный контроль. Действие веществ на активность C1q характеризуется константой ингибирования связывания C1q с иммуноглобулинами. Константу ингибирования Ki определяют по линейному уравнению 1/z=[I]/(z0Ki)+1/z0, где [I] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность C1q (оптическая плотность раствора в лунке при 450 нм) в присутствии ингибитора в данной концентрации, a z0 - активность C1q в отсутствие ингибитора [1], строя график зависимости 1/z от [I]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению -Кi. Для сурамина получено значение Ki=3,1·10-4±0,4·10-4 М, что близко значению 2,9·10-4±0,2·10-4 M, полученному ранее [2] методом [1]. Для гепарина получено значение Кi=1,7·10-3±0,5·10-3 М, что близко значению 2,3·10-3±0,1·10-3 M, полученному ранее [2].
Пример 2. Набор для определения действия веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным субкомпонентом C1q комплемента, конъюгат пероксидазы с неспецифическим иммуноглобулином G человека и субстратный буфер. Данный набор используется в соответствии с примером 1.
Из приведенных результатов следует, что константы, полученные предложенным методом согласуются с опубликованными ранее, т.е. заявленным способом действительно определяется действие веществ на C1q по ингибированию его функциональной активности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козлов Л.В., Бичучер A.M., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента C1q. Патент 2190219, 27.09.2002. Бюл. №27.
2. Козлов Л.В., Белкин З.П., Бичучер A.M., Баталова Т.Н., Дьяков В.Л. Сравнение действия ингибиторов комплемента в опытах in vitro и in vivo: иммуноферментный метод изучения ингибирования субкомпонента C1q и ингибирование действия комплемента на модельных животных. Биомедицинская химия. 2003. Т.49. №3. С.264-290.
1. Способ иммуноферментного определения действия веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента, характеризующийся тем, что сорбируют в лунках микропанели C1q, затем в лунки вносят тестируемое вещество и конъюгат неспецифического иммуноглобулина G с ферментом, после чего проводят определение количества связавшегося конъюгата IgG по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося конъюгата IgG в присутствии тестируемого вещества и в его отсутствие, определяют константу ингибирования этим веществом связывания субкомпонента C1q.
2. Набор для иммуноферментного определения действия веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента, характеризующийся тем, что он содержит микропанель с сорбированным субкомпонентом C1q комплемента, конъюгат фермента с неспецифическим иммуноглобулином G человека и субстратный буфер.
