Ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды в качестве средств для лечения злокачественных опухолей

Изобретение относится к области медицины и касается ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов в качестве средств для лечения злокачественных опухолей. Способ получения лекарственного средства для лечения карциномы, за исключением злокачественных кожных заболеваний, включает получение ксеногенной РНК, получение конъюгатов ксеногенной РНК с клетками подвергаемой лечению опухоли путем инкубации in vitro. Способ лечения карцином, за исключением злокачественных кожных заболеваний, включает многократное введение пациенту ксеногенной РНК в форме конъюгата в количестве 50-100 мг тРНК или общей РНК. Преимущество изобретения заключается в создании лекарственного средства на основе ксеногенной РНК в форме конъюгата с клетками подвергаемой лечению опухоли. 3 н. и 6 з.п. ф-лы.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ксеногенным олиго- или/и полирибонуклеотидам в качестве средств для лечения злокачественных опухолей. Далее оно относится к применению этих ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов для получения лекарственных средств в целях лечения злокачественных опухолей.

Уровень техники

В конце шестидесятых и в начале семидесятых годов в рамках исследования трансплантации было найдено, что предварительно обработанные ксеногенными гетерогенными нуклеиновыми кислотами ткани или "слабые" (низкоиммуногенные) антигены в различных иммунологических методах исследования обладают в значительной степени повышенными антититрами. Эти результаты затем были подтверждены исследованиями in vitro и in vivo с рядом различных антигенов. Однако нет никаких указаний на то, что нуклеиновые кислоты и в особенности олиго- или/и полирибонуклеотиды ксеногенного происхождения могут быть пригодны для лечения злокачественных опухолей.

Прежде всего в США в то же самое время проводили опыты с определенными синтетическими поли- и олигонуклеотидами, особенно с рибонуклеотидами, которые, однако, из-за их высокой токсичности in vivo были прекращены.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения поэтому являлось получение лекарственного средства, пригодного для лечения злокачественных опухолей. Злокачественные опухоли, в смысле настоящего изобретения, не охватывают злокачественные кожные заболевания.

Задача согласно изобретению решается благодаря способу получения лекарственного средства для лечения злокачественных опухолей, которое в качестве биологически активного вещества содержит ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды предпочтительно в форме их конъюгатов с клетками подвергаемых лечению опухолей.

Ксеноген, в смысле настоящего изобретения, означает, что рибонуклеиновая кислота происходит из другого, чем подвергаемый лечению с ее помощью организм, то есть такие олиго- или/и полирибонуклеотиды происходят не из того же самого организма, в который нужно вводить лекарственное средство. В случае используемых согласно изобретению ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов речь идет предпочтительно о тех, которые происходят из тканей животных (как, например, ткань крупного рогатого скота, плодная телячья ткань), растений и одноклеточных организмов, предпочтительно из дрожжевых клеток (в особенности Saccharomyces cerevisiae). Предпочтительно используют олиго- или/и полирибонуклеотиды из организмов, которые согласно истории развития по возможности чужеродны подвергаемому лечению организму. В случае лекарственных средств для человека, таким образом, предпочтительно применяют РНК из тканей животных или особенно предпочтительно из растений или одноклеточных организмов, как, например, дрожжи.

Используемые согласно изобретению олиго- или/и полирибонуклеотиды нетоксичны и сами не антигенны.

Можно эффективно использовать препараты общей РНК и ее солей и соединений. Особенно предпочтительна транспортная рибонуклеиновая кислота (тРНК). В качестве способа получения используемых согласно изобретению рибонуклеиновых кислот в особенности предпочтительна экстракция фенолом, в частности обозначаемые в настоящем контексте как метод I и метод II способы.

Далее найдено, что ксеногенные рибонуклеиновые кислоты (РНК), связанные с пептидами, полипептидами и протеинами, увеличивают свою антигенность. На основании этих наблюдений опухолевую ткань пораженных заболеванием пациентов подвергают лечению с помощью ксеногенной РНК как in vitro, так и также in vivo. Терапию клеток опухолевой ткани пациента с помощью ксеногенной РНК, предпочтительно тРНК, предпочтительно осуществляют in vitro. Смесь затем системно вводят пациенту. В случае поверхностных злокачественных опухолей РНК также можно применять локально в пригодной галеновой форме.

Дополнительно к терапии человека, с помощью ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов согласно настоящему изобретению, тем же способом можно также лечить теплокровных, как например: лошади, крупный рогатый скот, овцы и т.д.

Изобретение далее поясняется нижеследующими примерами и результатами испытаний.

Примеры

Пример 1

Получение применяемых согласно изобретению олиго- или/и полирибонуклеотидов

В соответствующей литературе описываются многочисленные способы получения нуклеиновых кислот, нуклеотидов и нуклеозидов, для каждого из которых известны соответствующие испытания. В настоящем изобретении предпочтительно используют два метода с незначительными модификациями, причем оба основаны на обработке фенолом (фенолизация): метод I для получения общей РНК (Georgiev G.P. и Mantieva V.L., Biochim. Biophys. Acta, 61, 153 (1962)) и метод II для получения тРНК (Bauer S. и др. Biotechnology and Bioengineering, 15, 1081 (1973)). Оба метода служат для экстракции больших количеств.

Метод I

15%-ную суспензию пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в буфере (А) [0,001 М этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУ), 0,01 М буфер Трис-HCl, рН=5-6, 25% сахарозы, 0,5% додецилсульфата натрия, 0,3% дезоксихолата натрия] гомогенизировали в гомогенизаторе Уоринга при температуре 10°С в течение 3 минут со скоростью 3000 оборотов в минуту. Гомогенат смешивали с равным объемом раствора (В) [80% перекристаллизованного фенола в буфере (А), 0,1% 8-гидроксихинолина, 1,2% диэтилпирокарбоната] и затем медленно перемешивали в течение 30 минут при температуре 60°С. Все буферные растворы приготавливали на деионизированной воде, которую предварительно встряхивали с бентонитом. Затем фенолизированный гомогенат центрифугировали при комнатной температуре, примерно 20°С, в течение 15 минут с ускорением 10000 g. Водную фазу отделяли, фенольную и промежуточную фазы отбрасывали. Водную фазу смешивали с равным объемом смеси в соотношении 1:1 раствора (В) и смеси хлороформа и изоамилового спирта (в соотношении 96:4) и экстрагировали как описано выше. Водную фазу встряхивали 3 раза с половинным объемом диэтилового эфира с целью удаления остаточного фенола. В раствор вводили ацетат натрия до концентрации 2% и РНК осаждали с помощью 2,5 объемов абсолютного этанола.

Осажденную РНК отделяли путем центрифугирования при температуре 0°С и скорости 5000 оборотов в минуту и обрабатывали охлажденным во льде 0,01 М буфером Трис-HCl, рН=7,0, и 0,01 M MgCl₂. Для расщепления возможной ДНК раствор смешивали с 4 мкг/мл электрофоретически чистой панкреатической дезоксирибонуклеазы (ДНКаза) и инкубировали в течение 3 часов при температуре 22°С. Затем протеиновые остатки, ДНКазу и РНКазы расщепляли с помощью 10 мкг/мл проназы в течение 3 дней при температуре 37°С. В течение этого времени проназа также подвергалась деструкции за счет саморестрикции. Раствор РНК экстрагировали как описано выше с помощью раствора (В) в течение 20 минут при температуре 60°С при "мягком" перемешивании, фазы разделяли путем центрифугирования, водную фазу отделяли и встряхивали с диэтиловым эфиром. После добавления ацетата натрия (конечная концентрация 2%) РНК осаждали с помощью 2,5 объемов этанола и отделяли путем центрифугирования. Осадок обрабатывали с помощью холодного 2%-ного раствора ацетата натрия, осаждали с помощью 2,5 объемов этилового спирта и выдерживали в течение ночи при температуре -20°С в спиртовой смеси. Затем преципитат отделяли путем центрифугирования, промывали два раза с помощью 75%-ного этанола, два раза с помощью абсолютного этанола и два раза с помощью диэтилового эфира. После высушивания в сушильном шкафу получали сыпучую сухую РНК, которую хранили в темном стеклянном сосуде при комнатной температуре.

Метод II

Этот метод служит также для экстракции больших количеств дрожжей (килограммовые количества).

Заданную массу дрожжей гомогенизировали в четырехкратном количестве буфера (А) (см. выше, метод I) в низкотемпературной камере. К гомогенату добавляли 40% объем/объем фенольного раствора (В) и 5% мас./объем кубиков льда из деионизированной воды и перемешивали в течение 30 минут. Супернатант отсасывали и еще дважды, как описано в методе I, обрабатывали фенолом. Водные супернатанты собирали в сосуд, в котором находилась суспензия диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) (примерно 10% мас./объем, Whatman DE-22), соответственно половинному объему собранных супернатантов. Суспензию DEAE-целлюлозы поддерживали в суспендированном состоянии в течение 30 минут путем перемешивания. Затем оставляли осаждаться DEAE-целлюлозу в течение часа. Супернатант отсасывали. Тем временем промежуточную и фенольную фазы еще дважды перемешивали с аликвотным количеством раствора (С) (83% деионизированной воды, 15% мас./объем кубиков льда, 2% концентрата ацетата магния [0,5 М ацетата магния в 0,25 мл меркаптоэтанола]) в течение 30 минут и затем оставляли на 70-80 минут для разделения. Водные супернатанты переносили в сосуд с DEAE-целлюлозой, снова перемешивали и оставляли осаждаться. Супернатант отсасывали и диэтиламиноэтилцеллюлозу, как указано выше, промывали лишь дважды раствором (С), затем еще раз раствором (D) (2 объема концентрата ацетата магния, 2 объема концентрата NaCl [3,75 М NaCl в воде], 0,2 объема концентрата Трис-HCl [2,5 М Трис-HCl, рН=7,5, в воде, 96 объемов воды]).

DEAE-целлюлозу затем вносили в колонку, которая снизу была закрыта. Все дальнейшие стадии осуществляли в низкотемпературной камере при температуре 4°С. Колонку промывали с помощью 12-кратного, по отношению к содержимому колонки, количества раствора (D), при скорости потока 1,4 л/ч (только за счет силы тяжести). Затем тРНК элюировали с помощью раствора (Е) [2 объема концентрата ацетата магния, 0,2 объема концентрата Трис-HCl, 14 объемов концентрата NaCl и 84 объема воды; конечная концентрация NaCl 0,525 М] со скоростью потока 3 л/ч. Содержащие более чем 35 А_206нм Ед./мл фракции объединяли и осаждали с помощью 1,5 объемов этанола. Дальнейший ход работы соответствовал методу I.

Альтернативно, последний преципитат можно обрабатывать водой и лиофилизировать.

Вариантом этого метода является обычная обработка фенолом исходного материала.

Из верхней фазы изопропанолом осаждают сырую тРНК. Осадок после центрифугирования экстрагируют натрийацетатным буфером и хроматографируют на DEAE-целлюлозе. Элюирование осуществляют с помощью градиента ацетат натрия/хлорид натрия, как это известно биохимикам. Пригодные фракции, см. выше, определяют посредством логометрии и объединяют; тРНК осаждают этанолом, осадок обрабатывают как указано выше и предпочтительно лиофилизируют.

Для исследования чистоты общей РНК и тРНК и для их характеристики использовали следующие тесты: протеин определяли согласно Lowry О.Н. и др. (J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)) и по соотношению А₂₆₀/А₂₈₀≅2; ДНК определяли согласно Dische (Mikrochemie, 8, 4 (1930)); общую РНК определяли согласно Mejbaum (Physiol. Chem., 258, 117 (1939)); количественное определение тРНК и встраивание аминокислот определяли согласно Sprinzl и Sternbach (Methods in Enzymology, 59, 182 (1979)); токсичность определяли согласно М.Nöldner (М.Nöldner, Сообщение); апирогенность (Pyrogenfreiheit) определяли in vitro согласно DAB 1997 (LAL-тест) и in vivo согласно Ph. Eur./DAB 1997.

Результаты исследований

(Свойства общей РНК и тРНК, средние значения из десяти тестирований)

Абсорбция

A₂₆₀/A₂₈₀ ≅ 1,94-2,0

C,H,N - Анализ

С	32,67 32,42
Н	5,22 5,20
N	2,29 2,00

с соответствующими значениями различных общей РНК и тРНК.

УФ- и ИК-спектры

УФ- и ИК-спектры изменяются, они почти одинаковы, но не идентичны, соответственно, биологическим веществам.

Молекулярная масса

Молекулярная масса общей РНК и тРНК из дрожжей имеет среднее значение ≅22000-27000 Дальтонов, изменяющееся в случае различных препаратов;

Белок	ДНК (общее содержание)
2,3%	отриц. общая РНК Saccharomyces cerevisiae
1,9%	отриц. тРНК Saccharomyces cerevisiae
0,9%	отриц. общая РНК бычьего происхождения

Среднее, в общем, обычное качество. Повышенная чистота при слишком повышенных затратах не приводит ни к какому в значительной степени улучшенному терапевтическому действию.

Встраивание аминокислот в случае тРНК, среднее значение из 10 исследований

Лизин	69-85 пмоль/А260 Ед
Phe	41-55
Ser	39-50
Val	77-90

Эти средние значения в случае дрожжей различных партий изменяются в указанных рамках.

Токсичность

Тест на острую токсичность на мышах:

животные: самцы мышей линии NMRI, фирма Janvier, Франция

введение: внутривенно в хвостовую вену

длительность наблюдения: 24 часа

объем выборочных проб: n=10 в самой высокой концентрации

тестируемое вещество: а. бычья общая РНК

б. тРНК из пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae)

растворитель: 0,9% NaCl в воде для инъекций

Результат:

Вплоть до максимальной дозировки 1 г/кг/10 мл внутривенно подопытные животные в течение периода времени наблюдения 24 часа не проявляли никаких необычностей (поведения).

Апирогенность:

А. Пирогенное содержание общей РНК, а также тРНК, причем обе, как описанные выше, определяли с помощью in vitro-теста на эндотоксины согласно DAB 1997 (LAL TEST) и в случае кроликов согласно Ph. Eur. / DAB 1997.

1. Общая РНК

Эндотоксиновый стандарт ЕС 5

Амебоцитный лизат:

- декларированная чувствительность:	0,06 эндотоксиновых единиц/мл
- найденная чувствительность:	0,06 эндотоксиновых единиц/мл

тест-раствор: 100 мг РНК, растворенные в 20 мл воды-LAL (0,5%)

Результат:

Содержание эндотоксина в 0,5%-ном тест-растворе, разбавленном в соотношении 1:5 с помощью воды-LAL: <0,03 эндотоксиновых единиц/мл.

2. тРНК

Эндотоксиновый стандарт ЕС 5

Амебоцитный лизат:

- декларированная чувствительность: 0,06 эндотоксиновых единиц/мл

- найденная чувствительность: 0,06 эндотоксиновых единиц/мл

тест-раствор: 100 мг РНК, растворенные в 20 мл воды-LAL (0,5%)

Результат:

Содержание эндотоксина в 0,5%-ном тест-растворе, разбавленном в соотношении 1:10 с помощью воды-LAL: < 0,03 эндотоксиновых единиц/мл.

Б. Тест in vivo на апирогенность согласно DAB/Ph. Eub., Stand 2000

1. Общая РНК

1%-ный Тест-раствор тестируемого вещества в апирогенной воде для инъекций

Доза: 1,0 мл/животное

Животные: 3 кролика, соответственно DAB/Ph. Eub., Stand 2000

Результат:

Сумма разностей температур трех кроликов составляла 1,05°С; пирогены таким образом нельзя обнаружить.

2. тРНК

1%-ный Тест-раствор тестируемого вещества в апирогенной воде для инъекций

Доза:	1,0 мл / животное
Животные:	2 раза по 6 кроликов, соответственно DAB / Ph. Eub., Stand 2000

Результат:

а. сумма разностей температур 6 кроликов: 1,02°С

b. сумма разностей температур 6 кроликов: 1,06°С

Пироген нельзя обнаружить.

Пример 2

Обнаружение активности в отношении опухолей веществ согласно настоящему изобретению

10 пациентов, которые страдали от различных карцином и были прооперированы, организм которых был поражен многочисленными метастазами и которые не обращались более к химиотерапии, срок жизни которых оценивался лечащим онкологом в несколько недель, подвергали лечению 2 раза в течение 14 дней с помощью конъюгата тРНК/опухолевые клетки (инкубация в течение примерно 30 минут, 6×10⁶ опухолевых клеток с 50-100 мг тРНК, системно).

Одну пациентку после этой терапии также поддерживающе подвергали лечению с помощью "легкого" химиотерапевтического средства в течение нескольких недель. Спустя почти 2 года она скончалась независимо от ее основного заболевания.

Все другие обработанные пациенты прожили в течение более 1-2 лет без химиотерапии при хорошем "качестве" жизни без побочных явлений.

Эти результаты оправдывают использование РНК в случае пациентов, особенно так как они не обращались более к химиотерапии, были in faust, и нельзя было наблюдать никаких побочных действий или токсических явлений во время увеличенной продолжительности жизни.

1. Способ получения лекарственного средства для лечения карцином, за исключением злокачественных кожных заболеваний, включающий

а) получение ксеногенной РНК в качестве биологически активного вещества;

6) получение конъюгатов указанной ксеногенной РНК с клетками подвергаемой лечению опухоли путем инкубации в условиях in vitro;

в) добавление физиологически приемлемых носителей, вспомогательных веществ, разбавителей и/или добавок;

причем указанное биологически активное вещество представляет собой ксеногенную РНК из тканей животных, растений и/или одноклеточных организмов.

2. Способ по п.1, в котором биологически активное вещество представляет собой ксеногенную РНК из дрожжевых клеток.

3. Способ по п.1, в котором биологически активное вещество представляет собой ксеногенную тРНК.

4. Способ по п.1, в котором ксеногенная РНК получена путем экстракции фенолом.

5. Применение конъюгата ксеногенной РНК с клетками подвергаемой лечению опухоли для лечения карцином, за исключением злокачественных кожных заболеваний.

6. Применение по п.5, в котором нуждающемуся в таком лечении пациенту или животному вводят ксеногенную РНК, предварительно инкубированную in vitro с клетками подвергаемой лечению злокачественной опухоли.

7. Способ лечения карцином, за исключением злокачественных кожных заболеваний, в котором нуждающемуся в таком лечении пациенту или животному одно- или многократно вводят ксеногенную РНК в форме конъюгата в эффективном количестве 50-100 мг тРНК или общей РНК.

8. Способ по п.7, в котором пациенту или животному вводят ксеногенную РНК в форме коньюгата с опухолевыми клетками подвергаемой лечению опухоли.

9. Способ по п.7, где пациенту или животному вводят инкубированную in vitro смесь 10⁵-10⁶ опухолевых клеток с 50-100 мг тРНК или общей РНК.